WO1997044475A1 - Vecteurs adenoviraux pour la therapie genique - Google Patents

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WO1997044475A1
WO1997044475A1 PCT/FR1997/000882 FR9700882W WO9744475A1 WO 1997044475 A1 WO1997044475 A1 WO 1997044475A1 FR 9700882 W FR9700882 W FR 9700882W WO 9744475 A1 WO9744475 A1 WO 9744475A1
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adenoviral vector
adenoviral
region
cell
vector according
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PCT/FR1997/000882
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Monika Lusky
Pierre Leroy
Majid Mehtali
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Transgene S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates firstly to new adenoviral vectors intended for the transfer of genes of interest into a cell or a host organism making it possible to minimize the problem of formation of replicative viruses during their propagation in a complementation cell. It also relates to host cells and infectious viral particles containing these new vectors as well as a method for preparing the latter.
  • the invention is of particular interest for gene therapy perspectives, especially in humans.
  • adenoviruses offer several advantages that make them the vectors of choice for a wide variety of applications. Indeed, they infect many cell types, are non-integrative, not very pathogenic and can replicate in dividing or quiescent cells. As an indication, their genome consists of a linear and double-stranded DNA molecule of approximately - 9 _
  • the early genes are distributed in 4 regions dispersed in the adenoviral genome (E1 to E4 ; E for early meaning early in English) They comprise 6 transc ⁇ ptional units which have their own promoters, respectively E1A, E1B, E2B, E2A, E3 and E4 when one traverses the adenoviral genome in the direction 5 'towards 3'.
  • the E1, E2 and E4 regions are essential for viral replication while the E3 region involved in the modulation of the anti-adenovirus immune response in the host is not.
  • Late genes (L1 to L5; L for late meaning late in English) partially cover the early transcription units and are, for the most part, transcribed from the major late promoter MLP (for Major Late Promoter)
  • MLP major Late Promoter
  • This promoter allows the synthesis of a long primary transcript which is then marinated in about twenty messenger RNAs (mRNAs) from which the capsid proteins of the vi ⁇ on are produced
  • mRNAs messenger RNAs
  • the gene coding for the structural protein IX making up the capsid is located at the 5 'end of the adenoviral genome and covers the 3' end of the early region E 1 B
  • the transcriptional unit of protein IX uses the same transcription termination signal as the transcriptional unit E1 B
  • the recombinant adenoviral vectors s used for gene therapy are deficient in replication to prevent their dissemination in the environment and the host organism.
  • genes of interest are introduced into viral DNA in place of one or the other deleted region. They can only be propagated by trans-complementation of the adenoviral functions for which they are deficient. Currently, the only usable complementation cell lines are line 293 (Graham and al. , 1977, J. Gen. Virol.
  • Line 293 was obtained by integration into a human embryonic kidney cell from the 5 'end of the genome of the adenovirus type 5 (Ad5) and contains sequences which are also found in the defective recombinant vector and which are essential such as ITR 5 ′, the encapsidation region and the sequences coding for protein IX (the 3 ′ part of the E 1 B region integrated into 293 cells does not allow the synthesis of a functional protein IX of where the obligation to keep the IX gene in the vectors).
  • RCA rephcative viral particles
  • rephcative viral particles constitutes a major obstacle to the use of adenoviral vectors in gene therapy.
  • On the one hand from the point of view of the concept because it is not possible to administer a particle capable of disseminating in the organism or the environment.
  • secondly, from the point of view of their production because it is necessary to limit the number of generations during the culture of the complementation line transfected with the adenoviral vector, to avoid as much as possible the appearance of rephcative viral particles hence the difficulty in obtaining preparations with a high viral titer.
  • the purpose of the present invention is precisely to make available of the public safer adenoviral vectors minimizing the risk of production of rephcative viral particles while allowing the transfer and the expression of therapeutic genes
  • the production of a non-functional viral particle for the E2 region incapable of autonomous replication will be favored.
  • adenoviral vectors of the present invention provide an advantageous solution to the drawbacks inherent in the use of vectors of the prior art. Indeed, they can be propagated in conventional complementation cells derived from line 293 with a higher titer compatible with industrial needs and the risks of formation of rephcative viral particles are reduced. They are particularly suitable for human gene therapy
  • the subject of the present invention is a detective adenoviral vector for replication capable of being replicated in a complementation cell, which is derived from the genome of an adenovirus and comprising a sequence homologous to a sequence integrated into said complementation cell. , characterized in that at least part of said homologous sequence is displaced in said adenoviral vector so as to be located at a location different from its natural position in said adenoviral genome
  • an adenoviral vector derived from a human adenovirus preferably of serotype C and, most preferably, of type 2 or 5 (Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, p. 109-128; Ed: EJ Murey, The Human Press Inc.).
  • an “adenoviral vector defective for replication” designates a vector incapable of autonomous replication in a host cell.
  • a vector is obtained from an adenovirus whose genome has been modified so as to render non-functional one or more viral genes essential for its replication. These modifications can be diverse (deletion, mutation and / or addition of one or more nucleotides) and localized in the coding regions of the viral genome or outside of them, for example in the promoter regions.
  • the propagation of such a vector is carried out in a complementation cell capable of supplying the defective function (s) in trans, ie producing the early and / or late proteins necessary for the constitution of an infectious virus particle.
  • infectious viral particle is meant a viral particle having the capacity to infect a host cell and to cause the viral genome to enter it.
  • a preferred adenoviral vector according to the invention is devoid of the majority of the E1 region with the exception of the sequences covering the transcriptional unit of the gene coding for protein IX which cannot be complemented by the line 293. It can optionally lack the E3 region. However, according to an advantageous mode, it is preferred to keep the part of the E3 region coding for the protein gp l 9k (Gooding and Wold, 1990, C ⁇ tical Reviews of Immunology 10, 53-71) placed under the control of its own promoter or d '' a conventional heterologous promoter.
  • an adenoviral vector according to the invention can comprise additional deletions or mutations of all or part of other viral genes, in particular within the E2, E4 and / or L1-L5 regions (see for example international application WO 94 / 28152).
  • the mutation thermosensitive affecting the DBP gene for DNA Binding Protem in English
  • Another interesting variant or combination consists in deleting the E4 region with the exception of the sequences coding for open reading frames (ORF) 6 and 7 (these limited deletions do not require complementation of the E4 function; Ketner et al.
  • An adenoviral vector according to the invention is characterized in that part or all of the sequences homologous to those present in the complementation line is displaced in the genome of the adenoviral vector so that it no longer occupies the initial position until 'it has in the genome of the parental adenovirus from which it is derived.
  • part is meant at least a hundred base pairs and preferably at least 0.5 kb.
