JP2000508904A - チロシンヒドロキシラーゼの遺伝子に由来の発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規な遺伝子発現系に関する。本発明の系は特に、転写エンハンサー特性を有するチロシンヒドロキシラーゼの遺伝子の第一イントロンに由来の配列の使用に基づく。本発明の系は、特に遺伝子治療に使用されるタンパク質の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）産生に特に有利である。

Description

【発明の詳細な説明】 チロシンヒドロキシラーゼの遺伝子に由来の発現系 本発明は遺伝子の新規な発現系に関する。本発明はまた、有益な遺伝子の発現 を増進させるためまたは組換えタンパク質を産生させるために、遺伝子治療また は細胞治療でこのような発現系を使用する方法に関する。 遺伝子治療または細胞治療は、病気に罹った細胞または器官に遺伝情報を導入 することによって欠陥もしくは異常（突然変異、異常発現、など）を矯正するか または有益な治療用タンパク質を発現させる治療方法である。器官から抽出した 細胞に遺伝情報を生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）導入し、修飾した細胞を生物に再 導入してもよく（細胞治療）、または、遺伝情報を生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ） 対象組織に直接導入してもよい（遺伝子治療）。種々の遺伝子導入技術が存在す る。例えば、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋ ａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質と の複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）のような天然または合成の化学的または生化学的ベ クターの使用、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５（１９８０）１０４３１）、カチオン性脂質の使用、などを含む種々のト ランスフェクション技術がある。いま１つの技術は、ウイルスを遺伝子導入ベク ターとして使用する方法である。この観点から、種々のウイルス、特にレトロウ イルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ、など）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイル ス及びアデノウイルスに関しては、いくつかの細胞集団に対するウイルスの感染 能力が試験された。しかしながらこのような遺伝子治療及び細胞治療の開発に伴 う難題の１つは治療の効率に関する問題である。治療効果を改善するために重要 な要件は、有益な遺伝子の大量発現を得ることである。組換えタンパク質の産生 方法においても同様の問題に直面する。 様々な種類のプロモーターが文献に記載されており、これらのプロモーターは 有益な遺伝子の発現をコントロールするために使用されている。しかしながら、 得られた発現レベルはしばしば、多量の組換えタンパク質を試験管内（ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ）で産生させるため、または、重要な及び／または持続的な治療 効果をｉｎ ｖｉｖｏで生じさせるために十分ではなかった。本発明はここに、 遺伝子の極めて有効な新規な発現系を記載する。本発明は特に、プロモーターの 力を増強しその結果として遺伝子の発現レベルを増進させ得る転写エンハンサー 活性を備えた領域の同定に基づいて生まれたものである。 より特定的には本発明は、転写プロモーターの活性を増強し得るチロシンヒド ロキシラーゼの遺伝子の第一イントロンの領域が同定された結果として生まれた 。より正確にはこれらの領域は、この遺伝子の第一イントロンに存在するマイク ロサテライトＨＵＭＴＨ０１の処に局在する。 マイクロサテライトはＤＮＡ反復配列の１つの大きいクラスを示しており、モ チーフの反復数及び／またはモチーフの配列の多様性に基づく高度な多型性を有 している。このような理由からこれらのマイクロサテライトは、遺伝地図を作成 するため及び病理発生に関与する遺伝子座を同定するためのマーカーとして使用 されていた。マイクロサテライトの種々の対立遺伝子は、モチーフの反復数の多 様性に伴って異なるサイズを有している。２量体の反復配列の配列決定実験では 、モチーフの反復数及びモチーフの配列の多様性が証明された。より詳細にはこ れらの多様な配列は、基本配列の中断がない“完全”反復配列に対応するか、ま たは、モチーフの配列中に（１つまたは複数の）欠失または（１つまたは複数の ）挿入のような１つまたは複数の中断がある“不完全”反復配列に対応し得る。 同様にして、モチーフの３量体またはモチーフの４量体の配列でも長さ及び／ま たは配列の多様性が観察された。例えば、マイクロサテライトＨＵＭＨＰＲＴＢ （Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１２（１９９２）２４１）及びＨＵＭＴ Ｈ０１（Ｐｕｅｒｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５３（１９９３）９５ ３）においてこの種の多様性が観察された。 マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１は、カテコールアミンの生合成経路の制限 酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の遺伝子の第一イントロンに局在 している。このイントロンの配列の一部を配列１（ヌクレオチド８７１以降）に 示す。この配列は、１１７０位に局在するマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１（ 対立遺伝子（ＴＣＡＴ）９、太字で示す）を含む（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号＃ Ｄ００２６９）。マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１はモチーフＴＣＡＴの４つ の反復から成る。このマイクロサテライトはいくつかの多型を有しており、異な る対立遺伝子は異な る数の反復モチーフを有すると記載されている。最も高頻度で出現する対立遺伝 子（対立遺伝子Ｅｉ）は１０個の反復モチーフを含み、５番目の反復モチーフは １つの塩基対が欠失して配列ＣＡＴとなっている（配列２）。別の対立遺伝子は ５〜１０個のモチーフＴＣＡＴを有することが同定されている。 出願人は、意外にもこれらの配列が種々の核抽出物に存在するタンパク質によ って特異的に認識されることをここに証明した（実施例１）。出願人は更に、こ れらの配列が種々の細胞系中の遺伝子の転写を増進させ得ることを証明した（実 施例３及び４）。即ち、ＰＣ１２細胞においては、２５〜５０倍の転写活性の増 進が観察された。ＨｅＬａ細胞においては、１００〜３５０倍の顕著な増進が観 察された。従ってこれらの配列は極めて強力な転写アクチベーター特性を有して いる。