JP2022522196A - ラミノパシーを処置するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ラミノパシーを処置、防止、または阻害するための組成物および方法を提供する。一態様では、本開示は、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物および／またはベクターを提供する。本発明は、例えば、ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくともイントロン８またはイントロン１１を含む核酸構築物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月２８日に出願された米国仮出願第６２／８１２，０２１号の優先権の利益を主張する。前述の出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＭＮＡ遺伝子は、正常な選択的スプライシングの結果として少なくとも３つのアイソフォーム（ラミンＡ、ラミンＣ、およびラミンＡΔ１０）をコードする。２つの主なアイソフォームであるラミンＡおよびラミンＣは、繊維状核ラミナの構成的構成成分であり、核エンベロープの内膜とＤＮＡとの間に位置する複雑な分子界面である。ラミンＡおよびラミンＣは、力学的な核膜の維持から遺伝子調節に至る多様な生理的役割を有する。ＬＭＮＡ遺伝子における複数の変異は、ラミノパシーとして公知の一連の疾患を生じる。これらの疾患は、少なくとも８個の良好に特徴付けられた表現型を含み、その一部は骨格筋または皮膚に限定されるが、他は多臓器性である。
拡張型心筋症は、大きいＬＭＮＡ関連疾患ファミリーにおける疾患の１つである。拡張型心筋症の発生率は、２５００人に１人から２５０人に１人の範囲である。拡張型心筋症は、左室または両室の拡張および収縮障害ならびに収縮機能障害によって特徴付けられる。まれな疾患であるが、拡張型心筋症は重篤な健康負荷を表し、しばしば疾患のいずれかの段階で不整脈、血栓塞栓症および突然死をもたらす。拡張型心筋症または他のＬＭＮＡ関連ラミノパシーの特定の処置はない。
ラミノパシー（例えば、拡張型心筋症）の新規処置が必要である。
本明細書において、一部の実施形態では、拡張型心筋症などのラミノパシーの処置に使用され得る組成物および方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、５００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結された、（ａ）ラミンＡポリペプチド、（ｂ）ラミンＣポリペプチド、または（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、もしくは（ａ）～（ｃ）のいずれかの生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチド、（ｂ）ラミンＣポリペプチド、または（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、もしくは（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、ヌクレオチド配列がＬＭＮＡ遺伝子の少なくとも１つのしかし全てではない非コード配列を含む核酸構築物を提供する。ある特定の実施形態では、非コード配列はイントロンである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～１１に対応する少なくとも１つのしかし全てではないイントロンを含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、イントロン１０に対応するイントロンは、配列番号７９のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、イントロン８に対応するイントロンは、配列番号７７のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、イントロン９に対応するイントロンは、配列番号７８のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、イントロン１１に対応するイントロンは、配列番号８０のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、１０、および１１に対応するイントロンを含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１に対応する少なくとも１つのイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応するイントロンを欠如する。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～８および１１に対応するイントロンを欠如する。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～９および１１に対応するイントロンを欠如する。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、４００塩基対（ｂｐ）未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する調節エレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３０～５８のいずれか１つ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである。ある特定の実施形態では、調節エレメントは配列番号３３である。ある特定の実施形態では、調節エレメントはＣＢＡである。ある特定の実施形態では、調節エレメントはｍｉｎＣＭＶである。ある特定の実施形態では、調節エレメントは細胞型選択的である。ある特定の実施形態では、調節エレメントは心筋細胞において選択的に発現される。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つの配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくともイントロン８またはイントロン１１を含む核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、イントロン８は、配列番号７７のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、イントロン１１は、配列番号８０のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン１０は、配列番号７９のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン９は、配列番号７８のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８および１１を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、１０、および１１を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７を欠如する。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９をさらに含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０をさらに含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１を含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７を欠如する。一部の実施形態では、調節エレメントは、５００塩基対未満またはそれに等しい塩基対を有する。一部の実施形態では、調節エレメントは、９００塩基対未満またはそれに等しい塩基対を有する。一部の実施形態では、調節エレメントは、８００塩基対（ｂｐ）未満もしくはそれに等しい、７００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、６００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、５００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する。一部の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３０～５８のいずれか１つ、配列番号１０２、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、ＭＬＣ－２、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントは配列番号３３である。一部の実施形態では、調節エレメントはＣＢＡである。一部の実施形態では、調節エレメントはｍｉｎＣＭＶである。一部の実施形態では、調節エレメントは細胞型選択的である。一部の実施形態では、調節エレメントは心筋細胞において選択的に発現される。一部の実施形態では、調節エレメントは、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、またはＭＬＣ－２のいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントはｃＴＮＴである。一部の実施形態では、ｃＴＮＴ調節エレメントは配列番号１０１を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３もしくは配列番号８の配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列はポリアデニル化シグナルをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；ならびに（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８およびイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０の１つまたは複数をさらにコードする。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８の配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１２～１９または２１のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応するヌクレオチド配列を含まない。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、９００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、９００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、８００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、６００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、５００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３０～５８のいずれか１つ、配列番号１０２、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、ＭＬＣ－２、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される核酸構築物のいずれかを含むウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）ラミンＡポリペプチド、（ｂ）ラミンＣポリペプチド、または（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、もしくは（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＬＭＮＡ遺伝子の少なくとも１つの非コード領域を含む。ある特定の実施形態では、非コード領域はイントロンである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書に提供される核酸構築物であって、ヌクレオチド配列が野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、および１１の１つまたは複数をさらにコードする核酸構築物を含む。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；ならびに（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つの配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、および（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、および（ｂ）配列番号１３のアミノ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１または２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応するヌクレオチド配列を含まないヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、調節エレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する調節エレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３０～５８のいずれか１つ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３３である調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＢＡである調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ｍｉｎＣＭＶである調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型選択的である調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ニューロン細胞、網膜細胞、腎細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、または心筋細胞において選択的に発現される調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、心筋細胞において選択的に発現される調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ポリアデニル化シグナルをさらに含むヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ６、またはｓｃＡＡＶ９である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含むヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくともイントロン８またはイントロン１１を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；ならびに（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８およびイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０の１つまたは複数をさらにコードする。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２；および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号８の配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１２～１９、または２１のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応するヌクレオチド配列を含まない。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、５００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、９００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、８００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、６００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、５００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３０～５８のいずれか１つ、配列番号１０２、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、ＭＬＣ－２、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントは、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントは配列番号３３である。一部の実施形態では、調節エレメントはＣＢＡである。一部の実施形態では、調節エレメントはｍｉｎＣＭＶである。一部の実施形態では、調節エレメントは細胞型選択的である。一部の実施形態では、調節エレメントは、ニューロン細胞、網膜細胞、腎細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、または心筋細胞において選択的に発現される。一部の実施形態では、調節エレメントは心筋細胞において選択的に発現される。一部の実施形態では、調節エレメントは、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、またはＭＬＣ－２のいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、調節エレメントはｃＴＮＴである。一部の実施形態では、ｃＴＮＴ調節エレメントは配列番号１０１を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ２、ｓｃＡＡＶ５、ｓｃＡＡＶ６、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は本明細書に提供されるウイルスベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶのカプシドタンパク質はＡＡＶ６またはＡＡＶ９である。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、またはウイルス粒子のいずれかを含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞のいずれか、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象におけるラミノパシーを処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象において（ａ）ラミンＡポリペプチド、（ｂ）ラミンＣポリペプチド、または（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、もしくは（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの生物活性バリアントおよび／もしくは断片を発現させる方法であって、前記対象に、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象において（ａ）機能的ラミンＡポリペプチド、（ｂ）機能的ラミンＣポリペプチド、または（ｃ）機能的ラミンＡポリペプチドおよび機能的ラミンＣポリペプチド、もしくは（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの生物活性バリアントおよび／もしくは断片の発現を増加させる方法であって、前記対象に、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法のいずれかに従って処置される対象は、ラミノパシーに罹患している。ある特定の実施形態では、ラミノパシーは、シャルコー・マリー・ツース病、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、肢帯型筋ジストロフィー、ＬＭＮＡ関連先天性筋ジストロフィー、下顎骨異形成、不整脈原性右室心筋症、家族性心房細動、左室緻密化障害（left ventricular noncompaction）、または拡張型心筋症のうちのいずれか１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、ラミノパシーは拡張型心筋症である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかは、心筋内、静脈内、筋肉内、髄腔内、皮下、全身、または心筋に局所投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかは、静脈内または全身投与される。
本発明の新規特徴は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られる。
図１は、ラミンＡの発現のための完全なウイルスベクターゲノム構築物のベクターマップを示す。ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、配列番号３１を有するエンハンサー、ラミンＡのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ挿入物、およびポリアデニル化配列シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
図２は、ラミンＣの発現のための完全なウイルスベクターゲノム構築物のベクターマップを示す。ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、配列番号３１を有するエンハンサー、ラミンＣのエクソン１～１０を含むラミンアイソフォームＣ挿入物、およびポリアデニル化配列シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
図３は、ラミンＡおよびラミンＣの発現のための完全なウイルスベクターゲノム構築物（ミニ遺伝子１）のベクターマップを示す。ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、配列番号３１を有するエンハンサー、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン８～１１、およびポリアデニル化配列シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
図４は、ラミンＡおよびラミンＣの発現のための完全なウイルスベクターゲノム構築物（ミニ遺伝子２）のベクターマップを示す。ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、配列番号３１を有するエンハンサー、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン９および１０、ならびにポリアデニル化配列シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
図５は、ラミンＡおよびラミンＣの発現のための完全なウイルスベクターゲノム構築物（ミニ遺伝子３）のベクターマップを例示する。ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、配列番号３１を有するエンハンサー、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン１０、およびポリアデニル化配列シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
図６は、ラミンＡおよびラミンＣアイソフォームが両方とも、ＨＥＫ２９３細胞中でＬＭＮＡミニ遺伝子構築物１から産生されることを示すウェスタンブロットである。
図７は、ＬＭＮＡミニ遺伝子構築物が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（左）とｉＰＳ心筋細胞（右）の両方における、ラミンＡとラミンＣとの両方を発現することができることを実証する、ｍＲＮＡ発現レベルのグラフである。
図８は、ラミンＡおよびラミンＣアイソフォームが両方とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（２９３Ｔ細胞）で、ならびに心臓および肝臓組織中、ｉｎ ｖｉｖｏでミニ遺伝子構築物１から産生されることを示すウェスタンブロットである（下パネルは、２４週齢の野生型およびヘテロ接合型Ｌｍｎａ＋／－オスマウスモデル動物に由来する心臓組織である）。
図９は、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶウイルスを投与した場合のＬＭＮＡ－／－ＫＯマウスにおける疾患表現型のレスキューを示すグラフである。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＲＮＡｓｅｑによって測定した場合のミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９で処置したマウスにおけるラミンＡおよびラミンＣアイソフォームのｉｎ ｖｉｖｏでの発現を示す。図１０Ａは、遍在性プロモーターの制御下での心臓および肝臓におけるラミンＡおよびラミンＣの発現を示す。図１０Ｂは、心臓特異的プロモーター（ｃＴＮＴ）の制御下での心臓および肝臓におけるラミンＡおよびラミンＣの発現を示す。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＲＮＡｓｅｑによって測定した場合のミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９で処置したマウスにおけるラミンＡおよびラミンＣアイソフォームのｉｎ ｖｉｖｏでの発現を示す。図１０Ａは、遍在性プロモーターの制御下での心臓および肝臓におけるラミンＡおよびラミンＣの発現を示す。図１０Ｂは、心臓特異的プロモーター（ｃＴＮＴ）の制御下での心臓および肝臓におけるラミンＡおよびラミンＣの発現を示す。
図１１Ａ～１１Ｃは、ニワトリベータアクチンプロモーターをそれぞれ組み込むいくつかの異なる構築物の単純化された概略図である。図１１Ａにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン８～１１、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｂにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン９および１０、ならびにポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｃにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン１０、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。 図１１Ａ～１１Ｃは、ニワトリベータアクチンプロモーターをそれぞれ組み込むいくつかの異なる構築物の単純化された概略図である。図１１Ａにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン８～１１、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｂにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン９および１０、ならびにポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｃにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン１０、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。 図１１Ａ～１１Ｃは、ニワトリベータアクチンプロモーターをそれぞれ組み込むいくつかの異なる構築物の単純化された概略図である。図１１Ａにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン８～１１、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｂにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン９および１０、ならびにポリアデニル化配列シグナルを含む。図１１Ｃにおいて、構築物は、ＣＢＡプロモーター、ラミンＡ／Ｃのエクソン１～１２を含むラミンアイソフォームＡ／Ｃ挿入物、ラミンＡ／Ｃのイントロン１０、およびポリアデニル化配列シグナルを含む。
図１２は、ＨＥＫ２９３細胞中での、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするＬＭＮＡミニ遺伝子構築物中のラミンＡおよびラミンＣアイソフォームの発現を示すウェスタンブロットである。
図１３は、ＣＭＶプロモーター下のラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするＬＭＮＡミニ遺伝子構築物が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でラミンＡおよび／またはラミンＣを発現することができることを実証するｍＲＮＡ発現レベルのグラフである。特に、ラミンＡおよびラミンＣをコードするＬＭＮＡミニ遺伝子が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でラミンＡとラミンＣとの両方を発現した。