  • Homologous means identical or sufficiently homologous to induce an intermolecular recombination event.
  • the degree of homology between the adenoviral sequences present in the vector and the complementation line is greater than 70%, advantageously greater than 80%, preferably greater than 90% and, most preferably, the around 100%.
  • An advantageous embodiment consists in displacing all or part of the homologous sequences beyond a gene essential for the replication of the adenoviral vector according to the invention.
  • the displaced sequences consist of the gene coding for protein IX, and this is inserted 3 ′ from the E2 region, more particularly within the E3 region.
  • a preferred adenoviral vector lacks the E1 and E3 regions and comprises a cassette for expression of a gene of interest in place of the E1 region and the gene coding for protein IX provided with its own promoter or a heterologous promoter in place of the E3 region. According to another variant, it can be msech at the level of the E4 region or in place of the latter.
  • an adenoviral vector according to the invention makes it possible to reduce the formation of rephcative viral particles during its propagation in the line of adequate complementation, advantageously by a factor of at least 2, preferably of a factor at least 5 and most preferably factor at least 10.
  • Techniques for evaluating rephcative viral particles in an adenoviral preparation are known to those of skill in the art. As an indication, one can proceed according to the protocol described in Example 3.
  • an adenoviral vector according to the invention is recombinant and comprises an exogenous nucleotide sequence placed under the control of the elements necessary for its expression in a cell the host.
  • Exogenous nucleotide sequence refers to a nucleic acid which may be of any origin and which is not normally present in the genome of a parental virus in use in the present invention.
  • the exogenous nucleotide sequence may consist of one or more genes and, in particular, of gene (s) of therapeutic interest.
  • the exogenous nucleotide sequence can code for an antisense RNA and / or an mRNA which will then be translated into protein of interest. It can be of genomic type, of complementary DNA type (cDNA) or of mixed type (minigene, in which at least one intron is deleted). It can code for a mature protein or a precursor of a mature protein, in particular a precursor intended to be secreted and comprising a signal peptide. Furthermore, it may be all or part of a protein as found in nature (native or truncated protein) or also a chimeric protein originating from the fusion of sequences of various origins or even mutated having improved and / or modified biological properties. Such proteins can be obtained by conventional molecular biology techniques.
  • cytokines or lymphokines ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, interleukins and in particular IL-2, IL-6, 1 * IL-10 or IL-12
  • TNF tumor necrotizing factors
  • GM-CSF colony stimulating factors
  • C-CSF C-CSF, M-
  • CSF CSF ...
  • cellular or nuclear receptors in particular those recognized by pathogenic organisms (viruses, bacteria, or parasites) and, preferably, by the HIV virus (Human Immunodeficiency Virus) or their hgands; proteins involved in a genetic disease (factor Vi l, factor VII I, factor IX, dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), growth hormones (hGH); - enzymes (urease, renin, thrombin).
  • pathogenic organisms viruses, bacteria, or parasites
  • HIV virus Human Immunodeficiency Virus
  • proteins involved in a genetic disease factor Vi l, factor VII I, factor IX, dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), growth hormones (hGH); - enzymes (urease, renin,
  • an exogenous nucleotide sequence in use in the present invention can, in addition, comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells.
  • a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells.
  • neo coding for neomycin phosphotransferase
  • CAT Chloramphenicol Acetyl transferase
  • pac Puromycin Acetyl-Transferase
  • gpi Xanthine Guanine Phospho ⁇ bosyl Transferor
  • elements necessary for the expression of an exogenous nucleotide sequence in a host cell is meant all of the elements allowing its transcription into RNA (antisense RNA or mRNA) and the translation of an mRNA into protein.
  • the promoter is of particular importance. It can be isolated from any gene of eukaryotic or even viral origin and can be constitutive or regulable. Alternatively, it may be the natural promoter of the gene in question. Furthermore, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a transcription inhibiting region, to make a constitutive promoter regulable or vice versa, to introduce a restriction site.
  • the promoters can be mentioned, by way of examples.
  • CMV Cytomegalovirus
  • RSV Raster Sarcoma Virus
  • TK gene of HSV-1 virus early SV40 virus (Simian Virus 40)
  • adenoviral MLP adenoviral MLP ... or eukaryotic promoters of PGK (Phospho Glycerate kinase) genes murine or human
  • PGK Phospho Glycerate kinase genes murine or human
  • 1-antitrypsin liver-specific
  • immunoglobuhnes lymphocyte-specific.
  • an exogenous nucleotide sequence in use in the the present invention may further comprise additional elements necessary for expression (intronic sequence, signal sequence, nuclear localization sequence, termination sequence of transcription, site of initiation of IRES or other type translation, etc.) or still has its maintenance in the host cell.
  • additional elements necessary for expression intraonic sequence, signal sequence, nuclear localization sequence, termination sequence of transcription, site of initiation of IRES or other type translation, etc.
  • the invention also relates to an infectious viral particle as well as to a eukaryotic host cell comprising an adenoviral vector according to the invention.
  • Said host cell is advantageously a mammalian cell and, preferably, a human cell and can comprise said vector in non-integrated form or also integrated into genome II can be a primary or tumor cell of hematopoietic origin ( totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage), muscle, liver, epithelial or fibroblast.
  • An infectious viral particle according to the invention can be prepared according to any conventional technique in the field of art (Graham and Prevect, 1991, supra), for example, by co-transfection of a vector and an adenoviral fragment in an appropriate cell or also by means of a helper virus providing non-functional viral functions in trans. It is also possible to generate the viral vector in vitro in Esclicriclua coli (E. coli) by hgation or homologous recombination (see for example French demand 94 14470)
  • the invention also relates to a method for preparing an infectious viral particle comprising an adenoviral vector according to the invention, according to which (i) said adenoviral vector is introduced into a complementation cell capable of complementing said vector in trans, so as to obtain a transfected complementation cell,
  • the infectious viral particle can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods consists in lysing the cells by consecutive freeze / thaw cycles to collect the virions in the lysis supernatant.
  • adenoviral vector deleted from all or part of the E l and E3 regions with the exception of the sequences covering the gene coding for the protein IX, and (n) the complementation 293.
  • a subject of the invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as therapeutic or prophylactic agent, an adenoviral vector, an infectious viral particle or a eukaryotic host cell according to the invention in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition according to the invention is, in particular, intended for the preventive or curative treatment of diseases such as • genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or myopathy, that of Duchêne and Becker.), - cancers, such as those induced by oncogenes or viruses, viral diseases, such as hepatitis B or C and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome resulting from HIV infection), and recurrent viral diseases, such as viral infections caused by the herpes virus.
