KR20030090609A

KR20030090609A - 씨에이알피 유전자의 상류 서열, 이를 함유하는 벡터 및이들의 용도

Info

Publication number: KR20030090609A
Application number: KR10-2003-7007662A
Authority: KR
Inventors: 베르트랜드 슈왈츠; 디디에르 브래넬렉; 케네스 시엔; 주 센; 파트릭 번와
Original assignee: 진셀 소시에테 아노님; 더 리젠트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2003-11-28
Also published as: JP2004519222A; CZ20031569A3; RU2283865C2; MXPA03005039A; BR0116014A; FI20030851A; US20060110362A1; WO2002046220A9; NZ526408A; IL156137A0; CA2431193A1; WO2002046220A3; CN1483040A; US20070150971A1; PL365314A1; US7193075B2; AU2640002A; NO20032584L; US20030039984A1; AU2002226400B2

Abstract

본 발명은 CARP 단백질(심장 앙키린 반복 유전자)에 대한 유전자의 암호화 서열의 상류 부분으로부터 유래하고, 심장 근육 세포내에서 생체내 트랜스진의 특이성과 발현의 수준을 조절할 수 있는 신규 프로모터 서열에 관한 것이다. 본 발명은 따라서 심장 근육 세포내에서 생체내 핵산의 전달 및 발현을 위한, 이들 신규 조성물, 작제물, 벡터 및 이들의 생체내 용도를 기술하고 있다. 본 발명의 주제는 또한 특정 심장 질병을 연구하기 위한 모델을 구성하는 트랜스진 동물을 만들기 위한 프로모터 서열의 용도이다.

Description

씨에이알피 유전자의 상류 서열, 이를 함유하는 벡터 및 이들의 용도{SEQUENCES UPSTREAM OF THE CARP GENE, VECTORS CONTAINING THEM AND USES THEREOF}

다수의 적용을 위해서는 트랜스진의 발현 수준 및 발현의 표적화를 조절하는 것이 필요하다. 따라서, 유전자 치료시, 치료에 성공할려면 트랜스진으로부터 합성된 단백질의 표적화를 필요로 할 수 있고, 이에 따라, 부작용의 확산을 제한할 수 있게 한다. 트랜스진 동물의 작제, 및 유전자의 효과 연구는 단백질 발현 특이성의 적절한 조절이 사용될 수 있고, 개선을 제공할 수 있는 모든 예이다.

이러한 관점에서, 심장특이적으로 발현시킬 수 있는 능력에 대해 다수의 프로모터가 시험되었다. 이 프로모터들은 특히 쥐내에서의 심장 마이오신 경쇄(MLC-2)(Henderson S.A. et al., J Biol Chem, 264(1989) 18142-8; Lee K. J. et al., J Biol Chem, 126(1992) 15875-85), 생쥐내의 심장 α-액틴(Biben C. et al., Dev Biol, 173(1996) 200-12), 나트륨이뇨 인자(ANF)(Harris A.N. et al., J Mol Cell Cardiol, 29(1997) 515-25), α- 또는 β-마이오신 중쇄(α-또는 β-MHC)(Colbert M.C. et al., J Clin Invest, 100 (1997) 1958-68), 토끼내의 근육 크레아틴 키나아제(MCK)(Vincent C.K. et al., Mol Cell Biol, 13(1993)567-74), 또는 심장 트로핀 T(US 5,266,488)를 암호화하는 유전자의 프로모터이다.

이들 프로모터들은 일정한 조직 특이성을 부여하는 것으로는 알려져 있지만, 또한 이들의 활성 수준은 소위 강한 프로모터의 활성 수준 이하로, 일반적으로는 10 내지 100배 낮게 유지되는 것으로 알려져 있어, 실제로 치료 용도로는 예상하지 못했었다.

예를 들어, Franz W.M. et al., (Cardiovasc Res, 35(1997) 560-6) 및 Griscelli F. et al., (C R Acad Sci III, 320(1997) 103-12)는 RSV(루 사코마 바이러스) 프로모터의 활성 수준보다 약 10배 더 실질적으로 낮게 유지되는 아데노바이러스 작제물내에서의 쥐의 α-MHC 및 MLC-2를 암호화하는 유전자의 상류 서열의 활성의 수준을 보여준다.

본 발명은 생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 유전자 발현의 표적화 분야, 및 더욱 구체적으로는 트랜스진(transgene)의 특이적인 발현을 위한 신규 시스템의 디자인과 개발에 관한 것이다. 본 발명의 주제는 특히 심장 근육 세포내에서 생체내(in vivo) 트랜스진의 발현 수준 및 발현 특이성을 조절할 수 있는 신규 프로모터 서열이다. 따라서, 본 발명은 심장 근육 세포내에서 핵산의 발현을 조절하고 유도할 수 있는 신규 조성물, 작제물 및 벡터를 기술한다. 본 발명을 근간으로 하는 적용은 예를 들면, 실험, 임상, 치료 및 진단 분야 등에서, 더욱 구체적으로는 특정 심장 질환의 치료/및 또는 예방 분야에서 다양하다.

도 1: 생쥐 CARP 단백질을 암호화하는 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 도해한 것(서열번호 1)

도 2: 인간 CARP 단백질을 암호화하는 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 도해한 것(서열번호 2)

도 3: 플라스미드 pXL3634의 개략도

도 4: 플라스미드 pXL3728의 개략도

도 5: CMV 프로모터(pRL-CMV)의 참조 활성과 비교한 플라스미드 pXL3635 및 pXL3634의 시험관내 상대적 활성을 도해한 것. 각 프로모터의 활성은 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시페라아제 활성으로 정규화한 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라아제 활성을 나타낸다.

도 6a: 플라스미드 pXL3759의 개략도

도 6b: 아데노바이러스 AV1.0 CARP-Luc+의 개략도

도 7a: 플라스미드 pXL3031 및 pXL3634의 다양한 양을 쥐의 횡경막을 통해 심장내 주사한 후 7일째의 루시페라아제 활성(pg 루시페라아제/심장)을 도해한 것

도 7b: 플라스미드 pXL3031 및 pXL3635, pXL3130, 및 pXL3153 25 ug을 쥐의 횡경막을 통해 심장내 주사한 후 7일째의 루시페라아제 발현(pg 루시페라아제/심장)을 도해한 것

도 8: 플라스미드 pXL3031, pXL3634, pXL3635, pXL3153, 및 pXL3130의 심장내 투여 후 수득된 심장내 발현의 함수로서, 근육내 발현된 것에 대해 상대적인 심장내 루시페라아제의 발현의 비를 나타낸 것

따라서, 본 출원은 더욱 정확하게는 씨에이알피(CARP, 심장 앙키린 반복 단백질) 유전자의 상류 영역에서 유래하는 신규 프로모터 서열에 관한 것이다. 이는 심장특이적인 발현을 가능하게 할 뿐 아니라, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터와 같은 강한 프로모터의 발현 수준에 필적하는, 높은 생체내 발현 수준을 보인다.