これらの特性は特に予想外であり、他の転写エンハンサーについて観察さ れた結果をはるかに上回っている。例えば、配列ＨＲＡＳ１−ＶＮＴＲ（Ｇｒｅ ｅｎら，１９９３参照）では３〜６倍、配列ＩＮＳ−ＶＮＴＲ（Ｃａｔｉｇｎａ ｎｉら，１９９５）では２〜５倍の転写活性の増進が観察された。本発明の配列 によって得られた増進は３００倍以上に達しており、これは従来の系に 比べて卓越した利点である。更に、得られた結果は、本発明の配列が多様な種類 の細胞中及び種々の生物の細胞（ラットＰＣ１２細胞、ヒトＨｅＬａ細胞）中で 機能性であることを示しており、このことは極めて広汎な用途が期待されること を示している。 従って、本発明の第一の目的は、実質的にチロシンヒドロキシラーゼの遺伝子 の第一イントロンの一部分から成る転写エンハンサー活性を有するＤＮＡフラグ メントに関する。本発明のフラグメントは好ましくは、２００ｂｐよりも短く、 マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子を含んでいる。より好ましくは 、フラグメントが１００ｂｐよりも短い。フラグメントが実質的にマイクロサテ ライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子から構成されているのが特に有利である。 上述のように、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１は、ヒトＴＨ遺伝子の約１ １７０位に局在しており（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＃Ｄ００２６９）、主として モチーフＴＣＡＴの４つの反復から成る。このマイクロサテライトの種々の対立 遺伝子が種々のモチーフ反復数（５〜１０）または配列の多様性を有しているこ と、及び、いくつかの対立遺伝子が塩基の突然変異を 有していることは既に開示されていた。例えば、最も高頻度で出現する対立遺伝 子（対立遺伝子Ｅｉ）は１０個の反復モチーフを含んでおり、５番目の反復モチ ーフは１つの塩基対が欠失して配列ＣＡＴとなっている（配列２）。別の対立遺 伝子は５〜１０個のモチーフＴＣＡＴを含むことが同定されていた（配列９−１ ５）。更に、３個のモチーフＴＣＡＴを含むＤＮＡフラグメントを合成し得るの で、本発明ではこれを転写エンハンサーとして試験する。 この観点から、本発明の目的はまた、転写エンハンサー活性を有しており、配 列（ＴＣＡＴ）_n−（ＣＡＴ）_o−（ＴＣＡＴ）_pを有しており、ｎが１〜５０、 ｏが０〜２０、ｐが０〜５０であることを特徴とするＤＮＡの単離フラグメント を提供することである。 本発明の変形実施態様によれば、転写エンハンサーが配列（ＴＣＡＴ）_n−（ ＣＡＴ）_o−（ＴＣＡＴ）_pを有しており、ｎが２〜２０（両端値を含む）、ｏ及 びｐが０である。 本発明の別の変形実施態様によれば、転写エンハンサーが配列（ＴＣＡＴ）_n −（ＣＡＴ）_o−（ＴＣＡＴ）_pを有しており、ｎが１〜１０、ｏが１〜５、ｐが １〜１０である。 本発明の転写エンハンサーの特定例としては、配列１、２、３、４、５、６、 ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５のフラグメントが挙げられ る。 本発明の別の目的は、コーディング配列と、該コーディング配列を発現させ得 るプロモーターと、上記のような転写エンハンサーとを含む発現カセットを提供 することである。好ましくは、カセットが更に転写終止シグナルを含んでいる。 プロモーターは、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞の機能性プロモーターから 選択されるのが有利である。好ましいプロモーターは特に、異常増殖細胞（癌細 胞、再発狭窄症、など）の核酸を発現させ得るプロモーターである。この観点か らはｐ５３遺伝子のプロモーターのような種々のプロモーターを使用し得る。好 ましいプロモーターはまた、（他のタンパク質の発現を担当する）種々の起源の 領域である（合成領域でもよい）。即ち、特異的または非特異的に、誘導的また は非誘導的に、強くまたは弱く遺伝子の転写を刺激または抑制する任意のプロモ ーターまたは該プロモーターに由来の配列を使用し得る。より特定的には、真核 細胞またはウイルスの遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、標的細 胞のゲノムに由来のプロモー ター配列を使用し得る。真核細胞プロモーターとしては、特に、遍在性プロモー ター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、ａ−アクチン、チューブリンなどの遺伝子のプロモー ター）、中間フィラメントのプロモーター（ＧＦＡＰ）デスミン、ビメンチン、 ニューロフィラメント、ケラチン、などの遺伝子のプロモーター）、治療用遺伝 子のプロモーター（例えば、ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子、ＡｐｏＡＩ、Ａ ｐｏＡＩＩ、アルブミン、チミジンキナーゼ、などの遺伝子のプロモーター）、 組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、腸内脂肪酸結合タンパ ク質、平滑筋のａ−アクチン、ニューロン特異的エノラーゼのプロモーター（Ｆ ｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら，Ｎｅｕｒｏｎ ５（１９９０）１８７）などの遺伝 子のプロモーター）、ＶＡＣｈＴのｍＲＮＡのＶ１形態を生じるプロモーター（ アセチルコリン輸送体：Ｃｅｒｖｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（ １９９５）２４６５４）、あるいは、刺激に応答するプロモーター（ステロイド ホルモンのレセプター、レチノール酸のレセプター、など）がある。また、ウイ ルスのゲノムに由来のプロモーター配列、例えば、アデノウイルスのＥ１Ａ及び ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの初期プロモーター、ＲＳＶもしくはＭＭ ＴＶ のＬＴＲのプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝子のプロモーターなどが ある。更に、これらのプロモーター領域を配列の付加または欠失によって修飾し てもよい。この目的で使用されるプロモーターは、“最小”プロモーター、即ち 、その活性が本発明のエンハンサーのようなトランス作用因子の存在に本質的に 依存する短いプロモーターでよい。即ち、エンハンサーが存在しないとき、プロ モーターの活性が低下し、遺伝子は全くまたは殆ど発現されない。逆に、エンハ ンサーの存在下では、最小プロモーターの活性が強化され、有益な遺伝子が大量 に発現する。最小プロモーターは概して、ＴＡＴＡまたはＩＮＲボックスから成 る。これらの要素は実際には、トランス作用因子の存在下の遺伝子の発現に必要 な最小要素である。最小プロモーターは２００ｂｐよりも短く、ＴＡＴＡまたは ＩＮＲ領域を含むのが有利である。最小プロモーターは任意のプロモーターから 遺伝的修飾によって作製できる。有望なプロモーターの特定例としては、チミジ ンキナーゼの遺伝子のプロモーターが挙げられる。