  • diseases such as • genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or myopathy, that of Duchêne and Becker.), - cancers, such as those induced by oncogenes or viruses, viral diseases,
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of the therapeutic or prophylactic agent is associated with a support such as a diluent.
  • a composition according to the invention can be administered locally, systemic or aerosol, especially by route intragast ⁇ que, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intratumoral intrapulmonary, intranasal or intratracheal Administration may be given as a single dose or repeated once or several times after a certain interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary according to various parameters, for example, the individual or the disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • the viral particles according to the invention can be formulated in the form of doses between 10 ′ 1 and 10 14 pfu (units forming plaques), advantageously 10 5 and 10 ⁇ pfu and, preferably, 10 6 and 10 12 ufp.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable adjuvant or excipient
  • the invention also extends to a method of treatment in which a therapeutically effective amount of an adenoviral vector, a viral particle or a eukaryotic host cell according to the invention is administered to a patient in need of a you! treatment.
  • Figure 1 is a schematic representation of the genome of human adenovirus type 5 (represented in arbitrary units from 0 to 100), indicating the location of different genes.
  • Figure 2 is a schematic representation of the adenoviral vector pTG5663 deleted from the E region! (replaced by a CMV promoter cassette - SV40 polyA) and sequences coding for protein IX.
  • Figure 3 is a schematic representation of the vector pTG8343 comprising the 5 * end of the l ⁇ d5 genome deleted from part of the El region (nt 459 to 3327).
  • Figure 4 is a schematic representation of the adenoviral vector pTG5665 deleted from the E1 region (replaced by a CMV promoter cassette - SV40 polyA) and from the E3 region (replaced by the sequences coding for protein IX in sense orientation).
  • Figure 5 is a schematic representation of the adenoviral vector pTG5664 deleted from the El region (replaced by a CMV promoter cassette - SV40 polyA) and from the E3 region (replaced by the sequences coding for protein IX in antise ⁇ s orientation).
  • FIG. 6 is a schematic representation of the adenoviral vector pTG5668 deleted from the E1 region (replaced by a CMV promoter cassette - IL2-SV40 polyA gene) and from the E3 region (replaced by the sequences coding for the protein IX in antisense orientation).
  • FIG. 7 is a schematic representation of the adenoviral vector pTG5669 deleted from the E1 region (replaced by a CMV promoter cassette - IL2-SV40 polyA gene) and from the E3 region (replaced by the sequences coding for the protein IX in sense orientation).
  • the cloning steps using bacterial plasmids are preferably carried out in strain L coli BJ 5 183 (Hanahan, 1983 J Mol Biol 166, 557-580)
  • the technique used consists of filling the protruding 5 'ends with the large fragment of the £ coli DNA polymerase I (Polenerase Chain Reaction)
  • PCR amplification techniques are known to those skilled in the art (see for example PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc)
  • the cells are transfected according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • the culture conditions they are conventional.
  • EXAMPLE 1 Construction of an adenoviral vector in which the bolt coding for the protein IX is displaced at the level of the E3 region
  • Ad5 nucleotides (m) 1 to 458)
  • MLP promoter of adenovirus 2 a polylinker which can be used for cloning a gene of interest
  • the signal for terminating the transcription of the SV40 virus nt 2543 to 2618 of the SV40 genome as disclosed in Genbank under the reference J02400
  • sequences of Ad5 ranging nt 4047 to 6241.
  • the Ba ⁇ nU ⁇ BstX ⁇ fragment of pTG6580 carrying the poly A SV40 and adenoviral sequences (nt 4047 to approximately 4790) is purified and introduced into the vector pTG5623 previously digested with these same enzymes.
  • the latter differs from pTG6580 in that it includes the CMV promoter (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 659-663) in place of MLP and the Ad5 sequences of nucleotides 3328 to 5788 instead of fragment 4047 to 6241.
  • pTG5654 which carries the sequences Ad5 1 to 458, the CMV promoter, the polylinker, the poly A of SV40 and the sequences Ad5 4047 to 5788 lacking the codan gene: for the protein IX
  • an El ' pIX adenovirus is constructed by homologous recombination.
  • the vector pTG3602 is used for this purpose, which results from the cloning of the genome of Ad5 in p poly II (described in French application 94 14470; Example I).
  • the E. coli BJ5183 cells are cotransformed by the Part and BstEU fragment of pTG5654 and the vector pTG3602 linearized by Cla ⁇ to generate pTG5663 ( Figure 2).
  • This corresponds to the deleted Ad5 sequences of the E l region and of the gene coding for the protein IX and in their place comprises the promoter cassette CMV, polylinker and poly A of SV40.
  • the latter comprises the adenoviral fragment Kpn ⁇ -Hpa ⁇ (nt 25838 to 32004) deleted from the majority of the E3 region (nt 27871 to 30748)
  • the vectors pTG5659 and pTG5660 are obtained according to the orientation of the pIX gene.
  • the pIX gene is integrated into an adenoviral context by homologous recombination in the strain BJ5183 cotransformed with the vector pTG5663 cleaved by Sfr ⁇ and the Apa ⁇ fragment from pTG5659 or pTG5660, to give pTG5665 or pTG5664 respectively ( Figures 4 and 5). After transfection into line 293, viruses are obtained indicating that the pIX sequence is functional outside its genomic context
  • EXFNTPLE 2 Establishment of a recombinant adenoviral vector comprising a gene coding for a cytokine in place of the E l region and that coding for the protein IX in place of the E3 region
  • the IL-2 sequences provided with free sites at each end are inserted into the vector pTG5664 cleaved by Bglll and treated with Klenow, to give pi G5662
  • the latter contains the sequences Ad5 1 to 458 followed by the cassette "CMV promoter, human IL-2 gene and poly A SV40" and of the adenoviral fragment 4047 to 5788
  • the vector pTG5667 is generated by homologous recombination in the strain E coli BJ5 183 between the vector pTG3602 linearized by ClaI and the Pocl-BstEll fragment derived of pTG5662
  • a viral stock is constituted which will be distributed in doses of 10 "to 10 10 pfu usable in the context of anti-cancer treatment.
  • the titer can be determined by conventional techniques such as the method agar, and the presence of RCA sought according to the technique indicated below
  • An adenoviral vector has also been constructed in which the pIX sequences have been integrated in antisense orientation in replacement of the E3 region and comprising at the level of the E1 deletion the IFN ⁇ gene under the control of the CMV promoter
  • the IFN ⁇ gene can be isolated from the plasmids of the prior art (for example M 13TG05 or pWTG41 described in French patent S5 09225) and can be introduced into the adenoviral genome by conventional techniques of molecular biology or as a replacement for the IL2 gene in the previous vector by homologous recombination.