MLC-2v 유전자의 발현 조절시 호메오박스 유전자 Nbx2.5의 하류에서 작용하는 심장근육세포의 분화에 대한 첫번째 마커 중 하나를 구성하는 씨에이알피 단백질이 연구되어 왔고, 이의 유전자의 암호화 부분이 생쥐내에서(Zou Y. et al., Development, 24(1997) 793-804), 토끼 내에서(Aihara Y. et al., Biochim Biophys Acta, 28(1999) 318-24), 및 인간에서(Chu W. et al., J Biol Chem, 270 (1995) 10236-45) 서열분석되어 왔다.

Kuo H. 등(Development, 126(1999) 4223-34)은 생쥐 CARP 유전자의 암호화 서열의 10 Kb 단편을 클로닝하고, 2.5 Kb 상류 단편을 서열분석했다. 단편내에 만들어진 5' 결실은, 전사 위치 +1을 기준으로 뉴클레오타이드 -166 내지 +47 사이에 있는 프로모터의 213 bp 영역은 시험관내(in vitro)에서 심장특이적인 발현을 부여하기에 충분하다는 것을 증명하였으며, 이를 통해 프로모터의 특이성을 조절하기 위한 요소의 5' 말단 존재가 추측된다. Kuo 등은 또한 CARP 유전자의 2.5 Kb 상류의 단편을 포함하는 트랜스진 생쥐 세포주를 만들었으며, 이는 배 발생 초기에 심장 세포내 및 골격 근육 세포내 트랜스진의 특이적 발현을 보여주었고, 이 발현은 이후의 발생 동안에는 억제되었다.

출원 WO 00/15821은 전사 위치 +1을 기준으로 하여 뉴클레오타이드 -2285 내지 +62 사이에 위치한 생쥐 CARP 유전자의 암호화 서열 중 5' 상류의 부분을 기술하였다. 아데노바이러스 벡터를 통해, 특히 생체내 활성에 대해 이 서열을 평가하였다. 그러나, 수득된 활성의 수준은 매우 낮게 유지되었으며, 이에 따라 생체내 활성을 검출하기 위하여, 아데노-관련 바이러스의 2개의 역위 말단 반복(AAV-ITR, inverted terminal repeat) 간의 프로모터 서열을 분리하는 것이 필요함을 깨닫게 되었다.

본 출원인은 CARP 단백질에 대한 유전자의 5' 영역을 더욱 잘 특징분석하는 데 집중하였다. 따라서, CARP 유전자의 신규 상류 서열을 동정할 수 있었으며, 이 신규 서열의 예상하지 못했던 유리한 특성, 특히 생체내 활성 수준의 상당한 개선을 측정할 수 있었다.

본 출원인은 결국, 놀랍게도 이 새로 동정된 서열이 시험관내(in vitro)에서는 유의적으로 발현되지 않았고, 이와는 반대로 심장 조직에서는 매우 선택적으로 발현되는 것을 유지하면서, 소위 강한 프로모터의 활성과 동등한 생체내 활성의 매우 양호한 수준을 수득할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주제는 CARP 단백질에 대한 유전자의 암호화 서열의 상류 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 상류 서열과 고엄중 조건하에서 하이브리드화되는 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 이의 조절하에 배치된 트랜스진의 심장조직내 특이적인 발현을 유도할 수 있는 것이다.

본 발명은 또한 화학적 합성방법에 의해 수득되거나 천연 기원이고, 서열번호 1과 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 보이는 임의의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1과 적어도 98%의 동일성을 보인다.

천연 기원의 발현 폴리뉴클레오타이드는 제한효소를 사용하여 세포내 DNA를 절단함으로써 수득되는 게놈 DNA 단편을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

화학적 합성방법에 의해 수득된 발현 폴리뉴클레오타이드는 자동화된 합성방법에 의해 생성된, 예를 들면, 적절한 자동화된 장치를 사용하여 생성된 DNA 단편을 의미하고자 한다.

본 발명에서, "고엄중 조건"이라는 용어는 Maniatis 등이 1982년도에 (Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor CSH, N.Y,, USA)에서, 또는 최근의 개정판에서 부여한 의미로 사용된다. 예시적으로, 하이브리드화 조건은 0.2 SSC와 0.1% SDS의 존재하에 65℃에서 3회 세척이 비하이브리드화된 단편을 제거하기 위해 필요한 조건이다.

발현의 "특이적"인 특성은 프로모터의 활성이 심장 조직의 세포내에서 상당히 유의하게 높다는 것을 의미한다. 다른 세포내에서 비특이적인 발현이 존재할 수 있지만, 상응하는 활성 수준은 심장 세포내에서 관찰된 것과 비교하여 가장 일반적으로는 매우 낮고(무시할 수준), 일반적으로는 적어도 10배 더 낮다.

실시예에 제시된 결과는 이러한 관점에서, 1000배에 이를 수 있는 발현의 차이를 보이며, 이는 생체내 심장 세포에서의 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 높은 선택성을 반영하는 것이다.

또한, 하기 실시예에 제시된 결과는, 상기 폴리뉴클레오타이드를 사용하면심장 조직에 대해 특이적인 것으로 알려진 다른 프로모터의 활성보다 더 높은 수준의 발현을 본 발명의 시스템에 제공하고, 이것이 100배 이상의 활성 차이를 가능하게 해 준다는 것을 명백히 입증한다. 따라서, 이들 요소는 심장 조직내 해당 핵산의 발현에 대해, 강도 및 특이성 면에서 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 잇점 및 예상하지 못했던 특성을 설명해준다.

유리하게도, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드는 전사 위치 +1을 기준으로 하여, -2266 내지 +92 간의 서열 일부를 포함하고, 이 서열(서열번호 1)은 서열목록에 제시되어 있다.

본 발명의 주제는 이에 따라, 고엄중 조건하에서 서열번호 1과 하이브리드화하는 서열이다.

본 발명은 생쥐 유전자의 상류 단편을 함유하는 폴리뉴클레오타이드에 국한되지 않고, 동일한 특성을 갖는, 즉, 심장 조직내 트랜스진의 생체내 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 다른 종의 임의의 기능적 변이체 또는 임의의 다른 서열에 관한 것이기도 하다.

따라서, 당업자는 참조번호 AF131884로서 GenBank에 기탁된 인간 유전자의 상류 서열을 유리하게도 참고할 수 있을 것이며, 이의 서열은 서열목록에 서열번호 2로 제시된다. 본발명은 따라서 서열번호 1의 서열과 동일하거나 유사한 기능을 보유하고, 특정 구조를 예를 들면 결실시킴으로써 변형시킨, CARP 단백질에 대한 유전자의 상류 서열의 단편을 포함하는 임의의 서열을 포괄한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2와 적어도80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 동일하다.