より特定的には、単純ヘルペ ス１型ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）の遺伝子のヌクレオチド−１０９か ら＋５２または−３７から＋１９から成るプロモーターに由来の 最小プロモーターによって有利な結果が得られた。また、最小プロモーターがヒ トＣＭＶに由来してもよい。特に、ＣＭＶのヌクレオチド−５３から＋７５また は−３１から＋７５（＋１はＡＴＧコドンに対応する）のフラグメントから構成 され得る。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシ ダーゼまたはルシフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーターのような慣用の 任意のプロモーターを使用してもよい。 好ましい転写プロモーターは、哺乳類細胞中の機能性プロモーター、特にウイ ルスプロモーター（ＴＫ、ＣＭＶ）、遍在性プロモーター（ＰＧＫ）または特異 的プロモーター（ニューロン特異的エノラーゼのプロモーター、ＶＡＣｈＴのｍ ＲＮＡのＶ１形態を生じるプロモーター）である。 別の好ましい実施態様では、転写プロモーターが、ＴＡＴＡまたはＩＮＲボッ クスを含む実質的に２００ｂｐ未満の領域から構成された最小プロモーターであ る。 コーディング配列はタンパク質をコードする１つまたは複数の配列を含むのが 有利である。コーディング配列としては特に、ペプチド、ポリペプチド、タンパ ク質、リボ核酸などの治療用物質をコードする配列がある。より特定的にはコー ディング配 列は、酵素；血液誘導体；ホルモン；リンフォカイン：インターロイキン、イン ターフェロン、ＴＮＦなど（フランス特許ＦＲ９２０３１２０）；成長因子；神 経伝達物質またはそれらの前駆物質、合成酵素；栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ 、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など；アポリ ポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（フランス特許ＦＲ９ ３０５１２５）；ジストロフィンまたはミニジストロフィン（フランス特許ＦＲ ９１１１９４７）；腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ− ｒｅｖなど（フランス特許ＦＲ９３０４７４５）；凝固関与因子をコードする遺 伝子：ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子など；天然または人工の免疫グロブ リンの全部または一部（Ｆａｂ、ＳｃＦｖなど）；リガンドＲＮＡ（国際特許Ｗ Ｏ９１／１９８１３）など、である。 コーディング配列はまた、標的細胞中で発現したときに遺伝子の発現または細 胞性ｍＲＮＡの転写をコントロールし得るアンチセンス配列でもよい。このよう な配列は例えば欧州特許ＥＰ１４０３０８に記載の技術によって、標的細胞中で 細胞性ｍＲＮＡから相補的ｍＲＮＡに転写され、該ｍＲＮＡがタンパ ク質に翻訳されることを阻止する。 本発明はまた、毒性因子をコードする配列の発現にも適している。毒性因子と しては特に、細胞に対する毒（ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシンＡ 、など）、外的因子に対する感受性を誘発する物質（自殺遺伝子：チミジンキナ ーゼ、シトシンデスアミナーゼ、など）、または、細胞死を誘発し得る致死遺伝 子（Ｇｒｂ３−３（国際特許ＰＣＴ／フランス特許ＦＲ９４／００５４２）、Ｓ ｃＦｖ抗−ｒａｓ（国際特許ＷＯ９４／２９４４６）、など）がある。この系は また、例えばサイトカイン、インターフェロン、ＴＮＦまたはＴＧＦの発現に特 に有益である。 発現カセットは好ましくは以下の要素から成る。 −エンハンサー領域として、配列（ＴＣＡＴ）_n−（ＣＡＴ）_o−（ＴＣＡＴ） ｐを有しており、ｎが１〜５０、ｏが０〜２０、ｐが０〜５０である配列、 −プロモーターとして、ＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子のプ ロモーターもしくはこのプロモーターに由来の最小プロモーターまたはＣＭＶの 初期プロモーターもしくはこのプロモーターに由来の最小プロモーター、または 、ＰＧＫ プロモーター、特異的エノラーゼプロモーターまたはＶＡＣｈＴ遺伝子のプロモ ーター、 −有益なコーディング配列。 より好ましいプロモーターは、ＨＳＶ−１のチミジンキナーゼの遺伝子のプロ モーターの−１０９から＋５２または−３７から＋１９の領域から構成されてい る。 有利なエンハンサー領域は、配列１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ 、１１、１２、１３、１４及び１５のフラグメントから選択される。更に、本発 明のエンハンサー領域の特に顕著な特性は、センス方向（ＴＨ遺伝子中のマイク ロサテライトの正常方向）でもアンチセンス方向（ＴＨ遺伝子中のマイクロサテ ライトの正常方向の逆方向）でも同等に活性であると考えられることである。従 って、本発明の発現カセットにおいては、エンハンサー領域を２つの方向（５’ →３’または３’→５’）で配置し得る。 本発明の更に別の目的は、上記に定義の発現カセットを含む発現ベクターを提 供することである。ベクターはプラスミドベクターでもよくウイルスベクターで もよい。 好ましいウイルスベクターとしては特に、アデノウイルス、 レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノ関連ウイルスを例示し得る。本 発明のウイルスは欠陥ウイルス、即ち、標的細胞中で自律複製できないウイルス である。 従って一般的に、本発明の範囲で使用される欠陥ウイルスのゲノムからは、感 染細胞中で該ウイルスが複製するために必要な配列が少なくとも削除されている 。これらの領域を除去（全部または一部）してもよく、非機能性にしてもよく、 他の配列特に本発明の配列によって置換してもよい。しかしながら、欠陥ウイル スが、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要なゲノムの配列を保存しているのが 好ましい。 特にアデノウイルスに関しては、構造及び特性に多少の違いをもつ種々の血清 型が特性決定された。これらの血清型のうちで、本発明の範囲内では、ヒトアデ ノウイルス２型もしくは５型（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起原のアデノ ウイルス（国際特許出願ＷＯ９４／２６９１４参照）を使用するのが好ましい。 本発明の範囲内で使用可能な動物起原のアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、 ネズミ（例えば：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０ ）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例えばＳＡＶ）起原のアデノウイル スを 例示し得る。