  • Non-permissive cells incapable of complementation
  • an adenovirus such as for example the A549 cells (ATCC CCL 185)
  • A549 cells ATCC CCL 185
  • MOI multiplicity of infection
  • the medium is changed and the culture continued conventionally for a fortnight
  • the presence of rephcative viral particles is detected by the appearance of cytopathic effects
  • a new passage is carried out on sensitive cells of the cell lysate collected after the first passage To do this, the cell pellet is subjected to two freeze / thaw cycles before being used to infect fresh A459 cells After 90 minutes of adsorption , the culture is returned to fresh medium and the cytopathy again observed for 6 to 8 days
  • An absence of cytopathy reflects an absence of rephcative viral particles in the dose of virus intended

Abstract

La présente invention concerne un nouveau vecteur adénoviral destiné à minimiser le problème de formation de particules virales compétentes pour la réplication lors de sa propagation dans une cellule de complémentation. Il est caractérisé en ce qu'une partie au moins des séquences également présentes dans la cellule de complémentation est localisée à un endroit différent de son positionnement naturel dans le génome adénoviral parental. Elle a également pour objet une cellule hôte et une particule virale infectieuse le contenant. Enfin, elle concerne une composition pharmaceutique les contenant et leur usage thérapeutique.

Description

VECTEURS ADENOVIRAUX POUR LA THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne en premier lieu de nouveaux vecteurs adénoviraux destinés au transfert de gènes d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte permettant de minimiser le problème de formation de virus réplicatifs lors de leur propagation dans une cellule de complémentation. Elle a également pour objet les cellules hôtes et particules virales infectieuses contenant ces nouveaux vecteurs ainsi qu'une méthode pour préparer ces dernières. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.
La possibilité de traiter les maladies humaines par thérapie génique est passée en quelques années du stade des considérations théoriques à celui des applications cliniques. La grande majorité des protocoles décrits jusqu'à présent met en oeuvre des vecteurs viraux pour transférer et exprimer le gène thérapeutique dans les cellules à traiter. A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés du fait de la simplicité de leur génome. Cependant, outre leur capacité restreinte de clonage, ils présentent deux inconvénients majeurs qui limitent leur utilisation systématique : d'une part, ils infectent majoritairement les cellules en division et d'autre part, du fait de leur intégration au hasard dans le génome de la cellule hôte, le risque de mutagénèse msertionnelle n'est pas négligeable. C'est pourquoi, de nombreuses équipes scientifiques se sont attachées à développer d'autres vecteurs de thérapie génique.
A cet égard, les adenovirus offrent plusieurs avantages qui en font des vecteurs de choix pour une grande variété d'applications. En effet, ils infectent de nombreux types cellulaires, sont non-intégratifs, peu pathogènes et peuvent se répliquer dans les cellules en division ou quiescentes. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ - 9 _
36 kb portant plus d'une trentaine de gènes, à la fois des gènes précoces nécessaires à la replication virale et des gènes tardifs de structure (voir Figure 1 ) Les gènes précoces sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome adénoviral (El à E4 ; E pour early signifiant précoce en anglais) Elles comportent 6 unités transcπptionnelles qui possèdent leurs propres promoteurs, respectivement E1A, E1B, E2B, E2A, E3 et E4 lorsque l'on parcourt le génome adénoviral dans le sens 5 ' vers 3' . Les régions El , E2 et E4 sont essentielles à la replication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l 'est pas Les gènes tardifs (Ll à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais) Ce promoteur permet la synthèse d'un long transcrit primaire qui est ensuite maruré en une vingtaine d'ARN messagers (ARNm) a partir desquels sont produites les protéines capsidaires du viπon Le gène codant pour la protéine structurale IX composant la capside est situé à l 'extrémité 5' du génome adénoviral et recouvre l'extrémité 3' de la région précoce E 1 B L'unue transcπptionnelle de la protéine IX utilise le même signal de terminaison de la transcription que l 'unité transcπptionelle E1 B Les vecteurs adenoviraux recombinants utilisés à des fins de thérapie génique sont déficients pour la replication afin d'éviter leur dissémination dans l 'environnement et l'organisme hôte. D'une manière générale, ils'déπvent du génome d'un adenovirus par délétion de la majorité de la région E l et certains comportent des délétions supplémentaires au niveau des régions E2, E3 et/ou E4 afin d'accroître leur capacité de clonage ou réduire les problèmes d' inflammation liés à l'expression des gènes viraux restants. Les gènes d' intérêt sont introduits dans l ' ADN viral à la place de l 'une ou l'autre région délétee Ils ne peuvent être propagés que par trans-complémentatioπ des fonctions adenovirales pour lesquelles ils sont déficients. A l 'heure actuelle, les seules lignées cellulaires de complémentation utilisables sont la lignée 293 (Graham et al. , 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) complémentant la fonction adénovirale E l ou des lignées dérivant de cette dernière aptes à trans-complémenter plusieurs fonctions adénovirales El et E4 (Yeh ét al. , 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Wang et al . , 1995, Gène Therapy 2, 775-783 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gène Therapy 6, 1575- 1586) ou El et E2 .
La lignée 293 a été obtenue par intégration dans une cellule de rein embryonnaire humain de l'extrémité 5' du génome de l'adénovirus de type 5 (Ad5) et contient des séquences qui se trouvent aussi dans le vecteur recombinant défectif et qui lui sont indispensables comme l' ITR 5 ' , la région d'encapsidation et les séquences codant pour la protéine IX (la partie 3' de la région E 1 B intégrée dans les cellules 293 ne permet pas la synthèse d'une protéine IX fonctionnelle d'où l'obligation de conserver le gène IX dans les vecteurs). Ceci a pour conséquence la production de particules virales rephcatives (RCA) générées par recombinaison entre les séquences adénovirales du vecteur et celles du génome cellulaire. Deux événements de recombinaison au niveau de l 'ITR 5' ou la séquence d'encapsidation et les séquences IX suffisent à générer un virus sauvage compétent pour la replication.
La formation de ces particules virales rephcatives constitue un obstacle majeur à l'utilisation des vecteurs adénoviraux en thérapie génique. D'une part du point de vue du concept car il n'est pas envisageable d'administrer une particule capable de se disséminer dans l'organisme ou l 'environnement. Et d'autre part, du point de vue de leur production, car il est nécessaire de limiter le nombre de générations lors de la culture de la lignée de complémentation transfectée par le vecteur adénoviral, pour éviter au maximum l 'apparition des particules virales rephcatives d'où la difficulté d'obtenir des préparations ayant un titre viral élevé. On imagine aisément les difficultés susceptibles d'être rencontrées lors de la production de lots cliniques non contaminés par une particule RCA.
