JP2004519222A - Carp遺伝子の上流配列、それらを含むベクターとその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は生物学の分野に関する。特に遺伝子適所発現の分野、より特定すると導入遺伝子の特異的発現のための新規システムの設計と開発に関する。本発明の対象は、特に、心筋細胞においてインビボで導入遺伝子の発現のレベルと特異性を制御することができる新規プロモーター配列である。本発明はそれ故、心筋細胞において核酸の発現を制御し、指令することを可能にする新規組成物、構築物及びベクターを述べる。本発明から生じる適用は、例えば実験、臨床、治療及び診断分野において、より特定すると一部の心臓疾患の治療及び/又は予防のために、数多く存在する。
【背景技術】
【0002】
導入遺伝子の発現のレベルの制御と適所送達は多くの適用のために必要である。例えば、遺伝子治療では、治療の成功には導入遺伝子から合成されるタンパク質の適所送達が必要であり、それによって副作用の拡大を制限することが可能になると考えられる。トランスジェニック動物の構築及び遺伝子の作用の研究は、すべて、タンパク質の発現の特異性の適切な制御が使用できること、および改善を提供しうることの例である。
【0003】
これに関して、多くのプロモーターを、それらの心臓特異的発現を指令する能力に関して試験した。それらは特に、ラットにおける心臓ミオシン軽鎖(MLC−2)(Henderson S.A.ら、J Biol Chem,264(1989)18142−8;Lee K.J.ら、J Biol Chem,126(1992)15875−85)、マウスにおける心臓α−アクチン(Biben C.ら、Dev Biol,173(1996)200−12)、ナトリウム利尿因子(ANF)(Harris A.N.ら、J Mol Cell Cardiol,29(1997)515−25)、α−又はβ−ミオシン重鎖(α−又はβ−MHC)(Colbert M.C.ら、J Clin Invest,100(1997)1958−68)、ウサギにおける筋クレアチンキナーゼ(MCK)(Vincent C.K.ら、Mol Cell Biol,13(1993)567−74)、又は心臓トロポニンT(米国特許第5,266,488号)をコードする遺伝子のプロモーターである。
【0004】
これらのプロモーターは、ある程度の組織特異性を与えることが知られている一方、またそれらの活性レベルは、一般に10から100の因数で、いわゆる強力なプロモーターのレベルよりもかなり低く、治療用途に実際に考慮することができないことも知られている。
【0005】
例として、Franz W.M.ら(Cardiovasc Res,35(1997)560−6)及びGriscelli F.ら(C R Acad Sci III,320(1997)103−12)は、アデノウイルス構築物においてラットα−MHC及びMLC−2をコードする遺伝子の上流配列の活性レベルが、約10の因数でRSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーターのレベルよりも実質的に低いままであることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本出願は、それ故、より詳細には、CARP(心臓アンキリンリピートタンパク質)遺伝子の上流領域から誘導される新規プロモーター配列に関する。これは、心臓特異的発現を指令することができるだけでなく、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーターのような強力なプロモーターに匹敵するインビボでの高いレベルの発現を示す。
【課題を解決するための手段】
【0007】
MLC−2v遺伝子の発現の調節においてホメオボックス遺伝子Nbx2.5の下流で働く心筋細胞の分化のための第一のマーカーの1つを構成する、CARPタンパク質は、マウス(Zou Y.ら、Development,24(1997)793−804)、ウサギ(Aihara Y.ら、Biochim Biophys Acta,28(1999)318−24)、及びヒト(Chu W.ら、J Biol Chem,270(1995)10236−45)において検討され、その遺伝子のコード部分が配列決定された。
【0008】
Kuo H.ら(Development,126(1999)4223−34)は、10Kbのフラグメントをクローン化し、マウスCARP遺伝子のコード配列の2.5Kb上流のフラグメントを配列決定した。5’における欠失をフラグメントにおいて作製して、転写位置+1に対してヌクレオチド−166から+47までのプロモーターの213bpの領域がインビトロでの心臓特異的発現を付与するのに十分であることを示し、そのことは、5’末端に、プロモーターの特異性を制御するためのエレメントが存在することを示唆した。Kuoらはまた、CARP遺伝子の2.5Kb上流のフラグメントを含むトランスジェニックマウス系統を生成して、胚発生の初期段階で心臓及び骨格筋細胞における導入遺伝子の特異的発現を示し、次に発生の間にこの発現を抑制した。
【0009】
特許出願第WO00/15821号は、転写位置+1に対して、ヌクレオチド−2285から+62までに位置する、マウスCARP遺伝子のコード配列の上流5’側の部分を述べている。この配列を、アデノウイルスベクターを通して特にそのインビボ活性について評価した。得られる活性のレベルは、しかしながら、非常に低いままであるので、インビボでの活性を検出するためには、アデノ関連ウイルスの2つの逆方向末端反復配列(AAV−ITR)の間のプロモーター配列を単離する必要があることが認められた。
【0010】
本出願人は、CARPタンパク質についての遺伝子の5’の領域をよりよく特徴付けることに焦点を合わせた。その結果、CARP遺伝子の上流の新規配列を特定し、この新規配列の予想外の有益な特性、特にインビボでの活性レベルの有意の改善を明らかにすることができた。
【0011】
本出願人は実際に、意外にも、この新たに特定された配列はインビトロでは有意の発現をもたらさないが、逆にインビボでは、心臓組織における発現の高い選択性を保存しながら、いわゆる強力なプロモーターに等しい非常に良好な活性レベルを得られることを発見した。
【0012】
本発明の対象は、それ故、CARPタンパク質についての遺伝子のコード配列の上流部分、又は高ストリンジェンシー条件下で該上流配列とハイブリダイズする部分を含むポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドは、その制御下に置かれた導入遺伝子の心臓組織における特異的発現を誘導することができる。
【0013】