발현 기능적 변이체는 상기 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 특성을 보유하고 있는 임의의 변형된 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 변형은 고려되는 서열내 뉴클레오타이드의 1 이상의 첨가, 돌연변이, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이들 변형은 특히 부위-지향 돌연변이유발과 같은 통상의 분자생물학적 방법에 의해, 또는 합성기에서 서열을 인공적으로 합성하는 보다 실질적인 방법에 의해 도입시킬 수 있다. 이어서, 수득된 변이체를 서열번호 1을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 필적할 만한 심장 근육 세포내 발현의 특이성을 조절할 수 있는 능력에 대해 시험한다.

본 발명의 다른 주제는 트랜스진의 발현이 심장 근육내에서 특이적으로 일어나도록 트랜스진에 작동적으로 연결된 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

유리하게도, 본 발명의 카세트는 트랜스진의 뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한 전사의 종결을 위한 시그널도 포함한다.

바람직하게는, 트랜스진은 심부전증, 심장 비대, 저산소증, 허혈증 또는 심장 이식 거부반응과 같은 심장관련 질병에 관여되어 있을 수 있는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 해당 치료 핵산을 포함한다.

해당 치료 단백질로서, 특히 하기와 같은 것들이 언급될 수 있다:

-혈관생성을 유도하는 단백질, 예를 들면, VEGF 패밀리 구성원, FGF 패밀리의 구성원, 더욱 구체적으로는 FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, 앤지오제닌, EGF, TGFα,TGFβ, TNFα, 분산 인자/HGF, 앤지오포이에틴 패밀리의 구성원, 사이토카인 및 특히, IL-1, IL-2, IL-8을 포함하는 인터루킨, 앤지오텐신-2, 플라스미노겐 활성화제(TPA), 유로키나아제(uPA), 활성 지질의 합성에 관여하는 물질(프로스타글란딘, Cox-1);

-포스포람반, 포스포람반 억제제, SERCA-2a, β2-아드레날린 수용체 또는 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91 11947)과 같은 심장 수축의 조절에 관여하는 단백질;

-저온보호 활성을 갖는, 특히 세포사멸을 차단하는 단백질, 예를 들면, bcl 패밀리의 구성원인 단백질 및 AKT/PKB와 같은 단백질 키나아제;

-예를 들면, 융합 단백질 tetR-NLS-VP16, 에스트로겐 수용체에서 유래하는 융합 단백질, 스테로이드 호르몬 수용체에서 유래하는 융합 단백질, 프로게스테론 수용체에서 유래하는 융합 단백질, Rivera 등(Rivera et al., Nature Medicine, 2(1996) 1028-1032)에 의해 기술된 CID(Chemical Inducer of Dimerization, 이량체화 화학유발기)시스템의 단백질과 같은, DNA-결합 도메인, 리간드-결합 도메인 및 전사 활성화 또는 전사 억제 도메인을 포함하는 예를 들면, 천연 또는 키메릭 핵 수용체와 같은 전사 인자. 이들은 출원번호 WO 96/23884 및 FR 99 07957 및 Frohnert 등의 (J Biol Chem 274 (1999) 3970-3977), 및 Mukherjee 등의(J Biol Chem 272 (1997) 8071-8076)에서 기재된 바와 같이, 1차 구조의 변형없이 천연 형태의 키메릭 핵 수용체, 핵 수용체 PPAR(퍼옥시좀 증식자 활성화된 수용체) 및 특히 PPARγ2로서, 또는 1 이상의 리간드-결합 부위, 또는 서열번호 3을 갖는PPARγ2γ2와 같은 E/F 도메인(Schoonjans et al. Biochim. Biophys. Acta. 1302(1996) 93-109)을 포함하는 변형된 PPARγ2의 형태로서 언급될 수 있다.

-면역 시그널링 경로를 완전히 또는 부분적으로 억제하여, 심장 이식체의 기간을 연장시킬 수 있는 예를 들면 인터루킨 2 및 10과 같은 면역억제제;

-NOS(산화 질소 합성효소), B-세포 류케미아/림포마 2(bcl-2), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 및 카탈라아제와 같이, 저산소증을 감소시키기 위한 제제로서 관여하는 단백질.

해당 치료 RNA로서, 예를 들면 유전자 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절하는 데 유용하여, 특허 EP 140 308에서 기술된 기술에 따라 단백질로 해독되는 것을 막는 안티센스 RNA, 및 EP 321 201에 기술된 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보자임이 언급될 수 있다.

본 발명은 단백질 또는 RNA의 특정 예에 국한되지 않으며, 심장 세포내 임의의 핵산의 발현을 위해, 간단한 통상의 실험 조작에 의해서 당업자가 사용할 수 있다.

본 발명의 주제에는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카셋트를 함유하는 벡터가 첨가된다. 이러한 벡터는 표적 조직에서 트랜스진의 발현에 필요한 임의의 다른 DNA 서열을 함유할 수 있고, 특히 심장 세포에서 효과적인 복제 원점을 함유할 수 있다.

본 발명의 벡터는 특히 천연 및/또는 플라스미드, 에피좀, 염색체, 바이러스 또는 파지 기원으로서 다양할 수 있다. 바람직하게는 벡터는 플라스미드 또는 재조합 바이러스이다.

폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카셋트를 포함하는 플라스미드의 예를 설명하기 위하여, 하기에 기술될 플라스미드 pXL3634, pXL3728 및 pXL3759가 예를 들어 언급될 수 있다.

첫번째 양태에 따르면, 본 발명에 따른 벡터는 플라스미드 유형이다. 플라스미드 벡터로서, 당업자에게 잘 알려져 있고 복제 원점을 일반적으로 포함하는 임의의 클로닝 및/또는 발현 플라스미드가 그 중에서도 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들면, 출원 WO 96/26270에 기술된 바와 같이 정제된 복제 원점 및/또는 마커를 운반하는 신세대 플라스미드가 언급될 수도 있다.

바람직한 양태에 따르면, 플라스미드 벡터는 미니플라스미드이고, 숙주 세포에 대해 특이적이고 그에 대해 외래인 적어도 하나의 단백질의 존재를 요구하는 숙주 세포에서 작용하는 복제 원점을 포함한다. 이러한 벡터는 특히 출원 WO 97/10343에 기술되어 있다.

