JPH11503011A

JPH11503011A - 条件発現系

Info

Publication number: JPH11503011A
Application number: JP8529022A
Authority: JP
Inventors: ブラコ，ロラン; シユウエゴフエール，フアビアン; トツク，ブリユノ
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1999-03-23
Also published as: TW496873B; NO974449D0; IL117713A0; NO974449L; BR9607928A; FR2732348B1; HUP9801221A3; EP0817845A1; AU716748B2; HUP9801221A2; ZA962506B; FR2732348A1; MX9706928A; AU5402096A; CA2214451A1; SK131197A3; KR19980703439A; CZ308097A3; WO1996030512A1

Abstract

(57)【要約】この発明は遺伝子を発現するための新規の条件発現系に関する。この発明の系は主に、所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインと、トランス作用因子もしくはトランス抑制又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体に特異的に結合できる検出ドメインとを含む二重特異性キメラ分子の形成及び発現を基盤とする。

Description

【発明の詳細な説明】条件発現系本発明は、遺伝子を条件発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｎｅｌｌｅ）するための新規の発現系に関する。本発明は、遺伝子治療又は細胞治療で、目的の遺伝子の発現を極めて選択的に標的化するための前記発現系の使用にも関する。遺伝子治療及び細胞治療は、欠陥もしくは異常（突然変異、異常発現、等）を直すか、又は障害のある細胞もしくは器官に遺伝情報を導入することによって治療にかかわる目的のタンパク質を確実に発現させることからなる。前記遺伝情報は、器官から抽出した細胞内にｅｘｖｉｖｏで導入し、次いで改変した細胞を生体内に再導入するか（細胞治療）、又は適当な組織内にｉｎｖｉｖｏで直接導入し得る（遺伝子治療）。遺伝子の移入（ｔｒａｎｓｆｅｒｔ）を実施する方法は色々存在し、その中には、天然又は合成の化学的又は生化学的ベクター、例えばＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３）を使用する様々なトランスフェクション方法、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）、カチオン脂質の使用等がある。ウイルスを遺伝子移入用のベクターとして使用する方法もある。これに関しては、種々のウイルスが、特定の細胞集団に感染する能力について調べられた。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス及びアデノウイルスがそれである。しかしながら、これらの遺伝子治療及び細胞治療の開発における大きな問題の一つは、治療の選択性にある。治療効果を集中させ、四散及び副作用を制限するためには、用途に応じ、移入する遺伝子に応じて、生体の特定の組織又は特定の部分だけをターゲッティングできることが重要である。このターゲッティングは、所与の細胞特異性を有するベクターを用いて実施し得る。別の方法は、特定種類の細胞に特異的な発現シグナルを使用することからなる。これに関しては、いわゆる特異的プロモーターが文献に開示されている。例えば、ピルビン酸キナーゼ、ビリン、ＧＦＡＰをコードする遺伝子のプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質用のプロモーター、平滑筋細胞αアクチン用のプロモーター、又はアポＡＩ、アポＡＩＩ、ヒトアルブミン等の遺伝子のプロモーターである。しかしながら、これらのプロモーターは幾つかの欠点を有し、特に、毒性遺伝子の発現を妨害し得るある種の転写ノイズを有しており、また特定の細胞に限定されるため、あらゆる用途に使用できるわけではない。本発明は、極めて選択的であり効果的である新規の遺伝子条件発現系を開示する。本発明の系の有利な特徴の一つは、遺伝子を細胞の種類に応じて発現させる能力に存するのではなく、特定の細胞要素の存在、又は特定の生理学的状態に応じて発現させることができることにある。実際この系は、所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインと、トランス作用因子又はトランス作用複合体に特異的に結合できる検出ドメインとを含本発明の第一の態様は、より具体的には、所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインと、トランス作用因子もしくはトランス作用もしくはトランス抑制複合体に特異的に結合できる検出ドメインとを含む二重特異性キメラ分子の形成及び発現にある。本発明の別の態様は、前述のようなキメラ分子をコードする核酸配列、及び該核酸配列を含む発現ベクターにある。本発明の別の態様は、遺伝子条件発現系であって、（ｉ）前述のようなキメラ分子と、（ｉｉ）調節配列、（活性がトランス作用因子の存在に依存する）最小プロモーター及び前記遺伝子を含む発現カットとからなる遺伝子条件発現系にある。本発明のさらに別の態様は、前述のようなキメラ分子をコードする核酸配列と前記発現カットとを含む発現ベクターである。本発明の条件発現系は特に、目的の遺伝子の発現を極めて選択的に標的化するために、遺伝子治療又は細胞治療で使用するのに適している。従って本発明の系の構成要素の一つは、所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインと、トランス作用因子もしくはトランス作用複合体に特異的に結合できるドメインとを含む特殊な二重特異性キメラ分子からなる。本発明の分子の二重特異性は、所定のＤＮＡ配列（一般的に調節配列もしくはオペレーター配列と称する）と結合する能力、及び遺伝子の発現を誘発もしくは抑制するトランス作用又はトランス抑制タンパク質ドメインを特異的に捕捉する（ｒｅｃｒｕｔｅｒ）能力にある。本発明は特に、活性化又は不活性化によって或る生態病理学的状態を生起する転写因子を捕捉することができる二重特異性キメラ分子の開発を目的とする。本発明の二重特異性キメラ分子は、或る生態病理学的状態に特異的な転写トランス作用因子を選択的に捕捉し、プロモーターの近傍に位置する所定のＤＮＡ配列（調節配列もしくはオペレーター配列）に自らが結合することによって前記プロモーターに前記転写因子を結合させ、その結果遺伝子を条件発現させる（第１図）。本発明は、トランス作用ドメインを有する分子ではなく、転写トランス作用複合体、即ち細胞内に存在する標的分子とトランス作用ドメインを有する分子との間で形成された複合体の捕捉を可能にする二重特異性キメラ分子の開発にも関する（第２図）。この場合は、トランス作用ドメインと前記細胞分子に選択的に結合するドメインとを含む第二の二重特異性キメラ分子を用いてトランス作用複合体を形成するのが好ましい。前記第二の分子の結合によって転写トランス作用二成分複合体が形成され、この複合体は本発明の検出系に捕捉される。その結果形成された三成分複合体がプロモーターの近傍に結合されると、遺伝子の調節発現が生起する。この種の構築物を使用すれば、有利なことに、本発明の系の使用条件が、内因性分子であれ、又は例えば感染に由来する分子であれ、トランス作用ドメインを欠失した任意の細胞内分子の検出まで拡大される。従って本発明の系は、極めて選択的な検出系（「センサー」）により、標的タンパク質が存在する時にだけ目的の遺伝子の発現を活性化させる。前記標的タンパク質は、或る生理学的又は生態病理学的状況時に出現する転写因子、又は内因性の分子もしくは例えば感染に由来する分子であり得る。実際、本発明の系は、遺伝子の発現が細胞内の任意の分子の存在、出現又は消滅時に生起するように条件付ける、極めて高感度で極めて選択的な検出用成分を含む。本発明では、トランス作用因子という用語は、総ての転写トランス作用因子、又は転写トランス作用ドメインを含む総てのタンパク質を意味する。トランス作用複合体は、細胞内に存在する分子と、トランス作用ドメイン及び前記分子に特異的に結合するドメインを有する本発明の二重特異性分子との間の複合体を意味する。本発明の発現系は、トランス作用性であるか又はトランス作用ドメインを有する総てのタンパク質、特に、転写トランス作用活性を有するウイルス、寄生虫、ミコバクテリア又は細胞由来の総てのタンパク質を捕捉するために使用し得る。ウイルス由来の転写因子としては特に、ＨＩＶウイルスのタンパク質Ｔａｔ、パピローマウイルスのタンパク質Ｅ６／Ｅ７、又はエプスタイン・バールウイルスのタンパク質ＥＢＮＡが挙げられる。これらのタンパク質は転写トランス作用ドメインを有し、これらのウイルスに感染した細胞内にだけ存在する。即ち、特定の生態病理学的条件下でのみ存在する。本発明の条件発現系は有利なことに、前述の生理学的状況（ウイルス感染に特異的な前記トランス作用因子の出現）の検出、及び所与の遺伝子の選択的発現の誘発を可能にする。細胞タンパク質としては、好ましくは、突然変異型又は野生型のタンパク質ｐ５３が挙げられる。タンパク質ｐ５３は３９３個のアミノ酸からなる。このタンパク質は、野生型形態では、細胞の増殖及び分裂の負の調節を行うことができる腫瘍抑制因子である。この活性は、タンパク質ｐ５３のＮ末端領域（残基約１〜１００）に位置する該タンパク質の構造中の転写トランス作用ドメインの存在に関連している。特定の状況では、野生型ｐ５３はアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）を誘導することもできる（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，３４５−３４７，１９９１）。これらの性質は、細胞ＤＮＡの完全性が脅かされるストレス状況で発揮されるため、ｐ５３は「ゲノム守護された。種類の別なくヒト腫瘍の約４０％に突然変異ｐ５３が存在するという事実は前記仮説を裏付けるものであり、腫瘍の発生で前記遺伝子の突然変異が果たす決定的と思われる役割を強調するものである（Ｍｏｎｔｅｎａｒｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７，１６７３−１６８０，１９９２；Ｏｒｅｎ，ＦＡＳＥＢＪ．，６，３１６９−３１７６，１９９２；Ｚａｍｂｅｔｔｉ及びＬｅｖｉｎｅ，ＦＡＳＥＢＪ．，８５５−８６５，１９９３参照）。本発明では、タンパク質ｐ５３のトランス作用ドメインを選択的に捕捉することができ、従って前記タンパク質を含む細胞内でだけ遺伝子調節発現を誘発することができる。本発明では、前述のように細胞過剰増殖（癌タイプ）という生態病理学的状況で出現するタンパク質ｐ５３の突然変異形態を捕捉するのが特に有利である。このターゲッティングは、好ましくは、突然変異形態のタンパク質ｐ５３に特異的に結合するドメインを用いて実施し得る。しかしながら実際に、野生型より著しく長い半減期を有する突然変異形態の蓄積に関連した特異性が存在する。本発明の系は、細胞内に存在する任意の標的分子の検出により遺伝子の選択的発現を誘発するために使用することもできる。検出されるタンパク質は好ましくは、異常な状況時（感染、過剰増殖等）に細胞内に発生するタンパク質である。該タンパク質は特に、ウイルスの構造又は機能タンパク質のようなウイルスタンパク質、中でもＨＩＶ、肝炎、ヘルペス等のウイルスのタンパク質であり得る。該タンパク質はまた、細胞過剰増殖状態に特有のタンパク質、例えば特にタンパク質ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、サイクリン等でもあり得る。