本発明はまた、配列番号1の配列と少なくとも93%、好ましくは少なくとも95%の同一性を示す、天然由来の又は化学合成によって得られるポリヌクレオチドに関する。さらに一層好ましくは、本発明に従ったポリヌクレオチドは配列番号1の配列と少なくとも98%の同一性を示す。
【0014】
天然由来の発現ポリヌクレオチドは、制限酵素を用いて細胞DNAを開裂することによって得られるゲノムDNAフラグメントを意味すると理解される。
【0015】
化学合成によって得られる発現ポリヌクレオチドは、自動合成によって、例えば適当な自動装置を使用して作製されるDNAフラグメントを意味すると理解される。
【0016】
本発明に関して、「高ストリンジェンシー条件」の語は、Maniatisら、1982(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor CSH,N.Y.米国)又はその新しい版の1つによって与えられる意味で使用される。例として、ハイブリダイズしていないフラグメントを排除するために0.2SSC及び0.1%SDSの存在下に65℃で3回の洗浄が必要であるようなハイブリダイゼーション条件である。
【0017】
発現の「特異的」性質とは、プロモーターの活性が心臓組織の細胞において有意に大きく高いことを意味する。非特異的発現は他の細胞でも存在しうるが、対応する活性のレベルは心臓組織で認められるものに比べてほとんどの場合非常に低い(無視しうる)ままであり、概して少なくとも10の因数でより低い。
【0018】
実施例で提示する結果は、これに関して、1000の因数に達しうる発現の差を示し、これは、インビボでの心臓細胞における本発明に従ったポリヌクレオチドの高い選択性を反映する。
【0019】
さらに、下記の実施例で提示する結果は、ポリヌクレオチドの使用が、心臓組織に特異的であることが知られている他のプロモーターに関するレベルを上回る、高いレベルの発現を本発明の系に提供することを示しており、その差は100の因数を越えることが可能である。これらの要素は、それ故、心臓組織での目的とする核酸の発現に関して、強度と特異性の見地から本発明に従ったポリヌクレオチドの利点と予想外の特性を例証する。
【0020】
好都合には、本発明に従ったポリヌクレオチドは、転写位置+1に対して、−2266から+92までの配列の部分を含み、その配列を配列番号1として付属物に示す。
【0021】
本発明の対象は、それ故、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1の配列とハイブリダイズする配列である。
【0022】
本発明は、それにもかかわらず、マウス遺伝子の上流のフラグメントを含むポリヌクレオチドに限定されず、同じ特性を持つ、すなわち心臓組織においてインビボで導入遺伝子の発現を特異的に誘導することができる、いかなる機能的変異体又は他のいかなる種の他のいかなる配列にも関する。
【0023】
そこで、当業者は、AF131884の参照番号の下にGenBankに寄託されているヒト遺伝子の上流配列を好都合に参照することができる。その配列を配列番号2として付属物に示す。本発明は、従って、例えば一部の構造の欠失によって修飾されているが、配列番号1の配列と同じか又は類似した機能を保持する、CARPタンパク質についての遺伝子の上流配列のフラグメントを含むいかなる配列もカバーする。
【0024】
好ましくは、本発明に従ったポリヌクレオチドは、配列番号2の配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%の同一性を示す。
【0025】
発現の機能的変異体は、上述したようなポリヌクレオチドの特性を保持する、何らかの修飾された配列を意味すると理解される。修飾は、考慮される配列内のヌクレオチドの1又はそれ以上の付加、突然変異、欠失及び/又は置換を含みうる。これらの修飾は、特に部位指定突然変異誘発のような従来の分子生物学の方法によって、又はより実際的にはシンセサイザーでの配列の人工合成によって導入しうる。得られた変異体をその後、配列番号1の配列を持つポリヌクレオチドと同等の、心筋細胞における発現の特異性を制御する能力に関して試験する。
【0026】
本発明のもう1つの対象は、上記で定義されるようなポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、任意に該ポリヌクレオチドの発現が心筋において特異的に指令されるように導入遺伝子に作動可能に連結された発現カセットに関する。
【0027】
好都合には、本発明のカセットは、導入遺伝子のヌクレオチド配列の3’に位置する、転写の終結のためのシグナルをさらに含む。
【0028】
好ましくは、導入遺伝子は、心不全、心肥大、低酸素症、虚血のような心臓疾患又は心臓移植拒絶反応に関与しうるタンパク質又はRNAをコードする、治療目的の核酸を含む。
【0029】
治療目的のタンパク質として、中でも特に次のものが挙げられる:
−例えばVEGFファミリーの成員、FGFファミリーの成員、より特定するとFGF1、FGF2、FGF4、FGF5、アンギオゲニン、EGF、TGFα、TGFβ、TNFα、散乱因子(Scatter Factor)/HGF、アンギオポエチンファミリーの成員、サイトカイン、特にIL−1、IL−2、IL−8を含めたインターロイキン、アンギオテンシン−2、プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、ウロキナーゼ(uPA)、活性脂質の合成に関わる分子(プロスタグランジン、Cox−1)のような、血管新生を誘導するタンパク質;
−ホスホランバン、ホスホランバン阻害因子、SERCA−2a、β2−アドレナリン受容体あるいはジストロフィン又はミニジストロフィン(FR91 11947号)のような、心筋収縮能の制御に関与するタンパク質;
−bclファミリーの成員であるタンパク質のような、特にアポトーシスを遮断する、低温防護作用を持つタンパク質、及びAKT/PKBのようなプロテインキナーゼ;
−例えば融合タンパク質tetR−NLS−VP16、エストロゲン受容体から誘導される融合タンパク質、ステロイドホルモン受容体から誘導される融合タンパク質、プロゲステロン受容体から誘導される融合タンパク質、Riveraら(Riveraら、Nature Medicine,2(1996)1028−1032)が記述しているCID(二量体化の化学的誘導物質(Chemical Inducer of Dimerization))系のタンパク質のような、DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン及び転写活性化又は抑制ドメインを含む、例えば天然又はキメラ核内受容体のような転写因子。特に、キメラ核内受容体として、核内受容体PPAR(ペルオキシソーム増殖因子活性受容体(Peroxisome Proliferator Activated Receptor))、特に、一次構造の修飾を伴わないその天然形態の、あるいは配列番号3の配列を持つPPARγ2のような1又はそれ以上のリガンド結合部位又はE/Fドメインを含む修飾されたPPARγ2としての(Schoonjansら、Biochim.Biophys.Acta.1302(1996)93−109)、特許出願第WO96/23884号及び第FR9907957号において、またFrohnertら(J Biol Chem 274(1999)3970−3977)及びMukherjeeら(J Biol Chem 272(1997)8071−8076)によって述べられているような、PPARγ2が挙げられる;
