FR2748753A1 - Nouveaux vecteurs adenoviraux pour la therapie genique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau vecteur adénoviral destiné à minimiser le problème de formation de particules virales compétentes pour la réplication lors de sa propagation dans une cellule de complémentation. Il est caractérisé en ce qu'une partie au moins des séquences également présentes dans la cellule de complémentation est localisée à un endroit différent de son positionnement naturel dans le génome adénoviral parental. Elle a également pour objet une cellule hôte et une particule virale infectieuse le contenant. Enfin, elle concerne une composition pharmaceutique les contenant et leur usage thérapeutique.

Description

NOUVEAUX VECTEURS ADENOVIRAUX
POUR LA THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne en premier lieu de nouveaux vecteurs adénoviraux destinés au transfert de gènes d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte permettant de minimiser le problème de formation de virus réplicatifs lors de leur propagation dans une cellule de complémentation. Elle a également pour objet les cellules hôtes et particules virales infectieuses contenant ces nouveaux vecteurs ainsi qu'une méthode pour préparer ces dernières. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.

La possibilité de traiter les maladies humaines par thérapie génique est passée en quelques années du stade des considérations théoriques à celui des applications cliniques. La grande majorité des protocoles décrits jusqu'à présent met en oeuvre des vecteurs viraux pour transférer et exprimer le gène thérapeutique dans les cellules à traiter. A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés du fait de la simplicité de leur génome. Cependant, outre leur capacité restreinte de clonage, ils présentent deux inconvénients majeurs qui limitent leur utilisation systématique : d'une part, ils infectent majoritairement les cellules en division et d'autre part, du fait de leur intégration au hasard dans le génome de la cellule hôte, le risque de mutagénèse insertionnelle n'est pas négligeable. C'est pourquoi, de nombreuses équipes scientifiques se sont attachées à développer d'autres vecteurs de thérapie génique.

A cet égard, les adénovirus offrent plusieurs avantages qui en font des vecteurs de choix pour une grande variété d'applications. En effet, ils infectent de nombreux types cellulaires, sont non-intégratifs, peu pathogènes et peuvent se repliquer dans les cellules en division ou quiescentes. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb portant plus d'une trentaine de gènes, à la fois des gènes précoces nécessaires à la replication virale et des gènes tardifs de structure (voir Figure 1). Les gènes précoces sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome adénoviral (El à E4 ; E pour early signifiant précoce en anglais). Elles comportent 6 unités transcriptionnelles qui possèdent leurs propres promoteurs, respectivement Pela, E1B, E2B, E2A, E3 et
E4 lorsque l'on parcourt le génome adénoviral dans le sens 5' vers 3'. Les régions E 1, E2 et E4 sont essentielles à la replication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas.

Les gènes tardifs (L1 à L5 , L pour late signifiant tardif en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais). Ce promoteur permet la synthèse d'un long transcrit primaire qui est ensuite maturé en une vingtaine d'ARN messagers (ARNm) à partir desquels sont produites les protéines capsidaires du virion. Le gène codant pour la protéine structurale IX composant la capside est situé à l'extrémité 5' du génome adénoviral et recouvre l'extrémité 3' de la région précoce E1B. L'unité transcriptionnelle de la protéine IX utilise le même signal de terminaison de la transcription que l'unité transcriptionelle
E1B.

Les vecteurs adénoviraux recombinants utilisés à des fins de thérapie génique sont déficients pour la replication afin d'éviter leur dissémination dans l'environnement et l'organisme hote. D'une manière générale, ils dérivent du génome d'un adénovirus par délétion de la majorité de la région El et certains comportent des délétions supplémentaires au niveau des régions E2, E3 et/ou E4 afin d'accroître leur capacité de clonage ou réduire les problèmes d'inflammation liés à l'expression des gènes viraux restants. Les gènes d'intérêt sont introduits dans l'ADN viral à la place de l'une ou l'autre région délétée. Ils ne peuvent être propagés que par transcomplémentation des fonctions adénovirales pour lesquelles ils sont déficients. A l'heure actuelle, les seules lignées cellulaires de complémentation utilisables sont la lignée 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) complémentant la fonction adénovirale El ou des lignées dérivant de cette dernière aptes à transcomplémenter plusieurs fonctions adénovirales El et E4 (Yeh et al., 1996, J. Virol.

