KR20230026986A - 코돈 최적화된 gla 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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데이비드 H. 크린
멜리사 코터맨
피터 프랜시스
데이비드 샤퍼
폴 시만스키
케빈 휘틀시
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4디 몰레큘러 테라퓨틱스 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 코돈 최적화된 알파-갈락토시다아제 A(alpha-galactosidase A)를 포함하는 인간 알파-갈락토시다아제 A, 벡터 및 숙주 세포를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열, 및 인간 알파-갈락토시다아제 A를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 파브리병(Fabry disease)과 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

코돈 최적화된 GLA 유전자 및 이의 용도
코돈 최적화된 GLA 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 배경
파브리병(Fabry disease)은 GLA 유전자(α-갈락토시다아제(galactosidase) A, AGA를 인코딩)의 돌연변이로 인해 AGA 효소 활성이 감소되거나 결여되어 결과적으로 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(Gb3)가 축적되는 X-연관 장애이다. Gb3는 심근세포 및 내피 세포(신장/심장/뉴런(neuron))에 대한 세포독성으로 간주되어 상당한 이환율과 기대 수명 단축을 초래한다. 재조합 AGA(ERT)의 투여는 일부 조직에서 질병 진행을 늦추는 것으로 보인다. 예를 들어 심장에서와 같은 세포로의 열악한 흡수로 인해, 상당한 미충족 의학적 요구가 남아 있다. 또한 심혈관 질환은 파브리병에서 가장 흔한 사망 원인으로 남아 있다(모든 알려진 사망의 75%). 따라서, GLA 세포를 자율적으로 발현하여, Gb3를 감소시켜 임상 결과를 개선하는 주요 조직을 표적으로 하는 단일 투여 정맥내 유전자 치료제와 같은 내구성 치료에 대한 강력한 요구가 존재한다.
심장 유전자 요법과 관련된 한 가지 장애는 정맥내 투여 후 인간 심근세포의 불충분한 형질도입이다. 현재 개발 중인 AAV 벡터는 주로 간으로 이동하며 심장 조직을 대상으로 하지 않는다. 야생형 AAV1은 임상적으로 평가되었지만, 궁극적으로 위약(placebo)과 비교하여 재발성 심부전 사건의 1차 종점에서 개선을 가져오지 못했다. 신규한 심장 표적화된 AAV 변이체는 파브리병 심근증(cadiomyophty)의 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
발명의 요약
인간 갈락토시다아제 A(AGA) 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산 분자가 개시된다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 이는 서열 식별 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 AGA 폴리펩타이드를 인코드 한다. 일부 실시 양태에서, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산이 제공된다. 관련 실시 양태에서, 핵산은 다른 동일한 세포에서 야생형 GLA 핵산 서열(예를 들어, 서열 식별 번호 3)의 발현 수준과 비교하여 더 높은 수준으로 발현된다. 서열 식별 번호 3(consensus CDS sequence no. CCDS14484.1; www.uniprot.org/uniprot/Q7X1P3)은 하기에 표시된다:
ATGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACATCTGGGCTGCGCGCTTGCGCTTCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATCCCTGGGGCTAGAGCACTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTTTAA(서열 식별 번호 3)
일부 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 코돈 최적화된 핵산 분자는 야생형 GLA cDNA(GenBank 수탁번호 NM_000169.3; 서열 식별 번호 3)의 것에 비해 증가된 인간 코돈 적응 지수((codon adaptation index)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 코돈 최적화된 핵산 분자는 적어도 약 0.80, 적어도 약 0.83, 적어도 약 0.85, 적어도 약 0.88, 적어도 약 0.90, 적어도 약 0.92 또는 적어도 약 0.93의 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
특정 실시 양태에서, 핵산은 서열 식별 번호 3의 G/C 뉴클레오타이드의 백분율에 비해 더 높은 비율의 G/C 뉴클레오타이드를 함유한다. 다른 실시 양태에서, 핵산은 적어도 약 49%, 적어도 약 51%, 적어도 약 53%, 적어도 약 55%, 적어도 약 57%, 적어도 약 57.9% 또는 약 57.9%인 G/C 뉴클레오타이드의 백분율을 함유한다.관련 실시 양태에서, 핵산은 약 49% 내지 60%, 약 50% 내지 59%, 약 55% 내지 59% 또는 약 57% 내지 약 59%인 G/C 뉴클레오타이드의 백분율을 함유한다.
다른 실시 양태에서, 핵산은 서열 식별 번호 3에 비해 하나 이상의 최적화된 파라미터: 최적 코돈의 빈도; 직접 반복 서열의 최대 길이의 감소; 제한 효소의 제거, CIS-작용 요소의 제거, 및 탈안정화 요소의 제거를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 핵산은 적어도 하나의 전사 제어 서열, 바람직하게는 핵산에 이종성인 전사 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 전사 제어 서열은 예를 들어 심장 또는 골격근 세포에서 핵산의 세포-특이적 발현을 초래하는 세포-또는 조직-특이적 프로모터이다. 다른 측면에서, 전사 제어 서열은 많은 세포 유형(예를 들어, CAG, CBA(chicken beta actin)(치킨 베타 액틴) 또는 CMV 프로모터)에서 핵산의 유사한 발현 수준을 초래하는 구성적 프로모터(constitutive promoter)이다. 바람직한 실시 양태에서, 전사 제어 서열은 (i) 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 프로모터, 치킨 베타-액틴 유전자의 제 1 엑손(exon) 및 제 1 인트론(intron) 및 (iii) Miyazaki et al., Gene 79(2):269-77(1989)에 기재된 바와 같은 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스(splice) 수용체를 포함하는 CAG 프로모터를 포함한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, CAG 프로모터는 서열 식별 번호 5의 서열을 포함하거나 이와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG(서열 식별 번호 5)
관련 실시 양태에서, 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 카세트가 본원에 제공된다.
관련 실시 양태에서, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 바람직한 실시 양태에서, 벡터는 재조합 아데노-관련(rAAV) 발현 벡터이다. 일부 실시 양태에서, rAAV 벡터는 천연 캡시드(예를 들어, AAV 혈청형 1, AAV 혈청형 2, AAV 혈청형 6, 또는 AAV 혈청형 8의 캡시드)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, rAAV 벡터는 천연 AAV 캡시드(예를 들어, 혈청형 1, 2, 6 또는 8의 AAV 캡시드에 비해 하나 이상의 변형을 포함함)에 대해 변형된(예를 들어, 하나 이상의 펩타이드 삽입 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 티로신(tyrosine)에서 페닐알라닌(phenylalanine)으로) 및/또는 아미노산 삽입 또는 아미노산 삭제) 캡시드를 포함한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV 벡터는 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 캡시드를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 제한 없이 CHO 세포, HEK293 세포, 및 HEK293T 세포, HeLa 세포, BHK21 세포, Vero 세포 또는 V27 세포를 포함하는 포유동물 세포이다. 다른 양태에서, 숙주 세포는 심장 또는 골격근 세포(예를 들어, 근모세포(myoblast), 골격근 섬유아세포(skeletal muscle fibroblast), 골격근 위성 세포(skeletal muscle satellite cell), 심근세포(cardiomyocyte), 심장 섬유아세포(cardiac fibroblast), 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell), 평활근 세포 내피(smooth muscle cell endothelial) 및/또는 횡격막 근육 세포(diaphragm muscle cell)이다. 관련 실시 양태에서, 본 개시 내용은 서열 식별 번호 2의 폴리펩타이드가 핵산 분자에 의해 발현되는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 서열 식별 번호 2의 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩타이드의 발현은 서열 식별 번호 3(비교자 서열(comparator sequence))의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 기준 핵산(reference necleric acid)을 포함하는 동일한 조건하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가된다.
다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하며, 서열 식별 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 분리된 핵산 분자를 대상체에게 투여하는, 인간 대상체에서 서열 식별 번호 2의 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩타이드의 발현은 서열 식별 번호 3의 뉴클레오타이드 서열(비교자 서열)을 포함하는 기준 핵산 분자 또는 기준 핵산 분자를 포함하는 벡터에 비해 증가된다.
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 개시된 핵산 분자 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 불충분한 GLA 활성과 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 장애는 파브리병(fabry disease)이다.
도 1. 파브리병 섬유아세포가 없는 AGA 단백질. 야생형 및 파브리병에 걸린 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석이 표시된다. Fabry 섬유아세포의 용해물은 질병 돌연변이(W162X)의 징후인, AGA 단백질 발현(49kDa)이 부족했다. 샘플을 총 단백질에 대해 정규화하고 겔에 동일하게 로딩했다. 맨 왼쪽에 있는 표준 단백질 래더(ladder). hrAGA: 인간 재조합 AGA, WT: 야생형, AGA: 알파 갈락토시다아제, kDa: 킬로달톤(kilodalton).