−免疫シグナル伝達経路を完全に又は部分的に阻害し、それによって心臓移植の期間を延長することを可能にする、例えばインターロイキン2及び10のような免疫抑制因子;
−NOS(一酸化窒素シンテターゼ)、B細胞白血病/リンパ腫2(bcl−2)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及びカタラーゼのような低酸素症を軽減するために作用物質として関与するタンパク質。
【0030】
治療目的のRNAとして、例えば遺伝子の発現又は細胞mRNAの転写を制御し、それ故、欧州特許第EP140308号に述べられている手法に従ってタンパク質への翻訳を遮断するために有用であるアンチセンスRNA、ならびに欧州特許第EP321201号に述べられているような標的RNAを選択的に破壊することができるリボザイムが挙げられる。
【0031】
本発明はタンパク質又はRNAの特定例に限定されず、当業者により、単純な慣例的実験操作によって、心臓細胞におけるいかなる核酸の発現のためにも使用されうることは明白である。
【0032】
本発明の対象は、さらに、本発明に従ったポリヌクレオチド又は発現カセットを含むベクターである。そのようなベクターは、標的組織における導入遺伝子の発現のために必要な他のいかなるDNA配列も含むことができ、特に心臓細胞において有効な複製起点を含みうる。
【0033】
本発明のベクターは多様であり、特にプラスミド、エピソーム、染色体、ウイルス又はファージ、天然及び/又は起原でありうる。好ましくはプラスミド又は組換えウイルスである。
【0034】
ポリヌクレオチド又は発現カセットを含むプラスミドの例示として、例えば下記で述べるプラスミドpXL3634、pXL3728及びpXL3759が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0035】
第一の実施態様に従えば、本発明に従ったベクターはプラスミド型である。プラスミドベクターとして、中でも特に、当業者に既知であり、一般に複製起点を含むクローニング及び/又は発現プラスミドが挙げられる。また、例えば特許出願第WO96/26270号に述べられているような、洗練された複製起点及び/又はマーカーを担う新世代プラスミドが挙げられる。
【0036】
好ましい実施態様に従えば、プラスミドベクターはミニプラスミドであり、宿主細胞におけるその機能性が、該細胞に特異的であり、外来性である少なくとも1つのタンパク質の存在を必要とする複製起点を含む。そのようなベクターは、特に特許出願第WO97/10343号に述べられている。
【0037】
第二の実施態様に従えば、本発明に従ったベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの中で、特に、その調製が当業者に既知の方法に従って実施しうる、組換えアデノウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスが挙げられる。好ましくは、特に特許出願第WO95/22617号に述べられているアデノウイルス−レトロウイルスキメラベクター、ならびにLebloisら(Mol Ther(2000)1(4)、314−322)及び特許出願第WO97/47757号に述べられているエピソーム/アデノウイルスベクターのようなキメラウイルスベクターを使用する。
【0038】
この実施態様に従ってアデノウイルスを使用するとき、これらは好ましくは欠損アデノウイルスから誘導されるベクターである、すなわちそれらは標的細胞において自律的に複製することができない。これらの欠損ウイルスの構築ならびにそれらの感染特性は文献で広く記述されている(特にS.BaeckとK.L.March,Circul.Research,82(1998)295−305);T.Shenk,B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howleyら(1996)、Adenoviridae:Viruses and Replication(in virology)211−2148,EDS−Ranes publishes Philadelphia;Yeh,P.ら、FASEB 11(1997)615−623参照)。
【0039】
構造と特性が幾分異なる様々なアデノウイルス血清型が特性付けられている。これらの血清型の中で、本発明に関しては2型又は5型ヒトアデノウイルス(Ad2又はAd5)あるいは特許出願第FR9305954号に述べられているもののような動物由来のアデノウイルス又は混合由来のアデノウイルスの使用が好ましい。本発明に関連して使用できる動物由来のアデノウイルスの中で、イヌ、ウシ、マウス(Beardら、Virology 75(1990)81)、ヒツジ、ブタ、鳥類又はサル由来のアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくは特許出願第WO94/26914号に述べられているようなCAV2アデノウイルス(Manhattann又はA26/61株)である。
【0040】
本発明の欠損アデノウイルスは一般に、各々の末端に逆方向末端反復配列(ITR)、キャプシド被包を可能にする配列(Psi)、E1遺伝子、そして当業者に既知の手法によってさらに不活性化されたE2、E4及びL1−L5遺伝子の少なくとも1つを含む(Leveroら、Gene,101(1991)195、欧州特許第185573号;Graham,EMBO J.3(1984)2917)。
【0041】
好都合には、本発明に関連して使用する組換えアデノウイルスは、そのゲノムのE1領域内に欠失を含む。より特定すると、E1a及びE1b領域の欠失を含む。厳密な例として、ヌクレオチド454−3328、382−3446又は357−4020に影響を及ぼす欠失が挙げられる(Ad5のゲノムに関して)。
【0042】
好ましい変法に従えば、本発明に関連して使用する組換えアデノウイルスは、さらに、そのゲノムのE4領域内に欠失を含む。より特定すると、E4領域の欠失はすべてのオープンリーディングフレームに影響を及ぼす。厳密な例として、33466−35535又は33093−35535の欠失が挙げられる。E4領域における他の種類の欠失が特許出願第WO95/02697号及びWO96/22378号に述べられており、それらは参照してここに組み込まれる。