Le but de la présente invention est précisément de mettre à la disposition du public des vecteurs adénoviraux plus sûrs minimisant le risque de production de particules virales rephcatives tout en permettant le transfert et l 'expression de gènes thérapeutiques On a maintenant construit de nouveaux vecteurs adénoviraux recombinants déletés des régions El et E3 dans lesquels la séquence codant pour la protéine IX est intégrée à la place de la région E3. Ainsi , en cas de recombinaison entre les séquences IX homologues présentes dans le vecteur et la lignée 293, on favorisera la production d'une particule virale non fonctionnelle pour la région E2 incapable de replication autonome
Les vecteurs adénoviraux de la présente invention proposent une solution avantageuse aux inconvénients inhérents à l 'utilisation des vecteurs de l 'art antérieur. En effet, ils peuvent être propagés dans les cellules de complémentation conventionnelles dérivées de la lignée 293 avec un titre plus élevé compatible avec les besoins industriels et les risques de formation de particules virales rephcatives sont réduits. Ils sont tout particulièrement adaptés a la thérapie génique humaine
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur adénoviral détectif pour la replication capable d'être répliqué dans une cellule de complémentation, qui dérive du génome d'un adenovirus et comprenant une séquence homologue à une séquence intégrée dans ladite cellule de complémentation, caractérisé en ce qu 'une partie au moins de ladite séquence homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral de manière a être localisée à un endroit différent de son positionnement naturel dans ledit génome adénoviral
Un vecteur adénoviral selon l ' invention peut dériver d'un adenovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, muπne, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral de différentes origines On peut citer plus particulièrement les adenovirus CAV- 1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al , 1993, Arch Virol , 128, 171 - 176 , Spibey et Cavanagh, 1989, J Gen Virol. , 70, 165- 172 , Jouvenne et al , 1987, Gène, 60, 2 1 -28 ; Mutai et al. , 1995, J. Gen. Virol. , 76, 93- 102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral dérivé d'un adenovirus humain, de préférence, de sérotype C et, de manière tout à fait préférée, de type 2 ou 5 (Graham et Prevect, 1991 , Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109- 128 ; Ed : E.J. Murey, The Human Press Inc.).
Au sens de la présente invention, un "vecteur adénoviral défectif pour la replication" désigne un vecteur incapable de replication autonome dans une cellule hôte. Généralement, un tel vecteur est obtenu à partir d'un adenovirus dont le génome a été modifié de manière à rendre non fonctionnels un ou plusieurs gènes viraux essentiels à sa replication. Ces modifications peuvent être diverses (délétion, mutation et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées dans les régions codantes du génome viral ou en dehors de celles-ci, par exemple dans les régions promotrices. La propagation d'un tel vecteur est effectuée dans une cellule de complémentation capable de fournir en trans la ou les fonction(s) défectueuse(s) c'est à dire de produire les protéines précoces et/ou tardives nécessaires à la constitution d'une particule virale infectieuse. Par "particule virale infectieuse", on entend une particule virale ayant la capacité d ' infecter une cellule hôte et d'y faire pénétrer le génome viral
A titre illustratif, un vecteur adénoviral préfère selon l 'invention est dépourvu de la majorité de la région El à l'exception des séquences recouvrant l 'unité transcπptionnelle du gène codant pour la protéine IX qui ne peut être complémentée par la lignée 293. Il peut être dépourvu , de manière optionnelle, de la région E3. Cependant, selon un mode avantageux, on préfère conserver la partie de la région E3 codant pour la protéine gp l 9k (Gooding et Wold, 1990, Cπtical Reviews of Immunology 10, 53-71 ) placée sous le contrôle de son propre promoteur ou d'un promoteur hétérologue conventionnel . Bien entendu , un vecteur adénoviral selon l'invention peut comprendre des délétions ou mutations supplémentaires de tout ou partie d'autres gènes viraux, notamment au sein des régions E2, E4 et/ou L1-L5 (voir par exemple la demande internationale WO 94/28152). Pour illuster ce point, on peut citer la mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protem en anglais) de la région E2A (Ensmger et al. , 1972, J . Virol. 10, 328-339). Une autre variante ou une combinaison intéressante consiste à déléter la région E4 à l'exception des séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 6 et 7 (ces délétions limitées ne nécessitent pas de complémentation de la fonction E4 ; Ketner et al. , 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). On aura alors recours à des lignées de complémentation adaptées aux déficiences du vecteur adénoviral selon l' invention, comme la lignée 293 pour complémenter la fonction E l ou les lignées dérivées telles que celles citées précédemment pour une double complémentation.
Un vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce qu'une partie ou la totalité des séquences homologues à celles présentes dans la lignée de complémentation est déplacée dans le génome du vecteur adénoviral de sorte qu 'elle n'occupe plus la position initiale qu 'elle a dans le génome de l 'adénovirus parental dont il dérive. Par partie, on entend au moins une centaines de paires de bases et de préférence au moins 0,5 kb. Homologue signifie identique ou suffisamment homologue pour induire un événement de recombinaison intermoléculaire. A titre indicatif, le degré d'homologie entre les séquences adénovirales présentes dans le vecteur et la lignée de complémentation est supérieur à 70 % , avantageusement supérieur à 80 % , de préférence supérieur à 90 % et, de manière tout à fait préférée, aux environs de 100 % .
Un mode de réalisation avantageux consiste à déplacer tout ou partie des séquences homologues au delà d'un gène essentiel à la replication du vecteur adénoviral selon l' invention. De préférence, les séquences déplacées sont constituées par le gène codant pour la protéine IX, et celui-ci est inséré en 3 ' de la région E2, plus particulièrement au sein de la région E3. Un vecteur adénoviral préféré est dépourvu des régions El et E3 et comprend une cassette d'expression d'un gène d' intérêt à la place de la région E l et le gène codant pour la protéine IX muni de son propre promoteur ou d'un promoteur hétérologue à la place de la région E3. Selon une autre variante, il peut être mséré au niveau de la région E4 ou à la place de cette dernière.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un vecteur adénoviral selon l'invention permet de réduire la formation de particules virales rephcatives lors de sa propagation dans la lignée de complémentation adéquate, avantageusement d'un facteur au moins 2, de préférence d'un facteur au moins 5 et, de manière tout à fait préférée d'un facteur au moins 10. Les techniques pour évaluer les particules virales rephcatives dans une préparation adénovirales sont connues de l 'homme de l'art. A titre indicatif, on peut procéder selon le protocole décrit à l'exemple 3. Selon un mode de réalisation préféré, un vecteur adénoviral selon l 'invention est recombinant et comprend une séquence nucléotidique exogène placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellu le hôte. "Séquence nucléotidique exogène" fait référence à un acide nucléique qui peut être d'une origine quelconque et qui n'est normalement pas présent dans le génome d'un virus parental en usage dans la présente invention. Dans le cadre de l'invention, la séquence nucléotidique exogène peut-être constituée d'un ou plusieurs gènes et, en particulier, de gène(s) d'intérêt thérapeutique.
