EP1115857A1 - Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire - Google Patents

Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire

Info

Publication number
EP1115857A1
EP1115857A1 EP99943036A EP99943036A EP1115857A1 EP 1115857 A1 EP1115857 A1 EP 1115857A1 EP 99943036 A EP99943036 A EP 99943036A EP 99943036 A EP99943036 A EP 99943036A EP 1115857 A1 EP1115857 A1 EP 1115857A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
promoter
gene
smooth muscle
region
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99943036A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Branellec
Rapha[L Darteil
Abderrahim Mahfoudi
Daniel Scherman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9812000A external-priority patent/FR2783839B1/fr
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA, Aventis Pharma SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP1115857A1 publication Critical patent/EP1115857A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the enhancer region can be positioned in the same orientation or in the reverse orientation with respect to the direction of transcription of the promoter region.
  • the enhancer region is chosen from the enhancer region of the immediate early cytomegalovirus gene (CMV-IE), the enhancer region of the red sarcoma virus LTR (LTR-RSV), the enhancer region SV40 virus, and the enhancer region of the EF1 ⁇ gene. More preferably, in the hybrid promoters of the invention, the enhancer region is the enhancer region of the immediate early gene of the cytomegalovirus (CMV-IE), preferably of the human cytomegalovirus (hCMV-IE).
  • a particular enhancer region consists for example of the fragment -522 to -63 of the hCMV-IE gene, or of any fragment comprising at least part of it and exhibiting enhancer activity.
  • a region comprising all or part of the promoter of the gene coding for ⁇ -actin of smooth muscle cells (SMact) or of the SM22 gene is advantageously used for implementing the invention.
  • the promoter of these genes has been described for its specific character of smooth muscle cells (see in particular Ueyama H. et al., Mol. Cell. Biol, 4 (1984) 1073-1078; Solway J. et al., J. Biol. Chem., 270 (1995) 13460-13469).
  • the enhancer region and the promoter region can be isolated by conventional techniques from nucleic acid libraries or from total cellular DNA, for example by amplification by means of specific probes. These fragments can also be synthesized artificially using the sequence information available in the prior art. When these fragments are obtained, they can be easily combined with one another by means of ligases and other restriction enzymes, to generate hybrid promoters of the invention. In addition, these fragments can be modified by digestion, mutation, insertion or addition of base pairs, either in order to facilitate their cloning, or in order to modify their functional properties.
  • the fragments can be associated directly with one another or, on the contrary, spaced by base pairs having no significant influence on the activity of the hybrid promoter.
  • the hybrid promoters of the invention thus have the capacity to express a nucleic acid of interest in a specific manner in smooth muscle cells.
  • the "specific" character of the expression means that the promoter activity is significantly very higher in the smooth muscle cells. Although a non-specific expression can exist in other cells, the corresponding level of activity generally remains very low (negligible) compared to that observed in smooth muscle cells, generally at least a factor of 10 .
  • the results presented in the examples show in this respect an expression differential which can reach a factor of 140, which testifies to the high selectivity of the promoters of the invention.
  • the nucleic acid can code, for example, for a protein chosen from: proteins involved in the cell cycle, such as for example p21 or any other kinase inhibitor protein cyclin-dependent (cdk), the retinoblastoma (Rb) gene product, GAX, GAS-1, GAS-3, GAS-6, Gadd 45, Gadd 153, cyclins A, B and D.
  • apoptosis such as for example p53, members of the family of apoptosis inducers such as Bas, Bcl-X s , Bad or any other antagonist of Bcl 2 and of Bcl-Xi.
  • proteins capable of modifying the proliferation of smooth muscle cells such as for example an intracellular antibody or an ScFv inhibiting the activity of proteins involved in cell proliferation, such as for example the Ras protein, mapkinase, or receptors for tyrosine kinase or growth factors.
  • proteins inducing angiogenesis such as for example members of the VEGF family, members of the FGF family and more particularly FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, angiogenin, EGF, TGF ⁇ , TGF ⁇ , TNF ⁇ , Scatter Factor / HGF , members of the angiopoetins family, cytokines and in particular interleukins including IL-1, IL-2, IL-8, angiotensin-2, plasminogen activator (TPA), urokinase (uPA) , the molecules involved in the synthesis of active lipids (prostaglandins, Cox-1).
  • proteins inducing angiogenesis such as for example members of the VEGF family, members of the FGF family and more particularly FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, angiogenin, EGF, TGF ⁇ , TGF ⁇ , TNF ⁇ , Scatter Factor / HGF , members of the angiopoetins family, cytokines and in particular inter
  • adenovirus viruses there may preferably be mentioned adenovirus viruses, retroviruses, herpes virus or recombinant adeno-associated viruses.
  • the construction of this type of recombinant virus defective for replication has been widely described in the literature, as well as the infection properties of these vectors (see in particular S. Baeck and KL March (1998), Circul. Research vol. 82, pp 295-305), T. Shenk, BN Fields, DM Knipe, PM Howley et al (1996), Adenoviridae: the viruses and their replication (in virology).
  • Pp 211-2148 EDS - Ravenspublishers / Philadelphia, P. Yeh and M. Perricaudet (1997), FASEB Vol. 11, pp 615-623.
  • a particularly preferred recombinant virus for the implementation of the invention is a defective recombinant adenovirus.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses around 36 (kilobases) kb in size. There are different serotypes, including the structure and properties vary somewhat, but have a comparable genetic organization. More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Adl2).
  • adenoviruses of animal origin mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of the adenovirus CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference.
  • the adenovirus genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes.
  • ITR inverted sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the El region in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) have also been sequenced.
  • adenovirus For their use as recombinant vectors, various constructs derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell. Thus, the constructions described in the prior art are deleted adenoviruses from the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al, Gene 101 (1991) 195; Gosh -Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus.
  • thermosensitive point mutation was introduced into the mutant ts125, making it possible to inactivate the 72kDa DNA binding protein (DBP) (Van der Vliet et al., 1975).
  • Other vectors include a deletion from another region essential for replication and / or viral propagation, the E4 region.
  • the E4 region is in fact involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNA, in the extinction of the expression of proteins of the host cell and in the efficiency of replication of l 'Viral DNA.
  • Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have very reduced transcription background noise and expression of viral genes.
  • Such vectors have been described by example in applications WO94 / 28152, WO95 / 02697, WO96 / 22378).
  • vectors carrying a modification in the IVa2 gene have also been described (WO96 / 10088).
  • the recombinant adenovirus used in the context of the invention comprises a deletion in the E1 region of its genome. Even more particularly, it includes a deletion of the Ela and Elb regions. As a specific example, mention may be made of deletions affecting nucleotides 454-3328; 382-3446 or 357-4020 (with reference to the Ad5 genome).
  • line 293 is a human embryonic kidney cell line containing the left end (approximately 11-12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the packaging region , the El region, including Ela and Elb, the region coding for the pIX protein and part of the region coding for the pIVa2 protein.
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E 1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, and of producing viral stocks having high titers.
  • This line is also capable of producing, at permissive temperature (32 ° C.), stocks of virus further comprising the thermosensitive E2 mutation.
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by the introduction of viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being 24 to 36 hours).
  • the viral DNA introduced may be the complete recombinant viral genome, optionally constructed in a bacterium (WO96 / 25506) or in a yeast (WO95 / 03400), transfected in the cells. It can also be a recombinant virus used to infect the packaging line.
  • the recombinant viral particles are isolated by centrifugation in a cesium chloride gradient.
  • An alternative method has been described in application FR96: 08164 incorporated herein by reference.
  • the use of a hydrogel is particularly advantageous for the transfer of nucleic acids into the vascular walls, and in particular into the smooth muscle cells of the vascular walls.
  • the doses used for the injection can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the aim pursued (labeling, pathology, screening, etc.), the gene to be expressed, or even the duration of the expression sought.
  • the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 10 ⁇ pfu, and preferably 10 ⁇ to 10 ⁇ pfu.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a viral solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measurement of the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the cassettes, vectors or compositions of the invention can be incubated at conventional doses in the presence of the selected cell populations. These incubations can be carried out on culture dishes, flasks, fermenters, or any other device chosen.
  • the invention also relates to any cell modified by a cassette or a vector (in particular an adenovirus) as described above.
  • modified cell is understood to mean any cell containing a construct according to the invention. These cells can be used for the production of recombinant proteins in vitro. They can also be intended for implantation in an organism, according to the methodology described in application WO95 / 14785. These cells are preferably human smooth muscle cells.
  • the invention also relates to the use of a hybrid promoter as defined above for the specific expression of a nucleic acid in smooth muscle cells, in vitro, ex vivo or in vivo.
  • Figure 2 Schematic representations of the plasmids whose expression cassette contains the hybrid promoter mSM22 ⁇ .
  • Figure 3 Activities of hybrid promoters evaluated in transient transfections in vitro in rabbit smooth muscle cells in primary culture (rabbit SMC), in endothelial cells derived from human umbilical cord carcinoma (ECV304), in myoblasts of mice (C2C12) as well as in epithelial cells from a carcinoma of the human cervix (HeLa).
  • the relative activity of each promoter is expressed as a percentage of the luciferase activity obtained with the plasmid pCMV-leadTK.