【0043】
アデノ関連ウイルス(AAV)については、それらは、感染する細胞のゲノム内に安定且つ部位特異的に組み込まれる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態又は分化への影響を誘発することなく、広いスペクトルの細胞に感染することができる。さらに、それらはヒトにおける疾病には関与しないと思われる。AAVゲノムはクローン化され、配列決定され、特性付けられている。約4700個の塩基を含み、各々の末端に、ウイルスのための複製起点として働く約145塩基の逆方向末端反復配列(ITR)を持つ。ゲノムの残りの部分は、キャプシド化機能を担う2つの必須領域に分けられる:ウイルスの複製とウイルス遺伝子の発現に関わるrep遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含む、ゲノムの左側部分。
【0044】
インビトロ及びインビボでの遺伝子の移入のためのAAV由来のベクターの使用は文献の中で記述されている(特にWO91/18088号;WO93/09239号;米国特許第4,797,368号、米国特許第5,139,941号、欧州特許第488528号参照)。これらの特許出願は、rep及び/又はcap遺伝子が欠失して、目的とする遺伝子で置換された様々なAAV由来の構築物、及び目的とする該遺伝子をインビトロ(培養細胞上に)又はインビボ(直接生物内に)で移入するためのそれらの使用を述べている。本発明に従った欠損組換えAAVは、2つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)にはさまれた本発明の核酸を含むプラスミドと、AAVキャプシド化遺伝子(rep及びcap遺伝子)を担うプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス(例えばアデノウイルス)に感染させた細胞系統にコトランスフェクションすることによって作製しうる。産生された組換えAAVを、その後、従来の手法によって精製する。
【0045】
レンチウイルスもこの実施態様に従って使用しうる;それらは、目的とする遺伝子の静止細胞への移入と効率的で安定な組込みを可能にする。
【0046】
例えばFIV(ネコ伝染性ウイルス)、EIAV(ウマ伝染性貧血ウイルス;WO98/51810号)、BIV(ウシ免疫不全ウイルス)、SIV(サル免疫不全ウイルス)、CAEV(ヤギ関節炎脳脊髄炎ウイルス)(WO98/39463号;Naldiniら、Science 272(1996)263−267;Schneleら、Hum Gen Ther 11(2000)439−447)のような動物レンチウイルスのHTLV−1、又はヒトではあまり病原性が高くない、AIDSを引き起こすものに関連するレンチウイルス、HIV−2(Kundraら、Hum Gen Ther 9(1998)1371−1380)が挙げられる。
【0047】
発現カセットは組換えゲノムの様々な部位に挿入することができる。抑圧された又は過剰の配列の置換として、E1、E3又はE4領域のレベルに挿入しうる。また、ウイルスの産生のためにシスで必要な配列(ITR配列及びキャプシド化配列)の外側の、他のいかなる部位でも挿入しうる。
【0048】
しかし、上述したベクターへの本発明に従った配列の導入は必須ではないので、これらの配列を含むDNAで心臓細胞を直接トランスフェクションしうることに留意すべきである。
【0049】
本発明に従った核酸配列は、核酸を、それらの細胞内への侵入又は核内への輸送を促進する化合物と共有結合し、生じた複合体を任意に、国際特許出願第WO94/27238号におけるようにポリマー微粒子にキャプシド化した後、導入することができる。
【0050】
もう1つの実施態様に従えば、核酸配列を、国際特許出願第WO95/10534号におけるように、それらの細胞内への侵入を促進するポリペプチドを含むトランスフェクション系に含めることができる。
【0051】
これらのポリヌクレオチド、カセット及びベクターは、当業者に既知の何らかの手段によって、例えば冠状動脈注入によって(Barrら、Gene Ther,1(1994)51−58)、心臓内注射によって、心外膜注射によって、すなわち心室壁を通して(Guzmanら、Cir Res,73(1993)1202−1207)、心膜内注射によって(Fromesら、Gene Ther,6(1999)683−688)、又は冠状静脈のレトロフュージョン(retrofusion)によって(Boeckstegersら、Circulation,100(Suppl I)(1999)、I−815)、インサイチューで投与することができる。
【0052】
本発明に従ったポリヌクレオチド、カセット又はベクターは、例えばそれらの心臓細胞へのトランスフェクションを促進する化学的又は生化学的移入剤の助けを得て、それらを含有する組成物の形態で好都合に投与しうる。「化学的又は生化学的移入剤」の表現は、細胞内への核酸の侵入を促進する何らかの化合物を意味すると理解される。これは、カチオン脂質、ペプチド、ポリマー(ポリエチレンイミン、ポリリシン)、ナノ粒子のようなカチオン物質、あるいは非カチオンリポソーム、非カチオンナノ粒子又はポリマーのような非カチオン物質を含みうる。そのような物質は当業者に周知であり、特に特許出願第WO95/18863号、WO97/18185号及びWO98/15639号に述べられている。
【0053】
本発明は、さらに、そのようなポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含有する薬剤、ならびに医薬上適合性の賦形剤と共に医薬上有効な量でそれらを含有する医薬組成物に関する。
【0054】
そのようなポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、心臓病の治療のため、特に心不全、低酸素症、心肥大、心筋炎、心臓虚血の治療及び/又は予防のため、又は心臓移植の際の拒絶反応を予防するために、特に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を発現しうる心臓組織に供給送達するための薬剤の製造のために好都合に使用しうる。
【0055】
そのような薬剤は、例えば、治療することを所望する心臓疾患に応じた損傷遺伝子の機能的形態を発現することができる、本発明に従ったカセット又はベクターを含有しうる。
【0056】