ラミンＡおよびラミンＣは、繊維状核ラミナの構成的構成成分であり、核エンベロープの内膜とＤＮＡの間に位置する複雑な分子界面である。ラミンＡおよびラミンＣは、力学的な核膜の維持から遺伝子調節に至るまで多様な生理的役割を有する。ＬＭＮＡ遺伝子は、正常な選択的スプライシングの結果として、少なくとも３つのアイソフォーム（ラミンＡ、ラミンＣ、およびラミンＡΔ１０）をコードする。ＬＭＮＡは、１２個のエクソンを含有し、エクソン１０の選択的スプライシングによってラミンＣおよびプレラミンＡ（成熟ラミンＡの前駆体）の転写物を生じる。いずれのアイソフォームも、最初の５６６アミノ酸（エクソン１～１０によってコードされる）が同一であるが、そのカルボキシル末端配列は異なる。プレラミンＡは、Ｃ末端で余分の固有の９８アミノ酸（エクソン１１～１２によってコードされる）を含有するが、ラミンＣはエクソン１０配列で終止し、６つの固有のＣ末端アミノ酸を有する。プレラミンＡは、プロセシングされてラミンＡを形成し、これは６４６アミノ酸長のタンパク質である。一方、ラミンＣは５７２アミノ酸で構成される。
ヒトにおけるＬＭＮＡの変異は、心筋症、筋ジストロフィー、および早老症様症候群を含む多様な疾患をもたらす。５００個を超える病因性変異が同定されており、その一部は拡張型心筋症などの疾患をもたらす。拡張型心筋症は、左室または両室の拡張および収縮障害ならびに収縮機能障害によって特徴付けられる。拡張型心筋症の発生率は、２５００人に１人から２５０人に１人の範囲である。まれな疾患であるが、拡張型心筋症は重篤な健康負荷を表し、しばしば疾患のいずれかの段階で不整脈、血栓塞栓症および突然死をもたらす。２０１４年現在、１６５個の拡張型心筋症関連変異が、ＬＭＮＡ遺伝子において同定されている（Tesson F. Cardiol J. 2014;21(4):331-42）。これらの変異は、ミスセンス／ナンセンス変異、スプライシング変異、小さい欠失、小さい挿入、小さいインデル、大きい欠失、または大きい挿入を含んだ。拡張型心筋症をもたらすＬＭＮＡ変異の大部分は、遺伝子全体を通して見出される常染色体優性ミスセンス変異であり、変異したラミンＡ／Ｃタンパク質を生成する。
本開示は、拡張型心筋症および他のラミノパシーを処置する、防止する、または阻害するための組成物および方法を企図する。一態様では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；または前述のいずれかのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を提供する。一態様では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；または前述のいずれかのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、および／またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せに作動可能に連結された、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、および／またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せに作動可能に連結された、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断；またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の実施形態では、本開示は、対象におけるラミノパシーを処置する方法であって、本明細書に開示される核酸、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物のいずれかの１つまたは複数を投与することを含む方法を提供する。
広く多様なラミノパシーが、本明細書に提供される核酸、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、医薬組成物、および方法を使用して処置または防止され得る。本開示の核酸、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、医薬組成物、および方法を使用して処置または防止され得るラミノパシーとしては、シャルコー・マリー・ツース病、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、肢帯型筋ジストロフィー、ＬＭＮＡ関連先天性筋ジストロフィー、下顎骨異形成、不整脈原性右室心筋症、家族性心房細動、左室緻密化障害、または拡張型心筋症が挙げられるがこれらに限定されない。
Ａ．全般的技術
本明細書において特に定義していない限り、本明細書において列挙した科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。一般的に、本明細書に記載される薬理学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがんの生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用される命名法である。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
本開示の実践は、特に示していない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常の技術を使用する。そのような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)などの文献に詳しく説明されている。
酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように製造業者の指示に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される命名法ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術を、化学合成および化学分析のために使用する。
Ｂ．定義
本明細書および実施形態を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載の整数または整数の群を含むが、他の任意の整数または整数の群を除外しないことを意味すると理解される。
実施形態が本明細書において「含む」という言語と共に記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される類似の実施形態も同様に提供されると理解される。
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味するために使用される。「含む」および「含むがこれらに限定されない」は、互換的に使用される。
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば」の後に続くいかなる例（複数可）も、網羅的または制限的であることを意味しない。
文脈によって特に必要とされない限り、単数の用語は複数の用語を含み、複数の用語は単数を含む。
例として、「１つのエレメント」は１つのエレメントまたは１つより多くのエレメントを意味する。
本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメーターは概算であるが、特定の例で記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、そのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差に必然的に起因するある特定の誤差を本質的に含有する。その上、本明細書に開示される範囲は全て、それらの範囲において小計されるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解される。例えば、「１から１０」という記載の範囲は、最小値１と最大値１０の間の（およびそれらを含む）ありとあらゆる部分範囲を含むと考えるべきであり、すなわち、最小値１またはそれより多くから始まり、例えば１～６．１、最大値１０またはそれ未満で終わる、例えば５．５～１０の全ての部分範囲を含むと考えるべきである。
本開示の態様または実施形態は、マーカッシュ群または他の代替の群に関して記載されているが、本開示は、全体として記載される群全体、個々の群の各メンバーおよび主群の全ての可能な亜群を包含するのみならず、群のメンバーの１つまたは複数が存在しない主群を包含する。本開示はまた、本開示における群のメンバーのいずれかの１つまたは複数の明白な除外も想像する。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈がそれ以外であることを明白に示していない限り、複数形も同様に含むと意図される。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「と共に（ｗｉｔｈ）」またはその変化形は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかに使用されている程度に、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と類似の様式で含まれると意図される。
特に示していなければ、用語「ラミンＡ」は、プレラミンＡポリペプチドおよび／または成熟ラミンＡポリペプチドを指すために本明細書において使用される。用語は、プレラミンＡの翻訳後修飾（例えば、プレラミンＡのカルボキシル末端からの１８アミノ酸が除去されて成熟ラミンＡを形成する）の結果として形成された全てのラミンＡポリペプチドを含む。用語は、全ての生物活性ラミンＡタンパク質、その断片またはバリアントを含む。
用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの省略語であり、ウイルスそのものまたはその誘導体を指すために使用され得る。用語は、それ以外であることを必要としている場合を除き、全ての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する型および組換え型の両方を含む。省略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然の末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースにおいて見出され得る。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的に細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般的に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている。ＩＴＲ配列は、当技術分野で十分理解されている用語であり、反対方向であるウイルスゲノムの末端で見出される比較的短い配列を指す。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド化されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、これは典型的には、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、または単純に「ｒＡＡＶ粒子」と呼ばれる。
用語「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されたか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する、当業者によって決定された特定の値に関して許容可能な誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における実践に従って１または１より大きい標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の上下最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。
用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、「評定する」、「アッセイする」、「分析する」、およびその文法的均等物は、本明細書において任意の形態の測定を指すために互換的に使用され、エレメントが存在するか否かを決定すること（例えば、検出）を含み得る。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含み得る。評定することは相対的または絶対的であり得る。
「発現カセット」は、発現のためにコード配列（例えば、遺伝子または複数の遺伝子）に作動可能に連結された１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸分子（nucleic molecule）を指す。
用語「有効量」または「治療有効量」は、以下に定義されるように疾患の処置を含むがこれらに限定されない意図される適用に影響を及ぼすために十分である本明細書に記載の組成物のその量を指す。治療有効量は、意図される処置適用（細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで）または処置される対象および疾患状態、例えば対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式等に応じて多様であり得、これらは当業者が容易に決定することができる。用語はまた、標的細胞において特定の応答を誘導する用量にも当てはまる。特定の用量は、選択される特定の組成物、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与の時期、投与される組織、およびそれが運ばれる物理的送達系に応じて多様である。
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」は、全長または参照のＤＮＡまたはタンパク質配列より短い配列の断片を指す。
用語「生物活性」は、本明細書でタンパク質、ポリペプチド、核酸、および／またはポリヌクレオチドなどの分子を参照する場合に使用する場合、分子が、全長または参照のタンパク質、ポリペプチド、核酸、および／またはポリヌクレオチドの生物活性と実質的に類似である少なくとも１つの生物活性（機能的または構造的のいずれか）を保持することを意味する。例えば、「生物活性」ラミンＡまたはラミンＣタンパク質、またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、全長または参照の野生型ラミンＡまたはラミンＣタンパク質と実質的に類似である少なくとも１つの活性を保持する。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性の核酸が導入されている細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これは初代形質転換細胞および継代回数によらないそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。
用語「ヒト由来」は、本明細書で使用される場合、ヒトゲノム（またはヒトゲノム構造）に見出される配列、またはそれと相同な配列を指す。相同な配列は、ヒトゲノムの領域と比較して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、ＢＬＡＳＴによって測定した場合）を有する領域を有する配列であり得る。例えば、ヒト配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列は、ヒト由来であると見なされる。一部の例では、調節エレメントは、調節エレメント全体がヒトゲノムと低い配列同一性を有するが、調節エレメントの一部がヒトゲノムにおける配列と１００％の配列同一性（または局所配列同一性）を有するように、ヒト由来配列および非ヒト由来配列を含有する。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、対象の体外で起こる事象を指す。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、対象の体外での任意のアッセイの実行を包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、生存細胞または死細胞を使用する細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはまた、無傷の細胞を使用しない無細胞アッセイも包含する。
用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、対象の体に起こる事象を指す。
「単離された」核酸は、その天然の環境の構成成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は、その天然の染色体位置とは異なる染色体位置で染色体外に存在するか、またはコード配列のみを含有する。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」、「作動可能な連結」、「作用的に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」またはその文法的同等物は、遺伝子エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列等の並置を指し、エレメントはそれらが予想される様式で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、調節エレメントがコード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域と作用的に連結している。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域の間に残基が介在してもよい。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤または組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が挙げられるがこれらに限定されない。
用語「医薬製剤」または「医薬組成物」は、その中に含有される活性成分の生物活性が有効となることを可能にする形態であり、製剤が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
用語「調節エレメント」は、遺伝子などの作動可能に連結された配列の発現に影響を及ぼす（例えば、増加させる、減少させる、またはモジュレートする）ことが可能な核酸配列または遺伝子エレメントを指す。調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター配列、イントロン、ＵＴＲ、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、安定性エレメント、翻訳後応答エレメント、またはポリＡ配列、またはその組合せが挙げられるがこれらに限定されない。調節エレメントは、例えば遺伝子発現を遺伝子発現の転写相、転写後相、もしくは翻訳相でモジュレートすることによって；翻訳レベル（例えば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化させる安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、および／もしくは転写の終止をモジュレートすることによって；転写因子を、遺伝子発現を増加させるコード領域に動員することによって；ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されるＲＮＡの安定性を増加させる、および／もしくはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成速度を増加させることによって；ならびに／またはＲＮＡ分解を防止する、および／もしくはタンパク質合成を容易にするためにその安定性を増加させることによって、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡレベルで機能し得る。一部の実施形態では、調節エレメントは、エンハンサー、リプレッサー、プロモーター、またはその組合せを指し、特にエンハンサープラスプロモーターの組合せ、またはリプレッサープラスプロモーターの組合せを指す。一部の実施形態では、調節エレメントはヒト配列に由来する。
用語「対象」および「個体」は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療薬、獣医学応用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床試験において有用であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」等は、疾患または障害を軽減する、その進行を遅延させるまたは遅らせる、その効果または症状を低減する、その発症を防止する、その再発を防止する、阻害する、その発症を改善する、疾患、障害、または医学的状態に関して有益なまたは望ましい結果、例えば治療利益および／または予防利益を得ることが挙げられるがこれらに限定されない、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。本明細書で使用される場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、（ａ）疾患の素因を有し得るまたは病気にかかるリスクにあり得るがまだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患が起こるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発生を停止させること；および（ｃ）疾患を軽減する、すなわち疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療利益は、処置される基礎となる障害の根絶または改善を含む。同様に、治療利益は、対象が基礎となる障害になおも罹患し得るにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、基礎となる障害に関連する生理的症状の１つまたは複数の根絶または改善によって達成される。一部の例では、予防的利益に関して、組成物は、特定の疾患を発症するリスクがある対象に、またはたとえこの疾患の診断がなされていない場合であっても疾患の生理的症状の１つもしくは複数を報告する対象に投与される。本開示の方法は、任意の哺乳動物について使用され得る。一部の例では、処置は、症状の減少または休止をもたらし得る。予防効果は、疾患または状態の出現を遅延または除去すること、疾患または状態の症状の発症を遅延または除去すること、疾患または状態の進行を遅らせること、停止させること、もしくは逆転すること、またはその任意の組合せを含む。
ヌクレオチド配列の「バリアント」は、最も一般的な野生型ＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡまたはそのＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって参照される配列）または特定の参照配列と比較して遺伝子変化または変異を有する配列を指す。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、連結される別の核酸分子の、それが複製または発現され得る細胞内への送達を媒介するために使用することができる核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクターならびにそれが導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それが作用的に連結している核酸の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターの他の例は、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。
一般的に、「配列同一性」または「配列相同性」は、互換的に使用することができ、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つまたはそれより多くの配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、「パーセント相同性」とも呼ばれるその「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。参照配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）に対するパーセント同一性は、２つの最適に整列させた配列間の正確なマッチ数を参照配列の長さで除算し、１００を乗算したものとして計算され得る。保存的置換は、配列同一性のマッチ数を決定する場合、マッチと見なされない。第１の配列（Ａ）の長さが第２の配列（Ｂ）の長さと等しくない場合、Ａ：Ｂの配列のパーセント同一性は、Ｂ：Ａの配列のパーセント同一性とは異なることが認識される。パーセント同一性を評定する目的のためなどの配列アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ワールドワイドウェブｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ワールドワイドウェブｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアライメントツールを参照されたい）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ワールドワイドウェブｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／で入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照されたい）、およびＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａアライメントプログラム（例えば、ワールドワイドウェブｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ／およびF. Sievers et al., Mol Sys Biol. 7: 539 (2011)を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない任意の適したアライメントアルゴリズムまたはプログラムによって実施され得る。最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを含む選択したアルゴリズムの任意の適したパラメーターを使用して評定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)のアライメント方法に基づき、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)；およびAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)において考察されている。
特に明記していなければ、本明細書で使用される全ての用語は、それらが当業者に対して有する意味と同じ意味を有し、本発明の実践は、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術の通常の技術を使用し、それらは当技術分野の知識範囲内である。
Ｃ．核酸構築物
１．ラミン構築物