D'une manière générale, la séquence nucléotidique exogène peut coder pour un ARN anti-sens et/ou un ARNm qui sera ensuite traduit en protéine d ' intérêt. Elle peut être de type génomique, de type ADN complémentaire (ADNc) ou de type mixte (minigène, dans lequel au moins un intron est délété). Elle peut coder pour une protéine mature ou un précurseur d'une protéine mature, notamment un précurseur destiné à être sécrété et comprenant un peptide signal. Par ailleurs, il peut s'agir de tout ou partie d'une protéine telle que trouvée dans la nature (protéine native ou tronquée) ou également d'une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses ou encore mutée présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. De telles protéines peuvent être obtenues par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire. Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser les gènes codant pour les polypeptides suivants: cytokines ou lymphokines (interférons α , β et γ , interleukines et notamment l ' lL-2, l' IL-6, 1 * IL- 10 ou l ' IL- 12, facteurs nécrosant des tumeurs (TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-
CSF...) ; récepteurs cellulaires ou nucléaires, notamment ceux reconnus par des organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence, par le virus VIH (Virus de l ' Immunodéficience Humain) ou leurs hgands ; protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur Vi l , facteur VII I , facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de croissance (hGH) ; - enzymes (uréase, rénine, thrombine....) ; inhibiteurs d'enzymes (α 1-antιtrypsιne, antithrombine I I I , inhibiteurs de protéases virales...) ; polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (ARN anti-sens, anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le système immunitaire....) ; protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou protéines régulatrices agissant sur l 'expression des gènes correspondants ; polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement (polypeptides antigémques ayant des propriétés immunogènes, épitopes antigémques, anticorps, variants trans-dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition...) ; toxines ( thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV- 1), πcine, toxine cholérique, diphtérique ) ou immunotoxines ; et marqueurs (β-galactosidase, luciférase....). II est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.
Par ailleurs, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut, en outre, comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransferase) conférant une résistance à l 'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpi (Xanthine Guanine Phosphoπbosyl Transférase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art. Par éléments nécessaires à l'expression d'une séquence nucléotidique exogène dans une cellule hôte, on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN (ARN anti-sens ou ARNm) et la traduction d'un ARNm en protéine. Parmi ceux-ci , le promoteur revêt une importance particulière. I l peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus) , du gène TK du virus HSV- 1 , précoce du virus SV40 (Simian Virus 40), adénoviral MLP ... υu encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, a 1 -antιtrypsine (foie-spécifique), immunoglobuhnes (lymphocyte-spécifique). Bien entendu, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut en outre comprendre des éléments additionnels nécessaires à l 'expression (séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatπce de la transcription, site d' initiation de la traduction de type IRES ou autre....) ou encore a sa maintenance dans la cellule hôte. De tels éléments sont connus de l 'homme de l'art
L'invention a également trait à une particule virale infectieuse ainsi qu 'à une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur adénoviral selon l 'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine et peut comprendre ledit vecteur sous forme non intégrée ou également intégrée dans le génome II peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoiétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage ), musculaire, hépatique, epithéliale ou fibroblaste.
Une particule virale infectieuse selon l'invention peut être préparée selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l 'art (Graham et Prevect, 1991 , supra), par exemple, par co-transfection d'un vecteur et d'un fragment adénoviral dans une cellule appropriée ou encore par le moyen d'un virus auxiliaire fournissant en trans les fonctions virales non fonctionnelles II est également envisageable de générer le vecteur viral in vitro dans Esclicriclua coli (E. coli) par hgation ou encore recombinaison homologue (voir par exemple la demande française 94 14470)
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral selon l ' invention, selon lequel (i) on introduit ledit vecteur adénoviral dans une cellule de complémentation capable de complementer en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectee,
(n) on cultive ladite cellule de complémentation transfectee dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale infectieuse, et (ni) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale infectieuse peut être récupérée du surnageant de culture mais également des cellules Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse.
Selon un mode de réalisation avantageux, on met en oeuvre (i) un vecteur adénoviral délété de tout ou partie des régions E l et E3 à l 'exception des séquences recouvrant le gène codant pour la protéine IX, et (n) la cellule de complémentation 293.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur adénoviral, une particule virale infectieuse ou une cellule hôte eucaryote selon l ' invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique La composition selon l 'invention est, en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que • des maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabète ou myopathie, celle de Duchêne et de Becker . ), - des cancers, comme ceux induits par des oncogènes ou des virus, des maladies virales, comme l'hépatite B ou C et le SIDA (syndrome de l' immunodéficience acquise résultant de l ' infection par le VIH), et des maladies virales récurrentes, comme les infections virales provoquées par le virus de l'herpès.
Une composition pharmaceutique selon l' invention peut être fabriquée de manière conventionnelle En particulier, on associe une quantité therapeutiquement efficace de l 'agent thérapeutique ou prophylactique a un support tel qu 'un diluant Une composition selon l 'invention peut être administrée par voie locale, systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastπque, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale L'administration peut avoir heu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l ' individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. En particulier, les particules virales selon l 'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 10'1 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 10π ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. La formulation peut également inclure un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique
Enfin, la présente invention est relative à l'usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral, d'une particule virale infectieuse ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol. .) On peut également adopter l 'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter m vitro selon les techniques de l 'art et de les réadminister au patient.
L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité therapeutiquement efficace d'un vecteur adénoviral , d'une particule virale ou d'une cellule hôte eucaryote selon l ' invention à un patient ayant besoin d'un te! traitement.
La présente invention est plus complètement décrite en référence aux Figures suivantes et à l 'aide des exemples suivants
La Figure 1 est une représentation schématique du génome de l'adénovirus humain de type 5 (représenté en unités arbitraires de 0 à 100), indiquant l'emplacement des différents gènes.
La Figure 2 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5663 délété de la région E! (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et des séquences codant pour la protéine IX. La Figure 3 est une représentation schématique du vecteur pTG8343 comprenant l 'extrémité 5* du génome de lΑd5 délétée d'une partie de la région El (nt 459 à 3327).
La Figure 4 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5665 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation sens).
La Figure 5 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5664 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation antiseπs).