従って、本発明のキメラ分子の特性の一つは、ＤＮＡの特定領域（調節又はオペレーター領域）に結合する能力にある。この結合はトランス作用ドメインをプロモーターの近傍に配置させ、従って前記プロモーターの制御下にある遺伝子の発現を活性化させる。本発明の分子内に存在する、所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインは、本質的にタンパク質に由来する。より好ましくは、前記ドメインは、ＤＮＡ配列と相互に作用できる原核又は真核タンパク質に由来する。現在では多くの遺伝及び構造研究により、二本鎖ＤＮＡ配列と相互作用し合うタンパク質について、これらの相互作用に関与するドメインを正確に決定することができる。二本鎖ＤＮＡ配列と相互作用し合う原核タンパク質としては特に、細菌リプレッサー、好ましくは大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のテトラサイクリンリプレッサー及びλバクテリオファージのＣｒｏリプレッサーが挙げられる。大腸菌のテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）はアミノ酸数約２１０のタンパク質である。大腸菌内でｔｅｔＲは、オペロンｔｅｔ内の該抗生物質に対する耐性を仲介する遺伝子転写の負の調節を行う。テトラサイクリンの不在下では、リプレッサーｔｅｔＲは特定配列（オペレーター又はＴｅｔｏｐ配列と称する）のレベルでＤＮＡに結合され、耐性遺伝子の転写を抑制する。逆に、テトラサイクリンの存在下ではリプレッサーｔｅｔＲはオペレーターｔｅｔｏｐに結合されず、遺伝子の構成性転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）を可能にする（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．及びＷｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９），Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．及びＨｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．編（Ｍａｃｍｉｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４３−１６２）。ｔｅｔＲの配列は公開されている（特に国際特許出願公開第９４／０４６８２号で再現されている）。ＤＮＡ（Ｔｅｔｏｐ）へのｔｅｔＲの結合に特有の二本鎖ＤＮＡ配列は下記のユニットからなる：ＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡ（配列番号１）。このユニットは、系の親和性及び効果を高めるために複数回反復させ得る。例えば、調節配列は該ユニットを１０個まで含み得、好ましくは２個のユニット（Ｔｅｔｏｐ２）又は７個のユニット（Ｔｅｔｏｐ７）を含む（第３図参照）。タンパク質Ｃｒｏは最初は、ＣＩリプレッサーの発現を調節する物質であると定義された（Ｅｉｓｅｎ，Ｈ．ら，（１９７０）ＰＮＡＳ６６，ｐｐ．８５５）。遺伝子ｃｒｏのクローニングによって、アミノ酸６６個のタンパク質が同定された（配列番号２１；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔ．ら，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ２７０，ｐｐ．２７４）。ＣｒｏはλのオペレーターＯＲ₃に優先的に結合されて生理学的役割を果たす。ＤＮＡ（ＯＲ３と称する領域）へのＣｒｏの結合に特有な二本鎖ＤＮＡ配列は下記の塩基からなる：ＴＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号２）。前記領域も、系の親和性及び効果を高めるために、複数回反復させ得る（第４図参照）。二本鎖ＤＮＡ配列と相互作用し合う真核タンパク質としては、本発明の分子を構築するために、タンパク質ＳＴＡＴ、ｐ５３又はＮＦｋＢ（Ｉｎｏｕｅら，ＰＮＡＳ８９（１９９２）４３３３）に由来するタンパク質又はドメインを使用するのが好ましい。タンパク質ｐ５３の場合は、ＤＮＡに結合するドメインが該タンパク質の中央部に位置し、より正確にはアミノ酸１０２〜２９２の間に含まれる領域に存在する（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．７（１９９３）２５５６）。上述のように、本発明の分子内に存在する、所定のＤＮＡ配列と選択的に結合できるドメインは、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの一領域と相互作用できる原核又は真核タンパク質に由来する。本発明の分子の構築に使用されるドメインは、ＤＮＡとの相互作用部分を含むタンパク質の全体又はそのフラグメントからなり得る。このドメインは、種々のタンパク質、特にＴｅｔＲについて同定された（例えばＢｅｒｅｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）１９４５参照）。このドメインはまた、ＤＮＡへの結合性を保持している前記タンパク質又はフラグメントの誘導体からなり得る。この種の誘導体は特に、例えば本発明の分子の他のドメインと融合できるように、分子生物学の一般的方法によって形成した一つ以上のアミノ酸の改変を有するタンパク質である。例えばタンパク質ＴｅｔＲ及びＣｒｏの誘導体は、点突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｐｏｎｃｔｕｅｌｌｅ）及び／又は欠失を有するものが文献に記述されている（Ｈｅｃｈｔら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７５（１９９３）ｐ．１２０６；Ａｌｔｓｃｈｍｉｅｄら，ＥＭＢＯＪ７（１９８８）４０１１；Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１４（１９９２）１６８；Ｈａｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）１４０３０）。次いで、形成した誘導体を調節配列と共にインキュベートし、形成された複合体を検出することにより、所定のＤＮＡ配列に対するこれらの誘導体の結合能力を調べることができる。これらの誘導体は、改善されたＤＮＡ結合性（特異性、親和性等）を有するタンパク質でもあり得る。好ましい実施態様の一つでは、本発明の分子内に存在する、所定のＤＮＡ配列と選択的に結合できるドメインは、原核タンパク質から誘導する。この種の構築物は特に有利である。なぜなら、非ヒト由来のこれらのタンパク質は、少なくとも１４個のヌクレオチドを含む二本鎖ＤＮＡ部位を認識するからである。ヒトゲノム内で同じ配列をみつける確率は殆どゼロであり、従って得られる発現系は選択性がより大きい。好ましい実施態様の一つでは、本発明の分子内に存在する、所定のＤＮＡ配列と選択的に結合できるドメインは、タンパク質ｔｅｔＲ又はＣｒｏから誘導する。完全なタンパク質ｔｅｔＲ又はＣｒｏ（配列番号２１）を使用すると特に有利である。本発明の分子中に存在する、転写トランス作用因子又は転写トランス作用複合体と特異的に結合できるドメインは、異なる種類のものであり得る。このドメインは特に、標的となるトランス作用因子又はトランス作用複合体もこのようなドメインを有する場合には、オリゴマー化するドメインであり得る。また、前記トランス作用因子又はトランス作用複合体と相互作用することで知られている任意の合成又は天然ドメインでもあり得る。更に、トランス作用因子又はトランス作用複合体に対する抗体、又は抗体のフラグメントもしくは誘導体でもあり得る。本発明で使用し得るオリゴマー化するドメインの具体例としては、より特定的には、ロイシンジッパー、ドメインＳＨ２又はドメインＳＨ３が挙げられる。ロイシンジッパーは、アミノ酸７個毎に４〜５個のロイシンを含む両親媒性αヘリックスである。このような周期性のおかげで、αヘリックス上のほぼ同じ位置にロイシンを見いだすことができる。二量化は、二つの隣接ジッパードメインのロイシンの側鎖間の疎水性相互作用を基盤とする（Ｖｏｇｔら，ＴｒｅｎｄｓＩｎＢｉｏｃｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１４（１９８９）１７２）。ドメインＳＨ２は、チロシンがリン酸化された特定のペプチド配列と相互作用することで知られている。ドメインＳＨ３は、対応するプロリンに富んだペプチドを含む任意のトランス作用因子又はトランス作用複合体とのオリゴマーを形成するために使用し得る（Ｐａｗｓｏｎら，ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ３（１９９３）４３４）。オリゴマー化を誘発することで知られているタンパク質領域、例えば特にタンパク質ｐ５３のＣ末端領域を使用することもできる。前記領域を使用すれば、細胞内に存在するタンパク質ｐ５３を選択的に捕捉することができる。本発明では、アミノ酸３２０〜３９３（配列番号３）、３０２〜３６０又は３０２〜３９０の間に含まれるｐ５３領域を使用するのが好ましい。標的トランス作用成分を含む分子と相互作用することで知られている合成又は天然ドメインとしては、例えば、タンパク質ｐ５３と相互作用するタンパク質ＭＤＭ２の領域が挙げられる。この種の構築物を使用すれば、トランス作用因子として野生型又は突然変異タンパク質ｐ５３を捕捉することができる。転写トランス作用因子に特異的に結合する本発明の好ましいドメインの一つは、抗体、又は抗体のフラグメントもしくは誘導体からなる。抗体のフラグメント又は誘導体は、例えば抗体のフラグメントＦａｂもしくはＦ（ａｂ）’₂、ＶＨ部分もしくはＶＬ領域、又はアームを介してＶＬ領域に結合したＶＨ領域を含む単一鎖抗体（ａｎｔｉｃｏｒｐｓｉｍｐｌｅｃｈａｉｎｅ）（ＳｃＦｖ）である。この種のドメインはあらゆる分子に指向することができるため、特に有利である。抗体、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子は、種々のドメイン（可変ドメイン（Ｖ）、接合ドメイン（Ｊ）等）からなる種々の鎖（２個のＨ鎖及び２個のＬ鎖）で構成されている。本発明の分子内に存在する、トランス作用因子又はトランス作用複合体への結合ドメインは、有利には、少なくとも抗原の結合部位を含む抗体のフラグメント又は誘導体からなる。前記フラグメントはＬ鎖の可変ドメイン（Ｖ_L）又はＨ鎖の可変ドメイン（Ｖ_H）であり得、任意にフラグメントＦａｂもしはくＦ（ａｂ）’₂の形態、又は好ましくは単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）の形態を有する。本発明の分子の構築に使用する単一鎖抗体は、抗体のＨ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドにペプチドアームを介して結合した抗体のＬ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドからなる。本発明に従って改変した前述のような抗体をコードする核酸配列の構築は、例えば米国特許第４，９４６，７７８号、又は国際公開第９４／０２６１０号、同第９４／２９４４６号に開示されている。この構築については実施例で説明する。本発明の好ましい構築物は、タンパク質ｐ５３に結合するドメインを含む。より好ましいのは、タンパク質ｐ５３に対する抗体の誘導体である。特定の実施態様は、ｐ５３に対する単一鎖抗体からなる。特定具体例としては、実施例に記載のように構築される配列番号４のＳｃＦｖを使用する。ＤＮＡに結合するドメイン及びトランス作用因子に結合するドメインは通常、アームを介して互いに結合する。このアームは通常、本発明の分子の二つのドメインが自律的に機能できるプチドからなる。