本明細書において、ラミンＡ、ラミンＣ、ラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントまたは断片）、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、ラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、ラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）の両方またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、核酸構築物は、調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、導入遺伝子は（ａ）ラミンＡ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）；（ｂ）ラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）の両方、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＡ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）またはコドン最適化バリアントおよび／もしく断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）の両方またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の例では、核酸構築物は、標的細胞（例えば、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（myocardiocyte）、これらの用語は本明細書において互換的に使用される）における導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で調節構成成分に作用的に連結している核酸コード配列を含む。導入遺伝子（異種核酸配列）は、任意の生物に由来し得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子はヒトに由来する。ある特定の実施形態では、導入遺伝子はラミンＡ（またはその生物活性バリアントまたは断片）の成熟型をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、プレラミンＡ（またはその生物活性バリアントまたは断片）をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＣ（またはその生物活性バリアントまたは断片）をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）の両方をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、プレラミンＡおよびラミンＣ（またはその生物活性バリアントもしくは断片）の両方をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は１つより多くのＬＭＮＡスプライスバリアント（例えば、ラミンＡおよびラミンＣの両方）またはＬＭＮＡスプライスバリアント以上に由来する断片（or fragments derived from more than LMNA splice variant）を含む。これは、２つもしくはそれより多くの異種配列を保有する単一の核酸構築物を使用して、または２つもしくはそれより多くのＬＭＮＡスプライスバリアント（例えば、ラミンＡおよびラミンＣ）をコードする単一の配列を保有する単一の核酸構築物を使用して達成され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、１つのみのＬＭＮＡスプライスバリアント（例えば、ラミンＡまたはラミンＣ）、または１つのＬＭＮＡスプライスバリアントに由来する断片を含む。各々が少なくとも１つのＬＭＮＡスプライスバリアントをコードする１つまたは複数の異種配列を保有する２つまたはそれより多くの核酸構築物を個別にまたは共に（例えば、同じまたは異なるウイルスベクター（複数可）中で）使用してもよいことが企図される。一部の実施形態では、ＬＭＮＡ遺伝子、スプライスバリアントまたはその断片に加えて、核酸構築物はまた、追加のタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、または触媒ＲＮＡもコードし得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物のいずれかは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）および野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）ならびに野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０（例えば、配列番号７８および７９）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）および野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つの核酸配列、ならびに前述のいずれかおよび前述のいずれかの断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つの配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つ、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～１０のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号１０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つの核酸配列、および／または前述のいずれかもしくは前述のいずれかの断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つの配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号３～５のいずれか１つまたはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチド、ならびに前述のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つのポリペプチドまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも６５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも７５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも８２％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも８７％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９１％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９２％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９３％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９４％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９６％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９７％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９８％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと少なくとも９９％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つと１００％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号２１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡまたはその生物活性断片をコードし、また、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号２１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡまたはその生物活性断片をコードし、また、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２および／または１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡおよびラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号２１および／または１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡおよびラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するラミンＡをコードし、また、配列番号１３のアミノ酸配列を有するラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するラミンＡをコードし、また、配列番号１３のアミノ酸配列を有するラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子からの１個もしくはそれより多く、２個もしくはそれより多く、３個もしくはそれより多く、４個もしくはそれより多く、５個もしくはそれより多く、６個もしくはそれより多く、７個もしくはそれより多く、８個もしくはそれより多く、９個もしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個もしくはそれより多くのイントロンを含まない。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応するヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～８および１１（例えば、配列番号７０～７７および８０）に対応するヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～９および１１（例えば、配列番号７０～７８および８０）に対応するヌクレオチド配列を含まない。
一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、１個もしくはそれより多く、２個もしくはそれより多く、３個もしくはそれより多く、４個もしくはそれより多く、５個もしくはそれより多く、６個もしくはそれより多く、７個もしくはそれより多く、８個もしくはそれより多く、９個もしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個もしくはそれより多くのイントロン（例えば、配列番号７０～８０）を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子、例えば野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子からのイントロンに対応する。他の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは合成イントロンである。特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、ヌクレオチド配列がラミンＡおよびラミンＣの両方をスプライス依存的にコードすることが可能であるように核酸構築物に配置される。特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする成熟ｍＲＭＡを産生するように核酸構築物に配置される。特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡより多くのラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡを産生するように核酸構築物に配置される。特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡより多くのラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡを産生するように核酸構築物に配置される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡおよびラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡのほぼ同じレベルを産生するように核酸構築物に配置される。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の内因性のイントロンの全てではないが少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応する少なくとも１つのイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、ヒト野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するイントロンを含み、ヒト野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～８および１１（例えば、配列番号７０～７７および８０）に対応する全てのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～９および１１（例えば、配列番号７０～７８および８０）に対応する全てのイントロンを欠如する。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８に対応するイントロンは、配列番号７７またはその断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９に対応するイントロンは、配列番号７８またはその断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０に対応するイントロンは、配列番号７９またはその断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１に対応するイントロンは、配列番号８０またはその断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８を含む。一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９を含む。一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０を含む。一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１を含む。一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０を含む。一部の例では、核酸構築物は、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、１０、および１１を含む。
ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つまたは複数の核酸配列、および前述のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数の配列であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。
一部の実施形態では、本開示の導入遺伝子は、これらの配列のバリアントを含み、そのようなバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失、および／または付加を含み得る。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号３に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号４に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号５に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号６に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号７に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号８に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号９に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１０に記載の特定の核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号６と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号７と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号３と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号４と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号５と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号８と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号９と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。一部の実施形態では、バリアントは、配列番号１２、１３、または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号１０と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。
当業者は、核酸と相補的な核酸配列および核酸のバリアントもまた、本開示の範囲内であることを認識する。核酸配列は一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノムまたは合成）、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子を含む。追加のコード配列または非コード配列が、本開示の核酸配列内に存在してもよいが存在する必要はなく、核酸配列は他の分子および／または支持材料に連結されてもよいが連結される必要はない。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離された、組換え体であり得、および／または異種ヌクレオチド配列に融合され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される任意のヌクレオチド（例えば、配列番号１～１０またはそのバリアントもしくは断片）がコドン最適化される（例えば、ヒトでの発現に関してコドン最適化されている）。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型ポリペプチド（例えば、配列番号１２、１３、または２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を有する生物活性ラミンＡおよび／またはラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型ポリペプチド（例えば、配列番号１２、１３、または２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）と比較して１、２、３、４、または５個のアミノ酸欠失を有する生物活性ラミンＡおよび／またはラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型ポリペプチド（例えば、配列番号１２、１３、または２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）と比較して１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を有する生物活性ラミンＡおよび／またはラミンＣポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、野生型ポリペプチド（例えば、配列番号１２、１３、または２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド）と比較して１、２、３、４、または５個のアミノ酸挿入を有する生物活性ラミンＡおよび／またはラミンＣポリペプチドをコードする。
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは当業者によって認識される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差により多様であるポリヌクレオチドが本開示によって具体的に企図される（すなわち、コドン最適化）。例えば、いくつかのアミノ酸は１つより多くのトリプレットによって指定される。同じアミノ酸または同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンの同義語である）を指定するコドンは、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異をもたらし得る。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３～５％）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子バリエーションにより所定の種のメンバーに存在し得ることを認識する。ありとあらゆるそのようなヌクレオチドのバリエーションおよび得られたアミノ酸多型が、本開示の範囲内である。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内である。対立遺伝子は、１つまたは複数の変異、例えばヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換の結果として変更されている内因性の遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を使用して同定され得る。
本開示の核酸／ポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成方法は当技術分野で周知であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して、所望のＤＮＡ配列を産生することができる。他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号１～１０（またはそのバリアントもしくは断片）のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列またはそれと相補的な配列のいずれかと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が多様であり得ることを容易に理解する。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でのハイブリダイゼーションの後に２．０×ＳＳＣ、５０℃での洗浄を実施することができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃での低ストリンジェンシーから約０．２×ＳＳＣ、５０℃での高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度は室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩はいずれも多様であり得るか、または他の変数を変化させて温度もしくは塩濃度を一定に保持してもよい。一実施形態では、本開示は、６×ＳＳＣ、室温の後に２×ＳＳＣ、室温での洗浄を行う低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。
本明細書で提供される場合、本明細書に開示されるＬＭＮＡ導入遺伝子またはその断片（例えば、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする遺伝子）のいずれかを使用して、ＬＭＮＡの正常なバリアント遺伝子産物が正常レベル未満で発現される欠損、または機能的バリアントが発現されない欠損を含み得る遺伝子欠損を修正または改善してもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子配列は、単一のＬＭＮＡアイソフォームまたはその生物活性断片をコードする。本開示は、複数の導入遺伝子、例えば２つまたはそれより多くのＬＭＮＡアイソフォームまたはその生物活性断片をコードする２つまたはそれより多くの導入遺伝子を使用することをさらに含む。特定の実施形態では、異なるＬＭＮＡアイソフォーム（例えば、ラミンＡおよび／またはラミンＣまたはその生物活性断片またはバリアント）が、単一のヌクレオチド配列の選択的スプライシングを利用することによって同じ導入遺伝子によってコードされ得る。ある特定の状況では、異なる導入遺伝子を使用して異なるＬＭＮＡアイソフォームまたはその生物活性断片（例えば、ラミンＡおよび／またはラミンＣまたはその生物活性断片またはバリアント）をコードしてもよい。あるいは、複数の異なるＬＭＮＡアイソフォーム（例えば、ラミンＡおよび／またはラミンＣまたはその生物活性断片またはバリアント）が、同じ導入遺伝子によってコードされ得る。一部の実施形態では、単一の導入遺伝子は、複数のＬＭＮＡアイソフォーム（例えば、ラミンＡおよびラミンＣ、またはその生物活性断片またはバリアント）をコードするＤＮＡを、１つまたは複数の内部リボソーム侵入部位（internal ribozyme entry site）（ＩＲＥＳ）または自己切断２Ａペプチドによって隔てられた各タンパク質またはその機能的断片のＤＮＡと共に含む。一部の実施形態では、これはサブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合に望ましく、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの総サイズは、５キロベース未満である。ＩＲＥＳに対する代替として、ＤＮＡを、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする１つまたは複数の配列によって隔ててもよい。例えば、MX. Donnelly, et al, J. Gen. Virol, 78(Pt 1): 13-21 (Jan 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (June 2001); Klump H., et al, Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001)を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳより有意に小さく、スペースが制限要因である場合での使用に特に好適となる。一部の実施形態では、１つまたは複数の自己切断２ＡペプチドはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａからなる群から選択される。
２．調節エレメント
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣ構築物は、ラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に加えて１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸構築物の一部である。例示的な実施形態では、本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣ構築物は、細胞におけるラミンＡおよび／またはラミンＣ配列の発現を駆動することが可能となるように、ラミンＡおよび／またはラミンＣ構築物の上流に位置するプロモーターを含む核酸構築物の一部である。
一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、配列番号３０～６９または１００～１０２（以下の表３および４に示すように）のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むプロモーターを含む。一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～５（以下の表１に示すように）のいずれか１つを含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列またはその機能的断片に作動可能に連結された、配列番号３０～６９または１００～１０２（以下の表３および４に示すように）のいずれか１つを有するプロモーターを含む。一実施形態では、核酸構築物は、配列番号１０２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むプロモーターを含む。一実施形態では、核酸構築物は、配列番号１０２の配列を有するプロモーターを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～５（以下の表１に示すように）のいずれか１つを含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列またはその機能的断片に作動可能に連結された、配列番号３０～６９または１００～１０２（以下の表３および４に示すように）のいずれか１つの２つまたはそれより多く（例えば、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または２、３、４、もしくは５個）の組合せを有する調節エレメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～５（以下の表１に示すように）のいずれか１つを含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列またはその機能的断片に作動可能に連結された配列番号３０～６９または１００～１０２（以下の表３および４に示すように）のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、哺乳動物細胞において、同じ型の哺乳動物細胞におけるＣＭＶプロモーターからの同じラミンＡおよび／またはラミンＣ配列の発現レベルと比較して、ラミンＡおよび／またはラミンＣ配列の少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、もしくは７５倍、または少なくとも２０～９０倍、２０～８０倍、２０～７０倍、２０～６０倍、３０～９０倍、３０～８０倍、３０～７０倍、３０～６０倍、４０～９０倍、４０～８０倍、４０～７０倍、４０～６０倍、５０～９０倍、５０～８０倍、５０～７０倍、５０～６０倍、６０～９０倍、６０～８０倍、６０～７０倍、７０～９０倍、７０～８０倍、８０～９０倍高い発現を生じる。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、心筋細胞の高いパーセンテージにおいてラミンＡおよび／またはラミンＣ配列の発現を駆動し、例えば核酸構築物を含有する心筋細胞の少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくはそれより多く、または少なくとも２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、８０～１００％、８０～９５％、８０～９０％、９０～１００％、もしくは９０～９５％がラミンＡおよび／またはラミンＣ構築物を発現する。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、肝細胞の高いパーセンテージにおいてラミンＡおよび／またはラミンＣ配列の発現を駆動し、例えば、核酸構築物を含有する肝細胞の少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくはそれより多く、または少なくとも２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、８０～１００％、８０～９５％、８０～９０％、９０～１００％、もしくは９０～９５％がラミンＡおよび／またはラミンＣ構築物を発現する。
