FR2737221A1 - Nouveaux vecteurs viraux pour la therapie genique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux dans lesquels l'expression des gènes viraux est régulée de manière à être fonctionnelle dans une cellule de complémentation et non-fonctionnelle dans une cellule hôte ainsi que les particules virales et les cellules hôtes contenant ces nouveaux vecteurs. Elle a également pour objet une cellule de complémentation comprenant un régulateur de l'expression des gènes viraux ainsi qu'un procédé de préparation de particules virales infectieuses. Enfin, elle concerne une composition pharmaceutique les contenant et leur usage thérapeutique.

Description

Nouveaux vecteurs viraux pour la thérapie génétique.

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression de gènes d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte, l'expression des gènes viraux étant régulée de manière à être fonctionnelle dans une cellule de complémentation et non-fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme hôte. Elle a également pour objet les cellules contenant ces nouveaux vecteurs ainsi qu'une méthode pour préparer des particules virales infectieuses destinées à un usage thérapeutique. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.

La possibilité de traiter les maladies humaines par thérapie génique est passée en quelques années du stade des considérations théoriques à celui des applications cliniques. Le premier protocole appliqué à l'homme a été initié aux
Etats Unis en septembre 1990 sur un patient génétiquement immunodéficient en raison d'une mutation affectant le gène codant pour l'Adénine Désaminase (ADA). Le succès relatif de cette première expérimentation a encouragé le développement de nouveaux protocoles de thérapie génique pour diverses maladies génétiques ou acquises (maladies infectieuses et notamment virales comme le SIDA ou cancers). La grande majorité des protocoles décrits jusqu'à présent met en oeuvre des vecteurs viraux pour transférer et exprimer le gène thérapeutique dans les cellules à traiter.

A ce jour, les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés du fait de la simplicité de leur génome. Cependant, outre leur capacité restreinte de clonage, ils présentent deux inconvénients majeurs qui limitent leur utilisation systématique : d'une part, ils infectent majoritairement les cellules en division et d'autre part, du fait de leur intégration au hasard dans le génome de la cellule hôte, le risque de mutagénèse insertionnelle n'est pas négligeable. C'est pourquoi, de nombreuses équipes scientifiques se sont attachées à développer d'autres types de vecteurs, parmi lesquels on peut citer ceux issus des adénovirus, virus associés aux adénovirus (AAV), cytomégalovirus, poxvirus et virus de l'herpès. D'une manière générale, leur organisation et leur cycle d'infection sont largement décrits dans la littérature accessible à l'homme de l'art.

A cet égard, l'emploi des vecteurs adénoviraux est apparu comme une alternative prometteuse. Les adénovirus ont été mis en évidence dans de nombreuses espèces animales, ont un large spectre d'hôtes, sont peu pathogènes et ne présentent pas les inconvénients liés aux rétrovirus puisqu'ils sont nonintégratifs et se repliquent également dans les cellules quiescentes. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb portant plus d'une trentaine de gènes, à la fois des gènes précoces nécessaires à la replication virale et des gènes tardifs de structure (voir
Figure 1).

Les gènes précoces sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome adénoviral (El à E4 ; E pour early signifiant précoce en anglais). Elles comportent 6 unités transcriptionnelles qui possèdent leurs propres promoteurs.

Les gènes tardifs (L1 à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) recouvrent en partie les unités de transcription précoces et sont, pour la plupart, transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais) .

A l'heure actuelle, tous les vecteurs adénoviraux utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dépourvus de la majeure partie de la région El essentielle à la replication, afin d'éviter leur dissémination dans l'environnement et l'organisme hôte. Certains comportent des délétions supplémentaires, notamment dans la région E3 non essentielle, permettant d'accroître leur capacité de clonage. Les gènes d'intérêt sont introduits dans l'ADN viral à la place de l'une ou l'autre région délétée. La délétion de la région El rend le génome viral déficient pour la replication. Cependant, les virus El- peuvent être propagés dans une lignée cellulaire de complémentation, qui fournit en trans les fonctions virales délétées pour générer une particule virale infectieuse.On utilise couramment la lignée 293, établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al., 1977, J.

Gen. Virol. 36, 59-72). La région E3 est non essentielle et ne nécessite pas d'être complémentée.

Si la faisabilité du transfert de gènes en utilisant ces vecteurs de première génération est maintenant bien établie, la question de leur innocuité reste posée.

Outre les aspects de sécurité (risque de générer des RCA c'est à dire des particules compétentes pour la replication), se pose le problème de leur toxicité.

En effet, les premiers essais cliniques ont mis en évidence l'induction de réponses inflammatoires liées à l'expression des gènes viraux chez l'hôte.

Des vecteurs adénoviraux de seconde génération ont récemment été proposés dans la littérature. Ils conservent les régions en cis nécessaires à la replication du virus dans la cellule infectée (ITRs et séquences d'encapsidation) et comportent des délétions internes importantes visant à supprimer l'essentiel des gènes viraux dont l'expression in vivo n'est pas souhaitable. Cependant, ces vecteurs de l'art antérieur présentent certains inconvénients qui limitent leur exploitation à un niveau industriel. Il est, en effet, nécessaire de disposer de nouvelles lignées complémentant l'ensemble des fonctions délétées et permettant la production de particules virales à un titre élevé.Or il est à craindre que les cellules de complémentation co-exprimant plusieurs régions adénovirales potentiellement toxiques, comme El, E2 et/ou E4, ne soient pas optimales en terme de capacité de croissance et rendement en particules virales.

La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. On a maintenant construit de nouveaux vecteurs adénoviraux délétés de la majorité des régions
El et E3, dans lesquels les unités transcriptionnelles des régions virales restantes (E2, E4 et/ou L1-L5) sont régulables afin de permettre leur expression lorsqu'il s'agit de générer les particules virales infectieuses et de l'inhiber dans la cellule hôte. Dans les exemples qui suivent, la régulation est assurée par les séquences dîtes "opérateurs" de l'opéron bactérien tétracycline. Leur insertion en 5' de la
TATA box génère un promoteur à partir duquel le niveau de transcription basal est minime mais peut être fortement stimulé en présence d'un inducteur. Ainsi, la production des protéines virales est activée dans une lignée 293 exprimant l'inducteur, ce qui permettra de constituer les particules virales infectieuses.Par contre, elle est considérablement réduite dans la cellule hôte infectée qui ne produit pas naturellement l'inducteur d'origine bactérienne. La régulation des gènes viraux est sans conséquence sur l'expression de la séquence nucléotidique exogène placée sous la dépendance d'un promoteur ne répondant pas à la tétracycline.