好ましくは、医薬組成物は、注射用製剤、特に心臓内注射のための医薬適合性の賦形剤を含有する。これは特に、等張無菌塩類溶液(一ナトリウム又は二ナトリウムリン酸塩、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム等、又はそのような塩の混合物)、あるいは、場合によって、滅菌水又は生理食塩水を加えて注射用溶液を調製することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物を含みうる。例えばヒドロゲルのような他の賦形剤も使用しうる。このヒドロゲルは、何らかの生体適合性で非細胞傷害性の(ホモ又はヘテロ)ポリマーによって調製しうる。そのようなポリマーは、例えば特許出願第WO93/08845号に記述されている。特にエチレン及び/又はプロピレンオキシドから得られるもののように、それらの一部は市販されている。注射のために使用する用量は、様々なパラメータに従って、特に求める目的(標識化、病理学、スクリーニング等)、発現する導入遺伝子、又は所望する発現の期間に従って調節しうる。
【0057】
一般に、本発明に従った組換えアデノウイルスは、104〜1014pfu、好ましくは106〜1010pfuの用量の形態で製剤し、投与する。pfu(プラーク形成単位)の語はウイルス溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養を感染させて、感染細胞のプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための手法は当該技術において周知である。
【0058】
本発明の対象は、さらに、治療目的の導入遺伝子が発現されうるように、本発明に従ったポリヌクレオチド、カセット又はベクターを使用する際に該導入遺伝子を発現する方法である。
【0059】
さらに、本発明はまた、上述したようなカセット又はベクター(特にアデノウイルス)で修飾された細胞に関する。「修飾された」細胞との表現は、本発明に従ったポリヌクレオチド又はカセットを含有する細胞を意味すると理解される。これらの細胞は、特許出願第WO95/14785号に述べられている方法に従って、生体内への移植が意図されうる。これらの細胞は基本的にヒト心臓細胞である。
【0060】
本発明はまた、トランスジェニック動物、特に治療目的のタンパク質をコードする遺伝子がレポーター遺伝子で置換されている、上記で定義したようなポリヌクレオチド又はカセットを担うマウスに関する。そのようなトランスジェニックマウスは、CARPタンパク質をコードする遺伝子の調節配列への作用に関して分子をスクリーニングするために使用しうる。
【0061】
分子をマウスに投与し、犠牲剖検した後、レポーター遺伝子で染色された組織を特定するために組織切片を調製する。
【0062】
本発明に従ったトランスジェニック動物はまた、心不全、心肥大、心筋過形成及び心筋梗塞のような遺伝的由来の心臓疾患の基礎となる分子機序を理解するための分子生物学試験の手段を構成する。
【0063】
例として、インターフェロン−1(IFN−1)をコードする遺伝子が不活性化される心筋炎を検討するためのマウスモデルが挙げられる(Aitkenら、Circulation,90(1994)1−139)。
【0064】
本発明に従って対象とする他の動物モデルは、癌原遺伝子又は癌遺伝子、例えば過形成のモデルを構成するc−myc(Jacksonら、Mol Cell Biol,10(1990)3709−3716)、心室肥大のモデルのためのp21−ras(Hunterら、J Biol Chem,270(1995)23176−23178)、一部の心筋症を検討するためのエプスタイン−バーウイルスの核抗原(Huenら、J Gen Virol,74(1993)1381−1391)のような導入遺伝子に連結された、本発明に従ったポリヌクレオチドを含みうる。
【0065】
もう1つの実施態様に従えば、本発明に従ったトランスジェニック動物は心臓肥大の実験モデルを構成し、導入遺伝子が、例えばカルモジュリン(Gruverら、Endocrinology,133(1993)376−388)、インターロイキン−6又はインターロイキン−6受容体(Hirotaら、Proc Natl Acad Sci,92(1995)4862−4866)、カルジオトロフィン−1(Pennicaら、Proc Natl Acad Sci,92(1995)1142−1146)、及び最後にα−アドレナリン受容体(Milanoら、Proc Natl Acad Sci,92(1994)10109−10113)をコードする発現カセットを含む。
【0066】
それに加えて、CARP遺伝子の発現上昇を可能にするように修飾された、本発明に従ったポリヌクレオチドも本発明の一部を形成する。そのようにして得られるトランスジェニック動物は、心筋梗塞のための実験ツールを構成する(Stantonら、Circul Res,86(2000)939−945)。
【0067】
本発明を実施するために、当業者は、次のマニュアル「SAMBROOKら(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York、1989)」、又はその最近の版の1つを好都合に参照することができる。
【0068】
下記の実施例を用いて本発明をより詳細に述べるが、実施例は例示であり、非制限的とみなされるべきである。
【実施例1】
【0069】
CARP遺伝子の上流ポリヌクレオチドの特性付け
CARPタンパク質をコードするマウス遺伝子の5’にある配列の2.3KbのBamHI−XhoIフラグメントをクローン化し、Sequenaseキット(United State Biochemical,Cleveland,Ohio)を用いてチェーンターミネーション法(Sangerら、1977、PNAS,74、5463)に従って両方の鎖について塩基配列決定した。その配列は図1に示されており、それ故、転写位置+1に対してヌクレオチド−2266から+92までのマウスCARPタンパク質をコードする遺伝子の上流部分(配列番号1)を含む。
【実施例2】
【0070】
CARPプラスミドベクターの構築
2.1 プラスミドpXL3634
プラスミドpXL3634を得るために、実施例1で特性付けた2.3KbのBamHI−XhoIフラグメントを、BamHI部位の充填後、あらかじめXhoIとSmaIで消化しておいたプラスミドpGL3−Basic(Promega)にクローン化した。このプラスミドの図式的表示を図3に示す。
【0071】
2.2 プラスミドpXL3728
プラスミドpXL3728は、ヒト線維芽細胞インターフェロンのシグナルペプチドとFGF1(線維芽細胞増殖因子1)のcDNAとの融合(sp−FGF1、Jouanneauら、PNAS 88(1991),2893−2897)をコードする遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルス初期領域(hCMV IE)及びSV40ウイルス後期領域のポリアデニル化シグナル(GenBank SV4CG)から得られるプロモーターの制御下で導入したプラスミドpXL2774(WO97/10343号)から誘導されるベクターである、プラスミドpXL3179から得られる。