一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３０～６９または１００～１０２のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３３を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号４４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３５を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号３、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号４４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号４４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号４４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号３、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３５を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３５を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３５を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＡプロモーターの上流で使用されるＣＭＶエンハンサー（例えば、配列番号６１）、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）プロモーター、ＳｅｒｐＥ＿ＴＴＲプロモーター（例えば、配列番号６３）、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター（例えば、配列番号６４）、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーター、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎハイブリッド肝特異的プロモーター（ＵＣＬ－ＨＬＰ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＭＶ初期エンハンサー／ＣＢＡ（ＣＡＧ）プロモーター、Ｍｙｈ６プロモーター、デスミンプロモーター、心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、アルファミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）プロモーター、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）プロモーター、配列番号１０２、およびＥＦ１αショート（ＥＦＳ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含み、これらは（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）前述のいずれかの機能的断片を含むラミンＡおよび／またはラミンＣ配列に作動可能に連結された配列番号３０～５８または１００～１０２のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、野生型ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質配列（例えば、配列番号１２、１３、および／または２１）と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする配列である。ある特定の実施形態では、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含み得、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣ配列は、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有する全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質の機能的断片をコードするように切断されているラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列を含む。例示的な切断されたラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含み得、そのようなラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列はラミンＡおよび／またはラミンＣの機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸構築物は、ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質の機能的断片をコードするように切断されているバリアントラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列を含む。例示的な切断されたラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含み得（may a sequence）、そのような切断されたバリアントラミンＡおよび／またはラミンＣヌクレオチド配列は、ラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質の機能的断片をコードする。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物は、プロモーターに加えて別の調節エレメント、例えば転写の開始または終止に関連する配列、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルなどを含む。例示的な調節エレメントとしては、例えばイントロン、エンハンサー、ＵＴＲ、安定性エレメント、ＷＰＲＥ配列、コザックコンセンサス配列、翻訳後応答エレメント、またはポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列、またはその組合せが挙げられる。調節エレメントは、遺伝子発現の転写相、転写後相、または翻訳相で遺伝子発現をモジュレートするように機能することができる。ＲＮＡレベルでは、調節は、翻訳（例えば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、および／または転写終止のレベルで起こり得る。様々な実施形態では、調節エレメントは、目的の細胞型における遺伝子発現の選択性を増加させる、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されるＲＮＡの安定性を増加させる、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成速度を増加させるコード領域に転写因子を動員することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物は、エンハンサー配列をさらに含む。例示的なエンハンサー配列としては、例えばＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝制御領域（hepative control region）からの３４ｂｐコアエンハンサー、ＥｎＴＴＲエンハンサー（トランスサイレチンからの１００ｂｐエンハンサー配列）、α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体エンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー（α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体からの１００ｂｐ遠位エンハンサーの４２ｂｐへの短縮版）、またはＡｐｏＥエンハンサーが挙げられる。例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６号およびWu et al., Mol Therapy 16(2): 280-289 (2008)を参照されたい。別の実施形態では、適したエンハンサー配列は、配列番号３０または配列番号３１を含むイントロン配列である。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列は、本明細書に記載の核酸構築物において導入遺伝子およびプロモーターの上流に、またはプロモーターと導入遺伝子の間に位置する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物は、ポリＡ配列をさらに含む。適したポリＡ配列としては、例えば長さ約７５ｂｐの人工ポリＡ（ＰＡ７５）（例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６号を参照されたい）、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ウサギベータグロビンポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、プロタミン遺伝子ポリＡ、アデノウイルス５ ＥＩｂポリＡ、成長ホルモンポリＡ、またはＰＢＧＤポリＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリＡ配列は、本明細書に記載の核酸構築物において導入遺伝子の下流に位置する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子に従って使用するために適した調節エレメントは、９００ｂｐ未満、８５０ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、７５０ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、６５０ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、５５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、２２５ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１７５ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、１４５ｂｐ未満、１４０ｂｐ未満、１３５ｂｐ未満、１３０ｂｐ未満、１２５ｂｐ未満、１２０ｂｐ未満、１１５ｂｐ未満、１１０ｂｐ未満、１０５ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、９５ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８５ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、もしくは７５ｂｐ未満、または約８０～３００ｂｐ、８０～２７５ｂｐ、８０～２５０ｂｐ、８０～２００ｂｐ、８０～１５０ｂｐ、８０～１２５ｂｐ、８０～１２０ｂｐ、８０～１１５ｂｐ、８０～１１０ｂｐ、８０～１０５ｂｐ、８０～１００ｂｐ、８５～３００ｂｐ、８５～２７５ｂｐ、８５～２５０ｂｐ、８５～２００ｂｐ、８５～１５０ｂｐ、８５～１２５ｂｐ、８５～１２０ｂｐ、８５～１１５ｂｐ、８５～１１０ｂｐ、８５～１０５ｂｐ、８５～１００ｂｐ、９０～３００ｂｐ、９０～２７５ｂｐ、９０～２５０ｂｐ、９０～２００ｂｐ、９０～１５０ｂｐ、９０～１２５ｂｐ、９０～１２０ｂｐ、９０～１１５ｂｐ、９０～１１０ｂｐ、９０～１０５ｂｐ、９０～１００ｂｐ、９５～３００ｂｐ、９５～２７５ｂｐ、９５～２５０ｂｐ、９５～２００ｂｐ、９５～１５０ｂｐ、９５～１２５ｂｐ、９５～１２０ｂｐ、９５～１１５ｂｐ、９５～１１０ｂｐ、９５～１０５ｂｐ、９５～１００ｂｐ、１００～３００ｂｐ、１００～２７５ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１００～２００ｂｐ、１００～１５０ｂｐ、１００～１２５ｂｐ、１００～１２０ｂｐ、１００～１１５ｂｐ、１００～１１０ｂｐ、もしくは１００～１０５ｂｐを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の核酸分子に従って使用するために適した調節エレメントは、約１００～１２０ｂｐ、約１１７ｂｐ、または約１００ｂｐを含む。
ある特定の実施形態では、ラミンＡおよび／またはラミンＣ核酸配列ならびに調節エレメントを含む本明細書に記載の核酸構築物は、例えば約４．７Ｋｂ未満を含むＡＡＶベクターにおいてパッケージングするために適している。ある特定の実施形態では、ラミンＡおよび／またはラミンＣ核酸配列ならびに調節エレメントを含む本明細書に記載の核酸構築物は、約４，４５０～４，５５０ｂｐ、４，４５０～４，５４０ｂｐ、４，４５０～４，５３０ｂｐ、４，４５０～４，５２０ｂｐ、４，４５０～４，５１０ｂｐ、４，４５０～４，５００ｂｐ、４，４６０～４，５５０ｂｐ、４，４６０～４，５４０ｂｐ、４，４６０～４，５３０ｂｐ、４，４６０～４，５２０ｂｐ、４，４６０～４，５１０ｂｐ、４，４６０～４，５００ｂｐ、４，４７０～４，５５０ｂｐ、４，４７０～４，５４０ｂｐ、４，４７０～４，５３０ｂｐ、４，４７０～４，５２０ｂｐ、４，４７０～４，５１０ｂｐ、４，４７０～４，５００ｂｐ、４，４８０～４，５５０ｂｐ、４，４８０～４，５４０ｂｐ、４，４８０～４，５３０ｂｐ、４，４８０～４，５２０ｂｐ、４，４８０～４，５１０ｂｐ、４，４８０～４，５００ｂｐ、４，４９０～４，５５０ｂｐ、４，４９０～４，５４０ｂｐ、４，４９０～４，５３０ｂｐ、４，４９０～４，５２０ｂｐ、４，４９０～４，５１０ｂｐ、もしくは４，４９０～４，５００ｂｐを含む、または約４，４９８ｂｐもしくは約４，５１５ｂｐを含む。例示的な実施形態では、そのような核酸構築物は、全長のラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質、例えば配列番号１２、１３、および／または２１の１つまたは複数を有するラミンＡおよび／またはラミンＣタンパク質をコードする。
別の実施形態では、本明細書において有用な導入遺伝子は、発現されると検出可能なシグナルを産生するレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列としては、βラクタマーゼ、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、およびそれに対する高親和性抗体が存在するかまたは通常の手段によって産生され得る当技術分野で周知であるその他のタンパク質を含む膜結合タンパク質、とりわけヘマグルチニンまたはＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられるがこれらに限定されない。これらのコード配列は、その発現を駆動する調節エレメントに会合すると、酵素、Ｘ線、比色測定、蛍光、または他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを保有するベクターの存在は、ベータガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターは、ルミノメーターにおいて色または光の産生によって視覚的に測定され得る。
Ｄ．発現ベクター
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のラミンＡおよび／もしくはラミンＣヌクレオチド配列または発現構築物を、発現ベクター中に組み込むことができる。
発現ベクターを使用して、トランスフェクションまたは形質導入によって標的細胞に核酸分子を送達することができる。ベクターは、発現カセットまたは導入遺伝子を、宿主細胞のゲノム中に組み込むベクターの能力を指す、組込みまたは非組込みベクターであってもよい。発現ベクターの例としては、限定されるものではないが、（ａ）線状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター；ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）などの人工染色体；エピソームベクター；トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）などの非ウイルスベクター；ならびに（ｂ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
発現ベクターは、線状オリゴヌクレオチドまたは環状プラスミドであってもよく、物理的および化学的方法を含む、種々のトランスフェクション法によって細胞に送達することができる。物理的方法とは一般に、遺伝物質の細胞内送達を容易にする際に細胞膜障壁に対抗する物理的な力を用いる送達方法を指す。物理的方法の例としては、針、弾道ＤＮＡ、電気穿孔、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、およびハイドロポレーションの使用が挙げられる。化学的方法とは一般に、化学的担体が核酸分子を細胞に送達する方法を指し、無機粒子、脂質に基づくベクター、ポリマーに基づくベクターおよびペプチドに基づくベクターを含んでもよい。
一部の実施形態では、発現ベクターは、無機粒子を使用して標的細胞に投与される。無機粒子は、細網内皮系から逃れるか、または捕捉された分子を分解から保護するために様々なサイズ、形状、および／または多孔性について操作されたナノ粒子などのナノ粒子を指してもよい。無機ナノ粒子を、金属（例えば、鉄、金、および銀）、無機塩、またはセラミックス（例えば、カルシウム、マグネシウム、もしくはケイ素のリン酸塩もしくは炭酸塩）から調製することができる。これらのナノ粒子の表面をコーティングして、ＤＮＡ結合または標的化遺伝子送達を容易にすることができる。磁気ナノ粒子（例えば、超磁性酸化鉄）、フラーレン（例えば、可溶性炭素分子）、炭素ナノチューブ（例えば、円筒状フラーレン）、量子ドットおよび超分子系を使用することもできる。
一部の実施形態では、発現ベクターは、陽イオン脂質（例えば、陽イオン性リポソーム）を使用して標的細胞に投与される。例えば、脂質ナノエマルジョン（例えば、乳化剤によって安定化された、１つの非混和性液体の別のものへの分散物である）または固体脂質ナノ粒子などの、様々な型の脂質が遺伝子送達のために調査されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターはいずれも、ペプチドに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ペプチドに基づく送達ビヒクルは、送達される遺伝物質を保護する、特定の細胞受容体を標的化する、エンドソーム膜を破壊する、および遺伝物質を核に送達する利点を有し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリマーに基づく送達ビヒクルを使用して標的細胞に投与される。ポリマーに基づく送達ビヒクルは、天然タンパク質、ペプチドおよび／もしくは多糖または合成ポリマーを含んでもよい。一実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。ＰＥＩは、ＤＮＡを凝集させて、陰イオン性細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスによって細胞中にもたらされる、正に荷電した粒子にすることができる。他の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、ポリ（ＤＬ－乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、デンドリマー、キトサン、デキストランの合成アミノ誘導体、および／または陽イオン性アクリルポリマーを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、例えば、ＰＥＧおよびＰＬＬなどのポリマーの混合物を含んでもよい。
本明細書に開示される核酸構築物および／またはポリヌクレオチド配列のいずれかを含むウイルスベクターが、本明細書で提供される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；または前記のいずれかの生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；ならびに／またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ラミンＡまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ラミンＣまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ラミンＡおよびラミンＣまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、発現ベクターは、遺伝子療法にとって好適なウイルスベクターであってもよい。ウイルス遺伝子療法ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特性は、再現可能かつ安定に増殖し、高力価で精製される；標的化送達を媒介する（例えば、他の場所への広範なベクター播種なしに目的の組織または臓器に特異的に導入遺伝子を送達する）；および有害な副作用を誘導することなく遺伝子送達および導入遺伝子発現を媒介する能力を含んでもよい。
いくつかの型のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルスと呼ばれる非病原性パルボウイルスが、ウイルス感染経路を利用するが、複製および毒性をもたらし得るウイルス遺伝子のその後の発現を避けることによって、遺伝子療法の目的のために操作されている。そのようなウイルスベクターを、ウイルスゲノムからコード領域の全部または一部を欠失させるが、ベクターゲノムのウイルスカプシドへのパッケージングまたはベクター核酸（例えば、ＤＮＡ）の宿主クロマチンへの組込みなどの機能にとって必要であり得る配列（例えば、末端反復配列）を無傷のままにすることによって取得することができる。
一部の場合、ウイルスベクターは、１つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子であって、ラミンＡ、ラミンＣ、ラミンＡおよびラミンＣ、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片をコードする導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＣまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ラミンＡおよびラミンＣまたはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）および野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）ならびに野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０（例えば、配列番号７８および７９）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２（例えば、配列番号８１～９３）および野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つまたは複数の核酸配列、および前記のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つもしくは複数の配列であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１～１０のいずれか１つと１００％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２または２１のポリペプチド配列をコードする配列番号６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１３のポリペプチド配列をコードする配列番号７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２、１３または２１のいずれか１つまたは複数のポリペプチド配列をコードする配列番号１０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つの核酸配列、および前記のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つの配列であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３～５のいずれか１つと１００％同一であるヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化されたバリアントおよび／もしくは断片を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１および２４のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチド、ならびに前記のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つのポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも６０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも６５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも７５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも８２％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも８７％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９１％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９２％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９３％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９４％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９６％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９７％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９８％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。 ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと少なくとも９９％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２～２１もしくは２４のいずれか１つと１００％同一であるポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡまたはその生物活性断片をコードし、また、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡまたはその生物活性断片をコードし、また、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２および／または１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡおよびラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１および／または１３のアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるラミンＡおよびラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するラミンＡをコードし、また、配列番号１３のアミノ酸配列を有するラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するラミンＡをコードし、また、配列番号１３のアミノ酸配列を有するラミンＣをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子に由来する１個もしくはそれより多く、２個もしくはそれより多く、３個もしくはそれより多く、４個もしくはそれより多く、５個もしくはそれより多く、６個もしくはそれより多く、７個もしくはそれより多く、８個もしくはそれより多く、９個もしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個もしくはそれより多くのイントロンを含まないヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応するヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～８および１１（例えば、配列番号７０～７７および８０）に対応するヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～９および１１（例えば、配列番号７０～７８および８０）に対応するヌクレオチド配列を含まない。