好ましい動物起原のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、特に 、ＣＡＶ２（例えば、マンハッタン菌株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ− ８００））である。本発明の範囲内ではヒト起原またはイヌ起原のアデノウイル スまたは混合アデノウイルスを使用するのが好ましい。 好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスのゲノムは、アデノウイルスのＩ ＴＲ（逆方向末端反復配列）及びキャプシド形成領域と、キメラ分子をコードす る核酸配列と、上記に定義の発現カセットとを少なくとも含む。より好ましくは 、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくとも領域Ｅ１は非機能性で ある。考察されるウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の技術、特に、考察され る１つまたは複数の遺伝子の完全削除、置換（例えば本発明の配列による置換） 、部分欠失、または１つもしくは複数の塩基の付加によって非機能性になる。こ のような修飾はｉｎ ｖｉｔｒｏで（単離ＤＮＡに対して）行ってもよく、また は、遺伝子工学の技術を用いることによってもしくは突然変異誘発物質で処理す ることによってその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）行ってもよい。また、他の領域、特 に領域Ｅ３（国際特許ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（国際特許ＷＯ ９４／２８９３８）、Ｅ４（国際特許ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６ ４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（国際特許ＷＯ９５／０２６９７）を修 飾してもよい。好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウイルスは、領域Ｅ １及びＥ４に欠失を含む。別の好ましい実施態様では、領域Ｅ１に欠失を含み、 欠失の処に領域Ｅ４と本発明の配列とが挿入される（フランス特許ＦＲ９４ １ ３３５５参照）。 本発明の組換え欠陥アデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術によって作 製できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，欧州特許 ＥＰ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。 より特定的には本発明の組換え欠陥アデノウイルスは、アデノウイルスと、本発 明の発現カセットとアデノウイルスに相同の配列とを特別に担持するプラスミド との相同組換えによって作製できる。相同組換えは、上記アデノウイルスとプラ スミドとを適当な細胞系にコトランスフェクションさせることによって生じる。 また、細菌（フランス特許ＦＲ９５ ０１６３２）または酵母（国際特許ＷＯ９ ５／０３４００）中でアデノウイルスゲノムをｉｎ ｖｉｔｒｏで調製してもよ い。アデノウイルスの産生に使用さ れる細胞系は好ましくは、（ｉ）上記要素によって形質転換可能である、（ｉｉ ）欠陥アデノウイルスのゲノムの部分を相補し得る配列を、好ましくは組換えの 危険を回避するために組込まれた形態で含む、という要件を満たしていなければ ならない。細胞系としては、アデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％ ）をそのゲノムに組込んだ形態で含むヒト胎児腎細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍら ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）、または、特に国際特許出 願ＷＯ９４／２６９１４及びＷＯ９５／０２６９７に記載されているようなＥ１ 及びＥ４の機能を相補し得る系を例示し得る。 次に、増幅されたアデノウイルスを、実施例に例示するような慣用の分子生物 学の技術によって回収し精製する。 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に関して考察すると、このウイルスは比較的小 さいサイズのＤＮＡウイルスであり、感染した細胞のゲノムに安定にかつ部位特 異的に組込まれる。これらのウイルスは、細胞の増殖、形態または分化に影響を 生じることなく広いスペクトルの細胞に感染し得る。更に、これらのウイルスは ヒトの病理発生に関与しないと考えられる。ＡＡＶのゲノムはクローニングされ 、配列決定され、特性決定された。 このゲノムは約４７００塩基から成り、各末端にウイルス複製起点となる約１４ ５塩基の逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの残りの部分はキャプシ ド形成機能を担う実質的に２つの領域に分割される。ゲノムの左側部分はウイル スの複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む。ゲノムの右 側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子導入にＡＡＶに由来のベクター を使用することは、文献に記載されている（特に、国際特許ＷＯ９１／１８０８ ８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許ＵＳ４，７９７，３６８；ＵＳ５，１３９ ，９４１；欧州特許ＥＰ４８８，５２８参照）。これらの特許出願は、ｒｅｐ及 び／またはｃａｐ遺伝子が欠失して有益な遺伝子によって置換されたＡＡＶに由 来の種々の構築物を記載し、また、この構築物を、有益な遺伝子のｉｎ ｖｉｔ ｒｏ導入（培養細胞に対する導入）またはｉｎ ｖｉｖｏ導入（生体内に直接導 入）に使用することを記載している。本発明の組換え欠陥ＡＡＶは、ヒト補助ウ イルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向末 端反復領域（ＩＴＲ）によっ て挟まれた本発明の発現カセットを含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド形成 遺伝子（ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドとをコトランス フェクションすることによって作製される。産生された組換えＡＡＶを次に、従 来の技術によって精製する。 ヘルペスウイルス及びレトロウイルスに関する組換えベクターの構築は多くの 文献に記載されている。特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｓｔ ３（１９９１）２０３；欧州特許ＥＰ４５３２４２；ＥＰ１７８２２０ ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣ ｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９，など。 