このペプチドは通常、本発明の分子の活性を妨害しない無電荷アミノ酸、例えばグリシン、セリン、トリプトファン、リシン又はプロリンからなる。アームは通常、５〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜２０個のアミノ酸を含む。本発明の分子の構築に使用し得るペプチドアームの具体例としては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）、コーディング配列がＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＡ（配列番号６）であるＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ（配列番号６）が挙げられる。本発明の分子の好ましい具体例は特に下記の分子である：ａ）ＳｃＦｖ−ｔａｇ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ａ）。この種の分子は下記のエレメントを含む： − 単一鎖抗体からなるトランス作用因子結合ドメイン。 − 該分子の免疫学的検出を可能にするモノクローナル抗体によって認識されるペプチド配列ｔａｇ。この配列は例えば、コーディング配列がＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号７）である配列ＭＮＲＬＧＫ（配列番号７）のエピトープＶＳＶ、又はコーディング配列がＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴ（配列番号８）である配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ（配列番号８）のエピトープｍｙｃであり得る。これは抗体９Ｅ１０によって認識される。 − 配列番号６（ヒンジ）のペプチドアーム。 − タンパク質ＴＥＴ又はＣｒｏからなるＤＮＡ結合ドメイン。好ましくは、ＳｃＦｖはタンパク質ｐ５３に対する抗体である。ｂ）ＳｃＦｖ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｂ）この種の分子は、配列ｔａｇを含まない点を除いて、分子ａ）と同じエレメントからなる。ｃ）ＳｃＦｖ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｃ）この種の分子は単に、単一鎖抗体からなるトランス作用因子結合ドメインと、タンパク質ＴＥＴ又はＣｒｏからなるＤＮＡ結合ドメインとを含むだけである。該分子はアームも、配列ｔａｇも含まない。この構築物では、トランス作用因子への結合ドメインが分子のＮ末端部分に位置し、ＤＮＡへの結合ドメインがＣ末端部分に位置する。ｄ）ＴＥＴ又はＣｒｏ−ＳｃＦｖ（第５図Ｄ）この種の分子は前記ｃ）の分子に類似している。違いは本質的にドメインの配置にある。即ち、この場合はトランス作用因子への結合ドメインが分子のＣ末端部分に位置し、ＤＮＡへの結合ドメインがＮ末端部分に位置する。ｅ）ＴＥＴ又はＣｒｏ−ヒンジ−ＳｃＦｖ（第５図Ｅ）この種の分子は、前記ｂ）の分子と同じエレメントを含む。違いは本質的にドメインの配置にある。即ち、この場合はトランス作用因子への結合ドメインが分子のＣ末端部分に位置し、ＤＮＡへの結合ドメインがＮ末端部分に位置する。ｆ）Ｏｌｉｇｏｍ−ｔａｇ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ａ）この種の分子はａ）の分子に類似しているが、相違点として、トランス作用因子への結合ドメインが配列番号３のタンパク質ｐ５３にオリゴマー化するドメインに置換されている。この分子は、腫瘍細胞内に出現する突然変異タンパク質ｐ５３の捕捉を可能にする。ｇ）Ｏｌｉｇｏｍ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｂ）この種の分子はｂ）の分子と類似しているが、相違点として、トランス作用因子への結合ドメインが配列番号３のタンパク質ｐ５３にオリゴマー化するドメインに置換されている。ｈ）Ｏｌｉｇｏｍ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｃ）この種の分子はｃ）の分子に類似しているが、相違点として、トランス作用因子への結合ドメインが配列番号３のタンパク質ｐ５３にオリゴマー化するドメインに置換されている。ｉ）ＴＥＴ又はＣｒｏ−Ｏｌｉｇｏｍ（第５図Ｄ）この種の分子はｄ）の分子に類似しているが、相違点として、トランス作用因子への結合ドメインが配列番号３のタンパク質ｐ５３にオリゴマー化するドメインに置換されている。ｊ）ＴＥＴ又はＣｒｏ−ヒンジ−Ｏｌｉｇｏｍ（第５図Ｅ）この種の分子はｅ）の分子に類似しているが、相違点として、トランス作用因子への結合ドメインが配列番号３のタンパク質ｐ５３にオリゴマー化するドメインに置換されている。これらの分子のいずれでも、ペプチドアームは配列（Ｇ４Ｓ）３（配列番号５）で容易に置換できる。本発明の別の態様は、前述のようなキメラ分子をコードする核酸配列にある。これは有利にはＤＮＡ配列、特にｃＤＮＡ配列である。ＲＮＡであってもよい。本発明の配列は通常、分子生物学の一般的方法を用いて、種々のドメインをコードする配列をクローニングベクター内で組み立てることにより構築する。本発明の核酸配列は任意に、安定な、及び／又は多機能性の、及び／又は大きさが小さいドメインを形成するために、及び／又はしかじかの細胞内コンパートメント中の前記ドメインの位置決定を促進するために、化学的、酵素的又は遺伝学的方法で改変し得る。従って、本発明の核酸配列は核局在ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｄｅｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎｎｕｃｌｅａｉｒｅ）（ＮＬＳ）をコードする配列を含み得る。特に、本発明の配列を、ペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）（Ｋａｌｄｅｒｏｎら，Ｃｅｌｌ３９（１９８４）４９９）を有するウイルスＳＶ４０のＮＬＳをコードする配列と融合することが可能である。本発明の核酸配列は有利には、プラスミド性又はウイルス性であり得る発現ベクターの一部を構成する。本発明の別の態様は、転写トランス作用ドメインと所与の分子に特異的に結合するドメインとを含み、これらのドメインが必要によりペプチドアームを介して結合している融合タンパク質、並びにこのような融合をコードする核酸配列にある。トランス作用ドメインは、任意の転写トランス作用タンパク質、例えばｐ５３、ＶＰ１６、ＥＢＮＡ、Ｅ６／Ｅ７、Ｔａｔ等に由来し得る。本発明の別の態様は、下記のエレメントからなる遺伝子条件発現系にある： − 前述のようなキメラ分子、及び − 調節配列と、最小転写プロモーターと、前記遺伝子とを含む発現カセット。発現カセットは、二重特異性分子によって捕捉されたトランス作用因子又はトランス作用複合体による遺伝子の発現の活性化に必要なエレメントを含む。従って、調節配列は、発現されるキメラ分子のＤＮＡに結合する配列である。キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＴｅｔＲの全体又は一部で表される時は、調節配列は配列番号１又は該配列の誘導体からなり、該配列は任意に複数回反復する。これは好ましくは、配列ｏｐ２（２個のＴｅｔｏｐユニットが反復）又はＯｐ７（例えばＷｅｉｎｍａｎｎら，ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ５（１９９４）５５９に記載のように７個のＴｅｔｏｐユニットが反復）である。また、キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＣｒｏの全体又は一部で表される時は、調節配列は配列番号２又はその誘導体からなる。該配列は任意に複数回反復する。これは好ましくは配列ＯＲ３である。配列番号１及び２の誘導体は、遺伝子の改変（突然変異、欠失、付加、反復等）によって得られ、タンパク質に特異的に結合する能力を保持している任意の配列であり得る。この種の誘導体は文献に記述されている（前出のＢａｕｍｅｉｓｔｅｒらの文献、Ｔｏｖａｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５（１９８８）７６、国際公開第９４／０４６７２号）。最小転写プロモーターは、活性がトランス作用因子の存在に依存するプロモーターである。そのため、キメラ分子が存在しない時には該プロモーターは不活性であり、遺伝子は全く又は殆ど発現されない。これに対し、キメラ分子の存在下では、捕捉されたトランス作用因子又はトランス作用複合体によって最小プロモーターの活性が誘発され、従って所期の遺伝子の発現が誘発される。最小プロモーターは通常、ＴＡＴＡボックス（ｂｏｉｔｅ）又はＩＮＲで構成される。これらのエレメントは実際、トランス作用因子の存在下での遺伝子発現に必要な最小限のエレメントである。最小プロモーターは遺伝子改変によって任意のプロモーターから形成できる。使用可能なプロモーターの好ましい具体例としては、チミジンキナーゼの遺伝子のプロモーターが挙げられる。より正確には、ヌクレオチド−３７〜＋１９からなるＴＫプロモーターに由来する最小プロモーターを使用すると有利な結果が得られた。最小プロモーターはヒトＣＭＶから誘導することもできる。最小プロモーターは特に、ＣＭＶのヌクレオチド−５３〜＋７５又は−３１〜＋７５の範囲に含まれるフラグメントで構成し得る。但し、一般的なプロモーター、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーターも総て使用し得る。発現カセットは有利には下記のエレメントからなる： − 調節配列として、配列番号１もしくは２又はこれらの配列の誘導体からなる配列を任意に複数回反復したもの。 − 最小プロモーターとして、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の遺伝子のプロモーターから誘導したプロモーター。 − 所期のコーディング配列。より好ましくは、最小プロモーターをチミジンキナーゼの遺伝子のプロモーターの−３７〜＋１９部分で構成する。有利には、発現カセットを、Ｔｅｔｏｐ２．ＴＫ−遺伝子；Ｔｅｔｏｐ７．ＴＫ−遺伝子及びＯＲ３．ＴＫ−遺伝子といった構造のカセットの中から選択する。本発明の別の態様は、キメラ分子をコードする核酸配列と前述のような発現カセットとを含む発現ベクターにある。本発明のベクターでは、キメラ分子をコードする核酸配列及び発現カセットを同一方向又は反対方向に挿入し得る。また、該ベクターはプラスミド性又はウイルス性であり得る。ウイルス性ベクターとしては、より好ましくは、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス又はアデノ随伴ウイルスが挙げられる。本発明のウイルスは欠陥ウイルス、即ち標的細胞内で自律複製することができないウイルスである。従って、本発明で使用する欠陥ウイルスのゲノムは通常、少なくとも、感染細胞内での前記ウイルスの複製に必要な配列を欠失している。これらの領域は（全体的もしくは部分的に）除去するか、又は非機能性にするか、あるいは別の配列、特に本発明の配列で置換し得る。欠陥ウイルスは、それにもかかわらずウイルス粒子のキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に必要なゲノムの配列を保存するのが好ましい。より特定的にアデノウイルスに関しては、構造及び性質が少し異なる種々の血清型が明らかにされた。本発明では、これらの血清型のうち、２型もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）、又は動物由来アデノウイルス（国際公開第９４／２６９１４号参照）を使用するのが好ましい。