Les vecteurs adénoviraux de la présente invention proposent une solution avantageuse aux inconvénients inhérents à l'utilisation des vecteurs de l'art antérieur, puisqu'ils combinent sécurité d'emploi et facilité de production. D'une part, ils peuvent être propagés dans une lignée de complémentation conventionnelle avec un titre élevé compatible avec les besoins industriels et, d'autre part, ils permettent de transférer une séquence nucléotidique exogène in vivo, de l'exprimer de manière stable tout en limitant les effets nocifs (réponses inflammatoires chez l'hôte). Ils sont tout particulièrement adaptés à la thérapie génique humaine.

C'est pourquoi la présente invention invention a pour objet un vecteur viral, caractérisé en ce qu'il comprend une unité d'expression comportant un ou plusieurs gènes viraux ; ladite unité d'expression étant fonctionnelle dans une cellule de complémentation et non fonctionnelle dans une cellule hôte.

Au sens de la présente invention, un "vecteur viral" est obtenu à partir d'un virus parental dont le génome a été modifié. Ces modifications peuvent être diverses (délétion, mutation et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées dans les régions codantes du génome viral ou en dehors de celles-ci, par exemple dans les régions promotrices. A titre indicatif, certaines séquences virales peuvent être délétées, rendues non fonctionnelles ou substituées par d'autres séquences et, notamment, une séquence nucléotidique exogène dont l'expression est recherchée dans une cellule hôte.

Un vecteur viral selon l'invention, peut dériver de virus très divers, comme les virus de l'herpès, cytomégalovirus, AAV (virus associé à l'adénovirus), poxvirus et notamment virus de la vaccine, fowlpox ou canarypox. De tels vecteurs ainsi que leurs techniques de préparation sont connus de l'homme de l'art.

Cependant, un vecteur particulièrement adapté à la présente invention est un vecteur adénoviral. Il peut dériver d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral de différentes origines. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine,
DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., 1993, Arch. Virol., 128, 171-176 ; Spibey et Cavanagh, 1989, J. Gen.

Virol., 70, 165-172 ; Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21-28 ; Mittal et al., 1995, J. Gen. Virol., 76, 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral dérivé d'un adénovirus humain, de préférence, de sérotype C et, de manière tout à fait préférée, de type 2 ou 5 (Graham et Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109-128 ; Ed : E.J. Murey, The Human Press Inc.).

Un mode de réalisation avantageux de la présente invention consiste en un vecteur défectif pour la replication dans lequel un ou plusieurs gènes viraux nécessaires à la replication sont délétés ou rendus non fonctionnels. Un tel vecteur, incapable de replication autonome, sera propagé dans une cellule de complémentation. Le terme "cellule de complémentation" désigne une cellule capable de fournir en trans la ou les fonction(s) pour la(les)quelle(s) un vecteur selon l'invention est défectif. En d'autres termes, elle est capable de produire la ou les protéine(s) nécessaires à la replication et à l'encapsidation dudit vecteur, protéines précoces et/ou tardives, qu'il ne peut lui même produire et qui sont nécessaires à la constitution d'une particule virale infectieuse.A titre illustratif, un vecteur adénoviral préféré selon l'invention étant dépourvu de la majorité de la région El, on aura recours à une cellule de complémentation telle que la lignée 293 capable de fournir en trans l'ensemble des protéines codées par la région El que le vecteur ne peut produire. Par "particule virale infectieuse", on entend une particule virale ayant la capacité d'infecter une cellule hôte et d'y faire pénétrer le génome viral.

Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel, un vecteur viral selon l'invention est recombinant. Ainsi, il comprendra une séquence nucléotidique exogène placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte. "Séquence nucléotidique exogène" fait référence à un acide nucléique qui peut être d'une origine quelconque et qui n'est normalement pas présent dans le génome d'un virus parental en usage dans la présente invention ou, s'il est présent, dans un contexte génomique différent. Dans le cadre de l'invention, la séquence nucléotidique exogène peut-être constituée d'un ou plusieurs gènes et, en particulier, de gène(s) d'intérêt thérapeutique.

D'une manière générale, la séquence nucléotidique exogène peut coder pour un
ARN anti-sens et/ou un ARNm qui sera ensuite traduit en protéine d'intérêt.

Elle peut être de type génomique, de type ADN complémentaire (ADNc) ou de type mixte (minigène, dans lequel au moins un intron est délété). Elle peut coder pour une protéine mature ou un précurseur d'une protéine mature, notamment un précurseur destiné à être secrété et comprenant un peptide signal. Par ailleurs, il peut s'agir de tout ou partie d'une protéine telle que trouvée dans la nature (protéine native ou tronquée) ou également d'une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses ou encore mutée présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. De telles protéines peuvent être obtenues par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire.

Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser les gènes codant pour les polypeptides suivants: - cytokines ou lymphokines (interférons a, ss et y, interleukines et
notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou l'IL-12, facteurs nécrosant des
tumeurs (INF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M CSF...); - récepteurs cellulaires ou nucléaires (récepteurs reconnus par des
organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence,
par le virus VIH (Virus de 1'Immunodéficience Humain) ou leurs
ligands;; - protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur VII, facteur
VIII, facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator),
hormones de croissance (HGF) - enzymes (uréase, rénine, thrombine....) - inhibiteurs d'enzymes (al-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de
protéases virales...) - polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins
partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (ARN
anti-sens, anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division
cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes
suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le
système immunitaire....) - protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou
protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes
correspondants; - polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou
parasitaire et/ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des
propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants trans
dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par
compétition...) ; - toxines ( thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1),
ricine, toxine cholérique, diphtérique ) ou immunotoxines ; et - marqueurs tss-galactosidase, luciférase....).

I1 est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.

Par ailleurs, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut, en outre, comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol
Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribesyl Transferase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art.

Par éléments nécessaires à l'expression d'une séquence nucléotidique exogène dans une cellule hôte, on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN (ARN anti-sens ou ARNm) et la traduction d'un ARNm en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question. On préférera employer un promoteur différent de celui inclu dans l'unité d'expression des gènes viraux (définie ci-après).Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs des gènes TK-HSV-1, PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, al-antitrypsine (foie-spécifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus 40), un LTR rétroviral, ou encore le promoteur adénoviral MLP, notamment de l'adénovirus humain de type 2.

Bien entendu, une séquence nucléotidique exogène en usage dans la présente invention peut en outre comprendre des éléments additionnels nécessaires à l'expression (séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatrice de la transcription, site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre....) ou encore à sa maintenance dans la cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art.