  • Enh-X the enhancer sequence of hCMV-IE is cloned upstream of promoter X according to its normal orientation.
  • hnE-X the enhancer sequence of hCMV-IE is cloned upstream of promoter X in the opposite orientation.
  • Figure 4 Activities of hybrid promoters evaluated in transient transfections in vitro in mouse embryonic fibroblasts (NIH 3T3), in cells derived from a human ENT carcinoma (TU182), as well as in transformed human embryonic renal cells (293) . The relative activity of each promoter is expressed as a percentage of the luciferase activity obtained with the plasmid pCMV-leadTK.
  • Enh-X the enhancer sequence of hCMV-IE is cloned upstream of promoter X according to its normal orientation.
  • hnE-X the enhancer sequence of hCMV-IE is cloned upstream of promoter X in the opposite orientation.
  • Figure 5 Activities of hybrid promoters evaluated in gene transfer in vivo in the cranial tibial muscle of C57BL6 mice. The relative activity of each promoter is expressed as a percentage of the luciferase activity obtained with the plasmid pCMV-leadTK.
  • the plasmid pGL3 -Basic used for cloning the different promoter regions, is of commercial origin (Promega Corporation).
  • the plasmids pCMV ⁇ (Clontech Laboratories Inc.) and pUC18 (Boehringer Mannheim) are also of commercial origin.
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the PCR technique can be carried out using a DNA thermal cycler ⁇ (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's recommendations.
  • the electroporation of plasmid DNA in Escherichia coli cells can be carried out using an electroporator (Bio-Rad) according to the manufacturer's recommendations.
  • EXAMPLE 1 Construction of hybrid promoters and expression plasmids containing them.
  • - Primer 6417 (5 'GATGGTCCCTACTTATGCTGCTA 3') (SEQ ID 1) starting at position -1034 (promoter region) of the human specific smooth muscle ⁇ -actin gene (Ueyama H. et al., Mol. Cell. Biol, 4 (1984) 1073-1078. Access Genbank D00618).
  • - Primer 6418 (5 'CTTCCATCATACCAAACTACATA 3') (SEQ ID 2) at position 1974 of the sequence D00618 located inside the first intron of the hSMact gene.
  • the reaction mixture comprises 1 mg of genomic DNA, 10 pmol of each of the two primers (6417 and 6418), 100 mM of each deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgC12 and 5 units of Taq DNA polymerase ( PerkinElmer).
  • the reaction volume is made up to 50 ml adjusted to the optimal concentration of the ACP buffer recommended by Perkin Elmer.
  • the PCR amplification is carried out in Micoamp TM tubes (Perkin Elmer) using a PTC-100 TM thermocycler (MJ Research, Inc.).
  • This amplification consists of a denaturation step at 95 ° C for 2 min followed by 30 cycles including a denaturation step of 15 sec at 95 ° C, a hybridization step of 30 sec at 60 ° C and an extension step 1 min at 72 ° C. These thirty cycles are followed by an additional extension of 5 min then the ACP reactions are stored at 10 ° C.
  • This fragment was digested with MluI and then was cloned into the plasmid phSMact previously digested with MluI and treated with alkaline phosphatase.
  • two different plasmids were obtained: pXL3130 and pXL3131.
  • the schematic representations of these plasmids are gathered in the figure ( Figure 1).
  • These plasmids comprise, in the form of an Mlul-NDSl fragment, a hybrid promoter consisting of the enhancer of the promoter of the hCMV-IE gene and of the promoter of the hSM ⁇ -actin gene.
  • This DNA was used as a template for PCR amplification using the following primers:
  • this primer introduces an Xhol site (lowercase underlined) in position -436 of the promoter of the mouse SM22 alpha gene (Solway J. et al., J. Biol. Chem., 270 (1995) 13460-13469; Access Genbank L41161).
  • this primer introduces a HindIII site at position +43 of mSM22 alpha.
  • Plasmid pXL3152 and pXL3153 A DNA fragment corresponding to the enhancer region of the promoter of the hCMV-IE gene between the positions -522 and -63 relative to the transcription initiation site, was amplified by PCR using the plasmid pCMV ⁇ as template and oligonucleotides 8557 (5 'ATC GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3') and 8558 (5 'ATC GAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG GGG CGG AGT TG 3') (SEQ ID 6) as primers.
  • This fragment was digested with MluI and then was cloned into the plasmid pmSM22 previously digested with MluI and treated with alkaline phosphatase.
  • two different plasmids were obtained: pXL3152 and pXL3153.
  • the schematic representations of these plasmids are collated in FIG. 2.
  • These plasmids comprise, in the form of an Mlul-NDTl fragment, a hybrid promoter consisting of the enhancer of the promoter of the hCMV-IE gene and of the promoter of the mSM22 gene.
  • the expression vector pCGN previously described by Tanaka et al. contains the CMV promoter (-522 / + 72) fused to the "leader" of the HSV tk gene (+ 51 / + 101) upstream of a sequence coding for the epitope hemagglutinin.
  • Plasmid pCGN (10 ng) was used as a template for PCR amplification. The PCR reaction and the amplification were carried out under the same conditions as those used for hSMact and mSM22 (Examples 1.1 and 1.2).
  • the PCR fragment thus obtained is purified and then phosphorylated using the polynucleotide kinase from phage T4 (New England Biolabs).
  • the vector pGL3-Basic Promega was linearized with purified NcoL then treated with Klenow DNA polymerase (Boehringer Manheim) in order to fill the Ncol site.
  • Klenow DNA polymerase Boehringer Manheim
  • This vector is then dephosphorylated using alkaline phosphatase (Boehringer Manheim) and then used for the insertion of the phosphorylated PCR fragment.
  • the guanosine (G) of primer 6719 makes it possible to restore the Ncol site only when the CMV-leader tk fragment is oriented with the 5 ′ part (primer 6718, position -522 of CMV) downstream of the HindIII site of pGL3 -Basic and its 3 ′ end (primer 6719, leader tk) is ligated to the Ncol site of pGL3-Basic (first luciferase ATG).
  • the plasmid thus obtained is designated pCMV-leadTK.
  • This example illustrates the tissue specificity properties of the hybrid promoters of the invention in vitro.
  • SMC Rabbit smooth muscle cells
  • DMEM TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 20%) of fetal calf serum (SVF).
  • ECV304 cells are cultured in 199 TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with 10%> of FCS.
  • C2C12 myoblasts, HeLa cells, NIH 3T3 cells and TU 182 cells are cultured in DMEM TM medium supplemented with 10% of SVF.
  • the 293 cells are cultured in MEM TM medium (Life Technologies Inc.) supplemented with pyruvate, non-essential amino acids and 10% FCS. All the cultures are carried out in an oven at 37 ° C., in a humid atmosphere and under a partial pressure of CO 2 of 5%.
  • plasmid DNA 250 ng of plasmid of interest and 250 ng of pUC18
  • DMEM TM medium 20 ⁇ l final
  • the 20 ⁇ l of the DNA / lipid mixture are brought into contact with the cells, in the absence of FCS, for 2 hours.
  • the culture medium is then supplemented with SVF so as to obtain the percentage of SVF required for the culture of each cell type.
  • the relative activity in rabbit SMC is at least 5 times greater than that observed in other cell types: (i) from 5 to 20 times greater for the hSMact promoter (Table I), and (ii) 5 to 25 times higher for the mSM22 promoter (Table II).
  • This example illustrates the tissue specificity properties of the hybrid promoters of the invention in vivo. 3.1. Gene transfer in skeletal muscle.
  • the various plasmids were injected, intramuscularly, into the cranial tibial muscle of female C57BL6 mice aged 5 weeks. Each plasmid, diluted in a NaCl solution at 150 mM final, is injected at a rate of 10 ⁇ g per muscle. Three days after injection, the muscles are removed in 2 ml of Cell Culture Lysis Reagent TM buffer (Promega Corporation), and ground using a Diax homogenizer (Heidolph). The ground material is then centrifuged for 15 minutes at 4000 g, then the luciferase activity is evaluated using the Luciferase Assay System TM kit (Promega Corporation) according to the recommendations of the supplier.
  • Cell Culture Lysis Reagent TM buffer Promega Corporation
  • Diax homogenizer Heidolph
  • the relative activities of the two specific promoters (hSMact and mSM22) as well as those of two of the hybrid promoters of the invention (Enh-hSMact and Enh- mSM22) were also evaluated in vivo after transfer of naked DNA into the cranial tibial muscle of mice.
  • the results collated in FIG. 5 show that the activity of the Enh-hSMact promoter is 100 times lower than that of the CMV promoter.
  • the activity of the Enh-mSM22 promoter is 17 times lower than that of the CMV promoter.
  • EXAMPLE 4 Construction of recombinant adenoviruses expressing the GAX protein under the control of specific hybrid promoters.
  • the purpose of this example is to describe an adenoviral vector carrying the gene coding for the protein GAX operatively linked to the hybrid promoter of the invention composed of the enhancer CMV and of the promoter SM ⁇ -actin (enh-hSMact).
  • the human gax gene comprises 912 base pairs and codes for a transcription factor of 303 amino acids involved in stopping cell growth (growth-arrest-specific homeobox) and having a role in the proliferation of human smooth muscle cells.
  • This homeodomain gene was originally isolated from the aorta and is expressed in particular in adult cardiovascular tissue (Gorski et al. 1993).
  • Plasmid pXL3297 is an expression vector containing the human gax gene. It was digested with the enzymes HindIII and Avril in order to introduce the human gax gene into the previous plasmid pXL3282 also digested with the enzymes HindIII and Avril to give the plasmid pXL 3300.
  • the expression cassette for the human gax gene is then introduced into a recombinant human adenovirus of serotype 5 (Ad5) deleted from the El and E3 regions by co-transfection and homologous recombination between the plasmid carrying the expression cassette for the gax gene and adenovirus, in packaging cells. These cells are preferably line 293.
  • the production of a stock of adenovirus containing the expression cassette for the human gax gene results from the lysis of the cells. packaging 2 or 3 days after infection and isolation of the recombinant viral particles by cesium chloride gradient centrifugation.
  • the viral particles are then used to study the expression of the human gax gene under the control of the promoter of the invention in smooth muscle cells.
  • messenger RNAs is analyzed 24 hours after infection of the smooth muscle cells by dot blot and northern blot using an oligonucleotide whose sequence is present in the gax gene.
  • Smooth muscle cells in the exponential growth phase are infected with an adenovirus containing the gene coding for the GAX protein under the control of the enh-hSMact promoter in the absence and in the presence of 125 ng of lipofectin (48-well plates).
  • the adenoviruses (in variable dilutions) and the lipofectamine are incubated for 30 minutes at room temperature in a medium deprived of serum.
  • the mixture or the virus alone is brought into contact with the cells for one hour at 37 ° C.
  • the medium containing the virus is removed and the cells are incubated in DMEM medium containing 0.5% of FCS.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un promoteur hybride comprenant: tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et ubiquitaire, et une région promoteur permettant l'expression spécifique dans les cellules musculaires lisses, ainsi que tout vecteur et cellule contenant ce promoteur, et leurs utilisations.