70, 559-565 , Wang et al., 1995, Gene Therapy 2, 775-783 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586) ou El et E2 .

La lignée 293 a été obtenue par intégration dans une cellule de rein embryonnaire humain de l'extrémité 5' du génome de l'adénovirus de type 5 (Ad5) et contient des séquences qui se trouvent aussi dans le vecteur recombinant défectif et qui lui sont indispensables comme l'ITR 5', la région d'encapsidation et les séquences codant pour la protéine IX (la partie 3' de la région E1B intégrée dans les cellules 293 ne permet pas la synthèse d'une protéine IX fonctionnelle d'où l'obligation de conserver le gène IX dans les vecteurs). Ceci a pour conséquence la production de particules virales replicatives (RCA) générées par recombinaison entre les séquences adénovirales du vecteur et celles du génome cellulaire. Deux événements de recombinaison au niveau de l'ITR 5' ou la séquence d'encapsidation et les séquences IX suffisent à générer un virus sauvage compétent pour la replication.

La formation de ces particules virales réplicatives constitue un obstacle majeur à l'utilisation des vecteurs adénoviraux en thérapie génique. D'une part du point de vue du concept car il n'est pas envisageable d'administrer une particule capable de se disséminer dans l'organisme ou l'environnement. Et d'autre part, du point de vue de leur production, car il est nécessaire de limiter le nombre de générations lors de la culture de la lignée de complémentation transfectée par le vecteur adénoviral, pour éviter au maximum l'apparition des particules virales réplicatives d'où la difficulté d'obtenir des préparations ayant un titre viral élevé. On imagine aisément les difficultés susceptibles d'être rencontrées lors de la production de lots cliniques non contaminés par une particule RCA.

Le but de la présente invention est précisément de mettre à la disposition du public des vecteurs adénoviraux plus sûrs minimisant le risque de production de particules virales réplicatives tout en permettant le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques. On a maintenant construit de nouveaux vecteurs adénoviraux recombinants déletés des régions El et E3 dans lesquels la séquence codant pour la protéine IX est intégrée à la place de la région E3. Ainsi, en cas de recombinaison entre les séquences IX homologues présentes dans le vecteur et la lignée 293, on favorisera la production d'une particule virale non fonctionnelle pour la région E2 incapable de réplication autonome.

Les vecteurs adénoviraux de la présente invention proposent une solution avantageuse aux inconvénients inhérents à l'utilisation des vecteurs de l'art antérieur. En effet, ils peuvent être propagés dans les cellules de complémentation conventionnelles dérivées de la lignée 293 avec un titre plus élevé compatible avec les besoins industriels et les risques de formation de particules virales réplicatives sont réduits. Ils sont tout particulièrement adaptés à la thérapie génique humaine.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur adénoviral défectif pour la replication capable d'être repliqué dans une cellule de complémentation, qui dérive du génome d'un adénovirus et comprenant une séquence homologue à une séquence intégrée dans ladite cellule de complémentation, caractérisé en ce qu'une partie au moins de ladite séquence homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral de manière à être localisée à un endroit différent de son positionnement naturel dans ledit génome adénoviral.

Un vecteur adénoviral selon l'invention peut dériver d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral de différentes origines. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., 1993, Arch. Virol., 128, 171-176; Spibey et Cavanagh, 1989,
J. Gen. Virol., 70, 165-172 ; Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21-28 ; Mittal et al.,
1995, J. Gen. Virol., 76, 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral dérivé d'un adénovirus humain, de préférence, de sérotype C et, de manière tout à fait préférée, de type 2 ou 5 (Graham et Prevect, 1991, Methods in Molecular
Biology, vol 7, p 109-128 ; Ed : E.J. Murey, The Human Press Inc.).