두번째 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 벡터는 바이러스 벡터이다. 이 중에서도 특히, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스, 및 백시니아 바이러스가 언급될 수 있고, 이들의 준비는 당업자에게 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 바람직하게는, 예를 들면 출원 WO 95/22617에 기술된 아데노바이러스-레트로바이러스 키메릭 벡터와 같은 키메릭 바이러스 벡터, 및 Leblois 등에 의해 기술된 (Mol Ther(2000) 1(4), 314-322)와, 출원 WO 97/47757에 기술된 바와 같은 에피좀/아데노바이러스벡터가 사용된다.

이 양태에 따라 아데노바이러스가 사용된 경우, 이들은 바람직하게는 결손 아데노바이러스에서 유래한 벡터인데, 다시 말하면, 이들은 표적 세포에서 자율적으로 복제할 수 없다. 이들 결손 바이러스의 제조 및 이들의 감염 특성은 문헌에 폭넓게 기재되어 있다[참조: 특히, S. Baeck 및 K.L. March, Circul. Research, 82, (1998) 295-305); T. Shenk, B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley 등(1996), Adenoviridae: Viruses and Replication (in virology) 211-2148, EDS-Ravens publishers Philadelphia; Yeh, P. et al. FASEB 11(1997) 615-623].

다양한 아데노바이러스 혈청형, 이의 구조 및 특성의 다양성은 어느 정도 특징분석되어 왔다. 이들 혈청형 중에서, 2형 또는 5형 인간 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 출원 FR 93 05954에 기술된 것과 같은 동물 기원의 아데노바이러스 또는 혼합된 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 맥락에서 바람직하게 사용된다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에서, 개, 소, 쥐(Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이 기원의 아데노바이러스들이 언급될 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스이고, 더욱 바람직하게는 출원 94/26914에 기술된 바와 같은 CAV2 아데노바이러스(Manhattan 또는 A26/61 스트레인)이다.

본 발명의 결손 아데노아비러스는 각 말단에 역위 말단 반복(ITR), 캡시드화 허용 서열(Psi), E1 유전자 및 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 한층 불활성화된 유전자 E2, E4 및 LI-L5 중 적어도 하나를 일반적으로 포함한다(Levero etal., Gene, 101(1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3(1984) 2917).

유리하게는, 본 발명의 맥락에서 사용된 재조합 아데노바이러스는 이의 게놈의 E1 영역내에 결실을 포함한다. 더욱 구체적으로는, E1a 및 E1b 영역의 결실을 포함한다. 보다 상세한 예로서, 결실에 영향을 주는 뉴클레오타이드 454-3328, 382-3446 또는 357-4020(Ad5의 게놈을 기준으로)이 언급될 수 있다.

바람직한 변이체에 따라, 본 발명의 맥락에서 사용되는 재조합 아데노바이러스는 이의 게놈내에 E4 영역 결실을 또한 포함한다. 더욱 구체적으로는, E4 영역 결실은 개방 판독 프레임 모두에 영향을 미친다. 보다 구체적인 예로서, 33466-35535 또는 33093-35535 결실이 언급될 수 있다. E4 영역내 다른 유형의 결실은 WO 95/02697 및 WO 96/22378에 언급되어 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본 발명에 인용된다.

아데노-관련 바이러스(AVV)를 말하자면, 이들은 안정하고 부위 특이적인 방식으로 감염시킬 세포의 게놈에 통합되는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태학 또는 분화에 대해 어떠한 영향도 미치지 않고, 폭넓은 범위의 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간 병리학에 관여하지 않는 것으로 보인다. AAV 게놈은 클로닝되고, 서열분석되었으며 특징분석되었다. 이들은 약 4700 염기를 포함하고, 각 말단에 바이러스에 대한 복제 원점으로서 작용하는 약 145 염기의 역위 말단 반복(ITR)을 함유한다. 나머지 게놈은 캡시드화 작용을 수행하는 2개의 필수적인 영역으로 세분된다: 바이러스 유전자의 발현과 바이러스 복제에 관여하는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 왼쪽 부분, 및 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 왼쪽 부분.

시험관내 및 생체내 유전자의 전달을 위한 AAV-유래 벡터의 사용은 문헌에 기술되어 왔다(참조: 특히 WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488528). 이들 출원들은 rep 및/또는 cap 유전자를 결실시키고, 해당 유전자로 치환시킨 다양한 AAV-유래 작제물과, 시험관내에서(배양중인 세포 상에), 또는 생체내에서(직접 유기체에) 상기 해당 유전자를 전달하기 위한 이들의 용도를 기술하고 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 두 개의 AAV 역위 말단 반복(ITR)에 의해 경계지어진 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주내로 공형질감염시켜, 제조될 수 있다. 이어서 생성된 재조합 AAV는 통상의 기술에 의해 정제된다.

렌티바이러스도 본 양태에 따라 사용할 수 있다; 이들은 휴면 세포로 해당 유전자를 전달하고 효율적이고 안정하게 통합시킨다.

예를 들어, FIV(고양이 감염 바이러스), EIAV(말 감염 빈혈 바이러스; WO 98/51810), BIV(소 면역결핍 바이러스), SIV(원숭이 면역결핍 바이러스), CAEV(염소 관절염뇌염 바이러스)(WO 98/39463; Naldini et al. Science 272 (1996) 263-267; Schnele et al. Hum Gen Ther 11 (2000) 439-447)와 같은 동물 렌티바이러스의 HTLV-1, 또는 인간에서는 고도로 병원성이 아닌 HIV-2, AIDS를 일으키는 것과 관련된 렌티바이러스(Kundra et al., Hum Gen Ther 9 (1998) 1371-1380)가 언급될 수 있다.

발현 카셋트는 재조합 게놈의 다양한 부위에 삽입될 수 있다. 억제된 또는 잉여 서열을 대체하기 위해서, E1, E3, 또는 E4 영역의 수준에서 삽입될 수 있다. 또한, 바이러스의 생산에 시스(cis)로 필요한 서열(ITR 서열 및 캡시드화 서열) 외의 임의의 다른 부위에 삽입될 수도 있다.

그러나, 본 발명에 따른 서열의 상기 기술한 벡터로의 도입은 심장 세포가 이들 서열을 포함하는 DNA로 직접 형질감염될 수 있도록 하는 데에는 필수적이지 않음을 숙지해야 할 것이다.

본 발명에 따른 핵산 서열은 세포내로 이들을 침투시키는 것, 또는 핵으로 이들을 전달하는 것을 촉진하는 화합물과 핵산을 공유 커플링시킨 다음에 도입할 수 있고, 생성되는 컨쥬게이트는 국제 출원 WO 94/27238과 같이, 중합체 미세입자로 임의로는 캡시드화되어 있다.

다른 양태에 따르면, 국제 출원 WO 95/10534와 같이, 세포내로 이들의 침투를 촉진하는 폴리펩타이드를 포함하는 형질감염 시스템에 핵산 서열을 포함시킬 수 있다.