Comme indiqué précédemment, un vecteur viral selon la présente invention comprend une unité d'expression comportant un ou plusieurs gènes viraux et ayant la caractéristique intéressante d'être fonctionnelle dans une cellule de complémentation et non fonctionnelle dans une cellule hôte. Par "fonctionnelle", on entend une expression des gènes viraux en quantité suffisante et pendant un temps suffisamment long, pour permettre la constitution d'une particule virale infectieuse. Par "non fonctionnelle", on entend une expression des gènes viraux réduite (de préférence d'au moins un facteur 10, voire même nulle) par rapport à leur niveau d'expression dans le virus parental.Le caractère fonctionnel se manifeste par la production des produits des gènes viraux inclus dans l'unité d'expression, ceuxci pouvant être mis en évidence par les techniques classiques de biologie moléculaire, d'immunologie, de biochimie ou d'enzymologie. Le caractère non fonctionnel se manifeste par l'absence de production ou encore par la production des produits viraux à un niveau atténué.

Avantageusement, ladite unité d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de régulation hétérologue(s) non présente(s) dans l'ADN viral parental. On peut avoir recours à des séquences répondant à un régulateur de type répresseur agissant de manière négative sur l'expression ou, de préférence, à un régulateur de type inducteur exerçant une action positive. Une séquence de régulation mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut être d'une origine quelconque, virale, procaryote ou encore eucaryote. D'une manière générale, les séquences de régulation sont décrites dans la littérature accessible à l'homme de l'art. Il peut également s'agir d'un homologue dont la séquence est modifiée par rapport à la séquence native mais exerçant une fonction de régulation similaire ou améliorée.Ces modifications peuvent résulter de l'addition, de la délétion et/ou de la substitution d'un ou plusieurs nucléotides.

Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, une séquence de régulation est susceptible de moduler l'expression des gènes viraux à différents niveaux : transcription, élongation, transport, stabilité des ARNm ou encore traduction. Elle peut être présente à des endroits divers de ladite unité d'expression, par exemple, dans le promoteur surtout lorsque son effet se situe au niveau de la transcription (de préférence en amont de la TATA box jusqu'à plusieurs centaines de paires de bases de celle-ci) ou dans les séquences transcrites (et si possible non codantes) lorsque son action s'exerce à une étape ultérieure de la transcription. On peut mettre en oeuvre de 1 à 25 séquences de régulation, avantageusement, de 1 à 20, de préférence, de 1 à 10 et, de manière tout à fait préférée, de 1 à 7.

Au sens de la présente invention, le terme "inducteur" désigne une molécule qui a la capacité d'initier ou d'activer l'expression des gènes viraux placés sous la dépendance d'une séquence de régulation, soit directement par liaison à ladite séquence de régulation soit indirectement par l'intermédiaire d'autres facteurs cellulaires ou viraux. Il peut également empêcher l'action d'un répresseur. A contrario, un "répresseur", a la capacité d'inhiber ou de bloquer l'expression des gènes viraux placés sous la dépendance d'une séquence de régulation sur laquelle il agit et ceci soit directement ou indirectement.

On peut illuster ces définitions par l'exemple de l'opéron lactose (lac). Le gène lacI code pour un répresseur qui se fixe à une courte séquence de régulation dîte "opérateur" empêchant ainsi la transcription des gènes structuraux codant pour les enzymes de la chaîne métabolique du lactose. En présence de l'inducteur, celui se fixe au répresseur et le transforme en forme inactive qui ne peut plus se lier à l'opérateur permettant ainsi à la transcription de se dérouler.

Il est également envisageable d'utiliser des portions ou des analogues de ces régulateurs afin d'améliorer leur efficacité ou modifier leur spécificité (par exemple l'anhydro tétracycline dix fois plus efficace que la tétracycline pour inhiber la transcription à partir d'un promoteur comprenant les séquences de régulation dérivant de l'opéron tétracycline ou le transactivateur reverse décrit récemment par Gossen et al., 1995, Science, 268, 1766-1769). Par ailleurs, un régulateur en usage dans la présente invention peut être une protéine hybride provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses. Une combinaison préférée consiste en un polypeptide capable de reconnaître ou lier une séquence de régulation en usage dans la présente invention (par exemple dérivé du répresseur tetracycline (tet R) ou estrogène ER) et un polypeptide capable d'activer l'expression (par exemple le domaine d'activation des protéines Gal4 ou VP16 capable d'interagir avec les facteurs de transcription).

Le tableau 1 suivant cite quelques unes des séquences de régulation et régulateurs utilisables dans le cadre de la présente invention