Au sens de la présente invention, un "vecteur adénoviral défectif pour la replication" désigne un vecteur incapable de replication autonome dans une cellule hôte. Généralement, un tel vecteur est obtenu à partir d'un adénovirus dont le génome a été modifié de manière à rendre non fonctionnels un ou plusieurs gènes viraux essentiels à sa replication. Ces modifications peuvent être diverses (délétion, mutation et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées dans les régions codantes du génome viral ou en dehors de celles-ci, par exemple dans les régions promotrices. La propagation d'un tel vecteur est effectuée dans une cellule de complémentation capable de fournir est (rails la ou les fonction(s) défectueuse(s) c'est à dire de produire les protéines précoces et/ou tardives nécessaires à la constitution d'une particule virale infectieuse. Par "particule virale infectieuse", on entend une particule virale ayant la capacité d'infecter une cellule hôte et d'y faire pénétrer le génome viral.

A titre illustratif, un vecteur adénoviral préféré selon l'invention est dépourvu de la majorité de la région El à l'exception des séquences recouvrant l'unité transcriptionnelle du gène codant pour la protéine IX qui ne peut être complémentée par la lignée 293. Il peut être dépourvu, de manière optionnelle, de la région E3. Cependant, selon un mode avantageux, on préfère conserver la partie de la région E3 codant pour la protéine gp 19k (Gooding et Wold, 1990, Critical
Reviews of Immunology 10, 53-71) placée sous le contrôle de son propre promoteur ou d'un promoteur hétérologue conventionnel. Bien entendu, un vecteur adénoviral selon l'invention peut comprendre des délétions ou mutations supplémentaires de tout ou partie d'autres gènes viraux, notamment au sein des régions E2, E4 et/ou Ll-L5 (voir par exemple la demande internationale WO 94/28152). Pour illuster ce point, on peut citer la mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protein en anglais) de la région E2A (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). Une autre variante ou une combinaison intéressante consiste à déléter la région E4 à l'exception des séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 6 et 7 (ces délétions limitées ne nécessitent pas de complémentation de la fonction E4 ; Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). On aura alors recours à des lignées de complémentation adaptées aux déficiences du vecteur adénoviral selon l'invention, comme la lignée 293 pour complémenter la fonction El ou les lignées dérivées telles que celles citées précédemment pour une double complémentation.

Un vecteur adénoviral selon l'invention est caractérisé en ce qu'une partie ou la totalité des séquences homologues à celles présentes dans la lignée de complémentation est déplacée dans le génome du vecteur adénoviral de sorte qu'elle n'occupe plus la position initiale qu'elle a dans le génome de l'adénovirus parental dont il dérive. Par partie, on entend au moins une centaines de paires de bases et de préférence au moins 0,5 kb. Homologue signifie identique ou suffisamment homologue pour induire un événement de recombinaison intermoléculaire. A titre indicatif, le degré d'homologie entre les séquences adénovirales présentes dans le vecteur et la lignée de complémentation est supérieur à 70 %, avantageusement supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 90 % et, de manière tout à fait préférée, aux environs de 100 %.

Un mode de réalisation avantageux consiste à déplacer tout ou partie des séquences homologues au delà d'un gène essentiel à la replication du vecteur adénoviral selon l'invention. De préférence, les séquences déplacées sont constituées par le gène codant pour la protéine IX, et celui-ci est inséré en 3' de la région E2, plus particulièrement au sein de la région E3. Un vecteur adénoviral préféré est dépourvu des régions El et E3 et comprend une cassette d'expression d'un gène d'intérêt à la place de la région El et le gène codant pour la protéine IX muni de son propre promoteur ou d'un promoteur hétérologue à la place de la région E3. Selon une autre variante, il peut être inséré au niveau de la région E4 ou à la place de cette dernière.

Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un vecteur adénoviral selon l'invention permet de réduire la formation de particules virales réplicatives lors de sa propagation dans la lignée de complémentation adéquate, avantageusement d'un facteur au moins 2, de préférence d'un facteur au moins 5 et, de manière tout à fait préférée d'un facteur au moins 10. Les techniques pour évaluer les particules virales réplicatives dans une préparation adénovirales sont connues de l'homme de l'art. A titre indicatif, on peut procéder selon le protocole décrit à l'exemple 3.

Selon un mode de réalisation préféré, un vecteur adénoviral selon l'invention est recombinant et comprend une séquence nucléotidique exogène placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hote.