이들 폴리뉴클레오타이드, 카셋트 및 벡터는 당업자에게 알려진 임의의 수단, 예를 들면, 관상동맥 주사(Barr et al., Gene Ther 1, (1994) 51-58), 심장내 주사, 심장위 주사, 즉, 심실 벽을 통한 주사(Guzman et al., Cir Res, 73(1993) 1202-1207), 심장주위내부 주사(Fromes et al., Gene Ther, 6(1999) 683-688), 또는 관상 정맥의 역융합(Boeckstegers et al., Circulation, 100 (SuuplI) (1999), I-815)을 사용하여 현장에서 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 카셋트 또는 벡터는 이를 함유하는 조성물의 형태로, 예를 들면, 심장 세포내로 이들을 형질감염시키는 것을 촉진하는 화학적 또는 생화학적 전달제를 사용하여 유리하게도 적용할 수 있다. "화학적 또는 생화학적 전달제"라는 표현은 핵산을 세포내로 침투시키는 것을 촉진하기 위한 임의의 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 양이온성 지질, 펩타이드, 중합체(폴리에틸렌아민, 폴리라이신), 나노입자와 같은 양이온성 제제, 또는 비양이온성 리포좀, 비양이온성 나노입자 또는 중합체와 같은 비양이온성 제제를 포함할 수 있으며, 이러한 제제는 당업자에게 잘 알려져 있고, 출원 WO 95/18863, WO 97/18185 및 WO 98/15639에 구체적으로 기술되어 있다.

본 발명은 또한, 이러한 폴리뉴클레오타이드, 발현 카셋트 또는 벡터를 함유하는 약물 및, 이들의 약학적 유효량 및 약학적으로 적합한 부형제를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

이러한 폴리뉴클레오타이드, 발현 카셋트 또는 벡터는 심장병 치료를 위해, 구체적으로는, 심부전증, 저산소증, 심장 비대, 심근염(mycarditis), 심장 허혈증의 치료 및/또는 예방을 위해, 또는 심장 이식 동안의 거부반응을 예방하기 위해, 구체적으로는 해당 단백질을 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 심장 조직에 전달하기 위한 약물 제조를 위해 유리하게는 사용될 수 있다.

이러한 약물은 예를 들면, 치료하고자 하는 심장 질병에 따른 결함 유전자의 기능적인 형태를 발현할 수 있는 본 발명에 따른 카셋트 또는 벡터를 포함한다.

바람직하게는, 약학 조성물은 주사 제형물, 특히 심장내 주사를 위한 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균 식염수 용액(일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 건조상태의, 특히 동결건조된 조성물(여기에, 상황에 따라, 멸균수 또는 생리식염수를 주사 용액 제조시에 첨가한다)을 포함한다. 다른 부형제, 예를 들면 하이드로겔과 같은 것들도 사용될 수 있다. 이 하이드로겔은 생물학적으로 적합한 비독성인 임의의 중합체(호모 또는 헤테로)로 제조될 수 있다. 이러한 중합체는 예를 들면, 출원 WO 93/08845에 기술되어 있다. 이들 중에서, 특히 에틸렌 및/또는 프로필렌 옥사이드로부터 수득된 것은 시판중에 있다. 주사용으로 사용되는 용량은 각종 기준, 특히 추구하는 목적(표지, 병리학, 스크리닝 등), 발현시킬 트랜스진, 또는 목적하는 발현 기간에 따라 조정될 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 10⁴내지 10¹⁴pfu(플라크 형성 유닛), 바람직하게는 10⁶내지 10¹⁰pfu의 용량의 형태로 제형되고 투여된다. pfu(플라크 형성 유닛)라는 용어는 바이러스 용액의 감염력에 해당하는 것으로서, 적절한 세포 배양균을 감염시키고, 감염된 세포의 플라크 수를 세어 측정한다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 결정하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 주제는 또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 카셋트 또는 벡터가 사용되는 동안에, 트랜스진이 발현될 수 있도록 해당 치료 트랜스진을 발현시키는 방법이다.

또한, 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 카셋트 또는 벡터(특히 아데노바이러스)로 변형시킨 임의의 세포에 관한 것이다. "변형시킨"이라는 표현은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 카셋트를 함유하는 임의의 세포를 의미하는 것으로 이해된다. 이들 세포는 출원 WO 95/14785에 기술된 방법론에 따라 유기체내로 이식될 수 있다. 이들 세포는 본질적으로 인간 심장 세포이다.

본 발명은 또한 트랜스진 동물, 특히 해당 치료 단백질을 리포터 유전자로 대체한 상기 정의된 폴리뉴클레오타이드 또는 카셋트를 운반하는 생쥐에 관한 것이다. 이러한 트랜스진 생쥐는 CARP 단백질을 암호화하는 유전자의 조절 서열 상에서 이들의 활성에 대해 분자를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

분자는 생쥐에 투여한 후 생쥐를 희생시킨 다음, 리포터 유전자로 염색된 조직을 동정하기 위하여 조직학 단편을 제조하게 된다.

본 발명에 따른 트랜스진 동물은 또한 심부전증, 심장 비대, 심장 증식, 심근 경색과 같은 유전자 기원 심장 질병의 근원이 되는 분자 메커니즘을 이해하기 위한 분자생물학적 연구 수단이 된다.

예로서, 인터페론-1(IFN-1)을 암호화하는 유전자가 불활성화된 심근염을 연구하기 위한 쥐 모델을 언급할 수 있다(Aitken et al., Circulation, 90(1994) 1-139).

본 발명에 따른 다른 해당 동물 모델은 예를 들면, 심장 증식의 모델이 되는 c-myc(Jackson et al., Mol Cell Biol, 10(1990) 3709-3716), 심실 증대에 대한 모델을 위한 p21-ras(Hunter et al., J Biol Chem, 270 (1995) 23176-23178), 특정 심장근육질병을 연구하기 위한 엡스타인 바아(Epstein-Barr) 바이러스의 핵항원(Huen et al., J Gen Virol, 74(1993) 1381-1391)과 같은 원종양 유전자 또는 종양 유전자 등의 트랜스진에 연결된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 트랜스진 동물은 심장 비대의 실험적 모델을 구성하며, 예를 들면, 트랜스진이 칼모둘린(Gruver et al., Endocrinology, 133(1993) 376-388), 인터루킨-6 또는 인터루킨-6 수용체(Hirota et al., Proc Natl Acad Sci, 92 (1995) 4862-4866), 카디오트로핀-1(Pennica et al,, Proc Natl Acad Sci, 92 (1995) 1142-1146) 및 마지막으로 α-아드레날린 수용체(Milano et al., Proc Natl Acad Sci, 92(1994) 10109-10113)를 암호화하는 발현 카셋트를 포함한다.