特に、レトロウイルスは、分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである 。従って、癌に使用するための有益なベクターを構成する。レトロウイルスのゲ ノムは実質的に２つのＬＴＲと、１つのキャプシド形成配列と、３つのコーディ ング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）とを含む。レトロウイルスに由来の組換 えベクター中では通常、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の全部または一部が欠 失し、有益なヘテロロガス核酸配列 によって置換されている。これらのベクターは多様な種類のレトロウイルスから 作製でき、例えばＭｏＭｕＬＶ（“マウスモロニー白血病ウイルス”；略号Ｍｏ ＭＬＶも使用される）、ＭＳＶ（“マウスモロニー肉腫ウイルス”）、ＨａＳＶ （“ハーベイ肉腫ウイルス”）、ＳＮＶ（“脾臓壊死ウイルス”）、ＲＳＶ（“ ラウス肉腫ウイルス”）あるいはフレンドウイルスがある。 本発明の組換えレトロウイルスを構築するために、通常は、特にＬＴＲとキャ プシド形成配列と本発明の配列（発現カセット）とを含むプラスミドを構築し、 次にこれを使用して、プラスミドの欠陥レトロウイルス機能をトランス配置で付 与し得るいわゆるキャプシド形成細胞系にトランスフェクトする。従って通常は 、キャプシド形成細胞系がｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現し得る。この ようなキャプシド形成細胞系は従来技術に記載されており、特にＰＡ３１７系（ 米国特許ＵＳ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（国際特許ＷＯ９０／０ ２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（国際特許ＷＯ８９／０７１５０）があ る。更に、組換えレトロウイルスは、ＬＴＲの処に転写活性を削除する修飾を含 むこともでき、また、ｇａｇ 遺伝子の一部を含む伸長したキャプシド形成配列を含むこともできる（Ｂｅｎｄ ｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。産生された組換えレト ロウイルスを次に従来の技術によって精製する。 また、発現カセットをプラスミドベクターに挿入してもよい（フランス特許Ｆ Ｒ９５ ０２１１７）。 本発明の遺伝子発現系は、遺伝子治療もしくは細胞治療または組換えタンパク 質の産生に特に好適に使用される。遺伝子治療または細胞治療に使用するために は、カセットまたはプラスミドベクターをヌードＤＮＡの形態または不活性導入 ベクターとの複合体として使用し得る。実際、真核細胞中の核酸の導入及び発現 を促進し得る多様な種類の不活性ベクターは既に開示されていた。化学的ベクタ ーまたは生化学的ベクターは特に、利便性及び安全性に優れており、またトラン スフェクトすべきＤＮＡのサイズに関する理論的制約がないという理由から、ウ イルスに代替して使用され得る。 これらの合成ベクターは主要な２つの機能を有している。トランスフェクトす べき核酸を小型化する機能、及び、核酸の細胞定着と核酸のプラスミド膜通過ま たは必要な場合には２つの 核膜通過を促進する機能である。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非ウ イルス性ベクターはいずれもポリカチオン性電荷を有している。 開発された合成ベクターのうちでは、ポリリシン（ＬＫＬＫ）ｎ、（ＬＫＫＬ ）ｎ、ポリエチレンイミン（国際特許ＷＯ９６／０２６５５）及びＤＥＡＥデキ ストランの種類のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質またはリポフェクタ ントが最も有利である。これらのベクターは、ＤＮＡを圧縮し、ＤＮＡと細胞膜 との結合を促進する特性を有している。これらのベクターとしては、リポポリア ミン（リポフェクトアミン、トランスフェクタム、国際特許ＷＯ９５／１８８６ ３）及び種々のカチオン性もしくは中性の脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰ Ｅなど）を例示し得る。より最近には、レセプターに仲介されるターゲット化ト ランスフェクションの構想が進んでいる。この手法は、ベクターの移入を受ける 細胞の表面に存在する膜レセプターのリガンドとカチオン性ポリマーとの化学結 合を利用して膜に複合体を結合させながらカチオン性ポリマーによってＤＮＡを 圧縮するという理論に基づく。トランスフェリン、インスリンに対するレセプタ ーまたは肝細胞のアシアロ糖タンパ ク質のレセプターのターゲッティングが記載されている。 本発明の目的は更に、上記に定義のベクターを含む医薬組成物を提供すること である。これらの組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻孔内投与、静 脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、などに好適な製剤の形態に調製さ れ得る。好ましくは、本発明の組成物は、注射可能製剤とするために医薬として 許容されるビヒクルを含む。ビヒクルとしては特に、無菌の等張性生理的塩類溶 液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム 、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど、または、これらの塩の混合物）また は必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清を添加して注射可能な溶質に復元し得 る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物がある。レトロウイルスの場合、キャプシド 形成細胞を直接使用するか、または、後で新器官の形態でｉｎ ｖｉｖｏに再移 植するためにｅｘ ｖｉｖｏで感染させた細胞を使用するのが有利である（国際 特許ＷＯ９４／２４２９８）。 注入に使用されるベクターの用量は種々のパラメーターに応じて調節でき、特 に、使用される投与モード、治療対象となる病気または所望の治療期間に応じて 調節できる。一般には、本 発明の組換えウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌの用量の形態で製剤化 され投与される。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、１０６〜１０１０ｐｆｕ／ ｍｌの用量も使用できる。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語は、ビリオ ン懸濁液の感染能に相当し、適当な細胞培養物にウイルスを感染させ、通常は４ ８時間後に感染細胞のプラーク数を測定することによって決定する。ウイルス溶 液のｐｆｕ価の測定技術は文献に詳細に記載されている。 本発明の別の目的は、ＤＮＡフラグメントと、上記の定義の発現カセットまた はベクターとを含む細胞を提供することである。これらの細胞は所与の細胞にＤ ＮＡを導入し得る当業者に公知の任意の技術によって得られる。