【0072】
プラスミドpXL3728を得るために、その末端を充填した、実施例1で特性付けた2.3KbのBamHI−XhoIフラグメントを、あらかじめXbaIとEcoRIで消化しておいたプラスミドpXL3179(pCOR CMV−FGF)にクローン化した。このプラスミドの図式的表示を図4に示す。
【0073】
2.3 プラスミドpXL3729
プラスミドpXL3729を得るために、プラスミドpXL3634のEcoRI−SalIフラグメントを、あらかじめEcoRI−SalIで消化しておいたプラスミドpXL3728にクローン化した。
【実施例3】
【0074】
比較プラスミド
3.1 プラスミドpXL3130及びpXL3153
プラスミドpXL3130及びpXL3153はそれぞれ、特許出願第WO00/18908号に述べられているようにCMVエンハンサー(−522、−63)に連結されたヒト平滑筋α−アクチンプロモーター(−680、+30)及びマウスSM22プロモーター(−436、+43)を含む。
【0075】
3.2 プラスミドpXL3635
RSV−229、+34プロモーターを、RSVプロモーターのより長いバージョンを含む構築物(Ad1.0RSVLAcZに含まれる、Stratford−Perricaudetら、J Clin Invest 90(1992)626−30)から、それぞれPCRフラグメントの5’と3’にSwaIとXbaI部位を導入するプライマー、5’−GGC GAT TTA AAT AAT GTA GTC TTA TGC AAT−3’及び5’−GGG GTC TAG AAG GTG CAC ACC AAT GTG GTG A−3’を用いたPCRによってクローン化した。次にこれら2つの制限部位を使用してプロモーターフラグメントをpGL3−basicに導入し、pXL3635を作製した。
【0076】
3.2 プラスミドpXL3031
プラスミドpXL3031はSoubrierら、Gene Ther.6(1999)、1482−8によって述べられている通りである。pGL3basicから得られる修飾Photinus pyralisルシフェラーゼ(細胞質性)をコードするluc遺伝子(GenBank:CVU47295)を、ヒトサイトメガロウイルス初期領域(hCMV IE,GenBank HS5IEE)から得られるプロモーター及びSV40ウイルス後期領域のポリアデニル化シグナル(GenBank SV4CG)の制御下で導入したプラスミドpXL2774(WO97/10343号)から誘導されるベクターである。
【実施例4】
【0077】
細胞培養
ラット心筋細胞の初代培養を樹立した。そのために、CO2で飽和した室内で妊娠ラットを死亡させた。腹部を開いた後、子宮角を切除し、PBS中、室温で洗う。胚をその膜から切り離し、胎盤を切断する(1ラット当り10から12の胚)。心臓を切除し、ADS/グルコース中で洗う。双眼レンズ下に、耳介と大脈管を切除し、その後心室だけを保持するように心臓を再びADS/グルコース中で洗浄し、滅菌ADS/グルコース中で3回すすぐ。
【0078】
次に、最終濃度0.1mg/mlのトリプシンT 4674(Sigma,St Louis,Missouri)を使用して、静かに攪拌しながら(1分当り60から100回転)37℃で20分間、各心臓当りADS/グルコース/トリプシン混合物0.3ml中で心臓をトリプシン処理する。
【0079】
その後上清を取り除き、補体除去したFCS 1mlを加えてトリプシンを不活性化する。1500rpmで10分間遠心分離した後、上清を除去し、心臓細胞を補体除去FCS 1ml中に取る。平行して、細胞の完全な分離が得られるまで、トリプシンによる処理の段階を5から6回反復する。細胞のプールを1500rpmで10分間遠心分離し、次にFCS中で2回洗って、最後に細胞をグリッドフィルターでろ過する。
【0080】
そのようにして分離した細胞を、24穴平板については106細胞/穴の濃度で、又は12穴平板については2×106細胞/穴の濃度で培養に入れる。各々の穴は培地1mlを含む。
【0081】
培地は、総容量100mlについて、DMEM 68ml(ピルビン酸不含)(Gibco−BRL)、M199 17ml(Sigma M 4530)、補体除去ウマ血清 10ml(Sigma H6762)、補体除去FCS 5ml(Gibco−BRL)及び100×Peni/Strepto/グルタミン混合物1ml(Gibco−BRL)を含む。
【0082】
心筋細胞を約1又は2日間培養する。
【実施例5】
【0083】
心筋細胞の初代培養のトランスフェクション
心筋細胞の初代培養を、プラスミドpRL−CMV 1ng(Promega Inc.,Madison,WI)、上述したようなプラスミドpXL3635及びpXL3634の各々1ngから100ngの範囲の可変量、pUC19の適量500ngを含む、各穴につき500ngに等しい総量のDNAとコトランスフェクションする。
【0084】
そのために、プラスミドの混合物を、NaCl 150mM、重炭酸塩50mM中20μlの最終容量でDNA 1μg(10mMの脂質溶液0.3μl)につきRPR 120535B 6nmol(Bykら、J Med Chem.41(1998)229−35)と共にインキュベートし、次に5秒間渦動攪拌して、室温で再び約20分から30分間インキュベートする。
【0085】
その後混合物を無血清培地250μlに加え、細胞と共に少なくとも2時間インキュベートする。最後に培地を取り出し、細胞を5%CO2の存在下に37℃の温度で24時間から7日間までの期間インキュベートする。
【0086】
トランスフェクション後24時間目又は48時間目に細胞を採集し、Renilliaルシフェラーゼ及びFireflyルシフェラーゼ活性をPromega Dual Lucキットにより、製造者の指示に従って分析する。Victor装置で活性を読み取る。
【実施例6】
【0087】
ポリヌクレオチドのインビトロ活性の比較評価
CARPポリヌクレオチド(pXL3634)及びRSV(pXL3635)プロモーターの相対活性を、ラット心筋細胞の初代培養での一過性トランスフェクションにおいてインビトロで評価し、プラスミドpRL−CMVの活性と比較して表示した(図5)。
【0088】
結果は、使用したCARP遺伝子の上流ポリヌクレオチド(pXL3634)が、CMVプロモーターのものに比べて0.04%というレベルの非常に低いインビトロ活性を持つことを示している。
【0089】
非特異的で強力なRSVプロモーター(pXL3635)の相対活性もやはり低く、それぞれ標準CMVプロモーターの0.05%と0.68%である。
【実施例7】
【0090】
アデノウイルスの構築
CARPプロモーターの制御下でルシフェラーゼの発現を可能にするアデノウイルスをCrouzetら(PNAS,94(1997)1414−1419)の方法に従って構築し、発現カセットはプラスミドpXL3634のものと同じであった(図3)。