La Figure 6 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5668 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - gène IL2-SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation antisens). La Figure 7 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5669 délété de ia région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - gène IL2-SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation sens).
EXEMPLES
Les exemples suivants n'illustrent qu'un mode de réalisation de la présente invention
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al , ( 1989, Laboratory Manual, Cold Spπng Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont de préférence réalisées dans la souche L coli BJ 5 183 (Hanahan, 1983 J Mol Biol 166, 557-580) S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes a l'aide du grand fragment de l'ADN polymerase I d'£ coli (Klenow) Les techniques d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, édite par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Académie Press Inc)
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier On peut citer la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al , sitpta), mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'electroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes Quant aux conditions de culture, elles sont classiques Dans les exemples qui suivent, on a recours a la lignée cellulaire 293 (Graham et al, 1977, supta , disponible a l'ATCC sous la référence CRL 1 573) Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuv ent être utilisées Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constaictions décrites ci-apres, sont indiques précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260
EXEMPLE 1 Construction d'un vecteur adénoviral dans lequel le pêne codant pour la protéine IX est déplace au niveau de la région E3
A Construction d un vecteur adenovual delete des séquences codant pour la protéine pIX On utilise tout d'abord le vecteur pTG6580 dont la construction est décrite dans la demande internationale WO 94/28152 (exemple 2). Celui-ci comprend dans une structure p poly I! (Lathe et al. , 1987, Gène 57, 193-201 ), l ' ITR 5 ' et la séquence d'encapsidation de l'Ad5 (nucléotides (m) 1 à 458), le promoteur MLP de l 'adénovirus 2, un polylinker utilisable pour le clonage d'un gène d'intérêt, le signal de terminaison de la transcription du virus SV40 (nt 2543 à 2618 du génome SV40 tel que divulgué dans Genbank sous la référence J02400) suivis des séquences de l'Ad5 allant des nt 4047 à 6241. Le fragment BaιnU\ BstX\ de pTG6580 porteur des séquences poly A SV40 et adénovirales (nt 4047 à environ 4790) est purifié et introduit dans le vecteur pTG5623 préalablement digéré par ces mêmes enzymes. Ce dernier diffère de pTG6580 en ce qu 'il comprend le promoteur CMV (Thomsen et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 , 659-663) à la place du MLP et les séquences Ad5 des nucléotides 3328 à 5788 au lieu du fragment 4047 à 6241. On obtient pTG5654 qui porte les séquences Ad5 1 à 458, le promoteur CMV, le polylinker, le poly A de SV40 et les séquences Ad5 4047 à 5788 dépourvues du gène codan: pour la protéine IX
Puis on construit un adenovirus El'pIX par recombinaison homologue. On utilise à cet effet le vecteur pTG3602 qui résulte du clonage du génome de l 'Ad5 dans le p poly II (décrit dans la demande française 94 14470 ; exemple I ). Les cellules E. coli BJ5183 sont cotransformées par le fragment Part et BstEU de pTG5654 et le vecteur pTG3602 linéarisé par Cla\ pour générer pTG5663 (Figure 2). Celui-ci correspond aux séquences Ad5 délétées de la région E l et du gène codant pour la protéine IX et comprend à leur place la cassette promoteur CMV, polylinker et poly A de SV40.
B Clonage du gène codant pour la protéine pIX au niveau de la région E3 d'un vecteur adénoviral. On part du vecteur pTG8343 lequel provient de l 'insertion dans p poly II d ' une partie de l 'extrémité 5 ' du génome de l'Ad5 , à savoir les séquences s'etendant des nucléotides 1 à 458 et 3328 à 5788 (Figure 3) On purifie de ce dernier le fragment BglU-BssHU porteur des séquences pIX (nt 3328 à 4105) Après action de la Klenow pour rendre les extrémités franches, il est inséré dans le sue BglU (également traité à la Klenow) du vecteur pTG4664 décrit dans la demande française 95 08946. A titre indicatif, ce dernier comporte le fragment adénoviral Kpn\-Hpa\ (nt 25838 à 32004) délété de la majorité de la région E3 (nt 27871 à 30748) On obtient les vecteurs pTG5659 et pTG5660 selon l'orientation du gène pIX.
Le gène pIX est intégré dans un contexte adénoviral par recombmaison homologue dans la souche BJ5183 cotransformée avec le vecteur pTG5663 clivé par Sfr\ et le fragment Apa\ de pTG5659 ou pTG5660, pour donner respectivement pTG5665 ou pTG5664 (Figures 4 et 5). Après transfection dans la lignée 293, on obtient des virus indiquant que la séquence pIX est fonctionnelle hors de son contexte genomique
EXFNTPLE 2 Constaiction d'un vecteur adénoviral recombinant comprenant un gène codant pour une cytokine a la place de la région E l et celui codant pour la protéine IX a la place de la région E3
Le clonage de la séquence ADNc codant pour l'IL-2 a ete initialement publiée par Taniguchi et al ( 1983, Nature 302, 305) Les séquences codant pour !'IL-2 humaine sont isolées des vecteurs de l'art antérieur par les techniques conventionnelles de la biologie moléculaire (par exemple pTG26 décrit dans la demande française 85 09480) L'homme du métier est en mesure de générer des amorces PCR adéquates incluant des sites de restriction appropries
Les séquences IL-2 munies de sites francs a chaque extrémité sont insérées dans le vecteur pTG5664 clive par Bglll et traite par la Klenow, pour donner pi G5662 Ce dernier comporte les séquences Ad5 1 a 458 suivies de la cassette "promoteur CMV, gène IL-2 humain et poly A SV40" et du fragment adénoviral 4047 a 5788 On génère le vecteur pTG5667 par recombinaison homologue dans la souche E coli BJ5 183 entre le vecteur pTG3602 linéarise par Clal et le fragment Pocl-BstEll issu de pTG5662 Enfin, on procède a une dernière étape de recombinaison homologue entre le vecteur pTG5667 clive par S/ti et le fragment Apaλ obtenu de pTG5659 ou pTG5660 On obtient les vecteurs pTG5668 et pTG5669 (Figures 6 et 7) qui portent l'ITR 5', la région d'encapsidation de l'AdS, la cassette d'expression de l'IL-2 et les séquences adénovirales 4047 à 35935 déletees de la région E3 à la place de laquelle est intégré le gène codant pour la protéine pIX Ces deux vecteurs différent par l'orientation de ce dernier
Apres transfection dans les cellules 293 sous forme de fragments Pacl, on constitue un stock viral qui sera réparti en doses de 10" a 1010 pfu utilisables dans le cadre de traitement anti-cancéreux Le titre peut être déterminé par les techniques classiques comme la méthode agar, et la présence de RCA recherchée selon la technique indiquée ci-après