"Séquence nucléotidique exogène" fait référence à un acide nucléique qui peut être d'une origine quelconque et qui n'est normalement pas présent dans le génome d'un virus parental en usage dans la présente invention. Dans le cadre de l'invention, la séquence nucléotidique exogène peut-être constituée d'un ou plusieurs gènes et, en particulier, de gène(s) d'intérêt thérapeutique.

D'une manière générale, la séquence nucléotidique exogène peut coder pour un
ARN anti-sens et/ou un ARNm qui sera ensuite traduit en protéine d'intérêt. Elle peut être de type génomique, de type ADN complémentaire (ADNc) ou de type mixte (minigène, dans lequel au moins un intron est délété). Elle peut coder pour une protéine mature ou un précurseur d'une protéine mature, notamment un précurseur destiné à être secrété et comprenant un peptide signal. Par ailleurs, il peut s'agir de tout ou partie d'une protéine telle que trouvée dans la nature (protéine native ou tronquée) ou également d'une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses ou encore mutée présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. De telles protéines peuvent être obtenues par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire.

Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser les gènes codant pour les polypeptides suivants: - cytokines ou lymphokines (interférons cr, ss et y, interleukines et
notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou 1'IL12, facteurs nécrosant des tumeurs
(TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...); - récepteurs cellulaires ou nucléaires, notamment ceux reconnus par des
organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence,
par le virus VIH (Virus de l'Immunodéficience Humain) ou leurs ligands; - protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur VII, facteur VIII,
facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de
croissance (hGH) - enzymes (uréase, rénine, thrombine. ...) - inhibiteurs d'enzymes (al-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de
protéases virales...) - polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement
l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (ARN anti-sens,
anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des
signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de
tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le système Immunltalre. . . . ); - protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou
protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes correspondants - polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou
parasitaire ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des
propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants trans
dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition...) ; - toxines ( thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-I),
ricine, toxine cholérique, diphtérique....) ou immunotoxines; et - marqueurs (p-galactosidase, luciférase ).

Il est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.

Par ailleurs, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut, en outre, comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées. On peut citer les gènes széo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol
Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine
Guanine Phosphoribosyl Transferase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art.

Par éléments nécessaires à l'expression d'une séquence nucléotidique exogène dans une cellule hôte, on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en
ARN (ARN anti-sens ou ARNm) et la traduction d'un ARNm en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question.

Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous
Sarcoma Virus), du gène TK du virus HSV-1, précoce du virus SV40 (Simian
Virus 40), adénoviral MLP . . ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes
PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, al-antitrypsine (foiespécifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique).

Bien entendu, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut en outre comprendre des éléments additionnels nécessaires à l'expression (séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatrice de la transcription, site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre....) ou encore à sa maintenance dans la cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art.

L'invention a également trait à une particule virale infectieuse ainsi qu'à une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur adénoviral selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine et peut comprendre ledit vecteur sous forme non intégrée ou également intégrée dans le génome. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopolétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage ...), musculaire, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.

Une particule virale infectieuse selon l'invention peut être préparée selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art (Graham et Prevect, 1991, st < pra), par exemple, par co-transfection d'un vecteur et d'un fragment adénoviral dans une cellule appropriée ou encore par le moyen d'un virus auxiliaire fournissant eii traszs les fonctions virales non fonctionnelles. Il est également envisageable de générer le vecteur viral in vid o dans Lscherichia coli (E. coli) par ligation ou encore recombinaison homologue (voir par exemple la demande française 94
14470).

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral selon l'invention, selon lequel
(i) on introduit ledit vecteur adénoviral dans une cellule de
complémentation capable de complémenter en (raïs ledit vecteur,
de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des
conditions appropriées pour permettre la production de ladite
particule virale infectieuse, et
(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture
cellulaire.