도 2A-B. 파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells) 특성화. 유도 만능 줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍된 파브리병에 걸린 섬유아세포(도 2A)는 임계 만능 전사 인자, Nanog(좌측, 적색), Oct4(중간, 녹색) 및 Sox2(우측, 적색), DAPI(핵, 청색)를 발현한다(상단 패널). Fabry iPSC는 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 세 가지 배엽 모두로 분화하고, 각 배엽, β-튜불린 III(좌측, 녹색), HNF-α(중간, 적색) 및 α-평활근 액틴(좌측, 적색)에 해당하는 계통 마커(lineage maker)를 각각 발현했다; DAPI(핵, 청색)(하단 패널). 스케일 바 = 100μm. HNF4a: 간세포 핵 인자 4 알파. Fabry iPSC의 핵형 분석은 정상적인 인간 남성 밴딩(banding) 및 염색체 배열을 나타낸다(도 2B).
도 3A-B. 파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포 특성화. 파브리병에 걸린 iPSC의 심근세포로의 분화는 유동 세포분석(flow cytometry)에 의해 검사되고 IgG 대조군을 사용하여 게이팅될 때 97% cTNT 양성 세포 집단이 생성됐다. 산점도는 게이팅 방식을 보여주는 대표적인 플롯이다(도 3A). cTNT(적색) 및 DAPI(청색), 핵 염색을 사용한 면역세포화학(Immunocytochemistry)에 따른 Fabry iPSC 심근세포의 대표적인 이미지(도 3B). 스케일 바=100μm. cTNT: 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 심근세포 마커. n=3, 생물학적 복제물.
도 4A-C. (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 입자로 파브리병에 걸린 iPSC-심근세포의 형질도입. AGA 단백질의 발현을 유도한다. 면역세포화학(Immunocytochemistry)(ICC)은 AAV로 형질도입된 Fabry iPSC 심근세포에서 심장 트로포닌 T(cTnT)(녹색), 알파-갈락토시다아제(적색) 및 Hoechst로 대조염색된 핵(청색)의 발현을 나타냈다(도 4A). AAV로 형질도입된 Fabry iPSC 심근세포를 cTnT 및 알파-갈락토시다아제로 공동-염색하여 AGA를 발현하는 Fabry iPSC 심근세포의 백분율을 측정했다(도 4B). AAV로 형질도입한 후 Fabry iPSC 심근세포의 웨스턴 블롯 분석에 의해 보여진 AGA 단백질의 강력한 발현(도 4C). AGA: 알파 갈락토시다아제, MOI: 감염 다중도, NT: 비-형질도입, Gb3: 글로보트리아오실세라마이드, n=3, 에러 바(bar) ± 표준 편차; NT와 대비 **** p<0.0001, †† p<0.001, MOI 25와 대비 †p<0.01, NT와 대비 일원 분산 분석(ANOVA), Tukey 사후검정(post-hoc).
도 5A-5B. 파브리병에 걸린 iPSC-심근세포에서 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 형질도입한 후 향상된 AGA 활성. AAV로 형질도입된 Fabry iPSC 심근세포는 AGA 활성에서 용량 의존성 증가를 나타냈다. 각 실행에 대한 키트 및 플레이트 판독기 내의 고유한 가변성으로 인해 3개의 생물학적 복제물이 개별적으로 정량화 된다. 기술적 복제는 각 실험 내에서 수행됐다(도 5A). 글로보트리아오실세라마이드(Gb3, 분홍색) 및 Hoechst로 대조염색된 핵(청색)의 ICC(도 5B). AGA=알파 갈락토시다아제, MOI=감염 다중도, NT=비형질도입, Gb3=글로보트리아오실세라마이드, n=3, 에러 바 ± 표준 편차; NT와 대비 **** p<0.0001, *** p<0.004, ** p=0.005, †††† p<0.0001, ††† p=0.0001, †† p<0.004; MOI 25와 대비 † p<0.02, MOI 100와 대비 # p<0.02. NT와 대비 일원 분산 분석(ANOVA), Tukey 사후검정.
도 6A-6B. 파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포-유래 내피 세포의 특성화. 도 6A: 파브리병 iPSC가 내피 세포로 분화된 21일째는, 유동 세포분석에 의해 검사되고 IgG 대조군을 사용하여 게이팅 될 때, 99.2% CD31 양성 세포 및 87.9% CD144 양성 세포 집단을 생성했다. 도 6B: 벡터 특성화에 사용된 배양물에서 면역세포화학에 의한 CD31(녹색) 발현. 세포는 DAPI로 대조염색됐다(청색). 스케일 바=100μM.
도 7A-7B. (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 파브리병 iPSC-내피 세포의 형질도입은 유동 및 웨스턴에 의한 외인성 AGA의 발현을 유도한다. 도 7A는 rAAV로 형질도입된 Fabry 내피 세포에서 형질도입 후 4일째에 살아있는 CD31+/CD144+ 집단에서 AGA 단백질의 유동 세포분석 발현을 예시한다. 도 7B: rAAV로 형질도입한 후 Fabry iPSC-유래 내피 세포의 웨스턴 블롯 분석에 의해 보여진 AGA 단백질의 강력한 발현. 히스토그램의 밴드 농도 측정. AGA=알파 갈락토시다아제, MOI=감염 다중도, NT=비-형질도입, Gb3=글로보트리아오실세라마이드, n=3, 에러 바 = 표준 편차; **** p<0.0001, 전임(precessor) MOI과 대비 * p<0.05, NT와 대비 일원 분산 분석, Tukey 사후검정.
도 8A-8B. 파브리병에 걸린 iPSC-내피 세포에서 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 형질도입한 후 향상된 AGA 활성. 도 8A: AGA 활성은 형질도입 후 4일째에 AGA 활성 분석에 의해 정량화됐다. rAAV로 형질도입된 Fabry iPSC-EC는 비-형질도입된 Fabry 내피 세포보다 더 많은 AGA 활성을 가졌다. 도 8B: 글로보트리아오실세라마이드(Gb3, 분홍색) 양성 세포 및 DAPI로 대조염색된 핵(청색)의 ICC. GLA=알파 갈락토시다아제, MOI=감염 다중도, NT=비-형질도입, Gb3=글로보트리아오실세라마이드, n=3, 에러 바 = 표준 편차; 선행(preceding) MOI들(500, 100, 50 및 NT_ 위에서 아래로)와 대비 * p<0.05 또는 ** p<0.001, 일원 분산 분석, Tukey 사후검정. 각각 3개의 실험 및 3개의 기술적 복제.
도 9A-9B. 파브리병의 마우스 모델에서 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 형질도입한 후 AGA 활성. 도 9A: 단일 정맥내 용량 후 야생형 및 Fabry 마우스 혈장에서의 AGA 활성. 도 9B: 단일 정맥내 용량 후 야생형 및 Fabry 마우스 조직에서의 AGA 활성. 평균 ± 표준 편차; * Vehicle-WT와 대비 p<0.01, Vehicle-KO와대비 # p<0.01. WT=야생형 마우스, KO=파브리병 마우스(녹아웃(knock-out)).
도 10. (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 단일 정맥내 용량 후 8주째에 정상(WT) 또는 Fabry(KO) 마우스의 조직에서 IHC에 의한 AGA의 검출. AGA에 대한 IHC 염색(짙은 갈색 색상)을 보여주는 4개의 조직(심장, 신장, 간 및 소장)의 대표적인 이미지. 각 조직에 대한 IHC 염색은, 비히클(vehicle)로 치료된 야생형 마우스 또는 비히클로 치료된 Fabry 마우스와 비교해 파브리병 마우스 모델에서, (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 단일 정맥내 용량 후 AGA 검출에서 용량-의존성 증가를 보여준다. IHC는 그룹당 n = 3마리의 동물로부터 수집된 조직에 대해 수행됐다.
도 11. 혈장 내 LysoGb3 수준. (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 이전 도면에 기술된 바와 같은 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 단일 정맥내 용량 후 혈장에서의 LysoGb3 감소. 비히클로 치료된 C57BL/6(WT) 또는 GLA null(KO) 동물, 또는 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA를 보유하는 rAAV의 표시된 용량으로 치료된 GLA null 동물 중 어느 하나의 그룹당 총 n = 15로부터 혈장에서 측정된 lysoGb3(m/z 786) 및 그의 유사체(m/z 784, m/z 802 및 m/z 804)의 평균 총 농도. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. *는 비히클-치료된 GLA null과 대비 P<0.01을 나타낸다.