本発明で使用し得る動物由来アデノウイルスとしては、イヌ由来、ウシ由来、マウス由来（例えばＭａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ由来、ブタ由来、トリ由来又はサル由来（例えばＳＡＶ）のアデノウイルスが挙げられる。動物由来アデノウイルスは好ましくはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株、又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］である。本発明では、ヒトもしくはイヌ由来のアデノウイルス、又はこれらを混合したものを使用するのが好ましい。好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスのゲノムは、少なくとも、アデノウイルスのＩＴＲ及びキャプシド形成領域と、キャプシド分子及び前述のような発現カセットをコードする核酸配列とを含む。より好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムでは、少なくともＥ１領域が非機能性である。当該ウイルス遺伝子は、当業者に公知の任意の方法、特に完全抑圧、置換（例えば本発明の配列で）、部分的欠失、又は当該遺伝子内への一つ以上の塩基の付加によって非機能性にし得る。このような改変は、遺伝子工学的手法を用いて例えばｉｎｖｉｔｒｏ（分離ＤＮＡ）又はｉｎｓｉｔｕで実施するか、又は突然変異誘発物質で処理することによって実施し得る。別の領域、特にＥ３領域（国際公開第９５／０２６９７号）、Ｅ２（国際公開第９４／２８９３８号）、Ｅ４（国際公開第９４／２８１５２号、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９５／０２６９７号）及びＬ５（国際公開第９５／０２６９７号）も改変し得る。好ましい実施態様の一つでは、本発明のアデノウイルスはＥ１及びＥ４領域に欠失を有する。別の好ましい実施態様では、本発明のアデノウイルスはＥ１領域内に欠失を有し、そのレベルにＥ４領域及び本発明の配列が挿入される（仏国特許出願公開第９４１３３５５号）。本発明の欠陥組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の方法で形成できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５、欧州特許出願公開第１８５５７３号、Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと主に本発明のＤＮＡ配列（キメラ分子＋発現カセットをコードする配列）を有するプラスミドとの間の相同的組換えによって形成できる。相同的組換えは、適当な細胞系内への前記アデノウイルス及びプラスミドの同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後に生起する。使用する細胞系は、好ましくは、（ｉ）前記エレメントによって形質転換することができ、且つ（ｉｉ）好ましくは組換えの危険を回避するために組込み形態で、欠陥アデノウイルスのゲノムの部分を補完できる配列を含むものでなければならない。細胞系の具体例としては、特にゲノム内に組込まれた状態でアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左方部分（１２％）を含むヒト胎児腎細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）、又は特に国際公開第９４／２６９１４号及び同第９５／０２６９７号に記載のような機能Ｅ１及びＥ４を補完することができる細胞系が挙げられる。次いで、増殖したアデノウイルスを回収し、実施例に記載のように一般的な分子生物学的方法で精製する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、大きさが比較的小さいＤＮＡウイルスであり、感染相手である細胞のゲノム内に安定に且つ部位特異的に組込まれるウイルスである。これらのウイルスは、細胞の増殖、形態又は分化に影響を与えずに、広範囲の細胞に感染することができる。また、これらのウイルスはヒトの病理には関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムはクローニングされ、配列決定され、特徴が解明されている。このゲノムは、約４７００個の塩基を有し、各末端に、当該ウイルスの複製起点として作用する塩基数約１４５の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成機能を有する二つの本質的領域、即ち、ウイルスの複製とウイルス遺伝子の発現とに関与する遺伝子ｒｅｐを含むゲノム左方部分、及びウイルスのキャプシドタンパク質をコードする遺伝子ｃａｐを含むゲノム右方部分に分割される。遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで移入するためのＡＡＶ由来ベクターの使用は文献に記述されている（特に、国際公開第９１／１８０８８号、国際公開第９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８５２８号参照）。これらの出願明細書には、ＡＡＶから誘導した種々の構築物が開示されている。これらの構築物では、遺伝子ｒｅｐ及び／又はｃａｐが欠失しており、所期の遺伝子で置換されている。また、前記所期の遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏ（培養細胞）又はｉｎｖｉｖｏ（生物内に直接）移入するための前記構築物の使用も開示されている。本発明の欠陥組換えＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞系に、二つのＡＡＶ逆方向反復領域（ＩＴＲ）が境界域に配置された本発明の核配列（キメラ分子＋発現カセットをコードする配列）を含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド形成遺伝子（遺伝子ｒｅｐ及びｃａｐ）を有するプラスミドとを同時にトランスフェクションすることによって形成し得る。次いで、形成された組換えＡＡＶを一般的な方法で精製する。ヘルペスウイルス及びレトロウイルスについては、組換えベクターの構築が文献に広く記載されている。特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，ＮｅｗＢｉｏｌｏｇｉｓｔ３（１９９１）２０３、欧州特許第４５３２４２号、欧州特許第１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（１９８５）等参照。特に、レトロウイルスは分裂中の細胞に選択的に感染する組込みウイルス（ｖｉｒｕｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｆ）である。従って、癌に適用するのに有利なベクターを構成する。レトロウイルスのゲノムは本質的に、二つのＬＴＲ、キャプシド形成配列及び三つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスに由来する組換えベクターでは通常、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖが全体的又は部分的に欠失し、所期の異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、種々のレトロウイルス、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス、ＭｏＭＬＶとも称する）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーベイ（ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）又はフレンドウイルスから製造し得る。本発明の組換えレトロウイルスを構築する場合は、通常、主にＬＴＲ、キャプシド形成配列及び本発明の配列（キメラ分子＋発現カセットをコードする配列）を含むプラスミドを構築し、次いでいわゆるキャプシド形成細胞系のトランスフェクションに使用する。前記細胞系はプラスミド内に欠失レトロウイルス機能をトランス導入することができる。従ってキャプシド形成細胞系は通常、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを発現することができる。このようなキャプシド形成細胞系は先行技術で開示されており、特に細胞系ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、細胞系ＰｓｉＣＲＩＰ（国際公開第９０／０２８０６号）及び細胞系ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（国際公開第８９／０７１５０号）が知られている。また、組換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するためにＬＴＲに改変を含み得ると共に、遺伝子ｇａｇの一部を含む伸長されたキャプシド形成配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。形成された組換えレトロウイルスは、次いで一般的な方法で精製する。本発明の欠陥組換えウイルス（レトロウイルス）の構造の一具体例を第８図に示す。この図は、キャプシド形成細胞系内で目的の遺伝子が発現されないという、本発明の構築物の第二の利点を明示している。前記細胞系は、本発明の発現系によって捕捉されるトランス作用因子又はトランス作用複合体を欠失しているため、プロモーターは不活性であり、遺伝子は産生細胞内で発現されない（第８図Ａ）。遺伝子が実際に発現されるのは、ウイルスが標的細胞、即ち本発明の系によって捕捉されたトランス作用因子又はトランス作用複合体が存在する細胞、に有効に感染した時だけである（第８図Ｂ）。これは、発現が細胞にとって毒性である遺伝子（遺伝子Ｇｒｂ３−３、ＩＬ−２、ジフテリアトキシン等）を含むウイルス構築の場合には特に有利である。本発明の実施には、欠失組換えレトロウイルス又はアデノウイルスを使用すると特に有利である。実際、これらのベクターは、遺伝子を腫瘍細胞内に移入するのに特に有利な性質を有する。本発明では種々の非ウイルス性ベクターも使用できる。実際、本発明の条件発現系は、真核細胞内への核酸の移入及び発現を促進することができる非ウイルス性物質内に組込むことができる。化学的又は生化学的ベクターは、特に利便性、安全性の点で、またトランスフェクションすべきＤＮＡの大きさが理論的に制限されないという理由で、天然ウイルスに替わる有利なベクターである。これらの合成ベクターは二つの主要機能、即ちトランスフェクションすべき核酸を圧縮する機能と、前記核酸が細胞に結合し、プラスミド膜、場合によっては二つの核膜を貫通するのを促進する機能とを有する。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非ウイルス性ベクターはいずれもポリカチオン電荷を有する。開発された合成ベクターの中で最も有利なものは、ポリリシン、（ＬＫＬＫ）_n 、（ＬＫＫＬ）_n、ポリエチレンイミン及びＤＥＡＥデキストランの類のカチオンポリマー、又はカチオン脂質もしくはリポフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）である。これらのベクターは、ＤＮＡを圧縮し、該ＤＮＡと細胞膜との結合を促進する性質を有する。これらの具体例としては、リポポリアミン（リポフェクタミン、トランスフェクタム等）及び種々のカチオンもしくは中性脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ等）が挙げられる。その後、受容体を介する標的トランスフェクションという概念が開発された。