추가적으로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 CARP 유전자의 발현을 증가시키는 것을 허용하도록 변형되어, 또한 본 발명의 부분을 구성하게 된다. 이에 따라 수득된 트랜스진 동물은 따라서, 심근 경색(Standton et al., Circul Res, 86(2000) 939-945)에 대한 실험적 도구를 구성하게 된다.

본 발명을 수행하기 위해서, 당업자는 유리하게도 하기 매뉴얼 "Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989), 또는 이의 최신판을 참조할 수 있다.

본 발명은 설명적이고 비제한적인 것으로 간주될 하기 실시예를 사용하여 더욱 상세히 설명될 것이다.

실시예 1: CARP 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드의 특징분석

CARP 단백질을 암호화하는 생쥐 유전자의 5'에 있는 서열 2.3 Kb의 BamHI-XhoI 단편을 서열분석 키트(United States BioChemical, Cleveland, Ohio)를 사용하여 사슬 종결법(Sanger et al., 1977, PNAS, 74, 5463)에 따라 두 가닥 모두에 대해 클로닝하고 서열분석했다. 서열은 도 1에 나타내었으며, 따라서, 전사 위치 +1을 기준으로 하여 뉴클레오타이드 -2266 내지 + 92 사이의 생쥐 CARP 단백질을 암호화하는 유전자의 상류 부분을 포함한다(서열번호 1).

실시예 2: CARP 플라스미드 벡터의 작제

2.1 플라스미드 pXL3634

플라스미드 pXL3634를 수득하기 위하여, XhoI 및 SmaI으로 미리 절단한 플라스미드 pGL3-베이직(Promega)내에 있는 BamHI 부위에 실시예 1에서 특징분석된 BamHI-XhoI 단편 2.3 Kb를 채워 넣은 후 클로닝했다. 이 플라스미드의 개략도는 도 3에 제공된다.

2.2 플라스미드 pXL3728

인간 섬유아세포 인터페론의 시그널 펩타이드와 FGF1(섬유아세포 성장 인자 1, sp-FGF1, Jouanneau et al., PNAS 88 (1991), 2893-2897)의 cDNA 사이에 퓨전을 암호화하는 유전자가 인간 사이토메갈로바이러스 얼리 영역(hCMV IE) 및 SV40 바이러스 레이트 영역의 폴리아데닐화 시그널(GenBank SVCG)로부터 수득된 프로모터의 조절하에 도입된 플라스미드 pXL2774(WO 97/10343)에서 유래한 벡터인 플라스미드pXL3179에서 플라스미드 pXL3728을 수득했다.

플라스미드 pXL3728을 수득하기 위하여 실시예 1에서 특징분석되고, 말단을 채워넣은 2.3 Kb의 BamHI-XhoI 단편을 XbaI 및 EcoRI으로 미리 절단한 플라스미드 pXL3179로 클로닝했다(pCOR CMV-FGF). 이 플라스미드의 개략도는 도 4에 제시된다.

2.3 플라스미드 pXL3729

플라스미드 pXL3729를 수득하기 위하여, 플라스미드 pXL3634의 EcoRI-SalI 단편을 EcoRI-SalI으로 미리 절단해 둔 플라스미드 pXL3728에 클로닝했다.

실시예 3: 비교 플라스미드

3.1 플라스미드 pXL3130 및 pXL3153

플라스미드 pXL3130 및 pXL3153은 출원 WO 00/18908에 기술된 바와 같이 CMV 인핸서(-522, -63)에 커플링된 인간 평활근 α-액틴 프로모터(-680, +30) 및 생쥐 SM22 프로모터 (-436, +43)를 각각 함유한다.

3.2 플라스미드 pXL3635

PCR 단편의 5' 및 3'에 있는 각각 SwaI 및 XbaI 부위에 도입되는 프라이머 5'-GGC GAT TTA AAT AAT GTA GTC TTA TGC AAT-3' 및 5'-GGG GTC TAG AAG GTG CAC ACC AAT GTG GTG A-3'을 사용하여 PCR에 의해 RSV 프로모터의 긴 버젼(Ad1.0RSVLAcZ에 함유된 것, Stratford-Perricaudet et al., J Clin Invest 90(1992) 626-30)을 함유하는 작제물로부터 RSV -229,+34 프로모터를 클로닝하였다. 이들 두 제한 부위는 pGL3-베이직으로 프로모터 단편을 도입하여 pXL3635를 생성시키는 데 사용되었다.

3.2 플라스미드 pXL3031

플라스미드 pXL3031은 Soubrier 등의 Gene Ther. 6 (1999), 1482-8에 기술된 바와 같다. 이는 pGL3베이직(GenBank: CVU47295)으로부터 수득한 변형된 포티누스 피랄리스(Photinus Pyralis) 루시페라아제(세포질)를 암호화하는luc유전자를 인간 사이토메갈로바이러스 얼리 영역(hCMV IE, GenBank HS5IEE) 및 SV40 바이러스 레이트 영역의 폴리아데닐화 시그널(Genbank SV4CG)로부터 수득된 프로모터의 조절하에 도입시킨 플라스미드 pXL2774(WO 97/10343)으로부터 유래한 벡터이다.

실시예 4: 세포 배양

쥐 심장근육 세포의 1차 배양물을 만들었다. 이를 위해, CO₂로 가득채운 챔버에서 임신중인 쥐를 사망시켰다. 복강을 연 다음, 나팔관을 제거하고, PBS로 실온에서 세척했다. 배를 막에서 제거한 뒤에, 태반을 절단했다(쥐 1마리당 10 내지 12개의 배). 심장을 제거한 뒤, ADS/글루코즈로 세척했다. 보호경을 끼고, 심이와 큰 혈관을 제거한 다음, 심장을 다시 ADS/글루코즈로 세정하여, 단지 심실만을 남긴 채, 멸균 ADS/글루코즈로 3회 세정하였다.

이어서, 최종 농도 0.1 mg/ml에서, 20분 동안 37℃에서 부드럽게 교반하며(분당 60 내지 100회 회전), 트립신 T 4674(Sigma, St Louis, Missouri)를 사용하여, 심장 하나당 ADS/글루코즈/트립신 혼합물 0.3 ml로 심장에 트립신처리하였다.

이어서 상층액을 제거하고, 1 ml의 보상시키지 않은 FCS를 첨가하여 트립신 불활성화시켰다. 10분동안 1500 rpm으로 원심분리시킨 다음, 상층액을 제거한 뒤,심장 세포를 1 ml의 보상시키지 않은 FCS 중에서 취하였다. 동시에, 트립신으로 처리하는 단계를 세포의 완전한 와해가 수득될 때까지 5 내지 6회 반복하였다. 세포 급원을 10분 동안 1500 rpm으로 원심분리 한 다음, FCS 중에서 2회 세척한 뒤, 눈금있는 필터 상에서 최종적으로 여과시켰다.