도 12. 조직에서 Gb3 분석. 조직은 비히클 또는 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) IV 주사 후 56일째에 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(이전 도면에 기재된 바와 같음)을 포함하는 rAAV의 증가하는 용량으로 치료된 C57BL/6(WT) 또는 GLA-null(KO) 마우스로부터 n=6(심장) 또는 n=12(신장, 소장, 간)에서 수집했다. 바(bar)는 측정된 모든 Gb3 종의 평균 반응 비율(response ratio)을 나타낸다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. *는 그룹 2("KO-Vehicle")와 대비할 때 P<0.005를 나타낸다.
도 13은 각각의 특정된 용량으로 4D-310((i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV)의 단일 정맥내 투여 후 야생형 C57BL/6 마우스의 혈장에서 GLA 활성을 그래프로 기술한다.
도 14는 각각의 특정된 용량으로 4D-310((i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV)의 단일 정맥내 투여 후 야생형 C57BL/6 마우스의 특정된 조직에서 GLA 활성을 그래프로 기술한다.
도 15는 비-인간 영장류에게 특정된 용량의 4D-310, 비히클 대조군 또는 C102.EGFP(서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 EGFP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV)를 단일 정맥내 투여한 후 주요 Fabry 조직에 대한 4D-310(qPCR에 의한)의 생물학적 분포(biodistribution)를 예시한다.
도 16은 특정된 용량 각각에서 4D-310의 단일 정맥내 투여 후, 투여량별로 배열된 NHP 혈장의 AGA를 예시한다.
도 17은 특정된 용량 각각에서 4D-310의 단일 정맥내 투여 후 동물별로 배열된 NHP 혈장의 AGA를 예시한다.
도 18은 특정된 용량 각각에서 4D-310의 단일 정맥내 투여 후, 투여량별로 배열된 Fabry-관련 NHP 조직에서 AGA(비히클 대조군에 대한)의 배수-변화(fold-change)를 예시한다.
도 19는 5 x 1013 vg/kg 용량에서 4D-310의 단일 정맥내 투여 후 동물별로 배열된 Fabry-관련 NHP 조직에서 AGA(비히클 대조군에 대한)의 배수-변화를 예시한다.
도 20은 비-인간 영장류에 대한 4D-310의 특정된 용량의 단일 정맥내 투여 후 GLA RNA 발현(RT-qPCR에 의한)의 생물학적 분포를 예시한다.
도 21A-B는 5 x 1013 vg/kg 용량으로 단일 정맥내 투여 후 비히클-치료 또는 4D-310-치료 NHP의 심장 조직에서 AGA의 IHC 검출을 나타낸다. 도 21A는 좌심실에서의 AGA 활성을 도시하고; 도 21B는 심실 중격에서의 AGA 활성을 도시한다.
도 22A-B는 5 x 1013 vg/kg 용량의 단일 IV 투여 후 비히클-치료 또는 4D-310-치료 NHP의 간(도 22A) 및 신장(도 22B) 조직에서 AGA의 IHC 검출을 나타낸다. 비히클 동물에서 높은 내인성 수준에 걸쳐 치료된 동물에서 AGA 활성의 상향조절이 나타난다.
정의
본원에 사용된 "코돈 적응 지수"는 코돈 사용 편향(bias)의 척도를 지칭한다. 코돈 적응 지수(codon adaptation index)(CAI)는 기준 유전자 세트에 대한 주어진 단백질 코딩 유전자 서열의 편차를 측정한다(Sharp P M and Li W H, Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95 (1987)). CAI는 유전자 서열의 길이에 걸쳐 각 코돈과 연관된 무게의 기하 평균을 결정함으로써 계산된다(코돈에서 측정):
Figure pct00001
각 아미노산에 대해, CAI에서 각 코돈의 무게는, 관찰된 코돈 빈도(fi)와 해당 아미노산에 대한 동의 코돈(synonymous codon) 빈도(fj) 사이의 비율로 계산된다:
Figure pct00002
용어 "분리된(isolated)"은 그의 기원 환경(자연적으로 존재하는 환경)에서 제거된 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)을 지정한다. 예를 들어, 식물 또는 동물에서 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오타이드는 분리되지 않지만, 그것이 자연적으로 존재하는 인접 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드는 "분리된" 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 구성된 폴리뉴클레오타이드의 일부이다. 비록 "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만 임의의 측면 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 부위(terminator), 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 코딩 영역의 경계는 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단의 시작 코돈 및 생성된 폴리펩타이드의 카르복실 말단을 인코딩하는 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 전형적으로 결정된다. 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 구조물에, 예를 들어, 단일 벡터에, 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 구조물에, 예를 들어, 별개의 (상이한) 벡터에 존재할 수 있다. 따라서 단일 벡터는 단일 코딩 영역만 포함할 수 있거나 둘 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 전사, RNA 프로세싱, 안정성, 또는 연관된 코딩 영역의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 분자"와 상호교환 가능하며 뉴클레오타이드의 중합체를 의도한다.
유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 회합(association)에서 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역은 유전자 산물의 발현이 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 놓이도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 회합된다. 예를 들어, 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우, 및 프로모터와 코딩 영역 사이의 연결 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형(templete)의 능력을 방해하지 않는 경우, 코딩 영역과 프로모터는 "작동 가능하게 회합" 된다. 프로모터 외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 또한 유전자 산물 발현을 지시하기 위해 코딩 영역과 작동 가능하게 회합될 수 있다.
"전사 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열을 지칭한다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 제한없이, 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께 전 초기(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들어, Rous 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 세그먼트와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역을 포함한다. 다른 전사 제어 영역에는 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열뿐만 아니라 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 베타-글로빈과 같은 척추동물 유전자에서 유래된 것을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인(lymphokine)-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도될 수 있는 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 피코르나바이러스(picornaviruses)에서 유래된 요소(특히, 내부 리보솜 진입 부위, 또는 CITE 서열로 지칭되는 IRES)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 지칭한다. 이는 폴리뉴클레오타이드의 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본원에 사용된 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱이 있는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 추가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합 또는 단백질 분해 절단이 있는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
"벡터"는 핵산의 숙주 세포 내로의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 분절(segment)의 복제를 가져오기 위해 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. 용어 "벡터"는 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵생물 바이러스, 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 공지되어 있고 당업계에 사용된다. 적절한 벡터로의 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편(fragment)을 상보적 응집 말단을 갖는 선택된 벡터에 결찰함으로써 달성될 수 있다.
벡터는 벡터를 포함하는 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택 가능한 마커(marker) 또는 리포터(reporter)를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선택 가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 함유된 다른 코딩 영역을 통합하고 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 암피실린(ampicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 바이알라포스 제초제(bialaphos herbicide), 설폰아미드(sulfonamide) 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자(anthocyanin regulatory genes), 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자(isopentanyl transferase gene) 등을 포함한다. 당업계에 공지되고 사용되는 리포터의 예는 루시페라아제(luciferase)(Luc), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase)(CAT), β-갈락토시다아제(galactosidase)(LacZ), β-글루쿠로니다제(glucuronidase)(Gus) 등을 포함한다. 선택 가능한 마커도 리포터로 간주될 수 있다.
사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 헤르페스바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-바이러스 벡터에는 플라스미드, 리포솜, 전하를 띤 지질(사이토펙틴(cytofectins)), DNA-단백질 복합체 및 생체고분자(biopolymer)가 포함된다.
"프로모터"와 "프로모터 서열"은 혼용되어 사용되며 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 완전히 천연 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성되거나, 합성 DNA 분절을 포함할 수도 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 경우 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터를 일반적으로 "구성적 프로모터"라고 지칭한다. 유전자가 특정 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 특정 발달 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 빛 등으로 세포를 노출 또는 치료한 후 유도되어 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절 가능한 프로모터"라고 한다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에 길이가 다른 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
용어 "플라스미드"는 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 보유하고 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 존재하는 염색체 외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열, 선형, 원형 또는 초나선형일 수 있으며, 이는 임의의 공급원으로부터 유래되며, 다수의 뉴클레오타이드 서열이 적절한 3' 비번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구조로 연결되거나 재조합된다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 특정 백분율 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬될 때, 두 서열을 비교할 때 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일함을 의미한다. 서열 유사성은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 월드 와이드 웹(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 이용 가능한 BLAST를 포함하는 컴퓨터 프로그램 및 방법을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은 미국 위스콘신주 매디슨의 GCG(Genetics Computing Group) 패키지로 사용 가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 기타 기술은 Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc. 에 기재됐다. 특히 흥미로운 것은 서열의 간격을 허용하는 정렬 프로그램이다. Smith-Waterman은 서열 정렬의 간격을 허용하는 알고리즘 유형 중 하나이다. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)를 참조. 또한 Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 참조.