Origine <SEP> des <SEP> séquences <SEP> régulatrices <SEP> Inducteur(+)/ <SEP> Site <SEP> d'insertion <SEP> # <SEP> Référence <SEP> bibliographique
<tb> Répresseur(-)
<tb> MRE(Metal <SEP> Responsive <SEP> Element) <SEP> ions <SEP> métalliques(+) <SEP> 5'TATA <SEP> Makarov <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1994, <SEP> Nucleic <SEP> Acids <SEP> Res. <SEP> 22, <SEP> 1504-1505
<tb> gène <SEP> métallothionéine
<tb> opéron <SEP> tryptophane <SEP> tryptophane(-) <SEP> 5'TATA <SEP> Yanofsky <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1981, <SEP> Nucleic <SEP> Acids <SEP> Res.<SEP> 9, <SEP> 6647-6668
<tb> opérateur <SEP> lac <SEP> produit <SEP> du <SEP> gène <SEP> lacI(-) <SEP> 5'TATA <SEP> Miller <SEP> et <SEP> Reznikoff <SEP> (Eds), <SEP> The <SEP> operons <SEP> (Cold <SEP> Spring <SEP> Harbor <SEP> Laboratory,
<tb> New <SEP> York
<tb> opérateur <SEP> tet <SEP> protéine <SEP> VP16-TetR(+) <SEP> 5'TATA <SEP> Gossen <SEP> et <SEP> Bujard, <SEP> 1992, <SEP> Proc. <SEP> Natl. <SEP> Acad. <SEP> Sci. <SEP> USA <SEP> 89, <SEP> 5547-5551
<tb> opérateur <SEP> tet <SEP> TetR(-) <SEP> 3'TATA <SEP> Kim, <SEP> 1955, <SEP> J. <SEP> Virol.<SEP> 69, <SEP> 2565-2573
<tb> TAR <SEP> (Trans-activation <SEP> Responsive <SEP> TAT(+) <SEP> 5'séquence <SEP> Steffy <SEP> et <SEP> Wong-Staal, <SEP> 1991, <SEP> Microbiological <SEP> Reviews <SEP> 55, <SEP> 193-205
<tb> Region) <SEP> transcrite
<tb> RRE <SEP> (REV <SEP> Responsive <SEP> Element) <SEP> REV(+) <SEP> 3'séquence <SEP> Steffy <SEP> et <SEP> Wong-Staal, <SEP> 1991, <SEP> Microbiological <SEP> Reviews <SEP> 55, <SEP> 193-205
<tb> transcrite
<tb> GRE <SEP> (Glucocorticoïd <SEP> Responsive <SEP> Glucocorticoïde(+) <SEP> 5'TATA <SEP> Israel <SEP> et <SEP> Kaufman, <SEP> 1989, <SEP> Nucleic <SEP> Acids <SEP> Res. <SEP> 17, <SEP> 4589-4604
<tb> Element)
<tb> PRE <SEP> (Progesterone <SEP> Responsive <SEP> Progestérone(+) <SEP> 5'TATA <SEP> Gronemeyer <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1987, <SEP> EMBO <SEP> J.<SEP> 6, <SEP> 3985-3994
<tb> Element)
<tb> USA <SEP> Gal4 <SEP> (Upstream <SEP> Activation <SEP> Gal4(+) <SEP> 5'TATA <SEP> Webster <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1988, <SEP> Cell <SEP> 52, <SEP> 169-178
<tb> Sequence <SEP> Gal <SEP> 4)
<tb> ERE <SEP> (Estrogen <SEP> Responsive <SEP> Estrogène <SEP> (+) <SEP> 5'TATA <SEP> Klein-Hitpass <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1986, <SEP> Cell <SEP> 46, <SEP> 1053-1061
<tb> Element)
<tb> # Le site d'insertion n'est donné qu'à titre indicatif mais non limitatif
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise des séquences de régulation dérivant de l'opéron bactérien tétracycline désignées dans la littérature "opérateur" (tet O). D'une manière générale, l'opéron de résistance à la tétracycline est codé par le transposon TnlO (Hillen et al., 1984,
J. Mol. Biol. 172, 185-201).La régulation est assurée par une courte séquence nucléotidique dite "opérateur" (tet O) qui constitue un site de fixation de divers régulateurs. Ainsi, la fixation du répresseur tétacycline (tet R) ou de l'antibiotique tétracycline diminue considérablement le niveau de transcription.

Au contraire, un effet d'activation est obtenu en mettant en oeuvre une protéine, désignée dans la littérature "trans-activateur tétracycline (tTA)" qui résulte de la fusion entre le tet R et les 130 acides aminés C-terminaux du domaine d'activation de la protéine VP16 du virus simplex de l'herpès. Gossen et
Boujard (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551) ont récemment montré que ce système de régulation est fonctionnel dans les cellules eucaryotes.

L'expression d'un gène reporter placé sous le contrôle de plusieurs copies de tet
O en amont de séquences de base de la transcription (TATA box, site d'initiation de la transcription..) est détectable par co-expression du tTA et inhibée par ajout de tétracycline. Quant au groupe de Kim (1995, J. Virol. 69, 2565-2573), il utilise les séquences tet O positionnées en aval de la TATA box d'un promoteur et, dans ce cas, la transcription est inhibée par action de tetR.

Dans le cadre de la présente invention, on préfère tout particulièrement la combinaison "tet O - promoteur minimal" (dans le sens 5' vers 3') donnant lieu à un promoteur dont le niveau de base de la transcription est naturellement très faible mais activable par l'inducteur tTA et répressible par la tétracycline.

Cependant, il est également possible d'utiliser un promoteur dans lequel les séquences tet O sont placées en 3' de la "TATA box" ou encore de part et d'autre de celle-ci, répressible par un répresseur comprenant les séquences du tet R reconnaissant tet O.

S'agissant de la variante préférée, un vecteur adénoviral selon l'invention est, de préférence, constitué par le génome d'un adénovirus dépourvu de tout ou partie de la région El et, de manière alternative, de tout ou partie de la région
E3. Avantageusement, on préfère conserver une partie de la région E3 et, notamment, la partie correspondant au gène codant pour la gpl9k (Gooding and
Wold, 1990, Critical Reviews of Immunology 10, 53-71), ladite partie n'étant pas incluse dans une unité d'expression telle que définie ci-avant mais placée sous le contrôle d'un promoteur homologue (E3) ou hétérologue conventionnel.

Il va de soi que l'on peut procéder à d'autres modifications, du génome viral notamment dans la région E4 ou E2. Il peut être intéressant d'introduire des délétions supplémentaires ou des mutations. Pour illuster ce point, on peut citer la mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protein en anglais) de la région E2A (Ensinger and Ginsberg, 1972, J. Virol. 10, 328339).

Selon un mode de réalisation préférentiel, un vecteur adénoviral selon l'invention comprend une unité d'expression comportant un ou plusieurs gènes viraux des régions E2, E4 ou L1-L5. Une variante intéressante consiste à ne retenir de la région Et que les séquences codant pour les ORFs 3, 6 et/ou 7 (ces délétions limitées de la région E4 ne nécessitent pas de complémentation de la fonction Et ; Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).

Il peut également être intéressant de disposer d'un vecteur adénoviral comprenant plusieurs unités d'expression, toutes les combinaisons étant envisageables (E2 et E4, E2 et L1-L5, Et et Ll-L5 ou E2, E4 et L1-L5). On choisira alors des séquences de régulation agissant d'une même manière et, de préférence, positivement (par exemple TAR, RRE, tet O...). Pour des raisons de simplicité de mise en oeuvre, on préfère le cas où les unités portent des séquences de régulation identiques permettant de propager le vecteur adénoviral dans une lignée de complémentation comprenant un seul inducteur.

L'invention a également trait à une particule virale infectieuse ainsi qu'à une cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine et peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée dans le génome ou non intégrée (épisome). Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopolétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.

La présente invention a également pour objet une cellule de complémentation caractérisée en ce qu'elle comprend un inducteur et/ou un répresseur (régulateur). Selon les besoins, celuici peut être ajouté dans le milieu de culture ou produit par la cellule elle-même d'une manière stable ou transitoire. De préférence, une cellule de complémentation selon l'invention est modifiée par introduction d'un fragment d'ADN codant pour ledit régulateur. Tous les moyens standards pour introduire un acide nucléique (vecteur synthétique, viral, plasmide, ADN nu...) dans une cellule peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, comme par exemple la transfection, l'électroporation, la microinjection, la lipofection, l'adsorption et la fusion de protoplastes.Dans le contexte de l'invention, il peut être intéressant de générer une cellule de complémentation qui ne produit qu'un seul régulateur et, notamment, un inducteur. Toutefois, il peut aussi être avantageux de disposer de cellules produisant plusieurs inducteurs.