【0091】
大腸菌(E.coli)における組換えを可能にするシャトルベクターを2段階で構築した。第一に、プラスミドpXL3758を作製するためにCARPプロモーター(フラグメント:クレノウ/BamHIで充填したXhoI)をITR−ΨとpIX領域の間でpXL3474(ScaI及びBglIIで消化した)に導入した。次に、BstBII(クレノウで充填した)及びBstEIIで消化したpXL3758に、ルシフェラーゼcDNAとSV40ポリアデニル化部位を含むフラグメント(pXL3634のクレノウ/BstEIIで充填したBamHIフラグメント)を導入することによってpXL3759を作製した。pXL3759を図6Aに図式的に示す。
【0092】
大腸菌における相同的二重組換えを、RSV−LacZ発現カセットがE1領域に導入されているΔE1/ΔE3アデノウイルスゲノムを含有するプラスミドpXL3215に対して、上述したように実施した。プラスミドpXL3215は、プラスミドRK2の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するプラスミドpXL2689の誘導体である(Crouzetら、PNAS,1997)。この二重組換えの産物であるプラスミドpXL3778を、発現カセットの塩基配列決定によって調べる。線状ウイルスゲノムを遊離するためにPacIで開裂した後、ウイルスAV1.0CARP−Luc+を作製するためにプラスミドをPer.C6細胞系統(WO97/00326号)にトランスフェクションする。
【0093】
ウイルスを制限分析による発現カセットの配列決定によっても検討し、RCA E1+(複製コンピテントアデノウイルス)粒子の存在をプローブΨとのハイブリダイゼーションによって試験する。
【0094】
Per.C6系統でのウイルスの増幅によって高いウイルス力価を持つ株を入手し、ウイルス粒子をCsCl勾配で精製する。ウイルス粒子中のこのウイルスの力価/ml(vp/ml)をクロマトグラフィーによって調べ、骨格筋又は心筋細胞の感染後のルシフェラーゼ活性の滴定によってインビトロでその活性を測定して、対照として使用したCMVプロモーターを含むウイルスと比較する。
【実施例8】
【0095】
インビボでのDNAの注入
体重200gのCD SPRAGUEラットを、1ml/kgのケタミン(70mg/ml)/キシラジン(6mg/ml)混合物を腹腔内経路で注射して麻酔する。
【0096】
開腹後、停止フランジとBD 26G*3.8針(短ベゼル)を備えるSteriflexカテーテル(参照番号167.10 G19 V)に接続した100μlハミルトンガラスシリンジにより、経横隔膜経路で心筋内注射を実施する。
【0097】
NaCl 0.9%に調整したDNA溶液50μlを5秒間注入する。
【0098】
動物を犠牲死亡させた後、心臓を切除し、0.9%NaCl溶液中で洗って、顕微鏡検査する。次にそれらを、プロテアーゼ阻害因子(COmplete(商標)、Roche Diagnostics)を補足したキット(Promega E151A)内の溶解緩衝液中で、ホモジナイザー(Ultra−thurax,Diax600 Heidolph)を用いて摩砕し、4℃、4000rpmで20分間遠心分離した後、該キットによってルシフェラーゼ活性を分析する。装置:LUMAT LB 9501(上清10μl+Promegaルシフェラーゼ基質50μl)で読取りを行う。Mirら(PNAS 96(1999)4262−4267)が述べている検定法を用いてルシフェラーゼ活性を心臓当りのルシフェラーゼ質量(pgルシフェラーゼ/心臓)に変換する。
【0099】
代替的には、心臓を3.7%パラホルムアルデヒドに固定し、FGF−1の発現に関して免疫組織化学によって分析する。
【実施例9】
【0100】
CARPポリヌクレオチドのインビボ活性の比較評価
図7Aにまとめた結果は、プラスミドpXL3031とpXL3634の1、5、25及び125μgの漸増用量を注射したときに得られるルシフェラーゼの発現レベルが有意の異ならないことを示しており、従ってCARP遺伝子の上流ヌクレオチドがCMVのような強力なプロモーターのものに等しい高いレベルの発現を誘導しうることを明らかに証明している。
【0101】
他方で、もう1つの強力なウイルスプロモーター、RSVプロモーター(pXL3635)に関して得られる発現は、CMVプロモーター又はCARP遺伝子の上流ポリヌクレオチドで得られるものよりも弱い(図7B)。
【0102】
さらに、平滑筋細胞プロモーターの上流のCMVエンハンサー(SM α−アクチン、pXL3130又はSM22、pXL3153)の付加は、インビトロで非常に効率的であることが明らかにされているが(WO00/18908号)、インビボで心臓細胞においては無効であると思われる。
【実施例10】
【0103】
CARPポリヌクレオチドの発現の特異性の評価
プラスミドpXL3634、pXL3435及びpXL3031の各々25μgを心臓内経横隔膜注射によってラットに投与した。
【0104】
平行して、エレクトロトランスファーを伴って又は伴わずに、マウスの群の頭蓋脛側筋にこれらのプラスミド各々10μgの筋肉内注射を実施した。
【0105】
上述したような注射から7日後にルシフェラーゼの発現を分析した(PNAS 96(1999)4262−4267)。
【0106】
心臓におけるルシフェラーゼの発現レベルを頭蓋脛側筋で認められたレベルと比較して表示し、図8にまとめている。
【0107】
結果は、CARP遺伝子の上流ポリヌクレオチドとCMVプロモーターが、心臓組織において最も高い発現を誘導することができるただ2つのプロモーターであることを明らかに示している。しかし、心臓/筋の発現比率はCMVプロモーターに関しては1であるが、CARP遺伝子の上流ポリヌクレオチドを使用するときにはこの比率が100に近く、心臓組織に対する後者の非常に高い選択性を明らかに示している。
【0108】
ポリヌクレオチドの発現の特異性の卓越性はまた、タンパク質SM−22及びアクチンをコードする遺伝子のもののような、平滑筋細胞に特異的なエンハンサーとプロモーターを含む他の構築物に対しても明らかであり、それらについても心臓/筋発現比率を例示として図8に示す。
【図面の簡単な説明】
【0109】
【図1】マウスCARPタンパク質をコードする遺伝子の上流ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図2】ヒトCARPタンパク質をコードする遺伝子の上流ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。
【図3】プラスミドpXL3634の図式的表示である。
【図4】プラスミドpXL3728の図式的表示である。