용어 "4D-310"은 (i) 서열 식별 번호 4의 아미노산을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6으로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 AAV 비리온을 지칭한다. 서열 식별 번호 6의 뉴클레오타이드 서열은 서열 식별 번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
용어 "4D-C102" 또는 "C102"는 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 지칭한다.
용어 "GLA" 및 "AGA"는 알파-갈락토시다아제를 인코딩하는 유전자 및 인코딩된 단백질을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호 2(인간 AGA, 429개의 아미노산으로 구성되고 GenBank 수탁번호 X14448.1 및 U78027에서 사용 가능함)의 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 핵산 분자를 제공하며, 여기서 핵산 서열은 코돈 최적화됨. 또 다른 실시 양태에서, 서열 식별 번호 2의 폴리펩타이드를 인코딩하고 코돈 최적화의 대상이 되는 출발 핵산 서열은 서열 식별 번호 3으로 표시된 뉴클레오타이드 서열 세트를 갖는다. 바람직한 실시 양태에서, 서열 식별 번호 2의 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열은 인간 발현에 최적화된 코돈이다. 서열 식별 번호 1은 인간 발현에 최적화된 서열 식별 번호 3의 코돈 최적화된 버전이다:
ATGCAGCTGCGGAATCCTGAACTGCACCTGGGATGTGCCCTGGCTCTGAGATTTCTGGCCCTGGTGTCTTGGGACATCCCTGGCGCTAGAGCCCTGGATAATGGCCTGGCCAGAACACCTACAATGGGCTGGCTGCACTGGGAGAGATTCATGTGCAACCTGGACTGCCAAGAGGAACCCGACAGCTGCATCAGCGAGAAGCTGTTCATGGAAATGGCCGAGCTGATGGTGTCCGAAGGCTGGAAGGATGCCGGCTACGAGTACCTGTGCATCGACGACTGTTGGATGGCCCCTCAGAGAGACTCTGAGGGCAGACTGCAAGCCGATCCTCAGAGATTCCCTCACGGCATCAGACAGCTGGCCAACTACGTGCACAGCAAGGGCCTGAAGCTGGGCATCTATGCCGACGTGGGCAACAAGACCTGTGCCGGCTTTCCTGGCAGCTTCGGCTACTACGATATCGACGCCCAGACCTTCGCCGATTGGGGAGTCGATCTGCTGAAGTTCGACGGCTGCTACTGCGACAGCCTGGAAAATCTGGCCGACGGCTACAAGCACATGTCACTGGCCCTGAATCGGACCGGCAGATCCATCGTGTACAGCTGCGAGTGGCCCCTGTACATGTGGCCCTTCCAGAAGCCTAACTACACCGAGATCAGACAGTACTGCAACCACTGGCGGAACTTCGCCGACATCGACGATAGCTGGAAGTCCATCAAGAGCATCCTGGACTGGACCAGCTTCAATCAAGAGCGGATCGTGGACGTGGCAGGACCTGGCGGATGGAACGATCCTGACATGCTGGTCATCGGCAACTTCGGCCTGAGCTGGAACCAGCAAGTGACCCAGATGGCCCTGTGGGCCATTATGGCCGCTCCTCTGTTCATGAGCAACGACCTGAGACACATCAGCCCTCAGGCCAAGGCTCTGCTCCAGGACAAGGATGTGATCGCTATCAACCAGGATCCTCTGGGCAAGCAGGGCTACCAGCTGAGACAGGGCGACAATTTCGAAGTGTGGGAAAGACCCCTGAGCGGACTGGCTTGGGCCGTCGCCATGATCAACAGACAAGAGATCGGCGGACCCCGGTCCTACACAATTGCCGTGGCTTCTCTCGGCAAAGGCGTGGCCTGTAATCCCGCCTGCTTTATCACACAGCTGCTGCCCGTGAAGAGAAAGCTGGGCTTTTACGAGTGGACCAGCAGACTGCGGAGCCACATCAATCCTACCGGCACAGTGCTGCTGCAACTGGAAAACACAATGCAGATGAGCCTGAAGGACCTGCTCTAA(서열 식별 번호 1)
서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열은 TAA 종결 코돈을 포함한다. 대안적 실시 양태에서, 서열 식별 번호 1의 처음 1287개 뉴클레오타이드를 포함하고 상이한 종결 코돈(예를 들어, TAG 또는 TGA)으로 끝나는 뉴클레오타이드 서열.
일 양태에서, 본 개시 내용은 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고 서열 식별 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 AGA 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL(서열 식별 번호 2)
용어 "코돈 최적화된(codon-optimized)"은 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역을 지칭하며, DNA에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 변경하지 않고 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위해 유전자 또는 핵산 분자의 코딩 영역에서 코돈의 변경을 지칭한다. 이러한 최적화는 적어도 하나, 또는 하나 이상, 또는 상당한 수의 코돈을 해당 유기체의 유전자에서 더 자주 사용되는 하나 이상의 코돈으로 대체하는 것을 포함한다.
임의의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 편차는 유전자를 인코딩하는 서열의 변이를 허용한다. 각 코돈은 3개의 뉴클레오타이드로 구성되고 DNA를 구성하는 뉴클레오타이드는 4개의 특정 염기로 제한되기 때문에 64개의 가능한 뉴클레오타이드 조합이 있으며, 그 중 61개는 아미노산을 인코딩한다(나머지 3개의 코돈은 번역을 종료하는 신호를 인코딩한다). 어떤 코돈이 어떤 아미노산을 인코딩하는지 보여주는 "유전자 코드"는 하기 표 1과 같이 본원에서 재생산된다. 결과적으로 많은 아미노산이 하나 이상의 코돈으로 설계(design)된다. 예를 들어, 아미노산 알라닌과 프롤린은 4개의 트리플렛(triplet)으로, 세린과 아르기닌은 6개로 인코딩되는 반면 트립토판과 메티오닌은 단 하나의 트리플렛으로 인코딩된다. 이러한 퇴화(degeneracy)는 DNA에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 DNA 염기 구성이 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있도록 한다.
[표 1]
The Standard Genetic Code T C A G T TTT Phe (F) TCT Ser (S) TAT Tyr (Y) TGT Cys (C) TTC Phe (F) TCC Ser (S) TAC Tyr (Y) TGC TTA Leu (L) TCA Ser (S) TAA Stop TGA Stop TTG Leu (L) TCG Ser (S) TAG Stop TGG Trp (W) C CTT Leu (L) CCT Pro (P) CAT His (H) CGT Arg (R) CTC Leu (L) CCC Pro (P) CAC His (H) CGC Arg (R) CTA Leu (L) CCA Pro (P) CAA Gln (Q) CGA Arg (R) CTG Leu (L) CCG Pro (P) CAG Gln (Q) CGG Arg (R) A ATT Ile (I) ACT Thr (T) AAT Asn (N) AGT Ser (S) ATC Ile (I) ACC Thr (T) AAC Asn (N) AGC Ser (S) ATA Ile (I) ACA Thr (T) AAA Lys (K) AGA Arg (R) ATG Met (M) ACG Thr (T) AAG Lys (K) AGG Arg (R) G GTT Val (V) GCT Ala (A) GAT Asp (D) GGT Gly (G) GTC Val (V) GCC Ala (A) GAC Asp (D) GGC Gly (G) GTA Val (V) GCA Ala (A) GAA Glu (E) GGA Gly (G) GTG Val (V) GCG Ala (A) GAG Glu (E) GGG Gly (G)
많은 유기체는 성장하는 펩타이드 사슬에서 특정 아미노산의 삽입을 코딩하는 특정 코돈의 사용에 대한 편향을 나타낸다. 유기체 간의 코돈 사용 차이인 코돈 선호도 또는 코돈 편향은 유전자 코드의 퇴화로 인해 발생하며 많은 유기체에서 잘 문서화된다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있으며, 결국 이는 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 믿어진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
매우 다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 대해 사용 가능한 많은 수의 유전자 서열이 주어지면, 코돈 사용의 상대 빈도가 계산됐다. 코돈 사용 테이블은, 예를 들어 www.kazusa.or.jp/codon/(2012년 6월 18일 방문)에서 입수 가능한 "Codon Usage Database"에서 사용 가능하다. Nakamura, Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000) 참조.