これは、カチオンポリマーによってＤＮＡを圧縮し、カチオンポリマーと、グラフトしたい細胞の表面に存在する膜受容体のリガンドとの間の化学的結合によって複合体を膜に結合させるという原理を利用するものである。例えば、トランスフェリンもしくはインスリンの受容体のターゲッティング、又は肝細胞のアシアロ糖タンパク質の受容体のターゲッティングが開示されている。本発明は、前述のベクターを含む医薬組成物にも関する。これらの組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、眼球内投与等で投与できるように配合し得る。好ましくは、本発明の組成物は、注射用組成物のための医薬的に許容し得るビヒクルを含む。これは特に、等張、無菌の塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化カリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて無菌水もしくは生理的食塩水を加えることにより注射剤を形成することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。レトロウイルスについては、ｅｘｖｉｖｏ感染され、必要に応じて植入するよう設計された細胞又はキャプシド形成細胞を直接使用すると有利であり得る（国際公開第９４／２４２９８号）。注射に使用するベクターの用量は、種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当病理又は所期の治療時間に応じて調整し得る。一般的には、本発明の組換えウイルスは、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの用量形態で配合し投与する。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合には、１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの用量も使用できる。ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ、プラーク形成単位）という用語はビリオン懸濁液の感染能力に対応し、適当な培養細胞の感染と、通常は４８時間後の感染細胞のプラーク数の測定とによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を測定する方法は文献に詳述されている。本発明の発現系及び対応するベクターは、細胞治療又は遺伝子治療で、目的の遺伝子の発現を制御するのに特に有用である。これらは例えば、任意の目的のコーディング配列、特に治療生成物をコードする配列の発現を制御するために使用し得る。前記治療生成物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボ核酸等である。より特定的には、遺伝子は、タンパク質性生成物、例えば酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、即ちインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（仏国特許第９２０３１２０号）、成長因子、神経伝達物質もしくはその前駆体、合成酵素、栄養因子、即ちＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等、アポリポタンパク質、即ちＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等（仏国特許第９３０５１２５号）、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（仏国特許第９１１１９４７号）、腫瘍抑制遺伝子、即ちｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等（仏国特許第９３０４７４５号）、凝固に関与する因子、即ち因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等をコードする遺伝子、又は天然もしくは合成免疫グロブリン（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ等）の全体もしくは一部、ＲＮＡリガンド（国際公開第９１／１９８１３号）、等をコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ヒト、動物、植物等のＤＮＡ）である。目的の遺伝子は、標的細胞内での発現によって遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写の制御を可能にするアンチセンス配列であってもよい。この種の配列は例えば、欧州特許第１４０３０８号に記載の方法を用いて、標的細胞内で細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写でき、それによってタンパク質への翻訳を阻止することができる。本発明は特に、毒性因子をコードする配列の発現に適している。毒性因子は特に、細胞に対する毒（ジフテリアトキシン、シュードモナストキシン、リシンＡ等）、外部の物質に対する感受性を誘発する生成物（自殺遺伝子：チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、又は細胞死を誘発することができるキラー遺伝子（Ｇｒｂ３−３（ＰＣＴ／ＦＲ９４／００５４２号）、ＳｃＦｖ抗ｒａｓ（国際公開第９４／２９４４６号）等）である。実際、本発明の系は、産生細胞に対する毒性をもたないこれらの配列を含む特にウイルス性のベクターを形成させ、次いでこれらの毒性分子の発現を、所望のトランス作用因子又はトランス作用複合体を有する標的細胞内で選択的に誘発させる。従ってこの種の構築物は、例えば影響を受けた細胞を選択的に破壊することを目的とする抗腫瘍治療法に特に適している。この系はまた、例えば、非調節的に産生されると極めて顕著な副作用を示し得るサイトカイン、インターフェロン、ＴＮＦ又はＴＧＦの発現に特に有用である。以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は例示のためのものであって本発明を限定するものではない。図面の説明第１図：オリゴマー化するドメイン（Ａ）又はＳｃＦｖ（Ｂ）によってトランス作用因子を選択的に捕捉することができる本発明の条件発現系の説明図である。第２図：トランス作用複合体を選択的に捕捉することができる本発明の条件発現系の説明図である。第３図：調節配列Ｔｅｔｏｐ７と最小プロモーター（ＴＡＴＡボックス）と遺伝子（ＣＡＴ）とを含む本発明の発現カセットの説明図である。第４図：調節配列ＯＲ３と最小プロモーター（ＴＡＴＡボックス）と遺伝子（ＣＡＴ）とを含む本発明の発現カセットの説明図である。第５図：本発明の二重特異性キメラ分子の説明図である。第６図：本発明の二重特異性キメラ分子をコードするＤＮＡ配列の構築の説明図である。第７図：制御キメラ構築物の説明図である。第８図：本発明のウイルス性ベクター（レトロウイルス）の構造及び機能を示す説明図である。第９図：本発明のハイブリッド分子と調節配列との間の相互作用の調査結果を示す説明図である。第１０図：本発明のハイブリッド分子と種々の形態のタンパク質ｐ５３との間の相互作用の調査結果を示す説明図である。第１１図：細胞ＳＡＯＳ−２内でのカセットＴｅｔ−Ｌｕｃの活性化を立証する説明図である。第１２図：細胞Ｈ３５８内でのカセットＴｅｔ−Ｌｕｃの活性化を立証する説明図である。分子生物学の一般的方法分子生物学の一般的な方法、例えば塩化セシウム−臭化エチジウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での形質転換、核酸の沈降等は文献に記述されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。酵素はＮｅｗ−ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。連結（ｌｉｇａｔｕｒｅ）のために、ＤＮＡフラグメントを０．８〜１．５％アガロースゲル上でそれぞれの大きさに従って分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）で精製し、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼの存在下で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ、ＤＴＴ１０ｍＭ、ＡＴＰ２ｍＭ中１４℃で一晩インキュベートした。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅も、下記の条件で、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９の方法で実施した： − ＭｇＣｌ₂濃度８ｍＭ、 − 変性温度９５℃、ハイブリダイゼーション温度５５℃、伸長温度７２℃。このサイクルをＰＥ９６００サーマルサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＯ）で２５回繰り返した。オリゴヌクレオチドは、シアノエチル基でβ保護したホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の化学を利用して（Ｓｉｎｈａら，１９８４，Ｇｉｌｅｓ１９８５）、ＤＮＡ自動合成器ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍモデル３９４（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で製造業者の指示に従い合成する。配列決定は、蛍光プライマーを使用して連鎖停止法により二本鎖鋳型上で行った。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍの配列決定キットＴａｑＤｙｅＰｒｉｍｅｒＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の指示に従い使用した。実施例実施例１：調節配列と最小転写プロモーターと遺伝子とを含む発現カセットの構築１．１．プラスミドｐＴＥＴｏｐ７／ＣＡＴの構築プラスミドｐＴＥＴｏｐ７／ＣＡＴは下記のエレメントを含む（第３図）： − ７個の反復Ｔｅｔｏｐモチーフ（配列番号１）からなる、テトラサイクリンリプレッサーｔｅｔＲと相互作用する配列からなる調節配列、 − チミジンキナーゼの遺伝子のプロモーターから誘導した最小プロモーター（ＴＡＴＡボックスを有する部分−３７〜＋１９領域）、 − 前記最小プロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配列。このプラスミドは、ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで予め消化したプラスミドｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内に、プラスミドｐＵＨＤ１０−７（国際公開第９４／２９４４２号）のフラグメントＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩをクローニングすることによって構築した。１．２．プラスミドｐＯＲ₃／ＣＡＴの構築プラスミドｐＯＲ₃／ＣＡＴは下記のエレメントを含む（第４図）： − Ｃｒｏリプレッサーと相互作用する配列ＯＲ３からなる調節配列（配列番号２）、 − チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターから誘導した最小プロモーター（ＴＡＴＡボックスを有する部分−３７〜＋１９領域）、 − 前記最小プロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配列。このプラスミドは下記の手順で構築した：Ｃｒｏリプレッサーと相互作用する配列ＯＲ３を人工的に合成した。