一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードするヌクレオチド配列であって、１個もしくはそれより多く、２個もしくはそれより多く、３個もしくはそれより多く、４個もしくはそれより多く、５個もしくはそれより多く、６個もしくはそれより多く、７個もしくはそれより多く、８個もしくはそれより多く、９個もしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個もしくはそれより多くのイントロン（例えば、配列番号７０～８０のいずれか１つまたは組合せ）を含む、ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子、例えば、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子に由来するイントロンに対応する。他の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、合成イントロンである。特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、それがスプライス依存的様式でラミンＡとラミンＣとの両方をコードすることができるようなウイルスベクター中のヌクレオチド配列中に位置する。特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡを産生するような核酸構築物中に位置する。特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡより多くのラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡを産生するような核酸構築物中に位置する。特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ほぼ同レベルの、ラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡと、ラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡとを産生するような核酸構築物中に位置する。特定の実施形態では、１個またはそれより多くのイントロンは、プレｍＲＮＡが選択的スプライシングを受けて、ラミンＣをコードする成熟ｍＲＮＡより多くのラミンＡをコードする成熟ｍＲＮＡを産生するような核酸構築物中に位置する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくとも１個であるが、全部ではない内因性イントロンを含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応する少なくとも１個のイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１個のイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１個のイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒト野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１（例えば、配列番号７７～８０）に対応するイントロンを含み、ヒト野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１個のイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９～１０（例えば、配列番号７８および７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～８および１１（例えば、配列番号７０～７７および８０）に対応する全てのイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する少なくとも１個のイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７（例えば、配列番号７０～７６）に対応する全てのイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０（例えば、配列番号７９）に対応するイントロンを含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～９および１１（例えば、配列番号７０～７８および８０）に対応する全てのイントロンを欠くヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８に対応するイントロンは、配列番号７７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９に対応するイントロンは、配列番号７８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０に対応するイントロンは、配列番号７９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１に対応するイントロンは、配列番号８０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片を含む。
一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡおよび／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８を含む、ヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９を含む、ヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０を含む、ヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１を含む、ヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０を含む、ヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ウイルスベクターは、ラミンＡ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）および／またはラミンＣ（またはその生物活性断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列であって、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、１０、および１１を含む、ヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つまたは複数の核酸配列、および前記のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つの配列であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８２％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも８７％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９２％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９３％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号７７～８０のいずれか１つもしくは複数と１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む。好適なポリＡ配列としては、例えば、約７５ｂｐの長さである人工ポリＡ（ＰＡ７５）（例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６を参照されたい）、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ウサギベータグロビンポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、プロタミン遺伝子ポリＡ、アデノウイルス５ＥＩｂポリＡ、成長ホルモンポリＡ、またはＰＢＧＤポリＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１１を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、ポリＡ配列は、本明細書に記載の核酸構築物中、導入遺伝子の下流に位置する。
Ｅ．ウイルスベクター
様々な実施形態では、好適なウイルスベクターは、レトロウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型ウイルス）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルスまたはＡＡＶ）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。レトロウイルスの例としては、鳥白血症・肉腫ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、レンチウイルス、およびスプーマウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。ウイルスベクターを、宿主ゲノム中に組み込まれるその能力に従って２つの群－組込み型および非組込み型に分類することができる。オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスは、宿主細胞クロマチンに組み込まれ得るが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスは、主に染色体外エピソームとして細胞核中で持続する。
ある特定の実施形態では、好適なウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスとは、レトロウイルス科のウイルスを指す。レトロウイルスの例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのオンコレトロウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）などのレンチウイルスが挙げられる。レトロウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡであり、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓで提供することができる種々の遺伝子を含む。例えば、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主染色体への組込みのためのエレメントと共に、２つの長鎖末端反復（ＬＴＲ）などのｃｉｓ作用性配列を含有してもよい。他の構成成分としては、新しく形成されたビリオンへの特異的ＲＮＡのパッケージングのためのパッケージングシグナル（プサイまたはΨ）および逆転写中のプラス鎖ＤＮＡ合成の開始部位であるポリプリントラクト（ＰＰＴ）が挙げられる。さらに、レトロウイルスゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含んでもよい。ｇａｇ遺伝子は構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はｓｓＲＮＡに付随し、ウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を実行する酵素をコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープをコードする。一般に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにｔｒａｎｓに提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。レンチウイルスの少なくとも５つの血清群または血清型が認識されている。異なる血清型のウイルスは、ある特定の細胞型および／または宿主に特異的的に感染し（differentially infect）得る。レンチウイルスは、例えば、霊長類レトロウイルスおよび非霊長類レトロウイルスを含む。霊長類レトロウイルスには、ＨＩＶおよびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レトロウイルスには、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびビスナウイルスが含まれる。レンチウイルスまたはレンチベクターは、静止細胞に形質導入することができる。オンコレトロウイルスベクターに関して、レンチベクターの設計は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ作用性配列の分離に基づくものであってよい。
ある特定の実施形態では、本開示は、最適化された治療用レトロウイルスベクターによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。レトロウイルスベクターは、左側（５’）のＬＴＲ；ウイルスのパッケージングおよび／または核内輸送を補助する配列；ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列に作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞型選択的（例えば、心筋細胞）プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）；必要に応じて、１つまたは複数のさらなる調節エレメント（例えば、ポリＡ配列など）；必要に応じて、レンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）；必要に応じて、インスレーター；ならびに右側（３’）のレトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスであってもよい。
例示的な実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さい、複製欠損、非エンベロープ動物ウイルスである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こさないことが知られており、軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞ゲノム中に組み込まれることなく、分裂細胞と静止細胞との両方に感染することができる。
ＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂの長さである線状一本鎖ＤＮＡからなる。このゲノムは、約１４５ｂｐの長さである逆位末端反復（ＩＴＲ）配列によって挟まれた２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＩＴＲは、５’末端のヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）と、パリンドローム配列を含有する３’末端に位置するヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）とからなる。ＩＴＲは、第２鎖合成のためのＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能する相補的塩基対によってＴ型のヘアピン構造を形成するようにフォールディングすることによってｃｉｓに機能する。２つのオープンリーディングフレームは、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする。例示的実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子もｃａｐ遺伝子も含有しない。そのような遺伝子を、以下にさらに記載されるようにビリオンを産生するためにｔｒａｎｓに提供することができる。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、スタッファー核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質またはカナマイシンもしくはアンピシリンなどの抗生物質耐性遺伝子をコードしてもよい。ある特定の実施形態では、スタッファー核酸は、ＩＴＲ配列の外側に位置してもよい（例えば、５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、ラミンＡおよび／またはラミンＣ導入遺伝子配列および調節配列と比較した場合）。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３を含む、様々な血清型のＡＡＶが存在する。これらの血清型は、その向性、またはそれらが感染する細胞の型において異なる。ＡＡＶは、複数の血清型（例えば、偽型）に由来するゲノムおよびカプシドを含んでもよい。例えば、ＡＡＶは、血清型５または血清型９に由来するカプシドにパッケージングされた血清型２のゲノム（例えば、ＩＴＲ）を含んでもよい。偽型は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、少なくとも、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードする導入遺伝子とを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、少なくとも、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードする導入遺伝子とから構成されるミニ遺伝子を含む。１つの特定の実施形態では、ＡＡＶ血清型６またはＡＡＶ血清型９のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の好適な血清型に由来するＩＴＲを選択することができる。ウイルスベクターは、カプシドタンパク質中にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される。本開示のＡＡＶベクターを、様々なアデノ随伴ウイルスから生成することができる。ベクターの向性を、ある血清型の組換えゲノムを、別のＡＡＶ血清型に由来するカプシド中にパッケージングすることによって変更することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスのＩＴＲは、ＡＡＶ１～１２のいずれか１つのＩＴＲに基づくものであってよく、ＡＡＶ１～１２、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ９または他の改変血清型のいずれか１つから選択されるＡＡＶカプシドと組み合わせることができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターもしくはＡＡＶウイルス粒子、またはビリオンを使用して、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む構築物を、細胞、細胞型、または組織に送達し、それをｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。例示的な実施形態では、そのようなＡＡＶベクターは、複製欠損である。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、それがヘルパー因子の存在下でのみ複製し、ビリオンを生成することができるように操作または遺伝子改変される。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを、特定の細胞型に対する選択性なしに高い感染力を有するビリオンを産生するように選択することができるが、心筋細胞選択的調節エレメントは、心筋細胞中での導入遺伝子の選択的発現を付与し、他の筋肉細胞がウイルスに感染し得る場合であっても、他の筋肉細胞中では導入遺伝子の選択的発現を付与しない。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを、多くの異なる細胞型に感染するビリオンを産生するように設計することができるが、導入遺伝子の発現は、目的の細胞型（例えば、心筋細胞）において増強および／または最適化され、導入遺伝子の発現は、他の非標的細胞型（例えば、非心筋細胞）において減少する、および／または最小化される。異なる細胞型における導入遺伝子の差次的発現を、１つまたは複数の細胞型にとって選択的である異なる調節エレメントを使用して制御する、操作する（engineered）、または操作する（manipulated）ことができる。一部の場合、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の調節エレメントは、標的細胞、細胞型、または組織中での導入遺伝子の選択的発現を増強するが、１つまたは複数の調節エレメントは、オフターゲット細胞、細胞型、もしくは組織中で導入遺伝子発現を抑制するか、または１つもしくは複数のオフターゲット細胞、細胞型、もしくは組織中での有意により低い、僅少な、もしくは統計的により低い遺伝子発現を付与する。遺伝子療法にとって、標的細胞型（例えば、心筋細胞）中での導入遺伝子の選択的発現および／または非標的細胞型中での導入遺伝子の最小化された発現が望ましい場合がある。意図されない細胞型（例えば、非標的細胞型）中での導入遺伝子の発現は、対象にとって有害作用をもたらし得る。意図されない細胞型中での導入遺伝子の発現は、意図される細胞型中での導入遺伝子の治療効果を弱め得る。
例示的な実施形態では、本開示は、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、またはキメラ、ハイブリッド、もしくはバリアントＡＡＶであってもよい。ＡＡＶはまた、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、プロモーター、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列に作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞型選択的（例えば、心筋細胞）プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）を含む構築物、ならびに３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列に作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞型選択的（例えば、心筋細胞）プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）を含む構築物、ポリＡ配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号３０～６９もしくは１００～１０２のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含む調節エレメント、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号３１、３３、６０、もしくは６１のいずれか１つもしくは複数、またはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号３１またはそのバリアントもしくは機能的断片を含む調節エレメント、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号３３またはそのバリアントもしくは機能的断片を含む調節エレメント、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号６０またはそのバリアントもしくは機能的断片を含む調節エレメント、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号６１またはそのバリアントもしくは機能的断片を含む調節エレメント、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。例示的なＡＡＶ発現ベクターは、図１～５および図１１Ａ～Ｃに例示される。
Ｆ．ウイルス粒子
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。用語「ウイルス粒子」および「ビリオン」は、本明細書では互換的に使用され、カプシド内にパッケージングされたウイルスゲノム（例えば、ウイルス発現ベクター）と、場合によっては、例えば、レトロウイルスについては、カプシドを取り囲む脂質エンベロープとを含む、感染性および典型的には、複製欠損性のウイルス粒子に関する。「カプシド」とは、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質製のいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成される２０面体カプシドを有する。一実施形態では、本明細書で提供されるビリオンは、本明細書に記載のラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列に作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞型（例えば、心筋細胞）選択的調節エレメントを含む）を含むＡＡＶベクターを、タンパク質外殻中にパッケージングすることによって得られる組換えＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶビリオンである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組換えＡＡＶビリオンを、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然Ｃａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子中に、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムをカプシドで包むことによって調製することができる。他の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶウイルス粒子は、異なる血清型に由来するタンパク質中にパッケージングされた所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲを含むウイルスベクターを含む。例えば、Bunning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733を参照されたい。例えば、所与のＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲを有するウイルスベクターを、ａ）同じか、もしくは異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ９カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ８カプシドタンパク質など）；ｂ）異なるＡＡＶ血清型もしくは変異体に由来するカプシドタンパク質の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９カプシドタンパク質）；ｃ）異なるＡＡＶ血清型もしくはバリアントの間でのドメイン交換によって切断されたカプシドタンパク質から構成されるキメラウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ＡＡＶ９ドメインを有するＡＡＶ８カプシドタンパク質）；またはｄ）標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にする、選択的結合ドメインを展示するように操作された標的化ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ５ ＩＴＲと、ペプチドリガンドの挿入によって遺伝的に切断された（genetically truncated）ＡＡＶ９カプシドタンパク質；もしくはペプチドリガンドのカプシド表面へのカップリングによって非遺伝的に改変されたＡＡＶ９カプシドタンパク質）中にパッケージングすることができる。
当業者であれば、本明細書で提供されるＡＡＶビリオンが任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含んでもよいことを理解する。一実施形態では、ウイルス粒子は、心筋への送達にとってより好適である、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む（M. Hocquemiller et al., Hum Gene Ther 27(7): 478-496 (2016)）。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。
トランスフェクション、安定細胞系産生、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Conway, J E et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む、ｒＡＡＶビリオンの産生のための多くの方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養物は全て、１）例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、もしくは２９３細胞などのヒト由来細胞系、またはバキュロウイルス産生系の場合、ＳＦ－９などの昆虫由来細胞系を含む、好適な宿主細胞；２）野生型または変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって挟まれた導入遺伝子（例えば、本明細書に記載のラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支援する好適な培地および培地成分を必要とする。
種々の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、以下の３つの成分：（１）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子（ＩＴＲによって挟まれた本明細書に記載のラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、およびヘルパー機能を提供する遺伝子を、例えば、プラスミドなどのベクター中に組み込み、前記ベクターを宿主細胞中に導入することによって、前記遺伝子を細胞中に導入することができる。ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびヘルパー機能遺伝子を、同じプラスミドまたは異なるプラスミド中に組み込むことができる。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミド中に組み込まれ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミド中に組み込まれる。ビリオン産生のための宿主細胞の作出のための種々のプラスミド（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、または導入遺伝子を含む）を、当技術分野で周知の任意の好適な方法を使用することによって細胞中に導入することができる。トランスフェクション法の例としては、限定されるものではないが、リン酸カルシウムとの共沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性融合、リポフェクション、レトロウイルス感染およびビオリスティックトランスフェクションが挙げられる。ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能ならびに導入遺伝子（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を提供するプラスミドを、細胞中に同時に導入することができる。別の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能を提供するプラスミドを、導入遺伝子を含むプラスミドの導入の前または後で細胞に導入することができる。例示的な実施形態では、細胞は、３つのプラスミド：（１）導入遺伝子（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を含むプラスミド、（２）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびに（３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミドと同時にトランスフェクトされる（例えば、三重トランスフェクション法）。例示的な宿主細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞であってもよい。
他の実施形態では、（１）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子のうちの１つまたは複数を、パッケージング細胞によって、エピソームとして保有させる、および／またはパッケージング細胞のゲノム中に組み込むことができる。一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、宿主細胞は、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を含有するプラスミドを一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり、宿主細胞は、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を含有するプラスミドと、ヘルパー機能を含有するプラスミドとを一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、宿主細胞は、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を含有するプラスミドと、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドとを一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能および導入遺伝子配列（例えば、ＩＴＲによって挟まれた本明細書に開示されるラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を安定にトランスフェクトされる産生細胞系であってもよい。例示的なパッケージングおよび産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来してもよい。
別の実施形態では、産生細胞系は、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞系（典型的には、Ｓｆ９細胞）である。この系は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（Ayuso E, et al., Curr. Gene Ther. 2010, 10:423-436）。
本明細書で使用される用語「ｃａｐタンパク質」とは、天然ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能的活性の例としては、カプシドの形成を誘導する、一本鎖ＤＮＡの蓄積を容易にする、ＡＡＶ ＤＮＡのカプシドへのパッケージング（すなわち、カプシド形成）を容易にする、細胞受容体に結合する、およびビリオンの宿主細胞への進入を容易にする能力が挙げられる。原理的には、任意のＣａｐタンパク質を、本発明の文脈において使用することができる。
Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主指向性、細胞、組織、または臓器特異性、受容体使用、感染効率、および免疫原性に対する効果を有すると報告されている。したがって、ｒＡＡＶにおける使用のためのＡＡＶ ｃａｐを、例えば、対象の種（例えば、ヒトもしくは非ヒト）、対象の免疫状態、長期的もしくは短期的処置のための対象の適合性、または特定の治療適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の処置、または特定の細胞、組織、もしくは臓器への送達）を考慮に入れて選択することができる。ある特定の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９血清型からなる群のＡＡＶに由来する。一部の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ６に由来する。一部の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ９に由来する。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ Ｃａｐを、上記ＡＡＶ ｃａｐの１つまたはそのコード核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換による）によって生成することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、上記のＡＡＶ ｃａｐのうちの１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％またはそれより高く類似する。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、上記ＡＡＶ ｃａｐのうちの２つ、３つ、４つ、またはそれより多くに由来するドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、２つもしくは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶを起源とするＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３単量体のモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、１より多い上記ｃａｐを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンにおける使用のためのＡＡＶ ｃａｐは、異種配列または他の改変を含有するように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列を、ｃａｐタンパク質中で操作することができる。あるいは、またはさらに、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（すなわち、ＰＥＧ化）され、免疫回避を容易にすることができるように、ｃａｐを化学的に改変することができる。ｃａｐタンパク質を、変異誘発することもできる（例えば、その天然受容体結合を除去する、または免疫原性エピトープを隠すため）。
本明細書で使用される用語「ｒｅｐタンパク質」とは、天然ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質（例えば、ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の機能的活性の例としては、認識によるＤＮＡの複製の容易化、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の結合およびニッキングならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能と関連する任意の活性が挙げられる。さらなる機能としては、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションおよびＡＡＶ ＤＮＡの宿主染色体への部位特異的組込みを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０に由来してもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ６に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ９に由来する。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を、上記ＡＡＶ ｒｅｐの１つまたはそのコード核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換による）によって生成することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、上記のＡＡＶ ｒｅｐのうちの１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％またはそれより高く類似する。
本明細書で使用される場合、「ヘルパー機能」または「ヘルパー遺伝子」という表現は、ＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質を指す。ヘルパー機能は、限定されるものではないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリーに関与するタンパク質を含む、ＡＡＶ複製にとって必要とされるタンパク質を含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来するものであってもよい。ヘルパー機能には、限定されるものではないが、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれる。好ましい実施形態では、ＡＡＶが複製のために依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。
一部の実施形態では、ＡＡＶが本発明の方法における使用のための複製のために依存するウイルスタンパク質を、上記のウイルスタンパク質のうちの１つまたはそのコード核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換による）によって生成することができる。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、上記のウイルスタンパク質のうちの１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％またはそれより高く類似する。
ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当技術分野で周知である。
Ｇ．宿主細胞
別の態様では、本発明は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子を含む宿主細胞に関する。別の実施形態では、本発明は、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であってもよい。例示的な実施形態では、宿主細胞は、目的のウイルスによる感染に罹りやすく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養に適している任意の細胞系を指す。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法目的で使用することができる。そのような実施形態では、細胞は、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列を含む核酸分子または発現ベクターをトランスフェクトされた後、患者または対象に移植される。移植される細胞は、自己、同種異系または異種起源を有してもよい。臨床的使用のためには、一般的には、細胞単離は、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）条件下で実行される。移植前に、典型的には、細胞の品質および微生物または他の夾雑物の非存在をチェックし、放射線および／または免疫抑制処置などに関するプレコンディショニングを実行することができる。さらに、宿主細胞を、成長因子と一緒に移植して、細胞増殖および／または分化を刺激することができる。
ある特定の実施形態では、宿主細胞を、目的の心臓または他の組織（複数可）中でのｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法のために使用することができる。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、これらのものとしては、限定されるものではないが、ヒト、類人猿；チンパンジー；サル、およびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコなどの家庭用動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどの他の哺乳動物種を含む。当業者であれば、移植される患者または対象に応じてより適切な細胞を選択する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞などの、自己再生および多能性特性を有する細胞であってもよい。幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または筋細胞の少なくとも１つに分化することができ、任意の型の組織から単離することができる。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離される。それを取得するための方法は、当業者には周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られる）は、成熟細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の型である。Yamanaka et al.は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒト線維芽細胞に移入し、細胞に、それらの遺伝子を発現させることによってｉＰＳ細胞を誘導した（ＷＯ２００７／０６９６６６）。Thomson et al.は続いて、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を産生した（ＷＯ２００８／１１８８２０）。
例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、パッケージング細胞である。前記細胞は、接着または懸濁細胞であってもよい。パッケージング細胞、およびヘルパーベクターもしくはウイルスまたはＤＮＡ構築物（複数可）は、一緒になってｔｒａｎｓに、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングにとって必要とされる全ての失われている機能を提供する。
好ましくは、前記パッケージング細胞は、サル、ヒト、イヌおよび齧歯類細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞である。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ０１／３８３６２）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、および胎仔アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。齧歯類細胞の例は、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。
哺乳動物起源の代替として、本発明における使用のための細胞系は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジなどの鳥起源に由来してもよい。鳥細胞系の例としては、鳥胚性幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）、不死化アヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）、およびニワトリ細胞（ＷＯ２００６／１０８８４６）またはアヒル細胞、例えば、ＥＢ６６細胞系（ＷＯ２００８／１２９０５８＆ＷＯ２００８／１４２１２４）を含む、鳥胚性幹細胞由来細胞が挙げられる。
別の実施形態では、前記宿主細胞は、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）などの昆虫細胞である。
ある特定の実施形態では、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子を含む本明細書で提供される宿主細胞は、例えば、（ｉ）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を保有しない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびに／または（ｉｉ）ＡＡＶ複製にとって必要なアデノウイルス機能を提供する核酸構築物（例えば、プラスミド）などの、１つまたは複数のさらなる核酸構築物をさらに含んでもよい。例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、ｉ）本明細書に開示される核酸構築物またはウイルスベクターのいずれか（例えば、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に開示される核酸構築物またはベクターのいずれか）；ｉｉ）ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物；ならびにｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物（以下でさらに説明される）を含む。
ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド上で組み合わせることができる（Blouin V et al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228；Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850）。かくして、別の例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、ｉ）ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）を含む核酸分子または発現ベクター；ならびにｉｉ）ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードし、アデノウイルスヘルパー遺伝子をさらに含むプラスミドを含む。
別の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、ａ）本明細書に開示される核酸構築物またはウイルスベクターのいずれか（例えば、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に開示される核酸構築物またはベクターのいずれか）；ｂ）ＩＴＲ配列を保有しないＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド；ならびにｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含むプラスミドを含み、共トランスフェクションは、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）のような、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現し、トランス補完する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）細胞、好ましくは、哺乳動物細胞中で行われる。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターの大規模産生にとって好適な宿主細胞は、組換えバキュロウイルスの組合せを感染させることができる昆虫細胞である（Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943）。例えば、ＳＦ９細胞に、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびパッケージングしようとするＡＡＶベクターをそれぞれ発現する３つのバキュロウイルスベクターを共感染させることができる。組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルス複製および／またはパッケージングにとって必要とされるウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。
本発明による遺伝子療法のためのビリオンの構築および産生のためのさらなる指針を、Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer)；Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag；Heilbronn R. and Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pp. 143-170；Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R. O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer)；Bunning H. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733；およびAdenovirus: Methods and Protocols. M. Chillon and A. Bosch (Eds.); Third. Edition. 2014 Humana Press (Springer)に見出すことができる。
目的の導入遺伝子（例えば、ラミンＡおよび／またはラミンＣをコードする配列）を発現させるための宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリーにとって十分な条件下で成長させることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリーおよび培地中へのビリオンの放出を促進するために好適な期間にわたって成長させる。一般に、細胞を、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または最大で約１０日間成長させることができる。約１０日後（または、培養条件および使用される特定の宿主細胞に応じて、より早く）、産生レベルは一般には有意に低下する。一般に、培養時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は一般に、本明細書に記載の適切な宿主細胞中でヘルパーウイルス機能の供給の際に開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染後（またはウイルス産生が開始した後）、約４８～約１００時間、好ましくは約４８～約９６時間、好ましくは、約７２～約９６時間、好ましくは、約６８～約７２時間で回収される。
ｒＡＡＶ産生培養物を、使用される特定の宿主細胞にとって好適な種々の条件下で（広い温度範囲にわたって、様々な時間長にわたって、など）成長させることができる。ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、ローラーボトル、ホローファイバーフィルター、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターなどの好適な接着依存的容器中で培養することができる接着依存的培養物を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養物はまた、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含む、様々な方法で培養することができる、ＨｅＬａ、２９３、およびＳＦ－９細胞などの懸濁適合宿主細胞を含んでもよい。
当技術分野で公知の好適な培地を、ｒＡＡＶビリオンの産生のために使用することができる。これらの培地には、限定されるものではないが、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産される培地が含まれる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養培地に０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで血清または血清由来組換えタンパク質を添加してもよい。あるいは、ｒＡＡＶベクターを、動物由来製品を含まない培地とも称することができる無血清条件で産生することができる。
ＡＡＶビリオン産生を可能にするために宿主細胞を培養した後、得られるビリオンを回収し、精製することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶビリオンを、（１）宿主細胞の溶解による産生培養物の宿主細胞、および／または（２）トランスフェクションの一定期間後、好ましくは、７２時間後の前記細胞の培養培地から取得することができる。細胞が、無傷の細胞から培地中へのｒＡＡＶビリオンの放出を引き起こす条件下で培養されるという条件で、ｒＡＡＶビリオンを、産生培養物に由来する消費された培地から回収することができる（例えば、米国特許第６，５６６，１１８号を参照されたい）。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で公知であり、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流体化、ならびに洗剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質による処理が挙げられる。
回収後、ｒＡＡＶビリオンを精製することができる。本明細書で使用される用語「精製された」は、ｒＡＡＶビリオンが天然に存在するか、または最初に調製される、存在してもよい他の成分の少なくとも一部を含まないｒＡＡＶビリオンの調製を含む。かくして、例えば、精製されたｒＡＡＶビリオンを、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物からそれを富化するための単離技術を使用して調製することができる。富化を、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合による、または感染力によるなどの様々な方法で測定することができるか、またはそれを、産生培養夾雑物もしくはヘルパーウイルス、培地成分などを含む、工程内の夾雑物を含む夾雑物などの、供給源混合物中に存在する第２の、潜在的に干渉する物質との関連で測定することができる。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物を明澄化して、宿主細胞デブリを除去することができる。一部の実施形態では、産生培養回収物を、遠心分離または０．２μｍもしくはそれより大きい孔径のフィルター（例えば、酢酸セルロースフィルターまたは一連のデプスフィルター）を介する濾過などの様々な標準的な技術を使用して明澄化することができる。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）でさらに処理して、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化する。一部の実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）消化を、標準的な条件下で、例えば、３０分～数時間にわたって、周囲温度から３７℃の範囲の温度で、１～２．５単位／ｍｌの最終濃度のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）で実施する。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを、以下の精製ステップ：平衡遠心分離；フロースルー陰イオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、または親和性交換クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉のうちの１つまたは複数を使用して単離または精製することができる。これらのステップを、単独で、様々な組合せで、または異なる順序で使用することができる。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232；米国特許第６，９８９，２６４号および第８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３に見出される。
ある特定の実施形態では、精製されたＡＡＶビリオンを、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保存することができる。ウイルスゲノムの力価を、標準曲線として線状化プラスミドＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲによって決定することができる（例えば、Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21:1273-1285を参照されたい）。
Ｈ．医薬組成物
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される核酸構築物、発現ベクター、ウイルスベクター、ウイルス粒子または宿主細胞のいずれかを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチドの生物活性断片；（ｂ）ラミンＣポリペプチドの生物活性断片；（ｃ）ラミンＡの生物活性断片およびラミンＣポリペプチドの生物活性断片；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。他の実施形態では、本開示は、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子と、薬学的に許容される担体とを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、そのような組成物は、遺伝子療法適用にとって好適である。医薬組成物は、好ましくは、製造および保存の条件下で無菌性であり、安定である。滅菌溶液を、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成することができる。