これらの技術と して特に、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、コンジュゲーシ ョン、プロトプラスト融合または当業者に公知の他の任意の技術がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの形質転換の場合、種々のプロトコルが従来技 術に記載されている。特に、細胞の形質転換は、酢酸リチウムとポリエチレング リコールとの存在下でＩｔｏら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３） １６３−１６８）に記載の技術で完全細胞を処理 するか、または、エチレングリコールとジメチルスルホキシドとの存在下でＤｕ ｒｒｅｎｓら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８（１９９０）７）の技術で完全細胞 を処理することによって行うとよい。また欧州特許出願ＥＰ３６１９９１にも代 替プロトコルが記載されている。電気穿孔は、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ Ｇｕａｒｅ ｎｔｔｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ１９４（１９ ９１）１８２）に従って行うことができる。 本発明の細胞は種々の起原を有し得る。特に、細菌または真核細胞（酵母、動 物細胞、植物細胞）などがある。特に好ましい細菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ ．ｐｕｔｉｄａ 、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌ ｏｔｉ 、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｓｔｉｎａ ｅｓｐｉｒａｌｉｓ 、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍまたはＣｌｏ ｓｔｒｉｄｕｍ を例示し得る。細菌のうちでは、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの使用が好 ましい。酵母としては、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ 、Ｐｉｃｈｉａ、 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ を例示し得る。哺乳動物細胞としては、ＣＨＯＮＣＯＳ）Ｎ ＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２などの細胞を例示し得る。ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療に 使用できる細胞としては、造血細胞株（国際特許ＷＯ８８／０８４５０、ＷＯ９ ３／２０１９５、ＷＯ９３／０９８１５、ＷＯ９３／１１２３０）、内皮細胞（ 国際特許ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９０／０６７５７、ＷＯ９２／０９２２２ ）、筋芽細胞（国際特許ＷＯ９３／０３７６８、ＷＯ９３／２４１５１、ＷＯ９ ４／０１１２９）、線維芽細胞（米国特許ＵＳ５，２１９，７４０、国際特許Ｗ Ｏ８９／０２４６８、ＷＯ９３／０７９０６）、肝細胞（国際特許ＷＯ８９／０ ７１３６、ＷＯ９２／１２２４２、ＷＯ９３／０３１４２）、星状膠細胞（国際 特許ＷＯ９４／０１１３５）、神経芽細胞（国際特許ＷＯ９４／１０２９２、Ｗ Ｏ９４／１６０５９）、ケラチノサイト（国際特許ＷＯ９４／１１０１１）、マ クロファージ（フランス特許ＦＲ９３／１０２２２）が挙げられる。これらの細 胞は一般に、有益な治療用物質を産生する能力を有しており、ｉｎ ｖｉｖｏ移 植が可能である。血液細胞としては、赤血球、好中球、好塩基球、好酸球のよう な顆粒球、Ｂ及びＴリンパ球特にＣＤ４リンパ球、細胞障害性リンパ球（ＣＤ８ ＣＴＬ）、 腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）及びＬＡＫ、単球及びマクロファージ、樹枝状細 胞、巨核細胞及び血小板がある。 本発明を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。これらの記載が非限定 的な代表例であることは理解されよう。図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＴＫ−Ｌｕｃ；チミジンキナーゼの最小プロモーター； ＴＨイントロンの完全センス反復配列；完全アンチセンス反復配列；ＴＨイント ロンの不完全センス反復配列；不完全アンチセンス反復配列を示す。 図２は、形質転換されたＨｅＬａ細胞中のルシフェラーゼ活性を示す。 図３は、形質転換されたＰＣ１２細胞中のルシフェラーゼ活性を示す。分子生物学の汎用技術 塩化セシウム−臭化エチジウム勾配によるプラスミドＤＮＡの遠心、制限酵素 による消化、ゲル電気泳動、大腸菌の形質転換、核酸の沈殿、のような分子生物 学の慣用の方法は文献（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）に記載されている。 酵素はＮｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅ ｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。 ＤＮＡフラグメントを結合させるために、ＤＮＡフラグメントを０．８％〜１ ．５％のアガロースゲルでサイズに従って分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ １０１，ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）によって精製し、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＴを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ ７．４中でＴ４ファージのＤＮＡリガーゼの存在下で１４℃で一夜インキュベー トした。 ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅もＭａｎｉａｔｉｓら，１９８９ の記載に従って以下の条件で実施した。 −８ｍＭのＭｇＣｌ₂濃度を用いた。 −変性温度９５℃、ハイブリダイゼーション温度５５℃、伸長温度７２℃。こ のサイクルをＰＥ９６００サーマルサイクラー（ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ ｏｒｗａｌｋ ＣＯ）中で２５回繰返した。 シアノエチル基でβ位を保護したホスホラミジットの化学作用（Ｓｉｎｈａら ，１９８４，Ｇｉｌｅｓ １９８５）を利用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍの全自動ＤＮＡシンセサイザーのモデル３９４(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ)を製造業者の指示通りに用いてオリゴヌクレオ チドを合成する。 