Selon un mode de réalisation avantageux, une cellule de complémentation selon l'invention est capable de complémenter en trans un vecteur viral selon l'invention et, en particulier, d'un vecteur adénoviral. A cet égard, on choisira avantageusement une cellule de complémentation pour la fonction El et/ou E4.

Celleci peut être générée à partir de diverses lignées cellulaires par transfection de portions appropriées du génome adénoviral (voir par la demande
WO94/28152) et d'un fragment d'ADN codant pour un régulateur. Parmi les lignées envisageables, on peut citer les lignées de rein Véro (singe), BHK (hamster), MDCK (chien) MBDK (bovin), la lignée CHO (hamster) ou encore les lignées humaines (HeLa, A549, MRC5, W138...) disponibles dans les collections telles que l'ATCC (Rockville, USA). Cependant, une cellule particulièrement adaptée à la présente invention est la lignée 293.

Une particule virale infectieuse selon l'invention peut être préparée selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art (Graham et Prevect, 1991, supra), par exemple, par co-transfection d'un vecteur et d'un fragment adénoviral dans une cellule appropriée ou encore par le moyen d'un virus auxiliaire fournissant en trans les fonctions virales non fonctionnelles. Il est également envisageable de générer le vecteur viral in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou encore recombinaison homologue (voir par exemple la demande française 94 14470).

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'invention, selon lequel
(i) on introduit ledit vecteur viral dans une cellule de
complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur,
de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des
conditions appropriées pour permettre l'expression des gènes
viraux et la production de ladite particule virale infectieuse, et
(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture
cellulaire.

Bien entendu, la particule virale infectieuse peut être récupérée du surnageant de culture mais également des cellules. Selon un mode de réalisation avantageux, on met en oeuvre un vecteur adénoviral et une cellule de complémentation selon l'invention.

Selon une autre variante, on peut avoir recours à une cellule de complémentation conventionnelle. Il peut être nécessaire d'ajouter un inducteur au milieu de culture dans le cas où l'unité d'expression comprend des séquences de régulation activables. La quantité à utiliser dépend de la nature même de l'inducteur.

L'homme du métier saura bien évidemment adapter la concentration optimale en fonction des données spécifiques.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur viral, une particule virale infectieuse, une cellule de complémentation ou une cellule hôte eucaryote selon l'invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.La composition selon l'invention est en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que
- des maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabéte ou
myopathie, celle de Duchêne et de Becker...),
- des cancers, comme ceux induits par des oncogènes ou des virus,
- des maladies virales, comme l'hépatite B ou C et le SIDA (syndrome
de l'immunodéficience acquise résultant de l'infection par le vrH),
et
- des maladies virales récurrentes, comme les infections virales
provoquées par le virus de l'herpès.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent thérapeutique ou prophylactique à un support tel qu'un diluant. Une composition selon l'invention peut être administrée par voie locale, systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer.En particulier, les particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 10l3 ufp et, de préférence, 106 et 1011 ufp. La formulation peut également inclure un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Enfin, la présente invention est relative à l'usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral, d'une particule virale infectieuse, d'une cellule de complémentation ou d'une cellule hôte eucaryote selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal et, préférentiellement, par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient. Dans le cas où l'unité d'expression comprend des séquences de régulation répondant à un répresseur, on peut envisager l'administration du répresseur pour bloquer ou limiter l'expression des gènes viraux (administration préalable, concommitante ou postérieure du répresseur ou co-expression via les vecteurs conventionnels).

L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur viral, d'une particule virale, d'une cellule hôte eucaryote ou d'une cellule de complémentation selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.

La présente invention est plus complètement décrite en référence aux Figures suivantes et à l'aide des exemples suivants.

La Figure l est une représentation schématique du génome de l'adénovirus humain de type 5 (représenté en unités arbitraires de 0 à 100), indiquant l'emplacement des différents gènes.

La Figure 2 est une représentation schématique du vecteur pTG4673, permettant l'expression constitutive du tTA dirigée par le promoteur CMV (p CMV) et du gène de sélectionpac (résistance à la puromycine) sous le contrôle du promoteur SV40.

La Figure 3 est une représentation schématique du vecteur adénoviral pTG4696 comportant une cassette d'expression des ORFs 6 et 7 de la région E4 activable par le tTA.

La Figure 4 est une représentation schématique du vecteur pTG8343 comportant une partie de l'extrémité 5' du génome de l'adénovirus 5.

La Figure 5 est une représentation schématique du vecteur pTG4662, vecteur adénoviral recombinant de première génération délété de l'essentiel des régions El et E3. La cassette recombinante est constituée par le promoteur adénoviral MLP (Ad2) suivi du gène bactérien LacZ codant pour la p-galactosidase et du signal de polyadénylation (pA) du virus SV40.

La Figure 6 est une représentation schématique du vecteur pTG4682, vecteur adénoviral délété de l'essentiel des régions El et E3 et comportant une cassette d'expression constitutive du tTA.

La Figure 7 est une représentation schématique du vecteur pTG4683, vecteur adénoviral délété de l'essentiel des régions El, E3 et E4 et comportant une cassette d'expression constitutive du tTA.

La Figure 8 est une représentation schématique du vecteur pTG4675 permettant l'expression du tTA de manière inductible (sous le contrôle du promoteur minimal
CMV (-53 à +1) précédé de 7 copies de séquences tet O, indiqué tet O - CMVi).

La Figure 9 est une représentation schématique du vecteur pTG4684, vecteur adénoviral délété de l'essentiel des régions El et E3 et comportant une cassette d'expression inductible du tTA.

La Figure 10 est une représentation schématique du vecteur pTG4685, vecteur adénoviral délété de l'essentiel des régions El, E3 et E4 et comportant une cassette d'expression inductible du tTA.

EXEMPLES
Les exemples suivants n'illustrent qu'un mode de réalisation de la présente invention.

Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial.

Les étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens sont réalisées dans la souche E. coli 5K (Hubacek et Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) ou
BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). On utilise préférentiellement cette dernière souche pour les étapes de recombinaison homologue. Les techniques d'amplification par PCR sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple PCR
Protocols-A guide to methods and applications, 1990, edité par Innis, Gelfand,
Sninsky et White, Academic Press Inc). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'L coli (Klenow).

En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer la technique au phosphate de calcium (Maniatis et al., supra), mais tout autre protocole peut également être employé, tel que la technique au DEAE dextran, l'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes. Quant aux conditions de culture, elles sont classiques.