이에 따라 분리된 세포를 24-웰 플레이트에 대해서는 10⁶세포/웰의 농도로 배양액 중에 넣고, 12-웰 플레이트에 대해서는 2 x 10⁶세포/웰의 농도로 넣었다. 각 웰은 1 ml의 배양 배지를 함유한다.

총 용적 100 ml에 대해서, 배양 배지는 68 ml의 DMEM(피루베이트 없는 것, Gibco-BRL), 17 ml의 M199(Sigma M 4530), 10 ml의 보상화시키지 않은 말 혈청(Sigma H6762), 5 ml의 보상화시키지 않은 FCS(Gibco-BRL) 및 1 ml의 100x 페니/스트렙토/글루타민 혼합물(Gibco-BRL)로 구성된다.

심장세포를 약 1 내지 2일 동안 배양했다.

실시예 5: 심장근육세포 1차 배양물의 형질감염

심장근육세포의 1차 배양물을 1 ng의 플라스미드 pRL-CMV(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 인코포레이티드), 상기 언급한 플라스미드 pXL3635 및 pXL3634의 각 1 내지 100 ng 범위의 다양한 양, 충분량인 500 ng의 pUC19을 포함하는 웰 당 500 ng에 이르는 DNA의 총량으로 공형질감염시켰다.

이를 위해, 플라스미드의 혼합물을 150 mM NaCl, 50 mM 비카르보네이트 중에서 20 ul의 최종 용적 내 DNA의 ug (10 mM에서 0.3 ul의 지질 용액) 당 RPR120535B(Byk et al., J Med Chem. 41 (1998) 229-35) 6 nmol과 배양시킨 다음, 5초 동안 볼텍싱하여 혼합한 뒤, 실온에서 20 내지 30분간 다시 배양시켰다.

이어서 혼합물을 250 ul의 무혈청 배지에 첨가한 뒤, 적어도 2시간 동안 세포와 함께 배양했다. 배지를 최종적으로 제거하고, 세포를 5% CO₂의 존재하에 37℃의 온도에서 24시간 내지 7일의 기간 동안 배양했다.

세포를 형질감염 후 24시간 또는 48시간째에 수집하고 레닐리아 루시페라아제 및 파이어플라이 루시페라아제 활성을 제조업자의 지시에 따라 프로메가 듀얼 Luc 키트(Promega Dual Luc Kit)로 분석하였다. 활성은 빅터(Victor) 장치로 판독하였다.

실시예 6: 폴리뉴클레오타이드의 시험관내 활성의 비교 측정

CARP 폴리뉴클레오타이드(pXL3634) 및 RSV(pXL3635) 프로모터의 상대적 활성을 쥐 심장근육세포의 1차 배양물내 순간 형질감염에서 시험관내 측정하였고, 플라스미드 pRL-CMV의 활성에 대해 상대적으로 발현시켰다(도 5).

결과는 사용된 CARP 유전자의 폴리뉴클레오타이드 상류(pXL3634)가 CMV 프로모터의 활성에 비해 0.04% 정도 상대적으로 매우 낮은 시험관내 활성을 가진다는 것을 증명한다.

비특이적이고 강한 RSV 프로모터(pXL3635)의 상대 활성도 또한, 참조 CMV 프로모터의 활성에 비해 각각 0.05 및 0.68% 정도 더 낮았다.

실시예 7: 아데노바이러스의 작제

CARP 프로모터의 조절하에 루시페라아제의 활성을 허용하는 아데노바이러스를 Crouzet 등의 방법(PNAS, 94 (1997) 1414-1419)에 따라 작제하였는데, 발현 카셋트는 플라스미드 pXL3634의 것과 동일한 것이었다(도 3).

이.콜라이(E.Coli)내 재조합을 허용하는 셔틀 벡터를 두 단계로 작제하였다. 우선, CARP 프로모터(단편: Klenow/BamHI로 채운 XhoI)를 ITR-Ψ과 pIX 영역의 pXL3474(ScaI 및 BglII로 절단)에 도입하여, 플라스미드 pXL3758을 만들었다. 이어서 BstBII(Klenow로 채운 것)과 BstEII로 절단한 pXL3758, 루시페라아제 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 부위(pXL3634의 Klenow/BstEII로 채운 BamHI 단편)를 함유하는 단편에 도입하여 pXL3759를 만들었다. pXL3759는 도 6a에 간략히 나타내었다.

RSV-LacZ 발현 카셋트가 E1 영역에 도입된 ΔE1/ΔE3 아데노바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드 pXL3215에 대해, 이.콜라이내 상동 이중 재조합이 상기에 기술한 바와 같이 실시되었다. 플라스미드 pXL3215는 플라스미드 RK2의 복제 원점, 테트라사이클린 내성 유전자(Crouzet et al. PNAS, 1997)를 함유하는 플라스미드 pXL2689의 유도체이다. 이러한 이중 재조합의 산물인 플라스미드 pXL3778을 발현 카셋트의 서열분석을 통해 확인하였다. 선형 바이러스 게놈을 방출하기 위해서 PacI으로 절단한 뒤, 플라스미드를 Per.C6 세포주(WO 97/00326)로 형질감염시켜서, 바이러스 AV1.0ARP-Luc+를 만들었다.

제한 분석 및 RCA E1+(복제 경쟁 아데노바이러스)의 존재에 의해 발현 카셋트를 서열분석함으로써 바이러스를 또한 확인하였다. 입자를 탐침 ψ와 하이브리드화 하는 것에 대해 시험하였다.

높은 바이러스 역가를 갖는 스톡을 CsCl 그래디언트 상에서 정제한 바이러스 입자와 Per.C6 세포주에서 바이러스의 증폭에 의해 수득하였다. 입자/ml(vp/ml) 단위의 이 바이러스의 역가는 크로마토그래피에 의해 수득되고, 이의 활성은 골격 또는 심장 근육 세포를 감염시키고, CMV 프로모터를 포함하는 대조군으로 사용된 바이러스와 비교한 뒤, 루시페라아제 활성의 역가에 의해 시험관내에서 확인한다.

실시예 8: 생체내 DNA 주입

200 g 체중의 CD SORAGUE 쥐에 케타민(70 mg/ml)/자일라진(6 mg/ml) 혼합물을 사용하여 복막내 경로로 1 ml/kg을 주사하여 안락사시켰다.

개복 후, 스탑 플랜지가 장착되고, BD 26G^*3.8 니들(숏 베젤)이 장착된 Steriflex catheter (ref. 167.10 G19 V)에 연결된 100 ul들이 해밀톤 글래스 시린지를 사용하여 횡경막을 통해 심장근육세포내 주사를 수행하였다.