蛍光プライマーを使用したチェーンターミネーション法によって二重鎖マトリ ックスの配列決定を行った。配列決定キットとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）製のＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｋｉｔを製造業者の指示通りに使用 した。実施例 実施例１：核タンパク質との相互作用 遺伝子発現の調節におけるマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の関与の有無を ゲル遅延実験（電気泳動移動度試験、ＥＭＳＡ）によって試験した。このために 、ＨｅＬａ細胞の核抽出物を調製し、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の配列 に対応するオリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートした。 ＨｅＬａ細胞の核抽出物をＤｉｇｎａｍ（ＮＡＲ １１（１９８３）１４７４ ）の方法で調製し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．７２（１９７６）２４８）の技術で測定した。電気泳動移動度試験は、１ ００ｍＭのＫＣｌ、 １２％のグリセロールを含む４ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ，ｐＨ７．６、中で、 １μｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）−（ｄｌ−ｄＣ）の存在下で５分間インキュベート した１０〜１５μｇの核抽出物の存在下で、最終容量１０μｌで行った。Ｔ４ポ リヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてγ３２Ｐ−ＡＴＰて標識 した２５ｆｍｏｌの二重鎖オリゴヌクレオチドを次に、タンパク質と共に室温で ５分問インキュベートした。使用したオリゴヌクレオチドは、マイクロサテライ トＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子Ｅｉ及びＥｐに対応するプローブである。競合実 験のために非標識オリゴヌクレオチドを標識プローブの５分前に添加した。オリ ゴヌクレオチドの配列を以下に示す。 形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体を次に、４℃、０．５Ｘ ＴＢＥバッフ ァ中の非変性６％アクリルアミドゲル電気泳動によって分解した。乾燥後、ゲル を室温で一夜オートラジオグラフィー処理した。 得られた結果は、２つのオリゴヌクレオチドが核抽出物のタンパク質によって 認識されたことを示す。更に、低温オリゴヌクレオチドとの競合実験では結合が 用量依存性であることが示されたので、相互作用の特異性が証明された。従って これらの結果は、核内因子がマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１と相互作用する ことをはっきりと証明する。 第二の段階では、種々のオリゴヌクレオチドを用いて一連の競合実験を実施し た。使用したオリゴヌクレオチドはＡＰ１因子のＴＲＥ結合配列（ＴＧＡＣＴＣ Ａ）に対応する。得られた結果は、このオリゴヌクレオチドが核内因子に対する 結合においてオリゴヌクレオチドＥｉ及びＥｐに置換できないことを示す。これ は、マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１と結合する因子がＪｕｎ及びＦｏｓでな いことを示す。ＣＲＥ−ＴＨ；ＣＲＥ；Ｐｏｕ；ＳＰ１；ＡＰ４及びＥ−ＴＨの ような他のタンパク質結合配列を含むオリゴヌクレオチドとの競合実験も実施し た。これらの配列はいずれも１００倍のモル過剰量で存在させても、ＨｅＬａ細 胞の核抽出物に対する結合においてマイクロサテライトのオリゴヌクレオチドに 置換できなかった。これは相互作用の特異性の確証となる。実施例２：発現カセット及びベクターの構築 ２．１．エンハンサー領域の合成 種々のエンハンサー領域を二重鎖オリゴヌクレオチドの形態で合成した。Ｂｅ ｃｋｍａｎ ｏｌｉｇｏ １０００シンセサイザーを製造業者の指示通りに使用 してオリゴヌクレオチドを合成した。以下のエンハンサーが産生される。 このＤＮＡフラグメントはマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の不完全対立遺 伝子をセンス方向（ＴＨイントロンの正常方向）で含む。 このＤＮＡフラグメントはマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の不完全対立遺 伝子をアンチセンス方向（ＴＨイントロンの逆方向）で含む。 このＤＮＡフラグメントはマイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の完全対立遺伝 子（（ＴＣＡＴ）１０）を含む。 ２．２．ベクターの構築 ２．２．１．ＴＫプロモーターを含むベクター ＴＫプロモーターのコントロール下のへテロロガス遺伝子（ルシフェラーゼ） 及び本発明のエンハンサーを含むベクターを構築した。このために、プラスミド ｐＴＫ−Ｌｕｃ（ＤｅＴｈｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３４３（１９９０）１７７）を 使用した。このベクターは、ヌクレオチド−１０９から＋５２から成る修飾され たＴＫプロモーター（最小）を含む。より小さいフラグメント（ヌクレオチド− ３７から＋１９）を用いて同様の構築を行う。種々のエンハンサー領域をこのプ ラスミドのＴＫプロモーターの上流に導入した。より特定的には、実施例２．１ ．に記載された５４量体のエンハンサーを、ＳａｌＩ部位の平滑末端に結合する ことによってプラスミドｐＴＫ−Ｌｕｃにサブクローニングした。インサートの 挿入及び方向を配列決定によってコントロールした。得られたベクターの発現カ セットの構造を図１に示す。勿論、本発明のエンハンサー領域をプロ モーター及び有益な遺伝子の下流に配置してもよい。 ２．２．２．他のプロモーターを含むベクター ＴＫプロモーターを他の望ましい転写プロモーターによって置換させるために 上記のベクターを容易に修飾し得る。他の転写プロモーターとしては、ＣＭＶの 初期プロモーターまたは他の任意の最小プロモーター、例えば、ＣＭＶのヌクレ オチド−５３から＋７５もしくは−３１から＋７５の間のフラグメントから成る プロモーターなどを使用する。また、マウスまたはヒ トのＰＧＫ遺伝子のプロ モーター、ニューロン特異的エノラーゼのプロモーター、ＶＡＣｈＴのｍＲＮＡ のＶ１形態を生じるプロモーターも使用できる。更に、これらの種々のプロモー ターを担持する種々のベクターまたはカセットは文献に記載されている。従って 、これらの構築物にエンハンサー配列を挿入することによって本発明のベクター またはカセットを構築することが可能である（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら，Ｎ ｅｕｒｏｎ ５（１９９０）１８７；Ｃｅｒｖｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２７０（１９９５）２４６５４など）。 ２．２．３．プラスミドＲＳＶ−ＣＡＴ 細胞のトランスフェクション効率を測定する実験にプラスミ ドＲＳＶ−ＣＡＴを使用した。即ち、このプラスミドと本発明のベクターとのコ トランスフェクションを実施した。このプラスミドはＣＡＴ遺伝子をＲＳＶウイ ルスのＬＴＲのコントロール下に含む。その構築はＧｏｒｍａｎら（Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２２１（１９８３）５５１）に記載されている。実施例３：ＨｅＬａ細胞中の遺伝子発現に対する効果 この実施例は、癌細胞中の遺伝子の発現レベルに対する本発明の配列の活性試 験を記載する。試験した細胞はＨｅＬａ細胞である。これはヒト上皮ガン細胞に 由来の細胞である。これらの細胞はＡＴＣＣに参照番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２で 寄託されている。 ７％のＳｕｐｒｅｍｅ血清を補充したダルベッコ培地でＨｅＬａ細胞を培養し た。０．１５ｍｌの無血清培地に１０６の細胞を採取し、Ｂｉｏｒａｄの“Ｇｅ ｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ”（登録商標）を用い、１ｐｍｏｌの被験ベクターの各々と 、５ｐｍｏｌのＤＮＡビヒクル（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）と、トランスフ ェクション効率を評価する０．５ｐｍｏｌのプラスミドＲＳＶ−ＣＡＴと共に電 気穿孔によってトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後及び ４８時間後に細胞 を採集し、ルシフェラーゼ活性を三重試験によって測定した。このために、光度 計ＬＵＭＡＴ ＬＢ９５０１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用し１５０μｌの反応容 量を用いた（０．０８ｍＭのルシフェリン、０．１ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのト リス−燐酸塩，ｐＨ７．８、８ｍＭのＭｇＣｌ₂、２ｍＭのジチオトレイトール 、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトン、１５％のグリセロール）。各ベクターの ルシフェラーゼ活性を次に、コトランスフェクトしたＲＳＶ−ＣＡＴベクターか ら得られたＣＡＴ活性の標準に基づいて補正した。ＣＡＴ活性は液体シンチレー ションカウンティングによって測定しておいた。標準に基づいて補正したルシフ ェラーゼ活性をＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ，相対光量 ）で表す。結果を３つの実験の平均値で表す。 得られた結果を図２に示す。これらの結果は、配列Ｔ１０ｉ及びＴ１０ｐの双 方が遺伝子の発現の強力な増進を誘発することを示す。即ち、２４時間後に、配 列Ｔ１０ｉはルシフェラーゼ活性の９０倍の増進を誘発し、配列Ｔ１０ｐはルシ フェラーゼ活性の１６０倍の増進を誘発する。これらの２つの配列を逆方向に配 置したときに観察された増進は双方ともに約２５０倍 になる。４８時間後に、２つの方向で観察された２つの配列の発現レベルの増進 は約３００〜３５０倍である。実施例４：ＰＣ１２細胞中の遺伝子発現に対する効果 この実施例は、ラットの褐色細胞腫の細胞中の遺伝子の発現レベルに対する本 発明の配列の活性試験を記載する。試験した細胞はＡＴＣＣに参照番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１で寄託されたＰＣ１２細胞である。 １０％のウマ血清と５％のウシ胎仔血清とを補充したＲＰＭＩ培地でＰＣ１２ 細胞を培養した。トランスフェクション及び活性測定のプロトコルは実施例３の ＨｅＬａ細胞に使用したプロトコルに等しい。 得られた結果を図３に示す。これらの結果は、配列Ｔ１０ｉ及びＴ１０ｐがそ の方向にかかわりなく遺伝子発現を２４時間後に２５倍、４８時間後に５０倍に 増進させたことを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月２６日（１９９７．５．２６） 【補正内容】 【図１】 【図２】【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 トレイルー，フアビエンヌ フランス国、エフ―91190・ジフ―スユル ―イベツト、クール・ドウ・リマージユ― サン―ジヤン、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．転写エンハンサー活性を有しており、実質的にチロシンヒドロキシラーゼ遺 伝子の第一イントロンの一部分から成ることを特徴とするＤＮＡの単離フラグメ ント。 ２．マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１の対立遺伝子から成ることを特徴とする 請求項１に記載のフラグメント。 ３．転写エンハンサー活性を有しており、配列（ＴＣＡＴ）_n−（ＣＡＴ）_o−（ ＴＣＡＴ）_pを有しており、ｎが１〜５０であり、ｏが０〜２０であり、ｐが０ 〜５０であることを特徴とするＤＮＡの単離フラグメント。 ４．ｎが２〜２０であり（両端値を含む）、ｏ及びｐが０であることを特徴とす る請求項３に記載のフラグメント。 ５．ｎが１〜１０であり、ｏが１〜５であり、ｐが１〜１０であることを特徴と する請求項３に記載のフラグメント。 ６．配列１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ または１５であることを特徴とする請求項３に記載のフラグメント。 ７．−転写プロモーターと、 −コーディング配列と、 −請求項１に記載の転写エンハンサーとを含むことを特徴とする発現カセット。 ８．転写プロモーターが哺乳類細胞の機能性プロモーターであることを特徴とす る請求項７に記載の発現カセット。 ９．転写プロモーターがウイルスプロモーター、遍在性プロモーター及び組織特 異的プロモーターから選択されることを特徴とする請求項８に記載の発現カセッ ト。 １０．転写プロモーターが実質的にＴＡＴＡ領域またはＩＮＲ領域から成ること を特徴とする請求項８に記載の発現カセット。 １１．転写エンハンサーがセンス方向であることを特徴とする請求項７に記載の 発現カセット。 １２．転写エンハンサーがアンチセンス方向であることを特徴とする請求項７に 記載の発現カセット。 １３．請求項７に記載のカセットを含む発現ベクター。 １４．プラスミドベクターであることを特徴とする請求項１３に記載のベクター 。 １５．ウイルスベクターであることを特徴とする請求項１３に記載のベクター。 １６．請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡフラグメントが導入された 組換え細胞。 １７．請求項７に記載の発現カセットが導入された組換え細胞。 １８．請求項１３に記載のベクターが導入された組換え細胞。 １９．マイクロサテライトＨＵＭＴＨ０１に由来の配列を転写エンハンサーとし て使用することを特徴とする方法。 ２０．請求項７に記載のカセットまたは請求項１３に記載のベクターを細胞に導 入することから成るタンパク質の産生方法。