Dans les exemples qui suivent, on a recours aux lignées cellulaires suivantes
Lignée 293 dérivée de rein embryonnaire humain (Graham et al, 1977, supra)
qui résulte de l'intégration dans ses chromosomes de l'extrémité 5' du génome
de l'Ad5 (ITR5', séquence d'encapsidation et région El) (disponible à l'ATCC
sous la référence CRL1573).

Lignée TGl653 (décrite dans la demande internationale W094/28152,
exemple 8) qui dérive de la lignée 293 transformée de manière stable par le
plasmide pTGl653 portant la région E4 de l'Ad5 (nt 32800 à 35826) et la
cassette d'expression du gène de sélection pac.

Il est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées.

Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260.

EXEMPLE 1 : lignée de complémentation exprimant un inducteur capable d'activer l'expression des gènes adénoviraux
Cet exemple décrit la constitution (1) d'une lignée de complémentation dérivant de la lignée 293 et capable d'exprimer de manière constitutive la protéine trans activatrioe tTA et (2) d'un vecteur adénoviral dans lequel certains gènes viraux de la région E4 ont été placés sous le contrôle des séquences tet O répondant au tTA. La transfection du vecteur dans la lignée est suivie de la formation de particules virales puisque les fonctions El et E4 sont trans-complémentées par l'apport des produits d'expression de la région adénovirale El et du tTA.Dans les cellules hôtes infectées qui ne produisent pas naturellement la protéine chimère tTA, l'expression de F4 et, par voie de conséquence, des protéines tardives (expression dépendante de E4) sera considérablement réduite, limitant ainsi les problèmes d'immunité cellulaire et d'inflammation.

1. Constitution d'une lignée de complémentation exprimant le trans-activateur tTA.

On construit tout d'abord le vecteur pTG6529 permettant la selection des cellules transformées par la puromycine. Le vecteur résulte du clonage dans un p polym-I* (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) d'une cassette d'expression composée du promoteur SV40, du gène pac suivi du signal polyA du virus
SV40. Une telle construction est à la portée de l'homme de l'art à partir des séquences correspondantes décrites dans la littérature.

En parallèle, le vecteur pUHD15-1 (Gossen et Bujard, 1992, supra) est digéré par les enzymes SspI et HpaI. Le fragment comportant les séquences codant pour le tTA précédées du promoteur CMV, est cloné entre les mêmes sites du pTG6529 pour donner pTG4673 (Figure 2).

Le vecteur pTG4673 est transfecté de manière conventionnelle dans les cellules 293. Bien entendu, on aurait pu également transfecter un vecteur d'expression du tTA et un vecteur de sélection (par exemple puHD15-1 et pTG6529). Après transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (1 jug/ml de puromycine). 80 clones résistants ont été isolés et, parmi eux, 35 testés pour leur capacité à transactiver un gène marqueur dont l'expression est contrôlée par les séquences tet O. Pour des raisons de simplicité de mise en oeuvre et de sensibilité de dosage, le choix s'est porté sur le gène luciférase.

On utilise le vecteur reporteur pUHC13-3 (Gossen et Bujard, 1992, supra) dans lequel les séquences codant pour la luciférase sont placées sous le contrôle du promoteur minimal CMV précédé par 7 copies de tet O. Le test est effectué par transfection transitoire dans les clones à tester. Deux jours plus tard, l'activité luciférase est évaluée sur les extraits cellulaires en mettant en oeuvre un kit commercialisé par Proméga ("Luciferase Assay System") et, pour la mesure des échantillons, un compteur à scintillation (LS 50000 TD, Beckman). Le dosage s'avère positif pour 10 des clones évalués, ce qui indique qu'ils produisent un produit tTA fonctionnel capable de reconnaître les séquences tet O et d'activer l'expression des gènes placés sous leur contrôle.

2. Constitution d'un adénovirus dont l'expression des gènes E4 est inductible par le tTA.

Comme cela a été mentionné précédemment, l'expression des gènes codant pour les ORFs 6 et 7 de la région E4 est suffisante pour assurer la replication virale sans nécessité de complémentation. Cet exemple décrit la construction d'un vecteur adénoviral délété des régions El et E3 et d'une partie de E4, à l'exception des séquences codant pour les ORFs 6 et 7 dont l'expression est placée sous le contrôle de tet O et, de ce fait, stimulée en présence du tTA.

Le vecteur pUHDîO-3 provient du clonage dans le plasmide pBR322 d'un fragment XhoI-EcoRI portant 7 copies tet O et le promoteur minimal CMV (position -53 par rapport au site d'initiation de la transcription ; voir Gossen et
Bujard, 1992, supra). Après digestion par BamXI (site situé en aval de la région promotrice), on insère le fragment BglII-BamHI obtenu de pTG1653 et porteur des séquences codant pour les ORFs 6 et 7 pour donner pTG4658.

Le vecteur pTG4664 résulte du clonage du fragment adénoviral KpnI-HpaI (nucléotides 25 838 à 32 004) entre les sites KpnI-SmaI d'un p poly II (Lathe et al., 1987, supra) dans lequel on avait au préalable supprimé le site BglII. Puis on effectue la délétion d'une grande partie de E3 (nucléotides 27 871 à 30 748) par digestion enzymatique (HpaI-HindIII).

Le fragment XhoI-HpaI porteur de la cassette d'expression régulée des ORFs 6 et 7 est isolé de pTG4658 et inséré après action de la Klenow dans le vecteur pTG4664 digéré par figili et traité par la Klenow pour donner pTG4668 et pTG4669 selon l'orientation de la cassette. Celle-ci est introduite dans un vecteur adénoviral par recombinaison homologue. On utilise à cet effet le vecteur recombinant pTG4663 qui dérive d'un vecteur de seconde génération (délété des régions El et E4 essentielles à la replication et de la région E3 nonessentielle (délétion des nucléotides 27 871 à 30 748); décrit à l'exemple 4 de la demande internationale WO94/28152) dans lequel on a cloné la cassette d'expression "promoteur MLP-gène LacZ pA SV40" à la place de la région El.

Les cellules E. coli sont co-transformées par pTG4668 ou pTG4669 clivé par Hindili et le vecteur viral pTG4663 linéarisé par SpeI pour générer pTG4696 (Figure 3) et pTG4697.

D'autres vecteurs adénoviraux de type similaire peuvent être générés. On peut, par exemple, envisager de placer les gènes de la région E2 sous le contrôle des séquences tet O. L'homme du métier connait les techniques de biologie moléculaire qui permettent de remplacer le promoteur E2 par un promoteur régulable tel que celui isolé du vecteur pUHD10-3 ou d'éliminer les séquences en amont de la TATA box du promoteur E2 et d'introduire à leur place une ou plusieurs copies (de préférence 7) de séquences tet O. Il est également possible de construire des vecteurs régulés à plusieurs niveaux, par exemple par insertion de tet O en amont de la TATA box des promoteurs dirigeant l'expression des gènes viraux de E2, E4 et/ou MLP.