0.9%의 NaCl로 조정한 50 ul의 DNA 용액을 5초 동안 주사하였다.

실험동물을 희생시킨 후에, 심장을 제거하고, 0.9% NaCl 용액으로 세정한 뒤에, 현미경으로 관찰하였다. 이들을 프로티아제 억제제(Cφmplete^TM, Roche Diagnotics)가 공급된 키트내의 용해 완충액 중에서 호모게나이저(Ultra-thurax, Diax600 Heidoph)를 사용하여 그라인딩 한 후에, 키트(Promega E151A)를 사용하여 루시페라아제 활성에 대해 분석한 다음, 20분 동안 4000 rpm으로 4℃에서 원심분리하였다. 장치 상에서 판독하였다: LUMAT LB 9501(10 ul의 상층액 + 50 ul의 프로메가 루시페라아제 기질). 루시페라아제 활성은 Mir 등(PNAS 96 (1999), 4262-4267)이 기술한 검정법을 사용하여 심장당 루시페라아제 질량(pg 루시페라아제/심장)으로 환산했다.

대안적으로, 심장을 3.7% 파라포름알데하이드로 고정한 뒤, FGF-1의 발현에 대해 면역조직화학적으로 분석하였다.

실시예 9: CARP 폴리뉴클레오타이드의 생체내 활성의 비교 평가

도 7a에서 조립된 결과는 증가하는 용량 1, 5, 25 및 125 ug의 플라스미드 pXL3031 및 pXL3634를 주사하였을 때 수득된 루시페라아제의 활성 수준은 유의적으로 차이나지 않았고, 이에 따라 CARP 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드는 CMV와 같은 강한 프로모터의 활성과 동등한 높은 수준의 활성을 유도할 수 있다는 것을 명백히 증명하였다.

다시 말하면, 또다른 강한 바이러스 프로모터인 RSV 프로모터(pXL3635)를 사용하여 수득된 발현은 CARP 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드 또는 CMV 프로모터를 사용하여 수득된 것보다 더 약했다(도 7b).

또한, 평활근 세포 프로모터(SM α-액틴, pXL3130 또는 SM22, pXL3153)의 CMV 인핸서 상류의 첨가는 시험관내에서 매우 효과적임이 증명되었음에도 불구하고(WO 00/18908), 생체내 심장세포에서는 비효과적인 것으로 보인다.

실시예 10: CARP 폴리뉴클레오타이드의 발현의 특이성의 평가

25 ul의 각 플라스미드 pXL3634, pXL3435, 및 pXL3031을 심장내에 횡경막을 통과하여 주사함으로써 투여하였다.

동시에, 전류통과 유무하에 이들 플라스미드 10 ug을 사용하여 생쥐 그룹의뇌 경골 근육으로 근육내 주사도 수행하였다.

루시페라아제 발현을 주사한 뒤 7일째에 (PNAS 96 (1999), 4262-4267)에 기술된 바와 같이 분석하였다.

심장내 루시페라아제의 발현 수준을 뇌 경골 근육내에서 관찰된 수준에 비해 상대적으로 표현하였으며, 이를 도 8에서 조립하였다.

결과들은, CARP 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드 및 CMV 프로모터가 심장 조직내에서 가장 높은 발현을 유도할 수 있는 단 2개의 프로모터임을 명백히 입증한다. 그러나, 심장/근육 발현비는 CMV 프로모터를 사용하여서는 1인 반면, CARP 유전자의 상류 폴리뉴클레오타이드를 사용하였을 때는 100에 가까웠고, 이는 심장 조직에 대한 후자의 매우 높은 선택성을 입증하는 것이다.

폴리뉴클레오타이드 발현의 우수성 및 특이성은 단백질 SM-22에 대한 암호화 유전자 및 액틴에 대한 암호화 유전자와 같은 평활근 세포에 대해 특이적인 인핸서 및 프로모터를 포함하는 다른 작제물에 비해 명백하고, 도 8에 예시의 방식으로 심장/근육 발현비가 또한 제시된다.

Claims

서열번호 1의 서열을 갖는 CARP 단백질에 대한 유전자의 암호화 부분의 상류 서열의 단편, 또는 상기 서열과 고엄중 조건하에서 하이브리드화하는 서열의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 이 폴리뉴클레오타이드는 심장 세포내에서 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 유전자의 생체내 특이적인 발현을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 1의 서열과 적어도 93% 동일성을 보이는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 단편이 CARP 단백질에 대한 생쥐 유전자의 뉴클레오타이드 -2266 내지 +92 사이에 위치한 서열(서열번호 1)내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 DNA 서열의 조절하에 배치된, 해당 치료 단백질, 또는 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
서열번호 2의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 보이는 DNA 서열의 조절하에배치된, 해당 치료 단백질 또는 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 단백질, 또는 상기 RNA가 심장 세포의 성장을 활성화시킬 수 있고, 면역 반응을 감소시키거나 억제할 수 있으며, 혈관 발생을 유도할 수 있으며, 근육 수축, 심장 비대, 심부전증 및 심근염을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 해당 치료 단백질이 VEGF, FGF, 앤지오포이에틴, 및 사이토카인을 포함하는 패밀리의 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 해당 치료 단백질이 전사 인자를 활성화시키거나 억제하는 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 해당 치료 단백질이 인터루킨-10, 인터루킨-2 및 인터루킨-8과 같은 면역억제 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 해당 치료 RNA가 심장 세포내 유전자의 발현을 조절하거나 mRNA의 전사를 막도록 하는 안티센스 RNA인 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 NOS(산화질소 합성효소), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 및 카탈라아제로부터 선택된 저산소증 치료제인 것을 특징으로 하는 발현 카셋트.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 4 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 발현 카셋트를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
심장세포내에서 효과가 있는 복제 원점을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스에 의해 캡시드화되지 않은 임의의 DNA인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 화학적 또는 생화학적 전달제를 포함하는 조성물.
제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 약물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 유효량을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 심부전증 치료를 목적으로 하는 약물의 제조에 사용하기 위한 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 심장 비대 치료를 목적으로 하는 약물의 제조에 사용하기 위한 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 저산소증 치료를 목적으로 하는 약물의 제조에 사용하기 위한 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 심장 이식 동안의 거부반응을 예방하기 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 용도.
해당 치료 단백질을 암호화하는 유전자가 리포터 유전자로 대체된, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 것을 특징으로 하는 트랜스진 동물.
a) 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 분리하고,

b) 상기의 해당 유전자가 발현되도록 하는 조건하에 심장 조직내에 상기 벡터의 유효량을 도입하는 것을 특징으로 하는, 생체내 해당 치료 유전자를 발현시키는 방법.