そのために、下記の二つのオリゴヌクレオチドを合成した：次いで前記二つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、以下のように配向されたクローニングを可能にする配列が境界域に配置された二本鎖配列ＯＲ３を再構築した：１．３．毒性遺伝子発現カセットの構築毒性遺伝子発現用のカセットは、毒性生成物、好ましくはＧｒｂ３−３遺伝子（ＰＣＴ／ＦＲ９４／００５４２号）、チミジンキナーゼの遺伝子、ジフテリアトキシン又はｐｓｅｕｏｄｍｏｎａｓトキシンをコードする遺伝子、等をコードする配列でＣＡＴ配列を置換することによって、前述のプラスミド（１．１．及び１．２．）から形成する。実施例２：ｐ５３に特異的な単一鎖抗体の構築この単一鎖抗体は下記のプロトコルに従って構築した： − 抗ｐ５３抗体を産生するハイブリドーマｐＡｂ４２１から、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを得た。そのために、ハイブリドーマの全ＲＮＡを抽出し、ランダムヘキサマーをプライマーとして使用して逆転写反応にかけた。この種のプライマーを使用すれば、免疫グロブリンに特異的なプライマーを使用せずにすむ。得られたｃＤＮＡクローンは、Ｖ領域をクローニングするのに十分な長さを有する。しかしながら、これらのクローンが、存在する全ｃＤＮＡの小さいフラクションを表す限り、クローニングに十分なＤＮＡを産生するために予備的増幅反応を実施しなければならない。そのために、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを別個に増幅した。使用したプライマーは、各鎖（Ｈ及びＬ）の可変領域の対向末端のレベルでハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。Ｈ鎖に特異的なプライマーを使用した増幅生成物は、約３４０塩基対のフラグメントである。Ｌ鎖に特異的なプライマーを使用した増幅生成物は、約３２５塩基対のフラグメントである。 − 精製後、抗体のＶＨ及びＶＬ部領域コードするｃＤＮＡをヌクレオチドアーム（Ｌ）を用いて単一鎖に組立てた。ヌクレオチドアームは、末端の一方がＶＨ領域をコードするｃＤＮＡの３’末端に結合し、もう一方がＶＬ領域をコードするｃＤＮＡの５’末端に結合するように構築した。該アームの配列はペプチド配列番号５をコードする。組立てられた約７００ｂｐの配列は、フラグメントＮｃｏＩ−ＮｏｔＩの形態で、配列番号４（アミノ酸９〜２４１）で表される配列を有する連鎖ＶＨ−Ｌ−ＶＬを含む。この配列は、Ｃ末端にｍｙｃのｔａｇ配列（残基２５６〜２６６）も含む。実施例３：単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）からなるトランス作用因子結合ドメインを含む二重特異性キメラ分子をコードする核酸配列の構築３．１．配列ＳｃＦｖ−ｍｙｃ−ヒンジ−ＴｅｔＲ又はＣｒｏを含むプラスミドの構築（第５図Ａ及び第６図）抗ｐ５３ＳｃＦｖをコードするｃＤＮＡを含むフラグメントＮｃｏＩ−ＮｏｔＩをまずｐＵＣ１９型プラスミド内にクローニングした。ＶＳＶエピトープ（配列番号７）又はｍｙｃエピトープ（配列番号８）をコードする配列を前記フラグメントの上流に挿入する（第６図）。次いで、タンパク質ＴｅｔＲ及びＣｒｏをコードする配列を下記のように構築した： − ＴｅｔＲをコードする配列は、下記のオリゴヌクレオチドを用いて、配列ｔｅｔＲを有する鋳型プラスミドから増幅することによって得た：これらのオリゴヌクレオチドは、分子の二つの機能ドメインを結合するヒンジペプチドアームをコードする配列も与える。従って増幅フラグメントは、ペプチドアーム及びｔｅｔＲＤＮＡへの結合ドメインをコードする配列を含む。このフラグメントを前述のように構築したプラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、分子ＳｃＦｖ−ｍｙｃ− ヒンジ−ＴｅｔＲをコードする配列を含むプラスミドを形成した（第６図）。 − Ｃｒｏをコードする配列は、下記のオリゴヌクレオチドを用いて、λバクテリオファージのＤＮＡ鋳型上で増幅することによって得た：これらのオリゴヌクレオチドは、分子の二つの機能ドメインを接続するヒンジペプチドアームをコードする配列も与える。従って増幅フラグメントは、ペプチドアーム及びＣｒｏＤＮＡへの結合ドメインをコードする配列を含む。このフラグメントを前述のように構築したプラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、分子ＳｃＦｖ−ｍｙｃ− ヒンジ−Ｃｒｏをコードする配列を含むプラスミドを形成した（第６図）。３．２．配列ＳｃＦｖ−ヒンジ−ＴｅｔＲ又はＣｒｏを含むプラスミドの構築（第５図Ｂ）この実施例は、ｔａｇ配列を欠失した本発明の二重特異性キメラ分子をコードする配列を有するプラスミドの構築を説明する。これらのプラスミドは、酵素ＮｏｔＩ及びＸｂａＩでの消化により、前記３．１．に記載のプラスミドから得た。前記消化は、ｔａｇｍｙｃをコードする領域を有するフラグメントの切断を可能にする。３．３配列ＳｃＦｖ−ＴｅｔＲ又はＣｒｏを含むプラスミドの構築（第５図Ｃ）この実施例は、アーム及びｔａｇ配列を欠失した本発明の二重特異性キメラ分子をコードする配列を有するプラスミドの構築を説明する。これらのプラスミドは、酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩでの消化により、前記３．１．に記載のプラスミドから得た。前記消化は、ｍｙｃｔａｇ及びヒンジペプチドアームをコードする領域を有するフラグメントの切断を可能にする。実施例４：オリゴマー化するドメインからなるトランス作用因子結合ドメインを含む二重特異性キメラ分子をコードする核酸配列の構築４．１．タンパク質ｐ５３のオリゴマー化する領域のクローニング（フラグメント３２０−３９３）タンパク質ｐ５３（配列番号３）のオリゴマー化する領域をコードするｃＤＮＡを、下記のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト野生型ｐ５３のｃＤＮＡを有するプラスミド上でＰＣＲ増幅することによって得た：（下線部はＮｃｏＩ部位を示す）（下線部：ＢａｍＨＩ部位、二重下線部：ＸｂａＩ部位、太字部分：ＮｏｔＩ部位）。４．２．ＳｃＦｖをコードする領域に代えて、フラグメントＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ形態の前記増幅フラグメントを実施例３．１．に記載のプラスミドの対応する部位にクローニングすることにより、プラスミドｐ５３３２０／３９３−ｍｙｃ−ヒンジ−ＴｅｔＲ又はＣｒｏ（第５図Ａ）を得た。４．３．ＳｃＦｖ及びｔａｇをコードする領域に代えて、フラグメントＮｃｏＩ−ＸｂａＩ形態の４．１．で増幅したフラグメントを実施例３．１．に記載のプラスミドの対応する部位にクローニングすることにより、プラスミドｐ５３３２０／３９３−ヒンジ−ＴｅｔＲ又はＣｒｏ（第５図Ｂ）を得た。４．４．ＳｃＦｖ、ｔａｇ及びヒンジをコードする領域に代えて、４．１．で増幅したフラグメントをフラグメントＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ形態で実施例３．１．に記載のプラスミドの対応する部位にクローニングすることにより、プラスミドｐ５３３２０／３９３−ＴｅｔＲ又はＣｒｏ（第５図Ｃ）を得た。４．５．オリゴ５５３７／５５３９又は５５３８／５５３９を用いて野生型ヒトｐ５３のｃＤＮＡを有するプラスミド上でＰＣＲ増幅しＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化したフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで予め消化した３．１．に記載のプラスミド内にクローニングすることにより、プラスミドｔｅｔＲもしくはＣｒｏ−ｐ５３３２０／３９３（第５図）又はｔｅｔＲもしくはＣｒｏ−ヒンジ−ｐ５３３２０／３９３（第５図Ｅ）を得た。実施例５：ＤＮＡ結合ドメイン（ＴｅｔＲ又はＣｒｏ）とタンパク質ｐ５３のトランス作用因子ドメイン（１〜７３領域）とを含むキメラ分子をコードする配列を有する制御プラスミドの構築オリゴ５６６１／５６６２を用いてヒト野生型ｐ５３のｃＤＮＡを有するプラスミドからＰＣＲ増幅し、次いでＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ／Ｘｂａｌ、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化したフラグメントを、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ／Ｘｂａｌ又はＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで予め消化した３．１．に記載のプラスミド内にクローニングすることにより、ｔａｇ（ｍｙｃ又はＶＳＶ）及びヒンジを有する又は有していないプラスミドｐ５３１／７３−ＴｅｔＲ又はＣｒｏ（第７図Ａ、Ｂ及びＣ）を得た。実施例６：本発明の種々のハイブリッド分子の発現プラスミドの構築ハイブリッド分子の発現に使用するプラスミドを、これらの分子をコードするｃＤＮＡを含むフラグメントを真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることによって構築した。このように実施した種々の構築は下記の通りである： − ＳｃＦｖ４２１：配列番号４、 − ＴＥＴ１９：実施例３．１．に従い第６図に示すＳｃＦｖ４２１−ＶＳＶ− ヒンジ−ＴｅｔＲ鎖を含むハイブリッドタンパク質、 − ＴＥＴ０２：実施例４．３．に従い第５図Ａに示すｐ５３（３２０／３９３）−ＶＳＶ−ヒンジ−ＴｅｔＲ鎖を含むハイブリッドタンパク質、 − ＴＥＴ０３：実施例４．４．に従い第５図Ｂに示すｐ５３（３２０／３９３）−ヒンジ−ＴｅｔＲ鎖を含むハイブリッドタンパク質、 − ＴＥＴ０４：実施例４．４．に従い第５図Ｃに示すｐ５３（３２０／３９３）−ＴｅｔＲ鎖を含むハイブリッドタンパク質、 − ＴＥＴ０７：実施例５に従い第７図Ａに示す連鎖ｐ５３（１／７３）−ＶＳＶ−ヒンジ−ＴｅｔＲを含むハイブリッドタンパク質。実施例７：本発明のハイブリッド分子による特異的二本鎖ＤＮＡ配列の認識７．１．ハイブリッド分子の製造この実験で使用する種々の分子は、ＴＮＴＣｏｕｐｌｅｄＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の実験プロトコルに従い、総反応容量５０μｌで、実施例６に記載の分子の網状赤血球溶解物中ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳によって得た。７．２．特異的二本鎖ＤＮＡ配列の構築この実験で使用する特異的二本鎖ＤＮＡ配列は、下記の配列を有する二つの合成オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕこれら二つの合成オリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌを下記の反応媒質１０μｌ中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより、リン３３で標識した：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH 7.6 50ｍＭＭｇＣｌ₂ 10ｍＭジチオトレイトール 5ｍＭスペルミジン 100μＭＥＤＴＡＡＴＰ−γ−³³Ｐ(Amersham) 50μCi(1000-3000 Ci/mmole) Ｔ４キナーゼ(Boehringer) 10Ｕ次いで、標識した二つのオリゴヌクレオチドを４００ｍＭＮａＣｌの存在下でハイブリダイズして、下記の二本鎖配列ＴｅｔＯ（配列番号２６）を再構築した：７．３．