3. Génération de particules virales.

Le vecteur viral pTG4696 ou pTG4697 est transfecté dans l'un des 10 clones producteurs de tTA de l'exemplel.1. Les cellules sont capables de complémenter la fonction El et de produire du tTA activant l'expression des ORFs 6 et 7, ce qui permet la formation de particules virales. On constitue un stock qui permet ensuite d'infecter les cellules cibles à une m.o.i. (multiplicité d'infection) déterminée susceptible de varier de 0,1 à 100.

EXEMPLE 2: Constitution d'une lignée de complémentation pour les fonctions
El et E4. l'expression de E4 étant inductible par le tTA.

Cet exemple a trait à une lignée de complémentation générée par transfection des cellules 293 par un vecteur d'expression des ORFs 6 et 7 de E4 placés sous le contrôle d'un promoteur minimal précédé de 7 copies de tet O. Les cellules transfectées sont capables de complémenter les fonctions El de manière constitutive et E4 de manière inductible par le tTA. Celui-ci peut être porté par un vecteur adénoviral défectif ou un vecteur d'expression classique.

1. Constitution de la lignée de complémentation.

Le fragment XhoI-BamHI de pTG4658 (portant la cassette "tet O-promoteur minimal CMV-ORFs 6 et 7") est inséré entre les sites SalI et BgllI du vecteur de sélection pTG6529. 60 clones résistants ont été générés après transfection dans la lignée 293 et sélection par la puromycine. On peut déterminer les clones présentant une capacité optimale de complémentation de différentes façons.

Une première méthode consiste à transfecter de manière transitoire le plasmide pUHD15-1 exprimant de manière constitutive le tTA. Une analyse par Western blot des extraits cellulaires à l'aide d'anticorps appropriés permettra d'évaluer la quantité de polypeptides ORFs 6 et/ou 7 produits dans ces clones et donc leur capacité à trans-complémenter la fonction adénovirale E4. Selon une autre méthode, on peut employer un adénovirus défectif exprimant le tTA. Cette méthode est détaillée ci-après.

2. Constitution d'un adénovirus défectif exprimant le tTA d'une manière constitutive.

Deux séries de constructions ont été réalisées .pTG4682 correspondant au génome adénoviral délété de l'essentiel des régions El et E3 et comportant à la place de la région El, une cassette d'expression constitutive du tTA (promoteur
CMV). pTG4683 est en outre délété de la région E4.

On part du vecteur pTG8343, lequel provient de l'insertion dans p poly II (Lathe et al., 1987, supra) d'une partie de l'extrémité 5' du génome adénoviral, à savoir les séquences s'étendant des nucléotides 1 à 458 et 3328 à 5788 (Figure 4). Après digestion de pTG8343 par BglII et traitement par la Klenow, celui-ci est mis en ligation avec le fragment SspI-HpaI de pUHD15-1 portant le promoteur CMV suivi des séquences tTA. On obtient pTG4674 destiné à permettre l'insertion de la cassette du tTA par recombinaison homologue avec un vecteur adénoviral comprenant des séquences homologues.A cet effet, on choisit le vecteur pTG4662 (Figure 5) qui comporte l'ITR 5' et les séquences d'encapsidation de l'Ad5 (nt 1 à 458), une cassette d'expression du gène LacZ à la place de la région El et les séquences adénovirales restantes délétées de la région E3 (nucléotides 3329 à 27870 et 30749 à 35935).

La souche E. coli BJ est co-transformée avec les vecteurs pTG4662 linéarisé par
ClaI et pTG4674 clivé par SgrAI et BstEII, pour obtenir pTG4682 (Figure 6).

Cet evènement de recombinaison homologue permet un échange de la cassette
LacZ de pTG4662 contre celle du tTA portée par le fragment issu de pTG4674.

Le vecteur pTG4683 (Figure 7) est obtenu selon la même technologie par recombinaison homologue in vitro entre pTG4663 clivé par ClaI et pTG4674 digéré par SgrAI et BstEII. Le vecteur pTG4663 est similaire à pTG4662 à la différence qu'il est délété de l'essentiel de la région M (nucléotides 32994 à 34998).

3. Constitution d'un adénovirus défectif exprimant le tTA d'une manière inductib le.

On a recours pour contrôler l'expression des séquences tTA, au promoteur minimal CMV comportant en 5' 7 copies de séquences tet O, ce qui rend le système autoinductible. En effet, la production de quelques molécules de tTA à partir du promoteur non induit va permettre d'activer le système. Comme avant, on génère deux vecteurs adénoviraux pTG4684 et pTG4685 délétés ou non de la région E4.

Le promoteur CMV de pUHD15-1 est échangé contre son homologue régulable isolé de pUHD10-3 sous forme d'un fragment XhoI-EcoRI. On obtient pTG4659. La cassette est isolée de ce dernier par digestion par SspI et HpaI et clonée dans le vecteur pTG8343 linéarisé par BglII et traité par la Klenow, pour donner pTG4675 (Figure 8). La souche E. coli BU est ensuite co-transformée par le vecteur précédent traité par SgrAI et BstEII et pTG4662 ou pTG4663 linéarisé par l'enzyme ClaI, afin de générer par recombinaison homologue les vecteurs viraux pTG4684 (Figure 9) et pTG4685 (Figure 10).

Les particules virales peuvent être obtenues par simple transfection d'une lignée cellulaire appropriée comme celle de l'exemple 2.1 en absence de tétracycline (l'addition de l'antibiotique dans le milieu de culture ayant un effet inhibiteur sur la transcription du tTA et des ORFs 6 et 7 régulée par les séquences tet O).

4. Tests fonctionnels de microinfection et de microtitration.

Les expériences sont réalisées en parallèle sur les cellules 293 complémentant la fonction El et les cellules 1653 complémentant les fonctions El et E4. Les cellules sont réparties dans une plaque de culture à raison d'environ 5 x 104cellules par puit. Elles sont ensuite transfectées par les vecteurs à tester, pTG4682 à 4685. On évalue leur capacité à former des plages dans les deux types cellulaires (suivant leur vitesse d'apparition) ainsi que leur taille. A titre de témoins, on utilise les vecteurs recombinants pTG4662 et pTG4663 qui correspondent respectivement à des vecteurs adénoviraux de première génération (délétion de El et E3) et de seconde génération (délétion supplémentaire de E4) et qui n'expriment pas le tTA.