Description

UTILISATION DE PROMOTEURS SPÉCIFIQUES HYBRIDES POUR CONTROLER L'EXPRESSION TISSULAIRE
La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particuler le domaine de la régulation de l'expression de gènes. Elle décrit notamment de nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression ciblée et forte de gènes. La présente invention est utilisable dans de nombreux domaines, et en particulier pour la production de protéines recombinantes, pour la création de modèles animaux transgéniques, pour la création de lignées cellulaires, pour la mise au point de tests de criblage, ou encore en thérapie génique et cellulaire.
La possibilité de contrôler et de diriger l'expression de gènes constitue un enjeu très important dans le développement des biotechnologies. In vitro, elle peut permettre d'améliorer les conditions de production de protéines recombinantes, en utilisant des populations particulières de cellules. Toujours in vitro, elle peut permettre la détection ou la mise en évidence de la présence de populations spécifiques de cellules dans un échantillon, ou également de tester les propriétés d'un produit ou la régulation d'un gène dans une population spécifique de cellules. Le contrôle de l'expression de gènes est également très important pour des approches thérapeutiques ex vivo ou in vivo, dans lesquelles la possibilité de contrôler sélectivement la production d'une molécule thérapeutique est essentielle. En effet, selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties seulement d'un organisme afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter la dissémination et les effets secondaires.
Le ciblage de l'expression d'un acide nucléique donné peut être réalisé selon différentes approches. Une première approche consiste par exemple à utiliser des vecteurs ou des agents de transfert présentant une spécificité cellulaire donnée. Cependant, la spécificité conférée par ce type de vecteurs est généralement assez grossière et ne permet pas un ciblage de populations précises de cellules. Une autre approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certains types cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits "spécifiques" ont été décrits dans la littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase, la villine, la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, le promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, le promoteur SM22 ou encore le promoteur du gène de l'albumine humaine par exemple. Cependant, si ces promoteurs présentent une spécificité tissulaire, ils présentent également, en contrepartie, une puissance relativement faible. Ainsi, la grande majorité de ces promoteurs possède des niveaux d'activité qui sont bien en deçà de ceux de promoteurs dits "forts", généralement d'un facteur compris entre 10 et 100 au moins. En outre, il est généralement considéré que la spécificité d'un promoteur est inversement proportionnelle à sa force et que, plus la force est augmentée, plus le niveau d'activité non-spécifique est important.
Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir disposer de promoteurs qui soient à la fois spécifiques de certains tissus et forts. L'objet de la présente invention est précisément de fournir de nouvelles constructions permettant l'expression forte et ciblée de gènes.
L'invention décrit en particulier de nouveaux promoteurs chimériques permettant une expression de gènes forte et spécifique des cellules musculaires lisses. L'invention décrit également des vecteurs contenant de tels promoteurs et leur utilisation pour le transfert de gènes dans les cellules in vitro, ex vivo et in vivo. Les constructions de l'invention permettent pour la première fois de combiner des propriétés opposées, à savoir un grande sélectivité et une activité transcriptionnelle élevée. La présente invention offre ainsi un moyen particulièrement performant pour le ciblage de l'expression de gènes dans des cellules du muscle lisse, in vivo ou in vitro, et pour la régulation de cette expression.
L'invention repose plus particulièrement sur la construction de promoteurs chimériques (ou hybrides), comprenant des régions d'origine et de fonction différentes. Plus particulièrement, un premier objet de l'invention réside dans un promoteur hybride comprenant :
- tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et ubiquitaire, et - une région promoteur permettant l'expression spécifique dans les cellules musculaires lisses.
L'association de régions enhanceur et de promoteurs a déjà été décrite dans l'art antérieur. Ainsi, il est connu par exemple de coupler la région enhanceur du CMV avec des promoteurs non spécifiques tels que le promoteur du gène de l'actine- β de poulet (WO96/13597) afin d'augmenter leur force. Néanmoins, de telles constructions n'ont pas été décrites ou suggérées dans le but de tenter d'obtenir une expression forte et spécifique des cellules du muscle lisse. L'invention repose en partie sur la sélection et la combinaison d'éléments "enhancers" particuliers et d'éléments "promoteurs" particuliers. L'invention repose également sur la mise en évidence que cette combinaison d'éléments permet d'obtenir une expression à des niveaux élevés, sans affecter la sélectivité du promoteur pour les cellules cibles du muscle lisse. L'invention fournit donc des constructions particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent la production ciblée et avec des niveaux importants de molécules dans les cellules du muscle lisse. En outre, la présente demande montre également que ces constructions peuvent être utilisées aussi bien in vitro que in vivo.
Dans les promoteurs hybrides selon l'invention, la région enhancer et la région promoteur sont associées de manière fonctionnelle, c'est-à-dire de sorte que la région enhancer exerce une activité stimulante sur l'activité de la région promoteur. Généralement, ces deux régions sont donc liées génétiquement et sont suffisamment proches l'une de l'autre pour permettre à la région enhancer d'activer la région promoteur. Préférentiellement, la distance séparant la région enhancer et la région promoteur est inférieure à 1 kb, plus préférentiellement inférieure à 500 pb. Dans les constructions particulièrement préférées selon l'invention, ces deux régions sont espacées de moins de 400 pb, plus préférentiellement de moins de 200 pb. En outre, comme le montrent les exemples, l'orientation respective des deux régions n'a pas d'influence significative sur l'activité des promoteurs hybrides de l'invention. De ce fait, la région enhancer peut être positionnée dans la même orientation ou dans l'orientation inverse par rapport au sens de la transcription de la région promoteur. Dans un mode préféré de mise en œuvre, la région enhancer est choisie parmi la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), la région enhancer du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV), la région enhancer du virus SV40, et la région enhancer du gène EFlα. Plus préférentiellement, dans les promoteurs hybrides de l'invention, la région enhancer est la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), de préférence du cytomégalovirus humain (hCMV-IE). Une région enhanceur particulière est constituée par exemple du fragment —522 à -63 du gène hCMV-IE, ou de tout fragment comprenant au moins une partie de celui-ci et présentant une activité enhancer.
S 'agissant de la région promoteur, on utilise avantageusement pour la mise en œuvre de l'invention une région comprenant tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'actine-α de cellules musculaires lisses (SMact) ou du gène SM22. Le promoteur de ces gènes a été décrit pour son caractère spécifique des cellules du muscle lisse (voir notamment Ueyama H. et coll., Mol. Cell. Biol, 4 (1984) 1073- 1078 ; Solway J. et coll., J. Biol. Chem., 270 (1995) 13460-13469).
Une première variante particulièrement avantageuse de la présente invention est constituée par un promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus humain (hCMV-IE), et
- tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'actine-α de cellules musculaires lisses (SMact), de préférence du gène Smact humain.
Une deuxième variante particulièrement avantageuse de la présente invention est constituée par un promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus humain (hCMV-IE), et
- tout ou partie du promoteur du gène SM22, de préférence du gène SM22 alpha de souris.
Par ailleurs, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la région promoteur utilisée est une région chimère comprenant un promoteur basai et une séquence conférant la spécificité tissulaire, ladite séquence étant dérivée du promoteur SMact ou du promoteur SM22, ou d'une combinaison des deux. Dans ce mode de réalisation, le promoteur basai peut être un promoteur "minimal", c'est-à-dire comprenant uniquement les séquences essentielles à l'activité de promoteur transcriptionnel (par exemple une boîte TATA). Ce promoteur basai peut être le propre promoteur basai du gène SMact ou SM22, ou d'origine hétérologue (β- globine, HSV-TK, SV40 ou EFl-α par exemple ). La séquence conférant la spécificité tissulaire comprend avantageusement une partie de la séquence du promoteur SMact (R. T. Shimizu et al. J. Biol. Chem. 270 (1995) 7634-7643) et/ou du promoteur SM22 ( L.Li et al. J Cell. Biol. 132 (1996) 849-859; S. Kim et al. J. Clin. Invest. 100 (1997) 1006-1014; Kemp et al. Biochem. J. 310 (1995) 1037-1043). Un type particulier de promoteur hybride selon l'invention comprend donc :
- tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et ubiquitaire,
- un promoteur basai et,
- une séquence conférant la spécificité tissulaire comprenant tout ou partie du promoteur SMact et/ou du promoteur SM22.
Pour la construction des promoteurs hybrides de l'invention, les techniques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier peuvent être mises en œuvre. Ainsi, la région enhancer et la région promoteur (y compris le promoteur basai et la séquence conférant la spécificité tissulaire) peuvent être isolées par les techniques classiques à partir de banques d'acides nucléiques ou à partir de l'ADN cellulaire total, par exemple par amplification au moyen de sondes spécifiques. Ces fragments peuvent également être synthétisés artificiellement en utilisant les informations de séquences disponibles dans l'art antérieur. Lorsque ces fragments sont obtenus, ils peuvent être aisément combinés entre eux au moyen de ligases et autres enzymes de restriction, pour générer des promoteurs hybrides de l'invention. En outre, ces fragments peuvent être modifiés par digestion, mutation, insertion ou addition de paires de bases, soit dans le but de faciliter leur clonage, soit dans le but de modifier leurs propriétés fonctionnelles. Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, les fragments peuvent être associés directement l'un à l'autre ou au contraire espacés par des paires de bases n'ayant pas d'influence significative sur l'activité du promoteur hybride. Les promoteurs hybrides de l'invention possèdent ainsi la capacité d'exprimer un acide nucléique d'intérêt de manière spécifique dans les cellules musculaires lisses. Le caractère « spécifique » de l'expression signifie que l'activité du promoteur est significativement très supérieure dans les cellules du muscle lisse. Bien qu'une expression non-spécifique puissse exister dans d'autres cellules, le niveau d'activité correspondant reste généralement très faible (négligeable) par rapport à celui observé dans les cellules du muscle lisse, généralement inférieur d'un facteur 10 au moins. Les résultats présentés dans les exemples montrent à cet égard un différentiel d'expression pouvant atteindre un facteur 140, ce qui témoigne de la sélectivité importante des promoteurs de l'invention. A cet égard, les résultats présentés montrent également une forte spécificité à l'égard des cellules musculaires lisses puisque aucune expression n'a été détectée dans les cellules endothéliales qui se trouvent au voisinage, dans le vaisseau sanguin, notamment l'artère. Les résultats présentés dans les exemples montrent également que la force des promoteurs de l'invention est bien supérieure à celle des promoteurs spécifiques non-hybrides, le différentiel pouvant dépasser un facteur 100. Ces éléments illustrent donc les propriétés avantageuses et inattendues des promoteurs hybrides de l'invention, en terme de force et de spécificité, pour l'expression d'acides nucléiques d'intérêt dans les cellules du muscle lisse.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt, placé sous le contrôle d'un promoteur hybride tel que défini ci-avant. Avantageusement, la cassette de l'invention comprend en outre un signal de terminaison de la transcription, placé en 3' de l'acide nucléique.
Compte tenu des populations cellulaires ciblées par les cassettes de l'invention, l'acide nucléique peut coder par exemple pour une protéine choisie parmi : les protéines impliquées dans le cycle cellulaire, telles que par exemple p21 ou toute autre protéine inhibitrice des kinases dépendantes des cyclines (cdk), le produit du gène du rétinoblastome (Rb), GAX, GAS-1, GAS-3, GAS-6, Gadd 45, Gadd 153, les cyclines A, B et D. les protéines induisant l'apoptose, telles que par exemple p53, les membres de la famille des inducteurs d'apoptose tel que Bas, Bcl-Xs, Bad ou tout autre antagoniste de Bcl2 et de Bcl-Xi . les protéines capables de modifier la prolifération des cellules musculaires lisses, telles que par exemple un anticorps intracellulaire ou un ScFv inhibant l'activité de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, comme par exemple la protéine Ras, la map- kinase, ou des récepteurs à la tyrosine-kinase ou aux facteurs de croissance. des protéines de marquage (LacZ, GFP, Luc, Phosphatase alcaline sécrétée (SeAP), hormone de croissance (GH) etc) dans le but de réaliser des études de prolifération ou des études de diagnostic, les protéines induisant l'angiogénèse, telles que par exemple les membres de la famille du VEGF, les membres de la famille du FGF et plus particulièrement FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, l'angiogénine, l'EGF, le TGFα, le TGFβ, le TNFα, le Scatter Factor/HGF, les membres de la famille des angiopoëtines, les cytokines et en particulier les interleukines dont IL-1, IL-2, IL-8, l'angiotensine-2, l'activateur du plasminogène (TPA), l'urokinase (uPA), les molécules impliquées dans la synthèse de lipides actifs (prostaglandines, Cox-1). les facteurs de transcription, tels que par exemple les récepteurs nucléaires naturels ou chimériques, comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de liaison au ligand et un domaine activateur ou inhibiteur de la transcription, tels que par exemple les protéines de fusion tetR-NLS-VP16, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux oestrogènes, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux hormones stéroîdiennes, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux progestérones, les protéines du système CID (Chemical Inducer of Dimerization) décrit par Rivera et col. (Rivera et al. (1996), A humanized
System for pharmacologie control of gène expression, Nature Médecine, 2
: 1028-1032).
Il est entendu que la présente invention n'est pas limitée à des exemples particuliers de protéines ou ARN, mais qu'elle peut être utilisée par l'homme du métier pour l'expression de tout acide nucléique dans les cellules du muscle lisse, par de simples opérations d'expérimentation habituelles.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant un promoteur hybride ou une cassette tels que définis ci-avant. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant, etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
Parmi les vecteurs de type plasmidique, on peut citer tous les plasmides de clonage et/ou d'expression connus de l'homme du métier et qui comportent généralement une origine de réplication. On peut citer également des plasmides de nouvelles génération portant des origines de réplication et/ou des marqueurs perfectionnés tels que décrits par exemple dans les demandes WO96/26270 et PCT/FR96/01414.
Parmi les vecteurs de type virus recombinant, on peut citer préférentiellement les virus adénovirus, rétrovirus, virus de l'herpès ou virus adéno-associés recombinants. La construction de ce type de virus recombinants défectifs pour la réplication a été largement décrite dans la littérature, ainsi que les propriétés d'infection de ces vecteurs (voir notamment S. Baeck et K.L. March (1998), Circul. Research vol. 82, pp 295-305), T. Shenk, B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley et al (1996), Adenoviridae : the viruses and their réplication (in virology). Pp 211-2148, EDS - Ravenspublishers/Philadelphia, P. Yeh et M. Perricaudet (1997), FASEB Vol. 11, pp 615-623.
Un virus recombinant particulièrement préféré pour la mise en œuvre de l'invention est un adénovirus recombinant défectif.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. Il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande WO94/26914 incorporée à la présente par référence.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région El, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al, Gène 101 (1991) 195 ; Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant tsl25, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une déletion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes WO94/28152, WO95/02697, WO96/22378). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (WO96/10088).
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5.
Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend une déletion dans la région El de son génome. Encore plus particulièrement, il comprend une déletion des régions Ela et Elb. A titre d'exemple précis, on peut citer des délétions affectant les nucléotides 454-3328; 382-3446 ou 357-4020 (par référence au génome de l'Ad5).
Selon une variante préférentielle, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend en outre une déletion dans la région E4 de son génome. Plus particulièrement, la déletion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes. On peut citer à titre d'exemple précis les délétions 33466-35535 ou 33093-35535. D'autres types de délétions dans la région E4 sont décrites dans les demandes WO95/02697 et WO96/22378, incorporées à la présente par référence.