주어진 폴리펩타이드 서열을 인코딩하기 위해 최적화된 빈도로 코돈을 무작위로 할당하는 것은 각 아미노산에 대한 코돈 빈도를 계산한 다음, 코돈을 폴리펩타이드 서열에 무작위로 할당함으로써 수동으로 수행될 수 있다. 또한, 다양한 알고리즘과 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 최적의 서열을 계산할 수 있다.
비-바이러스 벡터
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터(예를 들어, 발현 플라스미드)가 제공된다. 바람직하게는, 비-바이러스 벡터는 서열 식별 번호 1의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 플라스미드이다.
바이러스 벡터
바람직한 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된(코돈 최적화된) 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 적합한 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 실시 양태에서, 바이러스 벡터는 rep 및 cap 유전자가 삭제 및/또는 변형된 GLA 유전자 서열 및 그의 관련 발현 제어 서열에 의해 대체된 AAV 게놈과 같은 파보바이러스 게놈의 일부를 포함한다. 변형된 인간 GLA 유전자 서열은, 바이러스 rep 및 cap 단백질을 인코딩하는 핵산 대신에, 일반적으로 바이러스 복제에 적합한 1개 또는 2개의 AAV TR 또는 TR 요소에 인접하여 삽입된다(예를 들어, 측면에 배치된다)(Xiao et al., 1997, J. Virol. 71(2): 941-948 ). 표적 세포에서 변형된 GLA 유전자 서열의 조직-특이적 발현을 촉진하는 데 사용하기에 적합한 다른 조절 서열이 또한 포함될 수 있다.
당업자는 이식유전자(transgene)를 포함하고 바이러스 복제에 필요한 바이러스 단백질이 결여된 AAV 벡터(예를 들어, cap 및 rep)는 이러한 단백질이 바이러스 복제 및 패키징에 필요하기 때문에 복제할 수 없음을 이해할 것이다. 헬퍼(Helper) 바이러스는 일반적으로 아데노바이러스 또는 단순 포진 바이러스를 포함한다. 대안적으로, 아래에서 논의되는 바와 같이, 다양한 헬퍼 요소 및/또는 세포를 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하여 헬퍼 기능(E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA)이 패키징 세포에 제공될 수 있으며/거나 세포가 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, HEK 293은 인간 세포를 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환하여 생성되었으며 현재 E1 및 E3을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다수의 아데노바이러스 유전자를 발현한다(예를 들어, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72 참조). 따라서, 이러한 헬퍼 기능은 예를 들어 이를 인코딩하는 플라스미드에 의해 세포에 공급할 필요 없이 HEK 293 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다.
바이러스 벡터는 DNA 또는 RNA 구조물과 같은 임의의 적합한 핵산 구조물일 수 있고 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 이중화(duplexed)일 수 있다(예를 들어, WO 2001/92551에 기재된 바와 같은 자가 상보적).
패키징된 바이러스 벡터의 바이러스 캡시드 성분은 파보바이러스 캡시드일 수 있다. AAV Cap 및 키메라 캡시드가 선호된다. 예를 들어, 바이러스 캡시드는 AAV 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6 .3.1, AAV9.45, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV , 염소 AAV, 새우 AAV 및 현재 알려져 있거나 나중에 발견되는 기타 AAV일 수 있다. 예를 들어, Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4.sup.th ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조.
일부 실시 양태에서, 패키징된 바이러스 벡터의 바이러스 캡시드 성분은 천연 AAV 캡시드의 변이체이다(즉, 천연 AAV 캡시드에 대해 하나 이상의 변형을 포함함). 일부 실시 양태에서, 캡시드는 AAV2, AAV5 또는 AAV8 캡시드의 변이체이다. 바람직한 실시 양태에서, 캡시드는 PCT 출원 번호 US18/51812(WIPO 공개 번호 WO 2019/060454)에 기재된 것과 같은 AAV2 캡시드의 변이체이며(예를 들어, 서열 식별 번호 43-61), 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 캡시드는 하기 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLANKTTNKDARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(서열 식별 번호 4)
AAV Cap 단백질의 완전 보체(full complement)에는 VP1, VP2 및 VP3이 포함된다. AAV VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 ORF는 완전 보체 AAV Cap 단백질 미만을 포함할 수 있거나 AAV Cap 단백질의 전체 보체가 제공될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 치료적 생체 내 유전자 요법에 사용하기 위한 조상(ancestral) AAV 벡터의 용도를 제공한다. 구체적으로, 인시리코(in silico)-유래 서열은 데 노보(de novo)로 합성되었고 생물학적 활성에 대해 특성화됐다. 이러한 노력으로 9개의 기능성 추정 조상 AAV가 생성되고 AAV 혈청형 1, 2, 8 및 9의 예측된 조상인 Anc80이 확인됐다(Zinn et al., 2015, Cell Reports 12:1056-1068). 바이러스 입자로 조립하는 것 외에도 이러한 조상 서열의 예측 및 합성은 WO 2015/054653에 기재된 방법을 사용하여 달성할 수 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특히, 조상 바이러스 서열로부터 조립된 바이러스 입자의 사용은 현대의 바이러스 또는 이의 일부보다 현대 인간 집단의 기존 면역에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 본 발명의 패키징된 바이러스 벡터를 생성하기 위해 배양될 수 있는 "숙주 세포"에 의해 포함되는 패키징 세포를 포함한다. 본 발명의 패키징 세포는 일반적으로 이종성 (1) 바이러스 벡터 기능(들), (2) 패키징 기능(들), 및 (3) 헬퍼 기능(들)을 갖는 세포를 포함한다. 이러한 각 구성 요소 기능은 다음 섹션에서 설명한다.
초기에, 벡터는 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, WO 2013/063379 참조). 바람직한 방법은 Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297에 기재되며, 그 내용이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, HEK293 세포의 효율적인 형질감염이 출발점으로 사용되며, 여기서 적격한 임상 마스터 세포 은행의 부착성(adherent) HEK293 세포주는 신속하고 확장 가능한 rAAV 생산을 가능하게 하는 진탕 플라스크 및 WAVE 생물반응기에서 동물 성분이 없는 현탁 조건에서 성장하는 데 사용된다. 삼중 형질감염 방법(예를 들어, WO 96/40240)을 사용하여, 현탁액 HEK293 세포주는 형질감염 후 48시간에 수확될 때 입자(vg)/세포 또는 1014vg/L 이상의 세포 배양물을 함유하는 105개 이상의 벡터 게놈을 생성한다. 보다 구체적으로, 삼중 형질감염은 패키징 세포가 3개의 플라스미드로 형질감염된다는 사실을 의미한다: 하나의 플라스미드는 AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하고, 다른 플라스미드는 다양한 헬퍼 기능(예를 들어, 아데노바이러스 또는 E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA, 그리고 또 다른 플라스미드는 이식유전자와 이의 다양한 제어 요소(예를 들어, 변형된 GLA 유전자 및 CAG 프로모터)를 인코딩한다.
원하는 수율을 달성하기 위해, 성장 및 형질감염 모두 지원하는 적합한 무혈청 현탁액 배지의 선택, 형질감염 시약의 선택, 형질감염 조건 및 세포 밀도와 같은 다수의 변수가 최적화된다. 이온 교환 크로마토그래피 방법을 기반으로 하는 보편적인 정제 전략도 개발되어 AAV 혈청형 1-6, 8, 9 및 다양한 키메라 캡시드의 고순도 벡터 준비를 초래했다. 이 사용자 친화적인 프로세스는 1주일 이내에 완료될 수 있으며, 높은 전체 입자 대 빈 입자 비율(>90% 전체 입자)을 초래하며, 정제 후 수율(>1x10^13 vg/L) 및 임상 적용에 적합한 순도를 제공하며. 모든 혈청형 및 키메라 입자와 관련하여 보편적이다. 이 확장 가능한 제조 기술은 환자에게 투여된 망막 혈관신생(AAV2), 혈우병 B(scAAV8), 거대 축삭 신경병증(scAAV9) 및 색소성 망막염(AAV2)을 위한 GMP I상 임상 AAV 벡터를 제조하는 데 활용됐다. 또한, 형질감염 후 수많은 시점에서 배양 배지로부터 rAAV를 수확하는 것을 수반하는 관류 방법을 구현함으로써 전체 벡터 생산이 최소 5배 증가한다.