本発明の種々のハイブリッド分子による二本鎖配列ＴｅｔＯの認識ＤＮＡへの結合反応を、５０μｌの反応媒質（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、β−メルカプトエタノール６ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭ、ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍｌ）中で、実施例７．２．で構築した配列ＴｅｔＯ（１０^-10Ｍ）と、実施例７．１．で形成した翻訳産物１０μｌと、非特異的固定の除去に使用される低温競合オリゴヌクレオチドＡＰ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）１０^-8Ｍとを加えることにより実施する。反応媒質への１０μＭテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）の添加による平衡シフトにより、相互作用の特異性を確認する。反応混合物を２０℃で１５分間インキュベートし、次いで１０μｌの５０％グリセロールを加え、最終混合物を５％ポリアクリルアミドゲル上でネイティブの電気泳動にかけて２００Ｖ、１６℃で移動させる。次いで、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにかける。ハイブリッド分子ＴＥＴ１９、ＴＥＴ０２及びＴＥＴ０７を用いて実施した前記実験の結果を第９図に示す。これらの条件では、特異的二本鎖ＤＮＡ配列ＴｅｔＯへの前記三つの分子の結合は、前記配列の移動の遅延によって観察され、この相互作用の特異性は、テトラサイクリンの添加による前記遅延の阻害によって明らかにされる。従ってこの結果は、本発明のハイブリッド分子がヌクレオチド配列ＴｅｔＯに特異的に結合できることを立証している。実施例８：転写トランス作用ドメインを有する分子への本発明のハイブリッド分子の特異的結合８．１．本発明のハイブリッド分子及び転写トランス作用ドメインを有する又は有さない分子の製造この実験のために、実施例６に記載の本発明のハイブリッド分子ＳｃＦｖ４２１、ＴＥＴ１９及びＴＥＴ０２を、これらのハイブリッド分子が放射性標識された状態で得られるように４４μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）の存在下で、実施例７．１．に記載の実験プロトコルを用いてｉｎｖｉｔｒｏ翻訳することにより形成した。転写トランス作用ドメインを有する又は有さない分子のｃＤＮＡを部位ＢａｍＨＩでベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。これらのベクターから産生された組換えバキュロウイルスを製造業者の指示に従って精製した。製造業者の実験プロトコルに従い昆虫細胞ｓｆ９に組換えバキュロウイルスを感染させることによって分子を製造する。Ｋ．Ｏｒｙら（Ｋ，Ｏｒｙ，ＥＭＢＯＪ．，１３，３４９６−３５０４，１９９４）のプロトコルに従い、最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌでタンパク質抽出物を調製する。これらの分子は下記の通りである： − ｐ５３（１／３９３）：野生型タンパク質ｐ５３。 − ｐ５３（１／３２０）：アミノ酸１〜３２０の配列に制限され、従ってオリゴマー化ドメインとモノクローナル抗体ｐＡｂ４２１によって認識されるドメインとを欠失している野生型タンパク質ｐ５３。８．２．転写トランス作用ドメインを有する又は有さない分子への本発明のハイブリッド分子の結合実施例８．１．で形成した各ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳生成物５μｌを、実施例８．１．で調製したバキュロウイルス抽出物５μｌ及びタンパク質ｐ５３のＮ末端の先端を認識するモノクローナル抗体ＤＯ１（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）２μｇと共に、改良ＲＩＰＡ緩衝液（Ｋ．Ｏｒｙ，ＥＭＢＯＪ．１３，３４９６−３５０４，１９９４）１００μｌ中４℃で１６時間インキュベートした。免疫沈降を、Ｋ．Ｏｒｙら（Ｋ．Ｏｒｙ，ＥＭＢＯＪ．１３，３４９６−３５０４，１９９４）によって記述されているように実施する。抗体に保持された複合体を、移動緩衝液（ＬａｅｍｍｌｉＵ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）３０μｌの存在下、８０℃で１０分間インキュベートすることによって溶離し、前述のプロトコル（ＬａｅｍｍｌｉＵ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）に従い、改良媒質中１０％ポリアクリルアミドゲル上で２００Ｖで電気泳動にかける。次いでゲルを乾燥し、転写トランス作用ドメインを有する又は有さない分子に結合したハイブリッド分子の量を定量できるインスタントイメージャー（ｉｎｓｔａｎｔｉｍａｇｅｒ）（Ｐａｃｋａｒｄｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で現像する。この実験の結果を第１０図に示す。これらの条件では、ＳｃＦｖ４２１を有するハイブリッド分子（ＴＥＴ１９）が分子ｐ５３（１／３９３）を単独のＳｃＦｖ４２１と同等に認識し、ドメイン３２０／３９３を有するハイブリッド分子（ＴＥＴ０２）は、同じ性質を有するが、ｐ５３（１／３９３）保持能力が遥かに大きいことが明らかである。また、分子ｐ５３（１／３２０）とのインキュベーション時に観察されるシグナルの不在は、これらの相互作用が十分に特異的であり、予想通りタンパク質ｐ５３のＣ末端の先端（アミノ酸３２０〜３９３）に仲介されることを示す。従ってこれらの結果は、本発明のハイブリッド分子が、これらのハイブリッド分子の特異的な結合相手である分子が有する転写トランス作用ドメインを捕捉できることを立証している。実施例９：本発明のハイブリッド分子による転写トランス作用ドメインの機能的捕捉本発明のハイブリッド分子による転写トランス作用ドメインの機能的捕捉（ｒｅｃｒｕｔｅｍｅｎｔｆｏｎｃｔｉｏｎｎｅｌ）を、タンパク質ｐ５３の二つの対立遺伝子を欠失している細胞ＳＡＯＳ−２（ヒト骨肉腫）内、タンパク質ｐ５３の二つの対立遺伝子を欠失している腫瘍細胞系Ｈ３５８内（Ｍａｘｗｅｌｌ＆Ｒｏｔｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，３４２１，１９９３）、及びタンパク質ｐ５３の二つの対立遺伝子のうちの一つを欠失し、突然変異対立遺伝子（突然変異Ｈ２７３）を有する腫瘍細胞系ＨＴ２９内でｉｎｖｉｖｏトランス作用系で評価した。この系は、酵素的に定量でき、リプレッサーＴｅｔにより特異的に認識されるヌクレオチドユニットを含むプロモーター（Ｔｅｔオペレーター）の制御下におかれるレポータこの実験では、オペレーターＴｅｔの制御下におかれるレポーター遺伝子ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）が、プラスミドｐＵＨＣ１３−３（ＧｏｓｓｅｎＭ．＆ＢｕｊａｒｄＨ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９，５５４７−５５５１，１９９２）内に含まれる。９．１．使用する細胞系及び培養条件これらの実験で使用する細胞系、並びにタンパク質ｐ５３に関連したこれらの細胞系の遺伝子型及びこれらの細胞系の増殖に使用する培養培地を下記の表に示す。９．２．転写トランス作用ドメインを有する分子の発現プラスミドこの実験で使用する転写トランス作用ドメインを有する分子は、野生型（ｗｔ）タンパク質ｐ５３並びに該タンパク質の突然変異体Ｇ２８１及びＨ１７５である。これら３種類のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。９．３．本発明のハイブリッド分子の細胞内発現本発明のハイブリッド分子を、下記のプロトコルを用いて、一時的トランスフェクションにより培養細胞内で発現させる：細胞（３．５×１０⁵）を、培養培地２ｍｌを入れた６ウェルプレートに入れ、ＣＯ₂（５％）雰囲気下３７℃のインキュベーターで一晩培養する。次いで、ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）をトランスフェクション剤として使用して、種々の構築物を下記の手順でトランスフェクションする：１．５μｇの完全プラスミド（そのうち０．２５μｇはリポータープラスミド）を、２ｍｌの無血清培養培地を用いて５μ ｌのｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥと共に３０分間インキュベートする（トランスフェクション混合物）。この時間の間に、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、次いでトランスフェクション混合物と共に３７℃で４時間インキュベートし、その後トランスフェクション混合物を吸引除去し、代わりに、熱で不活化したウシ胎児血清を１０％添加した培養培地２ｍｌを加え、細胞を３７℃で４８時間再増殖する。９．４．転写の活性の検出ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを製造業者の実験プロトコルに従って使用して、遺伝子ＬＵＣにコードされるルシフェラーゼ活性を測定することにより、転写トランス作用因子の機能的捕捉に関連した転写の活性を検出し定量する。９．５．本発明の分子による転写トランス作用ドメインの機能的捕捉この実験は、実施例６に記載の分子ＴＥＴ０２、ＴＥＴ０３及びＴＥＴ０７を用いて実施した。この実験では、分子ＴＥＴ０７を正の対照として使用する。なぜなら、該分子は自己の転写トランス作用ドメインを有するからである。第１１図に示す細胞ＳＡＯＳ−０２内で得られた結果は、分子ＴＥＴ０７が、構築物ＴＥＴ０２と異なり、Ｔｅｔオペレーターの制御下におかれた遺伝子ＬＵＣの転写を単独で活性化できることを示している。これは、前記細胞系が、分子ＴＥＴ０２によって捕捉できない内因性タンパク質ｐ５３を含まないという事実と一致する。これに対し、野生型タンパク質ｐ５３、又は単独ではシグナルを発生しない前記タンパク質の突然変異体Ｇ２８１を導入すると、分子ＴＥＴ０２の存在下で転写活性が発生する。このような結果は、非機能的転写トランス作用ドメインを有するとして文献に記述されている突然変異体Ｈ１７５の場合には観察できない。分子ＴＥＴ０２について細胞系ＳＡＯＳ−０２内で得られた前記結果は、やはり内因性ｐ５３を含まない腫瘍細胞系（細胞Ｈ３５８）内で再現され、分子ＴＥＴ０３及びＴＥＴ０４についても得ることができた（第１２図）。異なる細胞コンテクストで前記二つの結果を確認するために、分子ＴＥＴ０２及び正の対照ＴＥＴ０７を、突然変異内因性タンパク質ｐ５３（Ｈ２７３）を有する細胞ＨＴ２９内で発現させた。この実験の負の対照は、空のベクターｐｃＤＮＡ３をトランスフェクションすることからなる。下記の表に示すこの実験の結果は、分子ＴＥＴ０２が内因性タンパク質ｐ５３の転写トランス作用ドメインを捕捉できることを示している。これらの実験は総て、本発明のハイブリッド分子が、特異的二本鎖ＤＮＡ配列と転写トランス作用ドメインを有するタンパク質とに同時に結合でき、これらの分子が目的の遺伝子の発現を条件的に誘発できることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＹＣ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/155 7/08 14/245 14/155 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 14/245 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤＣ１２Ｐ 21/02 37/48 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインと、生理学的又は生態病理学的状態に特有のトランス作用因子又はトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体に特異的に結合できる検出ドメインとを含む二重特異性キメラ分子。