On a également construit un vecteur adénoviral dans lequel les séquences pIX ont ete intégrées en orientation antisens en remplacement de la région E3 et comprenant au niveau de la déletion E l le gène IFNγ sous le contrôle du promoteur CMV Le gène IFNγ peut être isolé des plasmides de l'art antérieur (par exemple M 13TG05 ou pWTG41 décrits dans le brevet français S5 09225) et peut être introduit dans le génome adénoviral par les techniques classiques de biologie moléculaire ou en remplacement du gène IL2 dans le vecteur précédent par recombinaison homologue On génère pTG6697 qui après transfection dans la lignée de complémentation 293, donne les particules virales AdTG6697 On vérifie que les adenovirus recombinants sont aptes a sécréter le produit d'expression pour lequel ils codent Apres transduction de cellules cibles, les quantités dTL2 et d'IFNγ sécrétées dans le surnageant de culture sont déterminées par ELISA (kit Quantikine RD System, Minneapohs pour l'IL-2 et kit IFNγ-Easia, Medgenix, Fleurus Belgique pour l'IFNγ) Les cellules A549 (ATCC CCL- 185) infectées par AdTG566S (moi = 100 unîtes infectieuses (uι)/cellule) produisent 1 a 2 μg d'IL-2 / 106 cellules / 48 h A titre indicatif un vecteur adénoviral de première génération portant la même cassette d'expression mais dans lequel les séquences pIX sont dans leur positionnement naturel produit des quantités d'IL-2 comparables De même, les niveaux d'IFNγ secrètes par les cellules A549 infectées par AdTG6697 (moi = 100 ui/cellule) sont du même ordi e de grandeur
EXEMPLE 3 Recherche de particules virales rephcatives
Des cellules non permissives (incapables de complémentation) et sensibles a l'infection par un adenovirus, comme par exemple les cellules A549 (ATCC CCL 185) sont mises en culture et maintenues selon les conditions standards Lorsqu'elles atteignent la confluence, le milieu de culture est élimine et remplace par un milieu contenant une dose de la préparation adenovirale a tester en respectant une multiplicité d'infection (MOI) comprise entre 1 et 10 (premier passage) Apres 90 min d'infection, le milieu est change et la culture poursuivie de manière classique pendant une quinzaine de jours La présence de particules virales rephcatives est détectée par l'apparition d'effets cytopathiques On procède a un nouveau passage sur cellules sensibles du lysat cellulaire recueilli après le premier passage Pour ce faire, le culot cellulaire est soumis a deux cycles de congélation/ décongélation avant d'être utilise pour infecter des cellules A459 fraîches Apres 90 minutes d'adsorption, la culture est remise dans du milieu frais et la cytopathie a nouveau observée pendant 6 à 8 jours Une absence de cytopathie reflète une absence de particules virales rephcatives dans la dose de virus destinée a être administrée Un témoin positif est constitue par une dose équivalente de la préparation adenovirale contaminée par un virus sauvage Ad5
Il est également possible de détecter les RCA par PCR a partir de l'ADN isole d'une dose de la préparation virale a l'aide d'amorces spécifiques de la région E l , celle-ci étant normalement absente des vecteurs adénoviraux L'amplification d un fragment E l spécifique indique la présence de virus sauvages

Claims

Revendications
1 Vecteur adénoviral defectif pour la replication capable d'être réplique dans une cellule de complémentation, qui dérive du génome d'un adenovirus et comprenant une séquence homologue a une séquence intégrée dans ladite cellule de complémentation, caractérise en ce qu'une partie au moins de ladite séquence homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral de manière a être localisée à un endroit différent de son positionnement naturel dans ledit génome adénoviral.
i Vecteur adénoviral selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite partie au moins de la séquence homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral de manière à être localisée en 3' d'un gène essentiel à sa replication.
3 Vecteur adénoviral selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite partie au moins de la séquence homologue est localisée dans ledit vecteur adénoviral à la place de la région E3
4 Vecteur adénoviral selon l 'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite partie au moins de la séquence homologue est constituée par le gène codant pour la protéine IX d'un adenovirus.
5 Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 4, caractérise en ce qu'il dérive du génome d'un adenovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, muπne, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral de différentes origines
6. Vecteur adénoviral selon la revendication 5, caractérisé en ce qu 'il dérive du génome d'un adenovirus humain de type 5.
7. Vecteur adénoviral selon l 'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu' il est au moins dépourvu de tout ou partie de la région El .
8. Vecteur adénoviral selon la revendication 7, caractérisé en ce qu 'il est en outre dépourvu de tout ou partie de la région E3.
9. Vecteur adénoviral selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu 'il est en outre dépourvu de tout ou partie d'une ou plusieurs régions sélectionnées parmi les régions E2, E4, Ll , L2, L3, L4 et L5.
10. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique exogène placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte
1 1 . Vecteur adénoviral selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique exogène est sélectionnée parmi les gènes codant pour une cytokine, un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation, la protéine CFTR, l 'insuline, la dystrophine, une hormone de croissance, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un polypeptide à effet anti- tumoral, un polypeptide capable d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire ou virale et, notamment le VIH , un anticorps, une toxine, une immunotoxine et un marqueur.
12. Particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral selon l 'une des revendications 1 à 1 1 .
13. Cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur adénoviral selon l 'une des revendications 1 à 1 1 ou une particule virale infectieuse selon la revendication 12.
14. Procédé de préparation d'une particule virale infectieuse selon la revendication 12, selon lequel :
(i) on introduit un vecteur adénoviral selon l'une des revendications
1 à 1 1 dans une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur adénoviral pour obtenir une cellule de complémentation transfectee ;
(π) on cultive ladite cellule de complémentation transfectee dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale infectieuse ; et
(m) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture cellulaire.
15 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que (i) ledit vecteur adénoviral est délété de tout ou partie de la région E l à l 'exception des séquences recouvrant le gène codant pour la protéine IX, de tout ou partie de la région E3 et comprend lesdites séquences codant pour la protéine IX localisée à la place de la région E3 et (ii) ladite cellule de complémentation est la lignée 293.
16 Composition pharmaceutique comprenant un vecteur adénoviral selon l 'une des revendications 1 à 1 1 , une particule virale infectieuse selon la revendication 12 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la revendication 14 ou 15 ou une cellule hôte eucaryote selon la revendication 13, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique
17 Usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral selon l'une 97
des revendications 1 à 1 1 , d'une particule virale infectieuse selon la revendication 12 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la revendication 14 ou 15 ou d'une cellule hôte eucaryote selon la revendication 13, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique
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