패키징 세포는 패키징 및 벡터 기능과 함께 바이러스 벡터 기능을 포함한다. 바이러스 벡터 기능은 일반적으로 rep 및 cap이 삭제되고 변형된 GLA 서열 및 관련 발현 제어 서열에 의해 대체된 AAV 게놈과 같은 파보바이러스 게놈의 일부를 포함한다. 바이러스 벡터 기능은 패키징을 위한 바이러스 벡터의 복제를 초래하기에 충분한 발현 제어 서열을 포함한다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 파보바이러스 게놈의 일부, 예를 들어 rep 및 cap이 삭제되고 이식유전자 및 그의 관련 발현 제어 서열에 의해 대체된 AAV 게놈을 포함한다. 이식유전자는 일반적으로 삭제된 바이러스 rep 및 cap ORF 대신 2개의 AAV TR이 측면에 위치한다. 조직-특이적 프로모터 및 표적 세포에서 이식유전자의 조직-특이적 발현을 촉진하는 데 사용하기에 적합한 다른 조절 서열과 같은 적절한 발현 조절 서열이 포함된다. 이식유전자는 전형적으로 치료용 폴리펩타이드 또는 마커 폴리펩타이드를 생산하기 위해 발현될 수 있는 핵산 서열이다.
바이러스 벡터에 사용하기 위해 선택된 말단 반복부(terminal repeats) (TR(s))(분해성 및 비-분해성)는 바람직하게는 AAV 서열이고, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5 및 6이 바람직하다. 분해 가능한 AAV TR은 TR이 원하는 기능, 예를 들어 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 보호(rescure) 등을 매개하는 한, 야생형 TR 서열을 가질 필요가 없다(예를 들어, 야생형 서열은 삽입, 삭제, 절단 또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음). TR은, Samulski et al.의 미국 특허 제5,478,745호에 기재되어 있으며 이의 전체 개시 내용은 참고로 본원에 전체적으로 포함되는 "Double-D sequence"와 같은, AAV 역 말단 반복부로서 기능하는 합성 서열일 수 있다. 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 TR은 동일한 파보바이러스에서 유래하며, 예를 들어, 두 TR 서열은 모두 AAV2에서 유래한다.
패키징 기능은 캡시드 성분을 포함한다. 캡시드 성분은 바람직하게는 AAV 캡시드 또는 키메라 AAV 캡시드 기능과 같은 파르보바이러스 캡시드로부터 유래한다. 적합한 파보바이러스 바이러스 캡시드 성분의 예는 자율 파보바이러스 또는 디펜도바이러스(Dependovirus)와 같은 파보바이러스과(Parvoviridae) 계통의 캡시드 성분이다. 예를 들어, 캡시드 성분은 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N 및 AAV-LK03 및 아직 확인되지 않은 기타 신규 캡시드, 또는 인간이 아닌 영장류 출처로부터 선택될 수 있다. 캡시드 구성요소는 둘 이상의 AAV 캡시드로부터의 구성요소를 포함할 수 있다.
패키징된 바이러스 벡터는 일반적으로, 벡터 DNA의 패키징 및 형질도입된 세포에서 변형된 GLA 유전자 서열의 후속 발현을 야기하기에 충분한 "이식유전자" 또는 "이식유전자 발현 카세트"로 본원에서 지칭되는, TR 요소에 의해 플랭킹된 변형된 GLA 유전자 서열 및 발현 제어 서열을 포함한다. 바이러스 벡터 기능은 예를 들어 플라스미드 또는 앰플리콘(amplicon)의 성분으로서 세포에 공급될 수 있다. 바이러스 벡터 기능은 세포주 내에서 염색체외에 존재할 수 있고/있거나 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 및 핵 위치 파악 신호와 조합된 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 복제 및 패키징을 위해 바이러스 벡터 기능을 보유하는 뉴클레오타이드 서열을 세포 숙주 내로 도입하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바이러스 벡터 기능이 바이러스 벡터를 사용한 형질감염에 의해 제공되는 실시 양태에서; 바이러스 감염을 생성하는 표준 방법을 사용할 수 있다.
패키징 기능은 바이러스 벡터 복제 및 패키징을 위한 유전자를 포함한다. 따라서, 예를 들어 패키징 기능은 필요에 따라 바이러스 유전자 발현, 바이러스 벡터 복제, 통합 상태로부터 바이러스 벡터의 보호, 바이러스 유전자 발현 및 바이러스 입자로의 바이러스 벡터 패키징에 필요한 기능을 포함할 수 있다. 패키징 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘, 배큘로바이러스(Baculovirus) 또는 HSV 헬퍼 구성물과 같은 유전적 구성물을 사용하는 패키징 세포에 함께 또는 별도로 공급될 수 있다. 패키징 기능은 패키징 세포 내에서 염색체외에 존재할 수 있지만 바람직하게는 세포의 염색체 DNA에 통합된다. 예에는 AAV Rep 및 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자가 포함된다.
헬퍼 기능은 바이러스 벡터의 패키징을 개시하는 데 필요한 패키징 세포의 활성 감염을 확립하는 데 필요한 헬퍼 바이러스 요소를 포함한다. 예에는 바이러스 벡터를 패키징하기에 충분한 아데노바이러스, 배큘로바이러스 및/또는 헤르페스 바이러스에서 유래된 기능이 포함된다. 예를 들어, 아데노바이러스 헬퍼 기능은 일반적으로 아데노바이러스 구성요소 E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA를 포함한다. 패키징 기능은 패키징 세포에 필요한 바이러스 감염에 의해 제공될 수 있다. 패키징 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘과 같은 유전적 구성물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 별도로 공급될 수 있다. 예를 들어, Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791에 기재된 pXR 헬퍼 플라스미드 및 Grimm et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760에 기재된 pDG 플라스미드 참조. 패키징 기능은 패키징 세포 내에서 염색체외에 존재할 수 있지만 바람직하게는 세포의 염색체 DNA(예를 들어, HEK 293 세포의 E1 또는 E3)에 통합된다.
임의의 적합한 헬퍼 바이러스 기능이 사용될 수 있다. 예를 들어, 패키징 세포가 곤충 세포인 경우 배큘로바이러스는 헬퍼 바이러스의 역할을 할 수 있다. 헤르페스(Herpes) 바이러스는 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로도 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질(들)을 인코딩하는 하이브리드 헤르페스 바이러스는 유리하게는 더 확장 가능한 AAV 벡터 생산 계획(scheme)을 용이하게 할 수 있다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 및 핵 위치 파악 신호와 조합된 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 복제 및 패키징을 위해 헬퍼 기능을 보유하는 뉴클레오타이드 서열을 세포 숙주 내로 도입하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 헬퍼 기능이 바이러스 벡터를 사용한 형질감염 또는 헬퍼 바이러스를 사용한 감염에 의해 제공되는 실시 양태에서; 바이러스 감염을 생성하는 표준 방법을 사용할 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 허용 또는 패키징 세포가 패키징된 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 바람직하다. 본 발명의 실행에서 패키징 세포의 생산에 유용한 세포의 예는, 예를 들어 VERO, WI38, MRC5, A549, HEK 293 세포와 같은 인간 세포주(구성적 프로모터의 제어 하에 기능적 아데노바이러스 E1을 발현함), B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7 및 HT1080 세포주를 포함한다. 일 양태에서, 패키징 세포는 현탁 배양에서 성장할 수 있고, 보다 바람직하게는 세포는 무혈청 배양에서 성장할 수 있다. 일 실시 양태에서, 패키징 세포는 무혈청 배지에서 현탁액으로 성장하는 HEK293이다. 또 다른 실시 양태에서, 패키징 세포는 미국 특허 제5,008,818호에 기재되고 수탁번호 PTA 13274로 수탁된 HEK293 세포이다. WO 2002/46359에 개시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 rAAV 패키징 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 양태에서, 패키징 세포는 세포 스택(예를 들어, HEK293 세포가 접종된 10층 세포 스택)의 형태로 배양된다.
패키징 세포로 사용하기 위한 세포주는 곤충 세포주를 포함한다. AAV의 복제를 가능하게 하고 배양물에서 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예는 Sf9 또는 Sf21 세포주와 같은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 도로소피마 종(Drosophila spp.) 세포주, 또는, 예를 들어, 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래 세포주와 같은 모기 세포주를 포함한다. 바람직한 세포주는 Spodoptera frugiperda Sf9 세포주이다. 이종성 폴리펩타이드의 발현을 위한 곤충 세포의 사용, 이러한 세포에 핵산을 도입하는 방법, 및 배양에서 이러한 세포를 유지하는 방법에 관한 교시를 위해 하기 참조문헌이 본원에 포함된다: Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, N J (1995); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; Kajigaya et al., 1991, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650; Ruffing et al., 1992, J. Virol. 66:6922-6930; Kimbauer et al., 1996, Virol. 219:37-44; Zhao et al., 2000, Virol. 272:382-393; 및 Samulski et al., U.S. Pat. No. 6,204,059.