医薬組成物中の許容される担体および賦形剤は、好ましくは、用いられる用量および濃度でレシピエントにとって非毒性的である。許容される担体および賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＴＡＥなどの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤、塩化ヘキサメトニウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリシンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールなどの炭水化物を含んでもよい。本開示の医薬組成物を、注射可能製剤の形態で非経口で投与することができる。注射のための医薬組成物を、ビヒクルとしての滅菌溶液または任意の薬学的に許容される液体を使用して製剤化することができる。薬学的に許容されるビヒクルには、限定されるものではないが、滅菌水および生理食塩水が含まれる。
本開示の医薬組成物を、ヒドロキシルメチルセルロースなどのマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中で調製することができる。また、本開示の医薬組成物を、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルなどの他の薬物送達系中で調製することもできる。遺伝子療法のための医薬組成物は、許容される希釈剤中にあってもよいか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリックスを含んでもよい。
本明細書で提供される医薬組成物を、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、全身投与、筋肉内投与、動脈内投与、実質内投与、髄腔内投与、大槽内投与、脳室内投与、または腹腔内投与のために製剤化することができる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。一実施形態では、医薬組成物は、全身投与のために製剤化される。医薬組成物を、経鼻、スプレー、経口、エアロゾル、直腸、または経膣投与のために製剤化するか、またはそれによって投与することもできる。一実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、筋肉に、すなわち、筋肉内注射によって投与される。組織標的は、例えば、心臓に特異的であってもよく、またはそれはいくつかの組織の組合せ、例えば、心臓および肝臓組織であってもよい。例示的な組織または他の標的は、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮、造血細胞、ＣＮＳおよび／またはＣＳＦを含んでもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、心臓に、すなわち、心臓内注射、静脈内注射により、または全身的に投与される。これらの方法の１つまたは複数を使用して、本開示の医薬組成物を投与することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、「有効量」または「治療有効量」を含む。本明細書で使用される場合、そのような量は、ＬＭＮＡ発現レベルの増加および／または左心室拍出量の増加などの、所望の治療結果を達成するのに必要な用量で、および期間にわたって有効な量を指す。
本開示の医薬組成物の用量は、投与経路、処置しようとする疾患、および対象の身体的特性（例えば、年齢、体重、一般的健康）を含む因子に依存する。用量を、最適な治療応答を提供するように調整することができる。典型的には、用量は、有意な毒性を誘導することなく疾患を有効に処置する量であってもよい。一実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターを、５×１０１１～１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（患者体重１キログラムあたりのゲノムコピー数（ｇｃ／ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ラミノパシー（例えば、拡張型心筋症を含む）の処置のために患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１２～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１２～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇの範囲内で、または約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇまたは９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇで含まれる量で投与される。ｇｃ／ｋｇを、例えば、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定することができる（例えば、M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr; 25(2): 115-25を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターを、１×１０９～１×１０１１ｉｕ／ｋｇ（ベクターの感染単位（ｉｕ）／対象または患者の体重（ｋｇ））の範囲内の量または用量でラミノパシー（例えば、拡張型心筋症を含む）の処置のために患者に投与することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物を、必要に応じて単位用量で形成させることができる。そのような単一用量単位は、約１×１０９ｇｃ～約１×１０１５ｇｃを含有してもよい。
本開示の医薬組成物を、それを必要とする対象に、例えば、毎日、毎週、毎月、半年毎、毎年、または医学的に必要に応じて、１回または複数回（例えば、１～１０回またはそれより多く）投与することができる。例示的な実施形態では、単回投与で十分である。一実施形態では、医薬組成物は、ヒト対象における使用にとって好適であり、筋肉内注射によって投与される。一実施形態では、医薬組成物は、ヒト対象における使用にとって好適であり、心臓内注射、静脈内注射、または全身投与によって投与される。一実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射によって末梢静脈を介して送達される。他の実施形態では、医薬組成物は、約１０分（±５分）かけて、約２０分（±５分）かけて、約３０分（±５分）かけて、約６０分（±５分）かけて、または約９０分（±１０分）かけて輸注により末梢静脈を介して送達される。
別の態様では、本開示は、１つまたは複数の容器中に本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を含むキットをさらに提供する。キットは、キット内に含有される核酸分子、ベクター、宿主細胞またはビリオンを患者に投与する方法を記載する指示または包装材料を含んでもよい。キットの容器は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などのものであってよく、任意の好適なサイズ、形状、または構成のものであってもよい。ある特定の実施形態では、キットは、核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または好適な液体または溶液形態の医薬組成物を含有する１つまたは複数のアンプルまたはシリンジを含んでもよい。
Ｉ．処置方法
核内膜の下にある核ラミナは、主にＡ型およびＢ型ラミンからなるＶ型中間フィラメントタンパク質のメッシュワークである。哺乳動物体細胞は、４つのメジャー、および３つのマイナーな型のラミンを発現する。ＬＭＮＡ遺伝子は、２つのメジャーアイソフォーム、ＡおよびＣ、ならびに２つのマイナーアイソフォームＡΔ１０およびＣ２を含むＡ型ラミンをコードする。Ｂ型ラミンのメジャーアイソフォームＢ１およびＢ２は、それぞれ、ＬＭＮＢ１およびＬＭＮＢ２によってコードされる。ＬＭＮＢ２は、さらにマイナーアイソフォームＢ３をコードする。核に機械的強度を提供することに加えて、核ラミナ関連ヒト疾患における最近の発見は、ラミンが少なくとも３つの経路：（ａ）遺伝子の核内局在化およびエピジェネティック調節に寄与することによる遺伝子発現および分化；（ｂ）ＤＮＡ損傷修復およびゲノム安定性；ならびに（ｃ）種々の分化経路を制御する転写因子およびシグナル伝達成分の調節に寄与することを確立した。
ラミノパシーまたは核膜症と呼ばれる、ある１５の異なる疾患／異常は、ラミンおよびラミン結合タンパク質内の変異と関連する。ラミンポリペプチドの異常なフォールディング、不安定性、およびミスアセンブリーをもたらす、５００を超える変異がＬＭＮＡ内で報告されているか、またはそれらはラミンＡ／Ｃ相互作用の乱れをもたらす、タンパク質ドメイン表面の生化学的特性に影響し得る。これらの変異は、４つの主要な疾患型：横紋筋疾患、リポジストロフィー症候群、末梢ニューロパシー、および早老症において複数の疾患表現型を生じる。これらの疾患表現型は、心臓および骨格筋ミオパシー、リポジストロフィー、末梢ニューロパシーから、早期死亡を伴う早老までの範囲である。
拡張型心筋症は、左心室または両方の心室の拡張および収縮障害ならびに収縮機能の障害を特徴とする横紋筋疾患の一種である。拡張型心筋症の有病率は、１：２５００の個体から１：２５０の個体までの範囲である。稀な疾患であるにも拘わらず、拡張型心筋症は、重大な健康上の負担であり、不整脈（すなわち、徐脈性不整脈（bradyarrhthmia）および頻脈性不整脈（tachyarrhthmia））、房室ブロック、血栓塞栓症および疾患の任意の段階での突然死をもたらすことが多い。２０１４年現在、１６５の拡張型心筋症関連変異が、ＬＭＮＡ遺伝子中で同定されている（Tesson F. Cardiol J. 2014;21(4):331-42）。これらの変異は、ミスセンス／ナンセンス変異、スプライシング変異、小欠失、小挿入、小インデル、全欠失、または全挿入を含んでいた。拡張型心筋症をもたらすＬＭＮＡ変異の大部分は、変異したラミンＡ／Ｃタンパク質を生成する遺伝子を通して認められる常染色体優性ミスセンス変異である。
ある特定の実施形態では、本開示は、ラミノパシーを処置するための方法を提供する。処置にとって適切なラミノパシーには、限定されるものではないが、シャルコー・マリー・ツース病、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、家族性部分型リポジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）、肢帯型筋ジストロフィー、ＬＭＮＡ関連先天性筋ジストロフィー、下顎骨異形成、不整脈原性右室心筋症、家族性心房細動、左室心筋緻密化障害、拡張型心筋症、非定型ウェルナー症候群、Ｂａｒｒａｑｕｅｒ－Ｓｉｍｏｎｓ症候群、ブシュケ・オレンドルフ症候群、ダニガン型家族性部分型リポジストロフィー（ＦＰＬＤ）、グリーンバーグ骨異形成症、大脳白質萎縮症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型、皮下脂肪萎縮性糖尿病、肝臓脂肪症、肥大型心筋症、および白斑黒皮（ｌｅｕｋｏｍｅｌａｎｏｄｅｒｍｉｃ）丘疹（ＬＤＨＣＰ）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成（ＭＡＤＡ）、Ｂ型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成（ＭＡＤＢ）、ペルゲル・ヒュエット異常症（ＰＨＡ）、ペリツェウス・メルツバッハー病および皮膚拘縮症候群（Ｔｉｇｈｔ ｓｋｉｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が含まれる。
一部の実施形態では、ラミノパシーは、ラミノパシー性リポジストロフィー障害、全身性ラミノパシー、ラミノパシー性神経障害、または筋ラミノパシーであってもよい。「ラミノパシー性」リポジストロフィー障害および「ラミノパシー性」神経障害とは、異常な核エンベロープ形態の結果生じる、またはそれと関連するリポジストロフィーおよび神経障害を意味する。リポジストロフィー障害は、必要に応じて、糖尿病および高トリグリセリド血症などの代謝障害と関連する、脂肪組織の異常な分布を特徴とする。リポジストロフィー患者は、身体のある特定の領域における脂肪組織の選択的喪失および／または過剰な蓄積を経験することが多い（例えば、上背部への過剰な沈着を伴う肢における喪失）。ラミノパシー性リポジストロフィー障害の例としては、例えば、家族性部分型リポジストロフィー（ダニガン型）、後天性部分型リポジストロフィー、Ａ型インスリン抵抗症候群、全身性脂肪萎縮症候群、および家族性部分型リポジストロフィー（コベリング型）が挙げられる。
全身性ラミノパシーは、様々な組織型に影響し、例えば、非定型ウェルナー症候群、早老症（例えば、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群）、拘束性皮膚障害、および下顎骨異形成を含む。全身性ラミノパシーと関連する症状は、多様である。非定型ウェルナー症候群患者は、低身長、骨粗鬆症、薄毛、アテローム性動脈硬化症（athlerosclerosis）、および白内障などの一般的に加齢と関連する特徴を通常より早く呈する。他方、拘束性皮膚障害は、皮膚および関節の拘縮、異常な頭蓋骨のミネラル化、ならびに肺障害と一般的に関連する。ラミノパシー性神経障害、または末梢神経障害を伴うラミノパシーも、本発明の方法による処置にとって好適である。神経ラミノパシーとしては、例えば、シャルコー・マリー・ツース病２Ｂ１型、常染色体優性大脳白質萎縮症、および常染色体優性棘筋ジストロフィーが挙げられる。
ラミンＡ／Ｃの変異によって引き起こされるラミノパシーの大部分は、横紋筋を含む。エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型、先天性筋ジストロフィー、多系統ジストロフィー症候群、拡張型心筋症１Ａ、家族性拡張型心筋症、および伝導系の欠陥を伴う拡張型心筋症は、筋ラミノパシーと診断される。筋ラミノパシーに罹患している患者は、例えば、筋肉の虚弱または消耗、選択筋肉（例えば、ふくらはぎ）の肥大、筋肉または腱の拘縮、心筋症、心伝導障害、および精神遅滞を呈する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるラミノパシーを処置する方法であって、本明細書に開示される核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、および／または医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象において、（ａ）ラミンＡポリペプチドもしくはその生物活性断片；（ｂ）ラミンＣもしくはその生物活性断片ポリペプチド（a lamin C or biologically active fragment thereof polypeptide）；（ｃ）ラミンＡポリペプチドもしくはその生物活性断片およびラミンＣポリペプチドもしくはその生物活性断片；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を発現させるための方法であって、前記対象に、本明細書に開示されるウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象における、（ａ）機能的ラミンＡポリペプチド；（ｂ）機能的ラミンＣポリペプチド；（ｃ）機能的ラミンＡポリペプチドおよび機能的ラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片の発現を増加させるための方法であって、本明細書に開示されるウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、そのような対象は、ラミノパシーと診断されたか、またはラミノパシーのリスクがあり、ラミノパシーは、シャルコー・マリー・ツース病、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、肢帯型筋ジストロフィー、ＬＭＮＡ関連先天性筋ジストロフィー、下顎骨異形成、不整脈原性右室心筋症、家族性心房細動、左室心筋緻密化障害、および拡張型心筋症のいずれか１つまたは複数である。一部の場合、（ａ）ラミンＡポリペプチド；（ｂ）ラミンＣポリペプチド；（ｃ）ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド；またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９などのウイルスまたはウイルスベクターを使用して送達される。一部の場合、それを必要とする対象は、ＬＭＮＡ、ＬＭＮＢ１、およびＬＭＮＢ２のいずれか１つまたは複数の不十分な遺伝子発現または変異を有する。
一部の場合、本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を使用する処置は、心機能の改善、心筋収縮の改善、ラミンＡおよび／もしくはラミンＣの発現増加、またはｍＴＯＲ活性の低下をもたらす。ある特定の実施形態では、本開示は、拡張型心筋症を有するか、または発症するリスクがある対象を処置するための方法を提供する。拡張型心筋症と関連する症状には、息切れ、脚の腫れ、疲労、体重増加、失神、動悸、目眩、血栓、胸痛、および／または突然死が含まれる。さらに、ＬＭＮＡ変異から生じる拡張型心筋症は、心臓における過剰活性化型ｍＴＯＲシグナル伝達をもたらす。本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を用いた処置は、ｍＴＯＲシグナル伝達の減少などの１つまたは複数の症状の改善をもたらすことができる。拡張型心筋症を発症するリスクがある対象への本明細書に記載の療法の投与は、１つまたは複数の症状の発症を防止するか、またはその進行を遅延させることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を用いた処置は、ｍＴＯＲシグナル伝達を、未処置の対象と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％減少させる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を用いた処置は、ラミンＡおよび／またはラミンＣ発現を、未処置の対象と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％増加させる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物を用いた処置を、ベータ遮断剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）、ネプリライシン（niprilysin）阻害剤、利尿剤、アルドステロンアンタゴニスト、二硝酸イソソルビド、ヒドララジン、ジゴキシン、イバブラジン、心臓再同期療法（ＣＲＴ）、植え込み型除細動器（ＩＣＤ）、外科手術、心臓移植、および／またはその組合せからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる療法と組み合わせる。
ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物を使用して、疾患、例えば、ラミノパシーを有すると診断された対象を処置することができる。種々の実施形態では、ラミノパシーは、既知の遺伝的事象（例えば、当技術分野で公知のＬＭＮＡ変異のいずれか）によって引き起こされ得るか、または未知の原因を有してもよい。対象は、筋ラミノパシーに罹患している患者であってもよい。一部の例では、対象は、拡張型心筋症を有する患者である。
ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物を使用して、疾患を発症するリスクがある対象を処置することができる。対象は、疾患、例えば、ラミノパシー（すなわち、拡張型心筋症）の素因があることが知られていてもよい。対象は、遺伝的事象に起因する、または既知の危険因子に起因する、疾患の素因があってもよい。例えば、対象は、拡張型心筋症と関連するＬＭＮＡにおける変異を保有してもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される処置は、症状、例えば、本明細書に開示されるラミノパシー症状のいずれかの減少または停止をもたらすことができる。例えば、処置は、心機能の改善、ＥＣＧ読取り値の改善、ＥＲＫ１／２下方調節、ｍＴＯＲシグナル伝達の減少、および生存時間の増加をもたらすことができる。心機能、ＥＣＧ読取り値、ＥＲＫ１／２下方調節、ｍＴＯＲシグナル伝達、生存時間増加、および他の関連するパラメーターの測定を、ラミノパシーの特定の疾患モデルにおいて実施することができる。例えば、ラミノパシー（例えば、筋ジストロフィーまたは拡張型心筋症）のいくつかのマウスモデルが開発されている。特に、Ｈ２２２Ｐ ＬＭＮＡマウスモデルは、筋ジストロフィーおよび伝導系疾患を伴う拡張型心筋症をもたらす点変異（Ｈ２２２Ｐ）を含有する。ヘテロ接合性マウス（ＬＭＮＡＨ２２２Ｐ／＋）は、新生仔または成体としての表現型を示さないが、成体ホモ接合性変異体マウス（ＬＭＮＡＨ２２２Ｐ／Ｈ２２２Ｐ）は、横紋筋に影響するヒトラミノパシーの臨床特徴と同様、筋ジストロフィーおよび伝導系疾患を伴う拡張型心筋症を発症する。例えば、Arimura T, et al. Human Molecular Genetics, 2005;14(1):155-169を参照されたい。ＬＭＮＡｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスモデルは、一定範囲の組織においてより重篤な欠陥を提示し、骨格筋が最も障害を受ける。例えば、Kim Y, Biochem Biophys Res Commun. 2013;440(1):8-13を参照されたい。ＬＭＮＡｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスモデルは、条件付きＬｍｎａノックアウトマウスを効率的に作出する、Ｌｍｎａの第２のエクソンに隣接するｌｏｘＰ部位を有する。生殖系列Ｃｒｅ発現は、出産後１６～１８日で出産後致死性を示すＬｍｎａホモ接合性変異体をもたらす。一部の実施形態では、動物モデルは、Ｈ２２２Ｐ ＬＭＮＡ変異体マウスである。一部の実施形態では、動物モデルは、ＬＭＮＡｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ変異体マウス（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのストック番号０２６２８４）である。そのような疾患モデル系を、ラミノパシーを処置するための特定の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物の探索のために使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物は、対象に静脈内または全身投与される。本明細書に記載の方法において有用であり得る他の投与形態としては、限定されるものではないが、所望の臓器（例えば、心臓）への直接送達、経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、皮下、舌下、経鼻、吸入、噴霧、皮膚、局所、全身、心筋内、経皮、および他の非経口（parental）投与経路が挙げられる。投与経路を、必要に応じて、組み合わせることができる。
Ｊ．実施例
本開示はここで一般的に記載されており、ある特定の実施形態および本開示の実施形態の例示を単に目的として含まれ、本開示を限定することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、それはより容易に理解される。
（実施例１）
ラミンＡおよびラミンＣのＬＭＮＡミニ遺伝子構築物１の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を、９００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート中に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞に、ニワトリベータアクチン（ＣＢ）プロモーターの制御下のＬＭＮＡをコードする、３マイクログラムのプラスミドＤＮＡ（ミニ遺伝子１）、またはＧＦＰ対照を一過的にトランスフェクトした。ＣＢ調節エレメントは、ニワトリベータアクチンプロモーターを組み込み、配列番号１０２に対応する。細胞を、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する標準的な方法に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、タンパク質分析のために処理した。ベータ－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｌｉ ４×緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中で細胞を溶解し、９５℃で５分間沸騰させることによって、ウェスタンブロット分析のために試料を調製した。次いで、タンパク質溶解物を、ＴＧＸゲルによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、標準的なウェスタンブロットプロトコールを使用してブロックおよび洗浄し、４℃で一晩、一次抗体でブロットした。マウス抗ラミンＡ／Ｃ（ＣＳＴ＃４７７７、１：１０００）およびマウス抗ＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＴｅｘ＃ＧＴ２３９、１：２０００）を、一次抗体として使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１６０７８、１：５０００）を、化学発光検出のための二次抗体として使用した。ラミンＣおよびラミンＡは、それぞれ、６５ｋＤａおよび７２ｋＤａで検出されたが、ＧＡＰＤＨは３７ｋＤａで検出された。
ラミンＡまたはラミンＣのみをコードする構築物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、予想通り、それぞれ対応するタンパク質の産生を示した。ＬＭＮＡミニ遺伝子構築物１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ラミンＡとラミンＣとの両方の産生を示したが、これは、単一の構築物が両方のアイソフォームを生成することができたことを示している（図６）。ミニ遺伝子２および３は、試験した条件下で両方のラミンアイソフォームを産生しなかった。
（実施例２）
ラミンＡおよびラミンＣのｍＲＮＡ発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、上記のように成長させ、一過的にトランスフェクトした。ｉＰＳ心筋細胞（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）も、一過的にトランスフェクトした。心筋細胞を、６ウェルプレートに５００，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃で２日間インキュベートした。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＲＮＡに基づく分析のために処理した。ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞ペレットから抽出し、これを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲを、ラミンＡ／Ｃ、ラミンＡまたはラミンＣ特異的プライマーセット（表５）を使用して実施して、それぞれの遺伝子の発現レベルを評価した。
ラミンＡまたはラミンＣのみをコードする構築物をトランスフェクトされた細胞は、予想通り、それぞれの対応する遺伝子に関するｍＲＮＡ転写を示した。しかしながら、ミニ遺伝子構築物１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ラミンＡとラミンＣの両方のｍＲＮＡの転写を示したが、これは、単一の構築物が両方のアイソフォームを転写することができたことを示している（図７）。
Figure 2022522196000001
 （実施例３）
心臓および肝臓組織中でのラミンＡおよびラミンＣのミニ遺伝子構築物１の産生
ラミンＡおよびラミンＣの産生を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。細胞を、上記のように成長させ、一過的にトランスフェクトし、ウェスタンブロット分析のために処理した。また、ラミンＡおよびラミンＣの産生を、１２週齢の野生型（図８、上）マウス、およびＬＭＮＡ遺伝子についてヘテロ接合性の２４週齢のマウス（ＬＭＮＡ＋／－）（図８、下）においてｉｎ ｖｉｖｏでも測定した。両方のマウス株に、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９ウイルスを投与した。組織試料を収集し、抽出後、簡易凍結し、必要となるまで－８０℃で保存した。次いで、それらを解凍し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液中、ビーズホモジェナイザーを使用してホモジェナイズし、ベータ－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｌｉ ４×緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中に再懸濁した。ウェスタンブロット分析を、上記のように実施した。