Bien entendu, la particule virale infectieuse peut etre récupérée du surnageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Selon un mode de réalisation avantageux, on met en oeuvre (i) un vecteur adénoviral délété de tout ou partie des régions El et E3 à l'exception des séquences recouvrant le gène codant pour la protéine IX, et (ii) la cellule de complémentation 293.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur adénoviral, une particule virale infectieuse ou une cellule hôte eucaryote selon l'invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention est, en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que
- des maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabète ou
myopathie, celle de Duchêne et de Becker...),
- des cancers, comme ceux induits par des oncogènes ou des virus,
- des maladies virales, comme l'hépatite B ou C et le SIDA
(syndrome de l'immunodéficience acquise résultant de l'infection
par le VIH), et
- des maladies virales récurrentes, comme les infections virales
provoquées par le virus de l'herpès.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support tel qu'un diluant. Une composition selon l'invention peut etre administrée par voie locale, systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. En particulier, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 1013 ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. La formulation peut également inclure un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Enfin, la présente invention est relative à l'usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral, d'une particule virale infectieuse ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement liz vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter isz vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient.

L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur adénoviral, d'une particule virale ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.

La présente invention est plus complètement décrite en référence aux Figures suivantes et à l'aide des exemples suivants.

La Figure 1 est une représentation schématique du génome de I'adénovirus humain de type 5 (représenté en unités arbitraires de O à 100), indiquant l'emplacement des différents gènes.

La Figure 2 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5663 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et des séquences codant pour la protéine IX.

La Figure 3 est une représentation schématique du vecteur pTG8343 comprenant
I'extrémité 5' du génome de l'Ad5 délétée d'une partie de la région El (nt 459 à 3327).

La Figure 4 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5665 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation sens).

La Figure 5 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5664 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation antisens).

La Figure 6 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5668 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - gène IL2 SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation anti sens).

La Figure 7 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG5669 délété de la région El (remplacée par une cassette CMV promoteur - gène IL2 SV40 polyA) et de la région E3 (remplacée par les séquences codant pour la protéine IX en orientation sens).

EXEMPLES
Les exemples suivants n'illustrent qu'un mode de réalisation de la présente invention.

Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial.

Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.

166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'L coli (Klenow). Les techniques d'amplification par PCR (Polymérase Chain Reaction) sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990, édité par Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc).

En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al., supra), mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran,
I'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes. Quant aux conditions de culture, elles sont classiques. Dans les exemples qui suivent, on a recours à la lignée cellulaire 293 (Graham et al, 1977, supra, disponible à l'ATCC sous la référence
CRL1573). Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées.

Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés da
On utilise tout d'abord le vecteur pTG6580 dont la construction est décrite dans la demande internationale WO 94/28152 (exemple 2). Celui-ci comprend dans une structure p poly II (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201), l'ITR 5' et la séquence d'encapsidation de l'AdS (nucléotides (nt) 1 à 458), le promoteur MLP de l'adénovirus 2, un polylinker utilisable pour le clonage d'un gène d'intérêt, le signal de terminaison de la transcription du virus SV40 (nt 2543 à 2618 du génome SV40 tel que divulgué dans Genbank sous la référence J02400) suivis des séquences de l'Ad5 allant des nt 4047 à 6241. Le fragment BamHI BstXl de pTG6580 porteur des séquences poly A SV40 et adénovirales (nt 4047 à environ 4790) est purifié et introduit dans le vecteur pTG5623 préalablement digéré par ces mêmes enzymes. Ce dernier diffère de pTG6580 en ce qu'il comprend le promoteur CMV (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 659-663) à la place du
MLP et les séquences Ad5 des nucléotides 3328 à 5788 au lieu du fragment 4047 à 6241. On obtient pTG5654 qui porte les séquences AdS 1 à 458, le promoteur
CMV, le polylinker, le poly A de SV40 et les séquences Ad5 4047 à 5788 dépourvues du gène codant pour la protéine IX.

Puis on construit un adénovirus E l-pIX par recombinaison homologue. On utilise à cet effet le vecteur pTG3602 qui résulte du clonage du génome de 1'Ad5 dans le p poly II (décrit dans la demande française 94 14470 , exemple 1). Les cellules E.

coli BJS 183 sont cotransformées par le fragment PacI et BstEII de pTG5654 et le vecteur pTG3602 linéarisé par ClaI pour générer pTG5663 (Figure 2). Celui-ci correspond aux séquences Ad5 délétées de la région El et du gène codant pour la protéine IX et comprend à leur place la cassette promoteur CMV, polylinker et poly A de SV40.