본 발명에 따른 바이러스 캡시드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 배큘로바이러스로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다(Brown et al., (1994) Virology 198:477-488). 추가 대안으로서, 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들어, Urabe et al., 2002, Human Gene Therapy 13:1935-1943에 기재된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하기 위해 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충 세포에서 rAAV 생산 방법을 제공하며, 여기서 배큘로바이러스 패키징 시스템 또는 벡터는 이들 유전자를 배큘로바이러스 벡터의 다면체 코딩 영역으로 조작함으로써 그리고 숙주 세포로의 형질감염에 의한 바이러스 재조합체 생성함으로써 AAV Rep 및 Cap 코딩 영역을 보유하도록 구성될 수 있다. 특히 AAV에 대한 배큘로바이러스 생산을 사용할 때, 바람직하게는 AAV DNA 벡터 생성물은 AAV ITR에 대한 돌연변이를 사용하지 않는 자가-상보성 AAV 유사 분자이다. 이것은 곤충 세포에서 비효율적인 AAV rep 니킹(nicking)의 부산물인 것으로 보이며, 이는 기능적인 Rep 효소 활성의 결여로 인해 자가 상보적 DNA 분자를 생성한다. 숙주 세포는 배큘로바이러스에 감염된 세포이거나 배큘로바이러스 헬퍼 기능을 인코딩하는 추가 핵산이 내부에 도입되었거나 이러한 배큘로바이러스 헬퍼 기능을 포함한다. 이러한 배큘로바이러스 바이러스는 AAV 구성요소를 발현할 수 있고 후속적으로 캡시드의 생산을 촉진할 수 있다.
생산 동안, 패키징 세포는 일반적으로 바이러스 벡터의 복제 및 패키징을 초래하기에 충분한 헬퍼 기능 및 패키징 기능과 함께 하나 이상의 바이러스 벡터 기능을 포함한다. 이러한 다양한 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘과 같은 유전적 구성물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 별도로 공급될 수 있으며, 세포주 내에 염색체외에 존재하거나 세포의 염색체에 통합될 수 있다.
세포에는 이미 통합된 언급된 기능 중 임의의 하나 이상이 제공될 수 있다: 예를 들어, 염색체외로 통합되거나 세포의 염색체 DNA에 통합된 하나 이상의 벡터 기능을 갖는 세포주, 염색체외로 통합되거나 세포의 염색체 DNA에 통합된 하나 이상의 패키징 기능을 갖는 세포주, 또는 염색체외로 통합되거나 세포의 염색체 DNA에 통합된 하나 이상의 헬퍼 기능을 가진 세포주.
rAAV 벡터는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 Clark et al., 1999, Human Gene Therapy 10(6):1031-1039; Schenpp and Clark, 2002, Methods Mol. Med. 69:427-443; U.S. Pat. No. 6,566,118 및 WO 98/09657에 기재되어 있다.
치료 방법(Treatment methods)
특정 실시 양태에서, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여함으로써 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 파브리병의 치료를 위한 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 서열 식별 번호 1과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 대상체에서 글로보트리아오실세라마이드(Gb3)의 수준을 감소시키는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
관련 양태에서, 파브리병의 치료에 사용하기 위한, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 90% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
다른 관련 양태에서, 약제의 제조를 위한, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 용도가 제공된다.
다른 관련 양태에서, 파브리병 치료용 약제의 제조를 위한, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 용도가 제공된다.
일부 양태에서, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다.
바람직한 실시 양태에서, CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하거나 이러한 핵산을 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 파브리병을 치료하는 방법이 제공된다.
다른 실시 양태에서, 파브리병의 치료에 사용하기 위한, CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 양태에서, CAG 프로모터는 서열 식별 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 파브리병 치료용 약제의 제조를 위한, CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 용도가 제공된다.
관련 양태에서, 파브리병의 치료에 사용하거나 파브리병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, (i) 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 (ii) 천연 또는 변이체 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 비리온 또는 이러한 rAAV를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일부 실시 양태에서, rAAV 비리온은 천연 AAV1, AAV2, AAV6 또는 AAV8 캡시드를 포함한다. 다른 실시 양태에서, rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV6, 또는 AAV8에 비해 하나 이상의 변형을 포함하는 변이체 AAV 캡시드를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, AAV 캡시드는 서열 식별 번호 4의 서열 또는 이와 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
바람직한 실시 양태에서, 파브리병의 치료에서 또는 파브리병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 rAAV의 용도가 제공되며, 여기서 rAAV는 (i) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 (ii) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 (i) 서열 식별 번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 (ii) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함한다. 일부 양태에서, rAAV는 근육내 및/또는 혈관내(예를 들어, 정맥내) 주사에 의해 투여된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, rAAV는 단일 정맥내 투여로서 투여된다.
다른 양태에서, 발현 제어 서열에 선택적으로 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 약학적 조성물은 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번로 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, CAG 프로모터는 서열 식별 번호 5와 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함하거나 서열 식별 번호 5와 동일한 서열을 포함한다.
다른 양태에서, (i) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 (ii) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 감염성 rAAV를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 관련 양태에서, 감염성 rAAV는 (i) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 5'에서 3'로의: (a) AAV2 말단 반복부 (b) CAG 프로모터 (c) 청구항 제3항에 따른 핵산 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 말단 반복부를 포함하는 핵산을 포함한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 감염성 rAAV는 (i) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함한다:
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGTCTAGAGTCGACCTGCAGGTGGATATCTTGCTAGCACGCCACCATGCAGCTGCGGAATCCTGAACTGCACCTGGGATGTGCCCTGGCTCTGAGATTTCTGGCCCTGGTGTCTTGGGACATCCCTGGCGCTAGAGCCCTGGATAATGGCCTGGCCAGAACACCTACAATGGGCTGGCTGCACTGGGAGAGATTCATGTGCAACCTGGACTGCCAAGAGGAACCCGACAGCTGCATCAGCGAGAAGCTGTTCATGGAAATGGCCGAGCTGATGGTGTCCGAAGGCTGGAAGGATGCCGGCTACGAGTACCTGTGCATCGACGACTGTTGGATGGCCCCTCAGAGAGACTCTGAGGGCAGACTGCAAGCCGATCCTCAGAGATTCCCTCACGGCATCAGACAGCTGGCCAACTACGTGCACAGCAAGGGCCTGAAGCTGGGCATCTATGCCGACGTGGGCAACAAGACCTGTGCCGGCTTTCCTGGCAGCTTCGGCTACTACGATATCGACGCCCAGACCTTCGCCGATTGGGGAGTCGATCTGCTGAAGTTCGACGGCTGCTACTGCGACAGCCTGGAAAATCTGGCCGACGGCTACAAGCACATGTCACTGGCCCTGAATCGGACCGGCAGATCCATCGTGTACAGCTGCGAGTGGCCCCTGTACATGTGGCCCTTCCAGAAGCCTAACTACACCGAGATCAGACAGTACTGCAACCACTGGCGGAACTTCGCCGACATCGACGATAGCTGGAAGTCCATCAAGAGCATCCTGGACTGGACCAGCTTCAATCAAGAGCGGATCGTGGACGTGGCAGGACCTGGCGGATGGAACGATCCTGACATGCTGGTCATCGGCAACTTCGGCCTGAGCTGGAACCAGCAAGTGACCCAGATGGCCCTGTGGGCCATTATGGCCGCTCCTCTGTTCATGAGCAACGACCTGAGACACATCAGCCCTCAGGCCAAGGCTCTGCTCCAGGACAAGGATGTGATCGCTATCAACCAGGATCCTCTGGGCAAGCAGGGCTACCAGCTGAGACAGGGCGACAATTTCGAAGTGTGGGAAAGACCCCTGAGCGGACTGGCTTGGGCCGTCGCCATGATCAACAGACAAGAGATCGGCGGACCCCGGTCCTACACAATTGCCGTGGCTTCTCTCGGCAAAGGCGTGGCCTGTAATCCCGCCTGCTTTATCACACAGCTGCTGCCCGTGAAGAGAAAGCTGGGCTTTTACGAGTGGACCAGCAGACTGCGGAGCCACATCAATCCTACCGGCACAGTGCTGCTGCAACTGGAAAACACAATGCAGATGAGCCTGAAGGACCTGCTCTAAGCCACGCGTAACACGTGCATGCGAGAGATCTGCGGCCGCGAGCTCGGGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAATGCATCCTAGCCGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA(서열 식별 번호 6)
일부 바람직한 실시 양태에서, 파브리병이 있는 인간 대상체는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 (i) 서열 식별 번호 4로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 투여받으며, 여기서 대상체는 하나 이상의 용량의 rAAV 벡터를 투여받고, 각각의 용량은 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1015 벡터 입자(vetor particle)/kg 또는 벡터 게놈(vetor genome)/kg, 1 x 1012 내지 1 x 1015 벡터 입자 또는 벡터 게놈, 또는 약 1 x 1012, 약 2 x 1012, 3 x 1012, 약 4 x 1012, 약 5 x 1012, 약 6 x 1012, 약 7 x 1012, 약 8 x 1012, 약 9 x 1012, 약 1 x 1013, 약 2 x 1013, 약 3 x 1013, 약 4 x 1013, 약 5 x 1013, 약 6 x 1013, 약 7 x 1013, 약 8 x 1013, 약 9 x 1013, 약 1 x 1014, 약 2 x 1014, 약 3 x 1014, 약 4 x 1014, 약 5 x 1014, 약 6 x 1014, 약 7 x 1014, 약 8 x 1014, 약 9 x 1014 또는 약 1 x 1015 벡터 입자/kg 또는 벡터 게놈/kg을 포함한다. 일부 특히 바람직한 양태에서, 대상체는 하나 이상의 용량의 rAAV을 투여받고, 각각의 용량은 약 1 x 1012 vg/kg 내지 1 x 1014 vg/kg, 예를 들어, 약 3 x 1012, 약 1 x 1013, 3 x 1013, 또는 약 5 x 1013 벡터 입자/kg 또는 벡터 게놈/kg을 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 단일 정맥내 주사를 통해 파브리병이 있는 인간에게 투여되며, 여기서 단일 정맥내 주사는 인간 대상체에서 파브리병을 치료하는 데 효과적이다. 다른 실시 양태에서, 약학적 조성물은 단일 근육내 주사를 통해 파브리병이 있는 인간에게 투여된다.