La cassette d'expression peut être insérée en différents sites du génome recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région El, E3 ou E4, en remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut égelement être insérée en tout autre site, en dehors des séquences nécessaires en cis à la production des virus (séquences ITR et séquence d'encapsidation). Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. Parmi les lignées d'encapsidation connues par l'homme du métier, on peut citer par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela et Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVa2. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région E 1 , c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32°C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région El ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (WO94/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites. En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions El et E4 (Yeh et al., J. Virol. Vol. 70 (1996) pp 559-565; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322 ; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions El et E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral recombinant complet, éventuellement construit dans une bactérie (WO96/25506) ou dans une levure (WO95/03400), transfecté dans les cellules. Il peut également s'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral recombinant par recombinaison homologue entre les différents fragments.
Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode alternative a été décrite dans la demande FR96:08164 incorporée à la présente par référence.
L'invention concerne également une composition comprenant un vecteur tel que défini ci-avant et un agent de transfert chimique ou biochimique. On entend par le terme "agent de transfert chimique ou biochimique" tout composé (i.e., autre qu'un virus recombinant) facilitant la pénétration d'un acide nucléique dans une cellule. Il peut s'agir d'agents non viraux cationiques comme des lipides cationiques, des peptides, des polymères (Polyéthylène Imine, Polylysine), des nanoparticules ; ou d'agents non viraux non cationiques comme des liposomes non cationiques, des polymères ou des nanoparticules non cationiques. De tels agents sont bien connus de l'homme du métier.
L'invention concerne également une composition comprenant un virus recombinant tel que défini précédemment et un véhicule physiologiquement acceptable.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable, en particulier pour une injection intravasculaire ou dans les tissus du muscle lisse. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. D'autres excipients peuvent être utilisés tels que par exemple un hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845. Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux. L'utilisation d'un hydrogel est particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques dans les parois vasculaires, et notamment dans les cellules musculaires lisses des parois vasculaires. Les doses utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, du but poursuivi (marquage, pathologie, dépistage, etc), du gène à exprimer, ou encore de la durée de 1 'expression recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10^ pfu, et de préférence 10^ à lθlO pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution virale, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Pour une utilisation in vitro ou ex vivo, les cassettes, vecteurs ou compositions de l'invention peuvent être incubés à des doses classiques en présence des populations de cellules choisies. Ces incubations peuvent être réalisées sur des boites de culture, des flasques, des fermenteurs, ou tout autres dispositif choisi.
Par ailleurs, l'invention concerne également toute cellule modifiée par une cassette ou un vecteur (notamment un adénovirus) tels que décrits ci-avant. On entend par cellule « modifiée » toute cellule contenant une construction selon l'invention. Ces cellules peuvent être utilisées pour la production de protéines recombinantes in vitro. Elles peuvent également être destinées à une implantation dans un organisme, selon la méthodologie décrite dans la demande WO95/14785. Ces cellules sont préférentiellement des cellules musculaires lisses humaines. L'invention concerne également l'utilisation d'un promoteur hybride tel que défini ci-avant pour l'expression spécifique d'un acide nucléique dans les cellules musculaires lisses, in vitro, ex vivo ou in vivo.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un promoteur hybride tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée à l'expression d'un acide nucléique dans les cellules musculaires lisses in vivo et pas dans les cellules endothéliales qui se trouvent au voisinage dans l'artère.
En raison de leur caractère spécifique des cellules du muscle lisse, les constructions selon l'invention sont également utilisables pour la création de modèles animaux de pathologies vasculaires ou pour la réalisation d'études de marquage ou dans des méthodes de détection ou de dépistage de la présence de cellules musculaires lisses dans des échantillons.
La présente invention a encore pour objet un procédé de production de protéines recombinantes comprenant l'introduction dans une population cellulaire d'un vecteur tel que défini ci-avant, la culture de ladite population cellulaire recombinante, et la récupération de ladite protéine produite. Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on utilise des cellules musculaires lisses. Il peut s'agir de lignées établies ou de cultures primaires.
La présente demande sera décrite plus en détails à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Tableau I : Activités relatives des promoteurs hybrides (hSMα-actine) évaluées en transfections transitoires in vitro dans des cellules musculaires lisses de lapin en culture primaire (SMC lapin), dans des cellules ECV304, dans des myoblastes C2C12, dans des cellules HeLa, dans des cellules NIH 3T3, dans des cellules de carcinome TU182, ainsi que dans les cellules rénales 293. L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. HnE-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée.
Tableau II : Activités relatives des promoteurs hybrides (mSM22) évaluées en transfections transitoires in vitro dans des cellules musculaires lisses de lapin en culture primaire (SMC lapin), dans des cellules ECV304, dans des myoblastes C2C12, dans des cellules HeLa, dans des cellules NIH 3T3, dans des cellules de carcinome TU182, ainsi que dans les cellules rénales 293. L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. HnE-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée.
Figure 1 : Représentations schématiques des plasmides dont la cassette d'expression contient le promoteur hybride hSMα-actine.
Figure 2 : Représentations schématiques des plasmides dont la cassette d'expression contient le promoteur hybride mSM22α.
Figure 3 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfections transitoires in vitro dans des cellules musculaires lisses de lapin en culture primaire (SMC de lapin), dans des cellules endothéliales issues d'un carcinome de cordon ombilical humain (ECV304), dans des myoblastes de souris (C2C12) ainsi que dans des cellules épithéliales issues d'un carcinome du col de l'utérus humain (HeLa). L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. hnE-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée. Figure 4 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfections transitoires in vitro dans des fibroblastes embryonnaires de souris (NIH 3T3), dans des cellules issues d'un carcinome ORL humain (TU182), ainsi que dans des cellules rénales embryonnaires humaines transformées (293). L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. hnE-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée.
Figure 5 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfert de gène in vivo dans le muscle tibial cranial de souris C57BL6. L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK.
MATERIELS ET METHODES
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose, la purification de fragments d'ADN par électroélution, la précipitation d'ADN plasmidique en milieu salin par l'éthanol ou l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli sont bien connues de l'homme de l'art et sont abondamment décrites dans le littérature (Sambrook et coll. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Le plasmide pGL3 -Basic, utilisé pour les clonages des différentes régions promotrices, est d'origine commerciale (Promega Corporation). Les plasmides pCMVβ (Clontech Laboratories Inc.) et pUC18 (Boehringer Mannheim) sont également d'origine commerciale. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique d'ACP (Amplification en Chaine par la Polymerase) peut être effectuée en utilisant un DNA thermal cyclerτ (Perkin Elmer Cetus) selon les recommandations du fabricant.
L'électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules d'Escherichia coli peut être réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les recommandations du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par le méthode développée par Sanger et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467) en utilisant le kit distribué par Applied Biosystems selon les recommandations du fabricant.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Construction de promoteurs hybrides et de plasmides d'expression les contenant.