B. Cloizage du géize codant pour la protéine pIX au nivemr de la région E3
d'itiz vecteur adészoviral.

On part du vecteur pTG8343 lequel provient de l'insertion dans p polyII d'une partie de l'extrémité 5' du génome de l'AdS, à savoir les séquences s'étendant des nucléotides 1 à 458 et 3328 à 5788 (Figure 3). On purifie de ce dernier le fragment BglII-BssHII porteur des séquences pIX (nt 3328 à 4105). Après action de la
Klenow pour rendre les extrémités franches, il est inséré dans le site BgIII (également traité à la Klenow) du vecteur pTG4664 décrit dans la demande française 95 08946. A titre indicatif, ce dernier comporte le fragment adénoviral Kpiii-HpaI (nt 25838 à 32004) délété de la majorité de la région E3 (nt 27871 à 30748). On obtient les vecteurs pTG5659 et pTG5660 selon l'orientation du gène pIX.

Le gène pM: est intégré dans un contexte adénoviral par recombinaison homologue dans la souche BJ5183 cotransformée avec le vecteur pTG5663 clivé par SfrI et le fragment Apai de pTG5659 ou pTG5660, pour donner respectivement pTGS66S ou pTG5664 (Figures 4 et 5).

Après transfection dans la lignée 293, on obtient des virus indiquant que la séquence pIX est fonctionnelle hors de son contexte génomique.

EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur adénoviral recombinant comprenant
le gène codant pour l'IL-2 à la place de la region El et celui
codant pour la protéine IX à la place de la région E3.

Le clonage de la séquence ADNc codant pour 1'IL2 a été initialement publiée par Taniguchi et al. (1983, Nature 302, 305). Les séquences codant pour 1'IL-2 humaine sont isolées des vecteurs de l'art antérieur par les techniques conventionnelles de la biologie moléculaire (par exemple pTG26 décrit dans la demande française 85 09480). L'homme du métier est en mesure de générer des amorces PCR adéquates incluant des sites de restriction appropnés.

Les séquences IL-2 munies de sites francs à chaque extrémité sont insérées dans le vecteur pTG5664 clivé par BgnI et traité par la Klenow, pour donner pTG5662.

Ce dernier comporte les séquences Ad5 1 à 458 suivies de la cassette "promoteur
CMV, gène IL-2 humain et poly A SV40" et du fragment adénoviral 4047 à 5788.

On génère le vecteur pTG5667 par recombinaison homologue dans la souche E.

coli BJ5183 entre le vecteur pTG3602 linéarisé par Clal et le fragment PacI Bstl DII issu de pTG5662. Enfin, on procède à une dernière étape de recombinaison homologue entre le vecteur pTG5667 clivé par SftI et le fragment Apal obtenu de pTG5659 ou pTG5660. On obtient les vecteurs pTG5668 et pTG5669 (Figures 6 et 7) qui portent l'ITR 5', la région d'encapsidation de l'AdS, la cassette d'expression de l'lL-2 et les séquences adénovirales 4047 à 35935 délétées de la région E3 à la place de laquelle est intégré le gène codant pour la protéine pIX. Ces deux vecteurs diffèrent par l'orientation de ce dernier.

Après transfection dans les cellules 293 sous forme de fragments PacI, on constitue un stock viral qui sera réparti en doses de lO8 à 10'0 pfu utilisables dans le cadre de traitement anti-cancéreux. Le titre peut être déterminé par les techniques classiques comme la méthode agar, et la présence de RCA recherchée selon la technique indiquée ci-après.

EXEMPLE 3 Recherche de particules virales réplicatives
Des cellules non permissives (incapables de complémentation) et sensibles à l'infection par un adénovirus, comme par exemple les cellules A549 (ATCC CCLl85) sont mises en culture et maintenues selon les conditions standards.

Lorsqu'elles atteignent la confluence, le milieu de culture est éliminé et remplacé par un milieu contenant une dose de la préparation adénovirale à tester en respectant une multiplicité d'infection (MOI) comprise entre 1 et 10 (premier passage). Après 90 min d'infection, le milieu est changé et la culture poursuivie de manière classique pendant une quinzaine de jours. La présence de particules virales réplicatives est detectée par l'apparition d'effets cytopathiques. On procède à un nouveau passage sur cellules sensibles du lysat cellulaire recueilli après le premier passage. Pour ce faire, le culot cellulaire est soumis à deux cycles de congelation/ décongelation avant d'être utilisé pour infecter des cellules A459 fraîches. Après 90 minutes d'adsorption, la culture est remise dans du milieu frais et la cytopathie à nouveau observée pendant 6 à 8 jours. Une absence de cytopathie reflète une absence de particules virales réplicatives dans la dose de virus destinée à être administrée. Un témoin positif est constitué par une dose équivalente de la préparation adénovirale contaminée par un virus sauvage Ad5.