【図5】CMVプロモーター(pRL−CMV)の標準活性に対する、プラスミドpXL3635及びpXL3634のインビトロでの相対活性を示す。各々のプロモーターの活性は、Renilla reniformisルシフェラーゼ活性で基準化したPhotinus pyralisルシフェラーゼ活性を表わす。
【図6A】プラスミドpXL3759の図式的表示である。
【図6B】アデノウイルスAV1.0 CARP−Luc+の図式的表示である。
【図7A】ラットに様々な量のプラスミドpXL3031及びpXL3634を心臓内経横隔膜注射した後7日目のルシフェラーゼ活性(pgルシフェラーゼ/心臓)を示す。
【図7B】ラット心臓に25μgのプラスミドpXL3031及びpXL3635、pXL3130、及びpXL3153を心臓内経横隔膜注射した後7日目のルシフェラーゼ発現(pgルシフェラーゼ/心臓)を示す。
【図8】プラスミドpXL3031、pXL3634、pXL3635、pXL3153、及びpXL3130の心臓内投与後に得られた心臓における発現の関数としての、心筋での発現に対する心臓でのルシフェラーゼの発現の比率を表わす。
Claims (26)
- ポリヌクレオチドであって、配列番号1を有するCARPタンパク質についての遺伝子のコード部分の上流にある配列の、又は高ストリンジェンシー条件下で該配列とハイブリダイズする配列の、フラグメントを含むことを特徴とし、心臓細胞において該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された遺伝子のインビボでの特異的発現を誘導することができる、上記ポリヌクレオチド。
- 配列番号1の配列と少なくとも93%の同一性を示すことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 該フラグメントが、CARPタンパク質についてのマウス遺伝子のヌクレオチド−2266から+92の間に位置する配列内に含まれることを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1から3のいずれかで定義されたDNA配列の制御下に置かれた、治療目的の、タンパク質又はRNAをコードする配列を含むことを特徴とする発現カセット。
- 配列番号2の配列と少なくとも80%の配列同一性を示すDNA配列の制御下に置かれた、治療目的の、タンパク質又はRNAをコードする配列を含むことを特徴とする発現カセット。
- 該タンパク質又は該RNAが、心臓細胞の増殖を活性化する、免疫応答を低下させる又は抑制する、血管新生を誘導する、筋収縮能、心肥大、心不全及び心筋炎を矯正することができることを特徴とする、請求項4及び5のいずれか一項に記載のカセット。
- 治療目的の該タンパク質が、VEGF、FGF、アンギオポエチン、及びサイトカインを含むファミリーのタンパク質であることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載のカセット。
- 治療目的の該タンパク質が活性化又は抑制性転写因子であることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載のカセット。
- 治療目的の該タンパク質が、インターロイキン−10、インターロイキン−2及びインターロイキン−8のような免疫抑制タンパク質であることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載のカセット。
- 治療目的のRNAが、心臓細胞における遺伝子の発現を制御する又はmRNAの転写を遮断することを可能にするアンチセンスRNAであることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載のカセット。
- 該タンパク質が、NOS(一酸化窒素シンテターゼ)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及びカタラーゼから選択される、低酸素症を軽減するための作用物質であることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載のカセット。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項4から11のいずれか一項に記載の発現カセットを含むことを特徴とするベクター。
- 心臓細胞において有効な複製起点を含むことを特徴とするベクター。
- プラスミド、コスミド又はウイルスによってキャプシド化されていない何らかのDNAであることを特徴とする、請求項12から14のいずれか一項に記載のベクター。
- アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス又はそれらの誘導体から選択される組換えウイルスであることを特徴とする、請求項12から14のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターを含有することを特徴とする組成物。
- 請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターと化学的又は生化学的移入因子を含有する組成物。
- 請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターを含有することを特徴とする薬剤。
- 請求項1から3及び12から16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はベクターの有効量を含有することを特徴とする医薬組成物。
- 心不全の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- 心肥大の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- 低酸素症の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- 心臓移植の際の拒絶反応を予防するための薬剤を製造するための、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターの使用。
- 治療目的のタンパク質をコードする遺伝子がレポーター遺伝子で置換されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを担うことを特徴とするトランスジェニック動物。
- a)請求項12から16のいずれか一項に記載のベクターを単離すること、および
b)目的とする該遺伝子が発現される条件下で、該ベクターの有効量を心臓組織に導入することを特徴とする、治療目的の遺伝子をインビボで発現する方法。
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