1.1. Promoteurs hSMα-actine hybrides.
. Plasmide phSMact. L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été préparé selon la méthode décrite par Sambrook et coll. ("Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) à partir d'une culture primaire de cellules musculaire lisses aortiques humaines (Clonetics).
Cet ADN a été utilisé comme matrice pour une première amplification par ACP utilisant les amorces suivantes :
- Amorce 6417 (5' GATGGTCCCTACTTATGCTGCTA 3') (SEQ ID 1) commençant à la position -1034 (région promotrice) du gène de l'α-actine de muscle lisse spécifique humain (Ueyama H. et coll., Mol. Cell. Biol, 4 (1984) 1073-1078. Accès Genbank D00618). - Amorce 6418 (5' CTTCCATCATACCAAACTACATA 3') (SEQ ID 2) en position 1974 de la séquence D00618 se situant à l'intérieur du premier intron du gène hSMact. Le mélange réactionnel comprend 1 mg d'ADN génomique, 10 pmoles de chacune des deux amorces (6417 et 6418), 100 mM de chaque désoxyribonucléotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgC12 et 5 unités de Taq ADN polymérase (PerkinElmer). Le volume réactionnel est complété à 50 ml ajusté à la concentration optimale du tampon ACP recommandée par Perkin Elmer.
L'amplification ACP est réalisée dans des tubes Micoamp™ (Perkin Elmer) à laide d'un thermocycleur PTC- 100™ (MJ Research, Inc.). Cette amplification consiste en une étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation de 15 sec à 95°C, une étape d'hybridation de 30 sec à 60°C et une étape d'extension de 1 min à 72°C. Ces trentes cycles sont suivis d'une extension supplémentaire de 5 min puis les réations ACP sont conservées à 10°C.
Un microlitre de cette réaction a été prélevé de cette première réaction puis dilué dans 10 ml d'eau. Ensuite 1 ml de cette dilution a été utilisé pour réaliser une seconde ACP dans les mêmes conditions que la première (ci-dessus) mais avec un couple d'amorces différent :
-Amorce 6453 (5' CTGCTAAATTGctcgagGACAAATTAGACAAA 3*) (SEQ ID 3), cette amorce introduit un site Xhol (minuscules soulignées) en amont du promoteur hSMact (position -680).
- Amorce 6456 (5' CCCTGACAaagcttGGCTGGGCTGCTCCACTGG 3') (SEQ ID 4), cette amorce introduit un site HindIII en position +30 de hSMact.
Après analyse sur un gel d'agarose puis purification, le fragment d'ADN amplifié par ACP est digéré pendant 3 heures à 37°C par Xhol et HindIII puis clone dans le vecteur pGL3 -Basic (Promega) préalablement digéré par ces même enzymes de restriction, pour générer le plasmide phSMact (Figure 1).
. Plasmides pXL3130 et pXL3131. Un fragment d'ADN correspondant à la région enhancer du promoteur du gène IE du cytomégalovirus humain (hCMV-IE) comprise entre les positions -522 et -63 par rapport au site d'initiation de la transcription, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pCMVβ comme matrice et les oligonucléotides 8557 (5' ATC GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3') (SEQ ID 5) et 8558 (5' ATC GAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG GGG CGG AGT TG 3') (SEQ ID 6) comme amorces. Ce fragment a été digéré par MluI puis a été clone dans le plasmide phSMact préalablement digéré par MluI et traité par la phosphatase alcaline. Selon le sens d'insertion du fragment deux plasmides différents ont été obtenus : pXL3130 et pXL3131. Les représentations schématiques de ces plasmides sont rassemblées dans la figure (figure 1). Ces plasmides comportent, sous forme d'un fragment Mlul-Nçol, un promoteur hybride constitué de l'enhancer du promoteur du gène hCMV-IE et du promoteur du gène hSMα-actine.
1.2. Promoteurs mSM22 hybrides.
. Plasmide pmSM22. L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été préparé selon la méthode décrite par Sambrook et coll. ("Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) à partir d'un foie de souris Balbc.
Cet ADN a été utilisé comme matrice pour une amplification par ACP utilisant les amorces suivantes :
- Amorce 6517 :
(5' CCAGGCTGCActcgagACTAGTTCCCACCAACTCGA 3') (SEQ ID 7), cette amorce introduit un site Xhol (minuscules soulignées) en position -436 du promoteur du gène SM22 alpha de souris (Solway J. et coll., J. Biol. Chem., 270 (1995) 13460-13469 ; Accès Genbank L41161).
- Amorce 6518 :
(5' TCGTTTGaagçttGGAAGGAGAGTAGCTTCGGTGTC 3") (SEQ ID 8), cette amorce introduit un site HindIII en position +43 de mSM22 alpha.
Un mélange réactionnel comprenant 1 mg d'ADN génomique de souris, et 10 pmoles de chacune des deux amorces (6517 et 6518) a été préparé avec les mêmes réactifs que pour hSMact et aux mêmes concentrations, suivi d'une amplification ACP réalisée dans les mêmes conditions (voir exemple 1.1.).
Après analyse sur un gel d'agarose puis purification, le fragment d'ADN amplifié par ACP est digéré pendant 3 heures à 37°C par Xhol et HindIII puis clone dans le vecteur pGL3-Basic (Promega) préalablement digéré par ces même enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été désigné pmSM22 (Figure 2).
. Plasmide pXL3152 et pXL3153. Un fragment d'ADN correspondant à la région enhancer du promoteur du gène hCMV-IE comprise entre les positions -522 et -63 par rapport au site d'initiation de la transcription, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pCMVβ comme matrice et les oligonucléotides 8557 (5' ATC GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3') (SEQ ID 5) et 8558 (5' ATC GAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG GGG CGG AGT TG 3') (SEQ ID 6) comme amorces. Ce fragment a été digéré par MluI puis a été clone dans le plasmide pmSM22 préalablement digéré par MluI et traité par la phosphatase alcaline. Selon le sens d'insertion du fragment deux plasmides différents ont été obtenus : pXL3152 et pXL3153. Les représentations schématiques de ces plasmides sont rassemblées dans la figure 2. Ces plasmides comportent, sous forme d'un fragment Mlul-Nçol, un promoteur hybride constitué de l'enhancer du promoteur du gène hCMV-IE et du promoteur du gène mSM22.
1.3. Plasmide de contrôle pCMV-leadTK.
Le vecteur d'expression pCGN précédemment décrit par Tanaka et coll. (Cell , 60 (1990) 375-386) contient le promoteur CMV (-522/+72) fusionné au "leader" du gène tk de HSV (+51/+101) en amont d'une séquence codant pour l'épitope de l'hémagglutinine. Le plasmide pCGN (10 ng) a été utilisé comme matrice pour une amplification ACP. La réaction ACP ainsi que l'amplification ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles utilisées pour hSMact et mSM22 (exemples 1.1 et 1.2). Les amorces qui ont été utilisées sont les suivantes : - Amorce 6718 (5' CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3') (SEQ ID 9), cette amorce s'hybride avec le promoteur CMV en position -522 (8 nucléotides en aval du site EcoRI de pCGN).
- Amorce 6719 (5' gGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA 3') (SEQ ID 10), cette amorce s'hybride jusqu'en position 101 du "leader" tk. Le premier nucléotides G en gras est destiné à restaurer le site Ncol de pGL3-Basic comme sera explicité ci dessous.
Le fragment d' ACP ainsi obtenu est purifié puis phosphorylé à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (New England Biolabs). Parallèlement, le vecteur pGL3-Basic (Promega) a été linéarisé par NcoL purifié puis traité par la Klenow ADN polymerase (Boehringer Manheim) afin de remplir le site Ncol. Ce vecteur est ensuite déphosphorylé à l'aide de la phosphatase alcaline (Boehringer Manheim) puis utilisé pour l'insertion du fragment d' ACP phosphorylé. Ainsi, la guanosine (G) de l'amorce 6719 permet de restaurer le site Ncol uniquement lorsque le fragment CMV- leader tk est orienté avec la partie 5' (amorce 6718, position -522 du CMV) en aval du site HindIII de pGL3-Basic et son extrémité 3' (amorce 6719, leader tk) est ligaturée au site Ncol de pGL3-Basic (premier ATG de la luciférase). Le plasmide ainsi obtenu est désigné pCMV-leadTK.
EXEMPLE 2 : Spécificité des promoteurs hybrides in vitro.
Cet exemple illustre les propriétés de spécificité tissulaire des promoteurs hybrides de l'invention in vitro.
2.1. Cultures cellulaires.
Les cellules musculaires lisses (SMC) de lapin sont cultivées en milieu DMEM™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 20%) de sérum de veau foetal (SVF). Les cellules ECV304 sont cultivées en milieu 199™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 10%> de SVF. Les myoblastes C2C12, les cellules HeLa, les cellules NIH 3T3 ainsi que les cellules TU 182 sont cultivées en milieu DMEM™ supplémenté avec 10% de SVF. Les cellules 293 sont cultivées en milieu MEM™ (Life Technologies Inc.) supplémenté avec du pyruvate, des acides aminés non essentiels et 10% de SVF. Toutes les cultures sont réalisées dans une étuve à 37°C, en atmosphère humide et sous une pression partielle en CO2 de 5%.
2.2. Transfections in vitro.
Les transfections sont réalisées en plaques 24 puits et chaque transfection est effectuée trois fois. Vingt quatre heures avant la transfection, les cellules sont ensemencées : (i) à 5x104 cellules par puits pour les cellules musculaires lisses de lapin, les cellules ECV304, NIH 3T3 et HeLa, (ii) à 105 cellules par puits pour les cellules TU182, (iii) à 3xl04 cellules par puits pour les cellules C2C12, et (iv) à 2xl05 cellules par puits pour les cellules 293.