ラミンＡまたはラミンＣのみをコードする構築物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、予想通り、それぞれ対応するタンパク質のためのタンパク質を示した（図８、上）。ミニ遺伝子構築物１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ラミンＡとラミンＣとの両方の産生を示したが、これは、単一の構築物が両方のアイソフォームを生成することができたことを示している（図８、上）。ラミンＡおよびラミンＣアイソフォームは両方とも、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９ウイルスと共に投与した場合、野生型およびヘテロ接合性ＬＭＮＡ＋／－マウスにおいて検出される（図８、上および下）。内因性ＬＭＮＡレベルは、野生型とヘテロ接合性ＬＭＮＡ＋／－マウスとの両方において検出可能である。
（実施例４）
ＬＭＮＡ－／－ＫＯマウスにおける疾患表現型のレスキュー
ＬＭＮＡ－／－ＫＯ動物を、ＬＭＮＡ＋／－のオスとメスとを交配させることによって生成した。ＬＭＮＡ＋／－ｘＬＭＮＡ＋／－同腹子は、ｐ１で顔面静脈注射を受けた。顔面静脈注射を、Lampe et al. (J Vis Exp. 2014;(93):e52037)に一般的に記載されたように実施した。マウスに、１０マイクロリットルの、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９ウイルス（マウス１匹あたり２Ｅ１１個のウイルスゲノム）、またはＰＢＳを投与した。子（pup）をその母親と３週間一緒のままにしておいて、子を操作（manipulation）なしで離乳させた。
ＰＢＳ対照で処置したＬＭＮＡ－／－ＫＯマウスは、５０日未満しか生存しなかった（図９）。しかしながら、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９を投与したマウスは、８０日を超えて生存し、これは、ミニ遺伝子構築物１がＬＭＮＡ－／－ＫＯマウスにおいて通常観察される重篤な疾患表現型を実質的に軽減したことを示している。
（実施例５）
マウスにおけるラミンＡおよびラミンＣアイソフォームのｉｎ ｖｉｖｏでの発現
１２週齢のＣ５７ＢＬ／６野生型オスマウスは、尾静脈を介して、約２００マイクロリットルの、ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９、またはＰＢＳの全身投与を受けた。ＡＡＶ９調製物は、遍在性プロモーターを使用するミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９、心臓特異的プロモーター（ｃＴＮＴ）の制御下にＬＭＮＡ構築物を保有するＡＡＶ９、または遍在性プロモーター下にＧＦＰを保有するＡＡＶ９を含んでいた。４Ｅ１１ ｖｇ／マウスの低用量または２Ｅ１２ ｖｇ／マウスの高用量を使用した。全ての動物を処理し、注射後６週間で試料を採取した。心臓および肝臓組織を回収し、後の実験のために標準的な方法を使用して保存した。
組織を、抽出後、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に保持し、必要となるまで－８０℃で保存した。次いで、それらを解凍し、ビーズホモジェナイザーを使用してＲＬＴ緩衝液中でホモジェナイズした。ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＴＲＵｓｅｑ ｃＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＲＮＡ抽出物からｃＤＮＡライブラリーを産生し、Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００プラットフォーム上でＮＧＳシーケンシングにかけ、分析した。
ミニ遺伝子構築物１を保有するＡＡＶ９（遍在性プロモーター）を投与したマウスは、心臓と肝臓との両方においてラミンＡおよびラミンＣの発現を示した（図１０Ａ）。予想通り、心臓特異的プロモーター（ｃＴＮＴ）の制御下のＬＭＮＡを投与したマウスは、肝臓ではなく、心臓においてラミンＡおよびラミンＣの発現を示した（図１０Ｂ）。遍在性プロモーターの制御下の高用量のＬＭＮＡは、マウスにおいてはいくらかの肝臓毒性を示し、血清バイオマーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ビリルビン、クレアチンなど）の測定によって別々に確認された。低用量動物は健康であった。
（実施例６）
ＣＭＶプロモーターを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのラミンＡおよび／またはラミンＣの発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞に、ＣＭＶプロモーターの制御下にＬＭＮＡをコードするＤＮＡ、またはＧＦＰ対照を一過的にトランスフェクトした。細胞を、標準的な方法に従ってトランスフェクトした。細胞を培養した後、トリプシン処理し、遠心分離し、タンパク質分析のために処理した。
細胞を溶解し、９５℃で沸騰させることによって、ウェスタンブロット分析のために試料を調製した。次いで、タンパク質溶解物をゲル分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、標準的なウェスタンブロットプロトコールを使用してブロックおよび洗浄し、４℃で一晩、一次抗体でブロットした。マウス抗ラミンＡ／Ｃおよびマウス抗ＧＡＰＤＨを、一次抗体として使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを、化学発光検出のための二次抗体として使用した。ラミンＣおよびラミンＡは、それぞれ、６５ｋＤａおよび７２ｋＤａで検出されたが、ＧＡＰＤＨは３７ｋＤａで検出された。
ラミンＡのみ、またはラミンＣのみをコードする構築物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、それぞれ対応するタンパク質についてのタンパク質を示した（図１２）。ラミンＡ／Ｃ配列を有するＬＭＮＡミニ遺伝子構築物（ミニ遺伝子構築物１のラミンＡ／Ｃ配列を参照されたい）をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、単一の構築物が両方のアイソフォームを生成することができたことを示している（図１２）。
（実施例７）
ラミンＡおよびラミンＣのｍＲＮＡ発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実施例６に記載のように成長させ、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＲＮＡに基づく分析のために処理した。ＲＮＡを、標準的な抽出を使用して細胞ペレットから抽出し、これを使用して、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲを、ラミンＡ／Ｃ、ラミンＡ特異的プライマーセットを使用して実施して、それぞれの遺伝子の発現レベルを評価した。
ラミンＡのみ、またはラミンＣのみをコードする構築物をトランスフェクトされた細胞は、それぞれの対応する遺伝子に関するｍＲＮＡ転写を示した。しかしながら、ラミンＡ／Ｃ配列（ミニ遺伝子構築物１のラミンＡ／Ｃ配列を参照されたい）を有するＬＭＮＡミニ遺伝子構築物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ラミンＡとラミンＣとの両方のｍＲＮＡの転写を示し、これは、単一の構築物が両方のアイソフォームを転写することができたことを示している。
Ｋ．配列
Figure 2022522196000002
Figure 2022522196000003
Figure 2022522196000004
Figure 2022522196000005
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Figure 2022522196000042
Figure 2022522196000043
 参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (83)

  1. ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくともイントロン８またはイントロン１１を含む核酸構築物。
  2. イントロン８が、配列番号７７のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. イントロン１１が、配列番号８０のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  4. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  5. イントロン１０が、配列番号７９のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸構築物。
  6. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  7. イントロン９が、配列番号７８のヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の核酸構築物。
  8. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８および１１を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  9. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  10. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  11. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８、９、１０、および１１を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  13. 野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  14. 野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７を欠如する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  15. 野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９をさらに含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  16. 野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１０をさらに含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応する少なくとも１つのイントロンを欠如する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  17. 野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１を含み、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７を欠如する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  18. 調節エレメントが、５００塩基対未満またはそれに等しい塩基対を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  19. 前記調節エレメントが、９００塩基対未満またはそれに等しい塩基対を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  20. 前記調節エレメントが、８００塩基対（ｂｐ）未満もしくはそれに等しい、７００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、６００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、５００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  21. 前記調節エレメントが、配列番号３０～５８のいずれか１つ、配列番号１０２、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、ＭＬＣ－２、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  22. 前記調節エレメントが、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  23. 前記調節エレメントが配列番号３３である、請求項２１に記載の核酸構築物。
  24. 前記調節エレメントがＣＢＡである、請求項２１に記載の核酸構築物。
  25. 前記調節エレメントがｍｉｎＣＭＶである、請求項２１に記載の核酸構築物。
  26. 前記調節エレメントが細胞型選択的である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  27. 前記調節エレメントが心筋細胞において選択的に発現される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  28. 前記調節エレメントが、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、またはＭＬＣ－２のいずれか１つまたはその組合せである、請求項２７に記載の核酸構築物。
  29. 前記調節エレメントがｃＴＮＴである、請求項２６に記載の核酸構築物。
  30. 前記ｃＴＮＴ調節エレメントが配列番号１０１を含む、請求項２９に記載の核酸構築物。
  31. 配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  32. 配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  33. 配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  34. 配列番号３もしくは配列番号８の配列、またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  35. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする、請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  36. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＡポリペプチドまたはその生物活性断片、および配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むラミンＣポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする、請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  37. 前記ヌクレオチド配列がポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  38. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むウイルスベクター。
  39. ラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、野生型ヒトＬＭＮＡ遺伝子の少なくともイントロン８またはイントロン１１を含む、ウイルスベクター。
  40. （ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２、および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター。
  41. （ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２、および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター。
  42. （ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２、ならびに（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８およびイントロン１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター。
  43. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン９および１０の１つまたは複数をさらにコードする、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  44. （ａ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のエクソン１～１２、および（ｂ）野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン８～１１をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター。
  45. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも８０％同一である、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  46. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９０％同一である、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  47. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３もしくは配列番号８のヌクレオチド配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片と少なくとも９５％同一である、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  48. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３もしくは配列番号８の配列またはそのコドン最適化バリアントおよび／もしくは断片である、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  49. 前記ヌクレオチド配列が、ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする、請求項３８～４８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  50. 前記ヌクレオチド配列が、ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＡポリペプチド、およびｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するラミンＣポリペプチドをコードする、請求項３８～４８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  51. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２～１９、または２１のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項３８～５０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  52. 前記ヌクレオチド配列が、野生型ＬＭＮＡ遺伝子のイントロン１～７に対応するヌクレオチド配列を含まない、請求項３８～５１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  53. 前記ヌクレオチド配列が調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項３８～５２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  54. 前記ヌクレオチド配列が、５００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項３８～５３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  55. 前記ヌクレオチド配列が、９００ｂｐ未満を有する調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項３８～５３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  56. 前記ヌクレオチド配列が、８００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、６００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、５００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、４００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、３００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、２００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１５０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１４０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１３０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１２０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１１０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、１００ｂｐ未満もしくはそれに等しい、７０ｂｐ未満もしくはそれに等しい、または５０ｂｐ未満もしくはそれに等しいｂｐを有する調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項３８～５５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  57. 前記調節エレメントが、配列番号３０～５８のいずれか１つ、配列番号１０２、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ－ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、ＭＬＣ－２、ＣＡＧ、またはＥＦＳのいずれか１つまたはその組合せである、請求項５３～５６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  58. 前記調節エレメントが、配列番号３１、配列番号３３、ＣＢＡ、またはｍｉｎＣＭＶのいずれか１つまたはその組合せである、請求項５３～５６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  59. 前記調節エレメントが配列番号３３である、請求項５３～５８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  60. 前記調節エレメントがＣＢＡである、請求項５３～５８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  61. 前記調節エレメントがｍｉｎＣＭＶである、請求項５３～５８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  62. 前記調節エレメントが細胞型選択的である、請求項５３～５９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  63. 前記調節エレメントが、ニューロン細胞、網膜細胞、腎細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、または心筋細胞において選択的に発現される、請求項５３～６２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  64. 前記調節エレメントが心筋細胞において選択的に発現される、請求項５３～６３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  65. 前記調節エレメントが、Ｍｙｈ６、デスミン、ｃＴｎＴ、α－ＭＨＣ、またはＭＬＣ－２のいずれか１つまたはその組合せである、請求項６４に記載のウイルスベクター。
  66. 前記調節エレメントがｃＴＮＴである、請求項６２６５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  67. 前記ｃＴＮＴ調節エレメントが配列番号１０１を含む、請求項６５または６６に記載の核酸構築物。
  68. 前記ヌクレオチド配列がポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項３８～６７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  69. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３８～６８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  70. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ２、ｓｃＡＡＶ５、ｓｃＡＡＶ６、ｓｃＡＡＶ８、またはｓｃＡＡＶ９である、請求項６９に記載のウイルスベクター。
  71. 前記ヌクレオチド配列が、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項６９または７０に記載のウイルスベクター。
  72. 請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含むウイルス粒子。
  73. ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項７２に記載のウイルス粒子。
  74. 前記ＡＡＶがＡＡＶ６またはＡＡＶ９である、請求項６９～７３のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  75. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、または請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子を含む宿主細胞。
  76. 請求項１～３６のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、請求項７５に記載の宿主細胞、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  77. 対象におけるラミノパシーを処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～３７のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、請求項７５に記載の宿主細胞、または請求項７６に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
  78. 対象においてラミンＡポリペプチドおよびラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片を発現させる方法であって、前記対象に、請求項１～３６のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、請求項７５に記載の宿主細胞、または請求項７６に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
  79. 対象において機能的ラミンＡポリペプチドおよび機能的ラミンＣポリペプチド、またはその生物活性バリアントおよび／もしくは断片の発現を増加させる方法であって、前記対象に、請求項１～３６のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項３８～７１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、請求項７２～７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、請求項７５に記載の宿主細胞、または請求項７６に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
  80. 前記対象がラミノパシーに罹患している、請求項７８または７９に記載の方法。
  81. 前記ラミノパシーが、シャルコー・マリー・ツース病、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、肢帯型筋ジストロフィー、ＬＭＮＡ関連先天性筋ジストロフィー、下顎骨異形成、不整脈原性右室心筋症、家族性心房細動、左室緻密化障害、または拡張型心筋症のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項７７または８０に記載の方法。
  82. 前記核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物が、心筋内、静脈内、筋肉内、髄腔内、皮下、全身、または心筋に局所投与される、請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物が、静脈内または全身投与される、請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。
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