La génération de particules virales à partir de la construction pTG4662 est facilement détectable et ceci dans les deux lignées cellulaires (formation de grandes plages apparaissant rapidement). Quant à pTG4663, il ne peut être propagé que dans les cellules 1653 complémentant El et E4 et donne de petites plages qui apparaissent tardivement.

En ce qui concerne les vecteurs pTG4682 et pTG4684, leur transfection dans les cellules 293 et 1653 est rapidement suivie de la formation de grandes plages facilement repérables (comportement similaire au témoin pTG4662). Les vecteurs pTG4683 et pTG4685 délétés de la région M se comportent d'une manière comparable à pTG4663 : dans la lignée 1653 les particules virales apparaissent lentement en formant des plages de taille réduite alors que dans la lignée 293 on ne détecte pas de plages. Ces données semblent indiquer que l'expression du tTA n'est pas préjudiciable à la propagation virale ni toxique pour la croissance cellulaire.

Comme indiqué précédemment, on peut appliquer cette technologie à la lignée de l'exemple 1 (293/pTG4673) et des vecteurs pTG4696 et pTG4697.

Claims (26)

Revendications

1. Vecteur viral caractérisé en ce qu'il comprend une unité d'expression

comportant un ou plusieurs gène viraux ; ladite unité d'expression étant

fonctionnelle dans une cellule de complémentation et non fonctionnelle

dans une cellule hôte.

2. Vecteur viral selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite unité

d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de régulation hétérologue(s) .

3. Vecteur viral selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite unité

d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de régulation

permettant d'activer l'expression dudit gène viral en présence d'un

inducteur et/ou d'inhiber l'expression dudit gène viral en présence d'un

répresseur.

4. Vecteur viral selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite

séquence de régulation peut agir au niveau de la transcription,

l'élongation, le transport ou la stabilité des ARN messagers ou la

traduction.

5. Vecteur viral selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite

séquence de régulation est placée au niveau du promoteur de ladite unité

et, plus particulièrement, en amont de la TATA box.

6. Vecteur viral selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que

ladite unité d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de

régulation sélectionnées parmi les séquences TAR, RRE, GRE, PRE,

ERE, UAS Gal4, les séquences de régulation du gène métallothionéine

et des opérons bactériens tryptophane lactose et tétracycline.

7. Vecteur viral selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite unité

d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de régulation

dérivant de l'opéron tétracycline placée(s) en amont de la TATA box

dudit promoteur, pour donner un promoteur activable par un inducteur

de type trans-activateur tétracycline (tTA) et répressible par la

tétracycline.

8. Vecteur viral selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite unité

d'expression comprend une ou plusieurs séquence(s) de régulation

dérivant de l'opéron tétracycline placée(s) en aval de la TATA box dudit

promoteur, pour donner un promoteur répressible par le répresseur

tétracycline (TetR).

9. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 8, dérivé d'un virus

sélectionné parmi le virus de l'herpès, le cytomégalovirus, l'AAV (virus

associé à l'adénovirus), le poxvirus et l'adénovirus.

10. Vecteur adénoviral selon la revendication 9, dérivé d'un adénovirus

d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou

simienne ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome

adénoviral de différentes origines.

11. Vecteur viral selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce

qu'il est défectif pour la replication.

12. Vecteur adénoviral selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est

au moins dépourvu de tout ou partie de la région El et, de façon

optionnelle, de tout ou partie de la région E3.

13. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en

ce qu'il comprend une ou plusieurs unité(s) d'expression comportant un

ou plusieurs gènes viraux des régions E2, E4 ou L1-L5.

14. Vecteur adénoviral selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il

comprend une unité d'expression comportant une ou plusieurs

séquence(s) de régulation dérivant de l'opéron tétracycline placée(s) en

amont de la TATA box du promoteur et les cadres de lecture ouverts

(ORFs) 6 et 7 de la région M, de manière à ce que l'expression desdits

cadres de lecture soit activable par un inducteur de type trans-activateur

tétracycline (tTA) et répressible par la tétracycline.

15. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce

qu'il comprend une séquence nucléotidique exogène placée sous le

contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte.

16. Vecteur viral selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence

nucléotidique exogène est sélectionnée parmi les gènes codant pour une

cytokine, un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de

coagulation, la protéine CFTR, l'insuline, la dystrophine, une hormone

de croissance, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un polypeptide à

effet anti-tumoral, un polypeptide capable d'inhiber une infection

bactérienne, parasitaire ou virale et, notamment le VIH, un anticorps,

une toxine, une immunotoxine et un marqueur.

17. Particule virale infectieuse comprenant un vecteur viral selon l'une des

revendications 1 à 16.

18. Cellule hôte eucaryote comprenant un vecteur viral selon l'une des

revendications 1 à 16 ou une particule virale infectieuse selon la

revendication 17.

19. Cellule de complémentation caractérisée en ce qu'elle comprend un

inducteur et/ou un répresseur.

20. Cellule de complémentation selon la revendication 19, caractérisée en ce

qu'elle comprend un fragment d'ADN codant pour un inducteur et/ou un

répresseur.

21. Cellule de complémentation selon la revendication 19 ou 20, caractérisée

en ce qu'elle dérive de la lignée 293.

22. Procédé de préparation d'une particule virale infectieuse selon la

revendication 17, selon lequel

(i) on introduit un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 16

dans une cellule de complémentation capable de complémenter en

trans ledit vecteur viral pour obtenir une cellule de

complémentation transfectée

(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des

conditions appropriées pour permettre l'expression des gènes

viraux et la production de ladite particule virale infectieuse ; et

(iii) on récupère ladite particule virale infectieuse dans la culture

cellulaire.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit vecteur

viral est un vecteur adénoviral et ladite cellule de complémentation est

selon la revendication 21.

24. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur viral selon l'une des

revendications 1 à 16, une particule virale infectieuse selon la

revendication 17 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de

préparation selon la revendication 22 ou 23, une cellule hôte eucaryote

selon la revendication 18, une cellule de complémentation selon l'une des

revendications 19 à 21, en association avec un support acceptable d'un

point de vue pharmaceutique.

25. Usage thérapeutique ou prophylactique d'un vecteur viral selon l'une des

revendications 1 à 16, d'une particule virale infectieuse selon la

revendication 17 ou obtenue en mettant en oeuvre un procédé de

préparation selon la revendication 22 ou 23, d'une cellule hôte eucaryote

selon la revendication 18 ou d'une cellule de complémentation selon

l'une des revendications 19 à 21, pour la préparation d'un médicament

destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique.

26. Usage selon la revendication 25 en association avec un répresseur.