Pour chaque puits, 500 ng d'ADN plasmidique (250 ng de plasmide d'intérêt et 250 ng de pUC18) sont mélangés au lipide cationique RPR120535 B (WO 97/18185) à raison de 6 nmoles de lipide par μg d'ADN dans du milieu DMEM™ (20 μl final) comprenant 150 mM de NaCl et 50 mM de bicarbonate. Après 20 minutes à température ambiante, les 20 μl du mélange ADN/lipide sont mis en contact avec les cellules, en absence de SVF, durant 2 heures. Le milieu de culture est alors supplémenté en SVF de manière à obtenir le pourcentage de SVF requis pour la culture de chaque type cellulaire.
Quarante huit heures après la transfection, le milieu de culture est retiré et les cellules sont rincées deux fois avec du PBS (Life Technologies Inc.). L'activité luciférase est alors déterminée à l'aide du kit Luciférase Assay System™ (Promega Corporation) selon les recommandations du fournisseur.
2.3. Activités spécifiques des promoteurs hybrides.
Les activités luciférases relatives des promoteurs hybrides (par rapport au promoteur pCMV-lead TK) mesurées in vitro dans sept types cellulaires différents, sont rassemblées dans les figures 3 et 4, ainsi que dans les tableaux I et IL Les résultats montrent que pour les promoteurs hSMact (Tableau I) et mSM22 (Tableau II), l'activité relative est une valeur qui rend bien compte de la spécificité de ces promoteurs pour les cellules musculaires lisses ; spécificité qui a déjà été décrite dans la littérature (Skalli et coll., J. Histochem. Cytochem., 37 (1989) 315-321 ; Shimizu et coll., J. Biol. Chem., 270 (1995) 76 1-7643 ; Li et coll., J. Cell Biol, 132 (1996) 849- 859). En effet, l'activité relative dans les SMC de lapin est au moins 5 fois supérieure à celles observées dans les autres types cellulaires : (i) de 5 à 20 fois supérieure pour le promoteur hSMact (Tableau I), et (ii) de 5 à 25 fois supérieure pour le promoteur mSM22 (Tableau II).
Les résultats présentés dans les tableaux I et II montrent clairement que, dans les cellules musculaires lisses, l'activité des quatre promoteurs hybrides selon l'invention (Enh-hSMact, hnE-hSMact, Enh-mSM22, et hnE-mSM22) est comparable, en terme de force, à celle du promoteur CMV. D'autre part, l'activité relative de chacun de ces promoteurs, dans un autre type cellulaire, est au moins 10 fois inférieure pour les promoteurs hybrides hSMact, et au moins 4 fois inférieure pour les promoteurs hybrides mSM22, que celle observée dans les cellules musculaires lisses : (i) de 10 à 140 fois pour les promoteurs hybrides hSMact, et (ii) de 4 à 55 fois pour les promoteurs hybrides mSM22. Ces promoteurs hybrides conservent donc la même spécificité tissulaire que celle observée pour les promoteurs spécifiques hSMact et mSM22.
Ces résultats montrent en outre que l'orientation de la région enhancer dans les promoteurs hybrides de l'invention n'a pas d'influence significative sur leur activité.
Les quatre promoteurs hybrides possèdent donc, in vitro, une activité dans les cellules musculaires lisses aussi importante que celle du promoteur CMV (qui est réputé pour être un promoteur fort), tout en conservant une spécificité tissulaire comparable, voire supérieure, à celle des promoteurs hSMact et mSM22.
EXEMPLE 3 : Spécificité des promoteurs hybrides in vivo.
Cet exemple illustre les propriétés de spécificité tissulaire des promoteurs hybrides de l'invention in vivo. 3.1. Transfert de gène dans le muscle squelettique.
Les différents plasmides ont été injectés, en intramusculaire, dans le muscle tibial cranial de souris C57BL6 femelles âgées de 5 semaines. Chaque plasmide, dilué dans une solution de NaCl à 150 mM final, est injecté à raison de 10 μg par muscle. Trois jours après injection, les muscles sont prélevés dans 2 ml de tampon Cell Culture Lysis Reagent™ (Promega Corporation), et broyés à l'aide d'un homogénéiseur Diax (Heidolph). Le broyât est ensuite centrifugé durant 15 minutes à 4000 g, puis l'activité luciférase est évaluée à l'aide du kit Luciférase Assay System™ (Promega Corporation) selon les recommandations du fournisseur.
3.2. Activités des promoteurs hybrides dans le muscle squelettique in vivo.
Les activités relatives des deux promoteurs spécifiques (hSMact et mSM22) ainsi que celles de deux des promoteurs hybrides de l'invention (Enh-hSMact et Enh- mSM22) ont également été évaluées in vivo après transfert d'ADN nu dans le muscle tibial cranial de souris. Les résultats rassemblés dans la figure 5 montrent que l'activité du promoteur Enh-hSMact est 100 fois inférieure à celle du promoteur CMV. De même, l'activité du promoteur Enh-mSM22 est 17 fois inférieure à celle du promoteur CMV. Ainsi, la spécificité tissulaire observée in vitro, et notamment dans les cellules C2C12 qui constituent le modèle le plus proche de celui utilisé in vivo, est donc conservée in vivo.
EXEMPLE 4 : Construction d'adénovirus recombinants exprimant la protéine GAX sous contrôle de promoteurs hybrides spécifiques.
Cet exemple à pour but de décrire un vecteur adénoviral portant le gène codant pour la protéine GAX opérationellement lié au promoteur hybride de l'invention composé de l'enhancer CMV et du promoteur SMα-actine (enh-hSMact). Le gène gax humain comporte 912 paires de bases et code pour un facteur de transcription de 303 acides aminés impliqué dans l'arrêt de la croissance cellulaire (growth-arrest-specific homeobox) et ayant un rôle sur la prolifération des cellules musculaires lisses humaines. Ce gène à homeodomaine a été initialement isolé de l'aorte et est exprimé en particulier dans les tissus cardiovasculaires adultes (Gorski et al. 1993).
La séquence du gène humain de gax a été cloner à partir d'une banque de cDNA de muscle squelettique par PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant comme amorce une séquence dérivée du gène gax humain et publiée par Walsh et al. (Genomics (1994), 24, p535). La séquence a ensuite été clonée dans le vecteur d'expression pXL3297. Ce plasmide est dérivé du plasmide Bluescript (Stratagene) contenant l'enhancer/promoteur IE CMV humain (-522/+72) (Cell (1985), 41, p521) et le poly A de SV 40 (2538-2759)(GenBank locus SV4CG).
La construction utilise le plasmide pXL3130 décrit dans l'exemple 1 (figure 1) dans lequel le promoteur SMα-actine avait été préalablement introduit. Le plasmide pXL3297 est un vecteur d'expression contenant le gène gax humain. Il a été digéré par les enzymes HindIII et Avril afin d'introduire le gène gax humain dans le plasmide précédent pXL3282 également digéré par les enzymes HindIII et Avril pour donner le plasmide pXL 3300. Comme l'indique la figure 6, dans laquelle les différentes étapes de la construction des plasmides décrites ci-dessus sont détaillées, le plasmide final, pXL3310 comporte une cassette d'expression consituée de l'enhancer CMV-IE, le promoteur SMα-actine (pSMA), associés selon l'invention et opérationellement liés au gène codant pour la protéine GAX humaine ainsi que le signal de terminaison poly A de SV40.
La cassette d'expression du gène gax humain est ensuite introduite dans un adénovirus humain recombinant de sérotype 5 (Ad5) délété des régions El et E3 par co-transfection et recombinaison homologue entre le plasmide porteur de la cassette d'expression du gène gax et l'adénovirus, en cellules d'encapsidation. Ces cellules sont de préférence la lignée 293. La production d'un stock d'adénovirus contenant la cassette d'expression du gène gax humain, résulte de la lyse des cellules d'encapsidation 2 ou 3 jours après l'infection et l'isolation des particules virales recombinantes par centrifugation en gradient de chlorure de césium.
Les particules virales sont ensuite utilisées pour étudier l'expression du gène gax humain sous le contrôle du promoteur de l'invention dans des cellules musculaires lisses
L'expression de la protéine GAX est vérifiée 24 heures après l'infection des cellules primaires musculaires lisses par immunofluorescence ou par western blot en utilisant les anticorps polyclonaux anti-gax de lapin.
L'expression des ARN messagers est analysée 24 heures après l'infection des cellules musculaires lisses par dot blot et northern blot en utilisant un oligonucléotide dont la séquence est présente dans le gène gax.
L' analyse de l'activité biologique de l'adénovirus codant pour le gène gax est réalisée de la façon suivante :
Des cellules musculaires lisses en phase de croissance exponentielle sont infectées avec un adénovirus contenant le gène codant pour la protéine GAX sous le contrôle du promoteur enh-hSMact en l'absence et en présence de 125 ng de lipofectine (plaques 48 puits) . Les adénovirus (dans des dilutions variables) et la lipofectamine sont incubés pendant 30 minutes à température ambiante dans un milieu privé de sérum. Le mélange ou le virus seul est mis en contact avec les cellules pendant une heure à 37°C. A la fin de la période d'infection, le milieu contenant le virus est retiré et les cellules sont incubées en milieu DMEM contenant 0,5 % de SVF. Dans les 24 heures suivants l'infection le milieu de culture est remplacé par un milieu de croissance pour la moitié des cultures et l'incubation est poursuivie 48 heures pour permettre aux cellules d'entrer en phase S. Pour l'autre moitié des cultures, un milieu faiblement mitogène est ajouté pour maintenir les cellules en quiescence. Les cellules viables sont comptées 72 heures après l'infection en utilisant le protocole Alamar. TABLEAU I
TABLEAU II