Il est également possible de detecter les RCA par PCR à partir de l'ADN isolé d'une dose de la préparation virale à l'aide d'amorces spécifiques de la région El, celle-ci étant normalement absente des vecteurs adénoviraux. L'amplification d'un fragment El spécifique indique la présence de virus sauvages.

Claims (17)

Revendications

1. Vecteur adénoviral défectif pour la replication capable d'être repliqué dans une

cellule de complémentation, qui dérive du génome d'un adénovirus et

comprenant une séquence homologue à une séquence intégrée dans ladite cellule

de complémentation, caractérisé en ce qu'une partie au moins de ladite séquence

homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral de manière à être localisée

à un endroit différent de son positionnement naturel dans ledit génome

adénoviral.

2. Vecteur adénoviral selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite partie

au moins de la séquence homologue est déplacée dans ledit vecteur adénoviral

de manière à être localisée en 3' d'un gène essentiel à sa replication.

3. Vecteur adénoviral selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite partie

au moins de la séquence homologue est localisée dans ledit vecteur adénoviral

à la place de la région E3.

4. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que

ladite partie au moins de la séquence homologue est constituée par le gène

codant pour la protéine IX d'un adénovirus.

5. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il

dérive du génome d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine,

murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des

fragments de génome adénoviral de différentes origines.

6. Vecteur adénoviral selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il dérive du

génome d'un adénovirus humain de type 5.

7. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il

est au moins dépourvu de tout ou partie de la région El.

8. Vecteur adénoviral selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est en outre

dépourvu de tout ou partie de la région E3.

9. Vecteur adénoviral selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il est en

outre dépourvu de tout ou partie d'une ou plusieurs régions sélectionnées parmi

les régions E2, E4, L1, L2, L3, L4 et L5.

10. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il

comprend une séquence nucléotidique exogène placée sous le contrôle des

éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte.

11. Vecteur adénoviral selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence

nucléotidique exogène est sélectionnée parmi les gènes codant pour une

cytokine, un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de

coagulation, la protéine CFTR, I'insuline, la dystrophine, une hormone de

croissance, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un polypeptide à effet anti

tumoral, un polypeptide capable d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire

ou virale et, notamment le VIH, un anticorps, une toxine, une immunotoxine et

un marqueur.

12. Particule virale infectieuse comprenant un vecteur adénoviral selon l'une des

revendications 1 à 11.

13. Cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur adénoviral selon l'une des

revendications 1 à 11 ou une particule virale infectieuse selon la revendication

12.

14. Procédé de préparation d'une particule virale infectieuse selon la revendication

12, selon lequel:

(i) on introduit un vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à

11 dans une cellule de complémentation capable de complémenter en

tratîs ledit vecteur adénoviral pour obtenir une cellule de

complémentation transfectée

(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des

conditions appropriées pour permettre la production de ladite

particule virale infectieuse, et

(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture

cellulaire.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que (i) ledit vecteur

adénoviral est délété de tout ou partie de la région El à l'exception des

séquences recouvrant le gène codant pour la protéine IX, de tout ou partie de

la région E3 et comprend lesdites séquences codant pour la protéine IX localisée

à la place de la région E3 et (ii) ladite cellule de complémentation est la lignée

293.

16. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur adénoviral selon l'une des

revendications 1 à 11, une particule virale infectieuse selon la revendication 12

ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la

revendication 14 ou 15 ou une cellule hôte eucaryote selon la revendication 13,

en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

17. Usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur adénoviral selon l'une des

revendications 1 à 11, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 12

ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de préparation selon la

revendication 14 ou 15 ou d'une cellule hôte eucaryote selon la revendication 13,

pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou

animal par thérapie génique.