２．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、ＤＮＡと相互作用できるタンパク質に由来することを特徴とする請求項１に記載の分子。３．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、真核タンパク質に由来することを特徴とする請求項２に記載の分子。４．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、タンパク質ｐ５３、ＳＴＡＴ又はＮＦｋＢに由来することを特徴とする請求項３に記載の分子。５．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、原核タンパク質に由来することを特徴とする請求項２に記載の分子。６．原核タンパク質が細菌リプレッサーであることを特徴とする請求項５に記載の分子。７．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、タンパク質ｔｅｔＲに由来することを特徴とする請求項６に記載の分子。８．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、タンパク質Ｃｒｏに由来することを特徴とする請求項６に記載の分子。９．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが、前記タンパク質のＤＮＡと相互作用するドメインを含むことを特徴とする請求項２から８のいずれか一項に記載の分子。１０．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインが完全タンパク質からなることを特徴とする請求項２から８のいずれか一項に記載の分子。１１．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインがタンパク質ｔｅｔＲからなることを特徴とする請求項１０に記載の分子。１２．所定のＤＮＡ配列に選択的に結合できるドメインがタンパク質Ｃｒｏからなることを特徴とする請求項１０に記載の分子。１３．トランス作用因子もしくはトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体に特異的に結合できるドメインがオリゴマー化するドメインであることを特徴とする請求項１に記載の分子。１４．オリゴマー化するドメインがロイシンジッパー、ドメインＳＨ３又はＳＨ２であることを特徴とする請求項１３に記載の分子。１５．トランス作用因子に特異的に結合できるオリゴマー化するドメインがタンパク質ｐ５３のＣ末端部分からなることを特徴とする請求項１３に記載の分子。１６．オリゴマー化するドメインが、残基３２０〜３９３（配列番号３）、３０２〜３６０又は３０２〜３９０からなるタンパク質ｐ５３のＣ末端部分で構成されていることを特徴とする請求項１５に記載の分子。１７．トランス作用因子もしくはトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制に特異的に結合できるドメインが、前記トランス作用因子もしくはトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体と相互作用することで知られている合成又は天然ドメインであることを特徴とする請求項１に記載の分子。１８．トランス作用因子もしくはトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体に特異的に結合できるドメインが、トランス作用因子もしくはトランスリプレッサー又はトランス作用もしくはトランス抑制複合体に対する抗体又は抗体のフラグメントもしくは誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の分子。１９．トランス作用因子又はトランス作用複合体に特異的に結合できるドメインが、抗体のフラグメントＦａｂもしくはＦ（ａｂ）’₂、又は抗体のＶＨもしくはＶＬ領域からなることを特徴とする請求項１８に記載の分子。２０．トランス作用因子又はトランス作用複合体に特異的に結合できるドメインが、アームによってＶＬ領域に結合したＶＨ領域を含む単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）からなることを特徴とする請求項１８に記載の分子。２１．ＤＮＡに結合するドメイン及びトランス作用因子に結合するドメインがアームを介して互いに結合していることを特徴とする請求項１に記載の分子。２２．アームが、５〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜２０個のアミノ酸を含むペプチドからなることを特徴とする請求項２１に記載の分子。２３．アームが、配列番号５又は配列番号６の配列のペプチドから選択したものであることを特徴とする請求項２２に記載の分子。２４．ＤＮＡに結合するドメインがＮ末端位置に存在し、トランス作用因子に結合するドメインがＣ末端位置に存在することを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の分子。２５．ＤＮＡに結合するドメインがＣ末端位置に存在し、トランス作用因子に結合するドメインがＮ末端位置に存在することを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の分子。２６．構造ＳｃＦｖ−ＶＳＶ／ｍｙｃ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ａ）を有する二重特異性キメラ分子。２７．構造ＳｃＦｖ−ヒンジ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｂ）を有する二重特異性キメラ分子。２８．構造ＳｃＦｖ−ＴＥＴ又はＣｒｏ（第５図Ｃ）を有する二重特異性キメラ分子。２９．構造ＴＥＴ又はＣｒｏ−ＳｃＦｖ（第５図Ｄ）を有する二重特異性キメラ分子。３０．構造ＴＥＴ又はＣｒｏ−ヒンジ−ＳｃＦｖ（第５図Ｅ）を有する二重特異性キメラ分子。３１．構造Ｏｌｉｇｏｍ−ＶＳＶ／ｍｙｃ−ヒンジ−ＴＥＴもしくはＣｒｏ（第５図Ａ）、Ｏｌｉｇｏｍ−ヒンジ−ＴＥＴもしくはＣｒｏ（第５図Ｂ）又はＯｌｉｇｏｍ−ＴＥＴもしくはＣｒｏ（第５図Ｃ）を有する二重特異性キメラ分子。３２．請求項１から３１のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードする核酸配列。３３．ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項３２に記載の核酸配列。３４．ベクターの一部をなすことを特徴とする請求項３２又は３３に記載の核酸配列。３５．遺伝子条件発現系であって、請求項１から３１のいずれか一項に記載のキメラ分子と、調節配列、最小転写プロモーター及び前記遺伝子を含む発現カセットとを含む前記遺伝子条件発現系。３６．キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＴｅｔＲの全体又は一部によって表され、調節配列が、任意に複数回反復してもよい配列番号１の配列又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項３５に記載の条件発現系。３７．キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＣｒｏの全体又は一部によって表され、調節配列が、任意に複数回反復してもよい配列番号２の配列又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項３５に記載の条件発現系。３８．最小プロモーターがＴＡＴＡ又はＩＮＲボックスを含むことを特徴とする請求項３５から３７のいずれか一項に記載の条件発現系。３９．最小プロモーターがチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターに由来することを特徴とする請求項３８に記載の条件発現系。４０．最小プロモーターがチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−３７〜＋１９からなることを特徴とする請求項３９に記載の条件発現系。４１．請求項１から３１のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードする核酸配列と、調節配列、最小転写プロモーター及び目的のコーディング配列を含む発現カセットとを含むベクター。４２．最小転写プロモーターが請求項３８から４０のいずれか一項に記載のものであることを特徴とする請求項４１に記載のベクター。４３．キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＴｅｔＲの全体又は一部によって表され、調節配列が、任意に複数回反復してもよい配列番号１の配列又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項４１に記載のベクター。４４．キメラ分子のＤＮＡ結合ドメインがＣｒｏの全体又は一部によって表され、調節配列が、任意に複数回反復してもよい配列番号２の配列又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項４１に記載のベクター。４５．目的のコーディング配列が治療生成物をコードするＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項４１から４４のいずれか一項に記載のベクター。４６．治療生成物が毒性ペプチド又はポリペプチドであることを特徴とする請求項４５に記載のベクター。４７．毒性治療生成物が、ジフテリアトキシン、シュードモナストキシン、リシンＡ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、タンパク質Ｇｒｂ３−３又はＳｃＦｖＹ２８の中から選択される請求項４６に記載のベクター。４８．プラスミド性ベクターであることを特徴とする請求項４１から４７のいずれか一項に記載のベクター。４９．ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項４１から４７のいずれか一項に記載のベクター。５０．欠陥組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項４９に記載のベクター。５１．欠陥組換えレトロウイルスであることを特徴とする請求項４９に記載のベクター。５２．請求項４１から５１のいずれか一項に記載のベクターを少なくとも一つ含む医薬組成物。５３．配列番号４の配列を含む核酸。５４．生理学的又は生態病理学的状態に特有のトランス作用因子が、転写トランス作用活性を有するウイルス由来、寄生虫由来、ミコバクテリア由来又は細胞由来のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の分子。５５．トランス作用因子が、ＨＩＶウイルスのタンパク質Ｔａｔ、パピローマウイルスのタンパク質Ｅ６／Ｅ７及びエプスタイン・バールウイルスのタンパク質ＥＢＮＡの中から選択したウイルスタンパク質であることを特徴とする請求項５４に記載の分子。５６．トランス作用因子が細胞タンパク質、好ましくは突然変異型又は野生型ｐ５３タンパク質であることを特徴とする請求項５４に記載の分子。５７．生理学的又は生態病理学的状態に特有のトランス作用因子又はトランス作用複合体が、感染細胞又は過剰増殖細胞内に発生するタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の分子。