Claims

REVENDICATIONS
1. Promoteur hybride comprenant : - tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et ubiquitaire, et
- une région promoteur permettant l'expression spécifique dans les cellules musculaires lisses.
2. Promoteur hybride selon la revendication 1 caractérisé en ce que la région enhancer est choisie parmi la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), la région enhancer du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV), la région enhancer du virus SV40, et la région enhancer du gène EF la.
3. Promoteur hybride selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région enhancer est la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), de préférence du cytomégalovirus humain (hCMV- IE).
4. Promoteur hybride selon la revendication 1 caractérisé en ce que la région promoteur comprend tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'actine-α de cellules musculaires lisses (SMact) ou du gène SM22.
5. Promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus humain (hCMV-IE), et
- tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'actine-α de cellules musculaires lisses (SMact).
6. Promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du cytomégalovirus humain (hCMV-IE), et
- tout ou partie du promoteur du gène SM22.
7. Promoteur hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce que la région promoteur comprend un promoteur basai et une séquence conférant la spécificité tissulaire, ladite séquence étant dérivée du promoteur SMact et/ou du promoteur SM22.
8. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt, placé sous le contrôle d'un promoteur hybride selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Cassette selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un signal de terminaison de la transcription.
10. Cassette selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'acide nucléique code pour une protéine choisie parmi les protéines impliquées dans le cycle cellulaire, les protéines induisant l'apoptose, les protéines capables de modifier la prolifération des cellules musculaires lisses, les protéines induisant l'angiogénèse et les facteurs de transcription.
1 1. Vecteur comprenant un promoteur hybride selon la revendication 1 ou une cassette selon la revendication 8.
12. Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un cosmide ou de tout ADN non encapsidé par un virus.
13. Vecteur selon la revendication 1 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant, de préférence dérivé d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus de l'herpès ou d'un virus adéno-associé.
14. Composition comprenant un vecteur selon la revendication 12 et un agent de transfert chimique ou biochimique.
15. Composition comprenant un virus recombinant selon la revendication 13 et un véhicule physiologiquement acceptable.
16. Cellule modifiée par une cassette selon la revendication 8 ou un vecteur selon la revendication 11.
17. Utilisation d'un promoteur hybride selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition destinée à l'expression sélective d'un acide nucléique dans les cellules musculaires lisses.
18. Utilisation d'un promoteur hybride selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition destinée à l'expression d'un acide nucléique dans les cellules musculaires lisses et pas dans les cellules endothéliales qui se trouvent au voisinage du vaisseau sanguin.
EP99943036A 1998-09-25 1999-09-23 Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire Withdrawn EP1115857A1 (fr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9812000A FR2783839B1 (fr) 1998-09-25 1998-09-25 Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire
FR9812000 1998-09-25
US12329899P 1999-03-04 1999-03-04
US123298P 1999-03-04
PCT/FR1999/002265 WO2000018908A1 (fr) 1998-09-25 1999-09-23 Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1115857A1 true EP1115857A1 (fr) 2001-07-18

Family

ID=26234566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP99943036A Withdrawn EP1115857A1 (fr) 1998-09-25 1999-09-23 Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1115857A1 (fr)
JP (1) JP2002525109A (fr)
KR (1) KR20010075338A (fr)
CN (1) CN1326506A (fr)
AU (1) AU775717B2 (fr)
CA (1) CA2343922A1 (fr)
HU (1) HUP0105230A3 (fr)
IL (1) IL142107A0 (fr)
WO (1) WO2000018908A1 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482155B1 (en) 2000-07-05 2009-01-27 Transgene S.A. Chimeric promoters for controlling expression in smooth muscle cells
EP1310561A1 (fr) * 2001-11-09 2003-05-14 Transgene S.A. Promoteurs chimeriques permettant de commander l'expression dans des cellules de muscles squelettiques

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266490A (en) * 1991-03-28 1993-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mammalian expression vector
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
PT787200E (pt) * 1994-10-28 2005-08-31 Univ Pennsylvania Adenovirus melhorado e metodos para a sua utilizacao
DE69731660T2 (de) * 1996-12-02 2005-12-22 Valentis Inc., Burlingame Insulinähnlicher wachstumfaktor i (igf-i) expressionssystem und methode zur verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0018908A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL142107A0 (en) 2002-03-10
AU5632499A (en) 2000-04-17
HUP0105230A3 (en) 2003-10-28
HUP0105230A2 (hu) 2002-04-29
JP2002525109A (ja) 2002-08-13
CA2343922A1 (fr) 2000-04-06
CN1326506A (zh) 2001-12-12
KR20010075338A (ko) 2001-08-09
AU775717B2 (en) 2004-08-12
WO2000018908A1 (fr) 2000-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0667912B1 (fr) Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
KR101752910B1 (ko) 종양 선택적 ｅ１ａ 및 ｅ１ｂ 돌연변이
WO1995014102A1 (fr) Adenovirus recombinants codant pour la thymidine kinase lors de therapie genique
KR20100105630A (ko) 유인원 아과 ｃ 아데노바이러스 ｓａｄｖ-40, -31, 및 -34 및 그것의 사용
FR2707664A1 (fr) Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2712602A1 (fr) Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
JPH11503011A (ja) 条件発現系
EP1078094B1 (fr) Methodes et compositions pour la production de particules virales
EP1002120B1 (fr) Vecteurs adenoviraux chimeres
FR2782732A1 (fr) Systeme d'expression inductible
FR2755699A1 (fr) Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes
FR2762615A1 (fr) Nouveau site interne d'entree des ribosomes et vecteur le contenant
EP1115857A1 (fr) Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire
EP1129204B1 (fr) Nouveau systeme de regulation de l'expression d'un transgene
EP0796338B1 (fr) Lignees cellulaires d'encapsidation pour la transcomplementation de vecteurs retroviraux defectifs
FR2783839A1 (fr) Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire
Ehsan et al. Antisense and gene therapy to prevent restenosis
Rubanyi Gene therapy—basic principles and the road from bench to bedside
MXPA01003065A (en) Use of specific hybrid promoters for controlling tissue expression
FR2786198A1 (fr) Nouveau systeme de regulation de l'expression d'un transgene
FR2737221A1 (fr) Nouveaux vecteurs viraux pour la therapie genique

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20010417

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

AX Request for extension of the european patent

Free format text: SI PAYMENT 20010417

17Q First examination report despatched

Effective date: 20031202

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20050210