일부 바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물이 제공되며, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 (i) 서열 식별 번호 4로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 1 x 1010 내지 1 x 1017 벡터 입자 또는 벡터 게놈, 1 x 1013 내지 1 x 1016 벡터 입자 또는 벡터 게놈, 또는 약 1 x 1013, 약 2 x 1013, 3 x 1013, 약 4 x 1013, 약 5 x 1013, 약 6 x 1013, 약 7 x 1013, 약 8 x 1013, 약 9 x 1013, 약 1 x 1014, 약 2 x 1014, 약 3 x 1014, 약 4 x 1014, 약 5 x 1014, 약 6 x 1014, 약 7 x 1014, 약 8 x 1014, 약 9 x 1014, 약 1 x 1015, 약 2 x 1015, 약 3 x 1015, 약 4 x 1015, 약 5 x 1015, 약 6 x 1015, 약 7 x 1015, 약 8 x 1015, 약 9 x 1015, 약 1 x 1016, 약 5 x 1016 또는 약 8 x 1016 벡터 입자 또는 벡터 게놈을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 예시하고 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명이 바람직한 실시예와 관련하여 기술되었지만, 본 발명의 다양한 수정은 본 출원을 읽는 것으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1 - GLA cDNA 서열의 코돈 최적화
내인성 GLA 분비 신호(GenBank 수탁번호 NM_000169.3; 서열 식별 번호 3)를 포함하는 인간 GLA 오픈 리딩 프레임 cDNA 서열은 인간 발현을 위해 최적화된 코돈이었다. 최적화 알고리즘에는 코돈 사용 편향, GC 함량, CpG 디뉴클레오타이드 함량, 음성 CpG 섬(island), mRNA 2차 구조, RNA 불안정성 모티프(motif), 비밀 스플라이싱(cryptic splicing) 부위, 조기 폴리아데닐화 부위, 내부 카이(chi) 부위 및 리보솜 결합 부위 및 반복 서열을 포함하지만 이에 국한되지 않는 파라미터가 포함된다.
인간의 코돈 사용 편향은 코돈 적응 지수(CAI)를 0.75에서 0.93으로 업그레이드함으로써 변경됐다. 평균 GC 함량은 mRNA의 반감기를 연장하기 위해 네거티브 서열(negative sequence)의 48.6%에서 최적화된 서열의 57.9%로 최적화됐다. 리보솜 결합과 mRNA의 안정성에 영향을 미치는 스템-루프(stem-loop) 구조는 최적화된 서열에서 깨졌다. 또한 음성 시스(cis) 작용 부위를 선별하여 인간 세포에서 유전자 발현을 최적화하고 여러 제한 효소 부위를 삭제했다.
본원에서 서열 식별 번호 1로 표시된 생성된 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 개선된 코돈 사용, 변경된 GC 함량, 더 나은 mRNA 안정성, 및 음성 시스 작용 요소의 변형을 함유한다.
실시예 2 - 코돈 최적화된 GLA cDNA 서열은 파브리병 환자의 심근세포에서 더 높은 수준으로 발현된다
인간 파브리병 환자로부터 유래된 질병에 걸린 인간 심근세포에서 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 인간 GLA 핵산의 발현 및 질병 표현형의 기능적 교정을 평가하기 위해 인간 시험관 내 모델 시스템을 생성했다.
재료 및 방법
섬유아세포 배양 및 유도 만능 줄기세포주로의 재프로그래밍
질병이 없는 섬유아세포 또는 남성 파브리병 섬유아세포를 Coriell Institute로부터 입수하고 15% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)(FBS, Hyclone) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(ThermoFisher)을 포함하는 Eagle의 변형 필수 배지(Eagle’s Modified Essential Medium)(EMEM)에서 배양했다. 재프로그래밍을 위해, 세포를 0.05% 트립신을 사용하여 계대(passage)하고 6웰 조직 배양 플레이트에 cm2당 2.5x104개 세포의 밀도로 플레이팅했다. 세포는 정상산소 조건에서 37℃, 5% CO2로 유지됐다.
병든 섬유아세포의 세포 재프로그래밍은 제조사의 지침(Simplicon RNA Reprogramming Kit, EMD Millipore)에 따라 Oct4-Klf4-Sox2-Glis1 폴리시스트론(polycistronic) 전사체의 단일 RNA 형질감염에 의해 수행됐다. 10일째에, 인간 iPSC Reprogramming Boost Supplement II(EMD Millipore)가 보충된 B18R 단백질(200ng/mL)을 함유하는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)(MEF) 조정 배지에서 약 5 x 104 - 1 x 105개의 재프로그래밍된 세포를 성장 인자 감소 매트리겔(Groth Factor Reduced Matrigel)(Corning)에 재플레이팅 했다. 20일째에, 변경된 형태와 작은 콜노니(colony)를 형성하는 능력으로 인식되는 재프로그래밍된 세포를 mTeSR-1 배지(Stem Cell Technologies)로 전환했다. 약 200개 이상의 콜로니를 수동으로 분리하고 mTeSR-1 배지에서 Matrigel 코팅 플레이트에 플레이팅했다. Fabry-iPSC 라인은 단일 콜로니에서 확장됐다. Fabry-iPSC 라인은 mTeSR-1 유지 배지의 Matrigel에서 배양되었고 Gentle Cell Dissociation Reagent(Stem Cell Technologies)를 사용하여 70-80% 합류(confluence)에서 4-5일마다 계대 배양됐다. 3개의 배아 층 모두로의 무작위 분화를 보장하기 위해, iPSC 배아체(embryoid body)(EB)를 1주 동안 현탁 배양에서 형성한 다음 1x GlutaMax, 1x 비-필수 아미노산, 1.4μL/100mL 베타-메르캅토에탄올 배지(Thermo Fisher Scientific)를 함유하는 DMEM에서 20% 녹아웃 혈청 대체물에서 추가 4주 동안 부착 조건(adherent condition)에서 분화했다. 심장 분화에 사용된 iPSC 클론은 회사 프로토콜에 따라 표준 핵형 분석을 위해 Cell Line Genetics에 제출됐다.
파브리병에 걸린 iPSC 심근세포 분화
Fabry iPSC는 성장 인자 감소 Matrigel(GFR Matrigel, Corning)로 코팅된 3개의 웰 플레이트의 mTeSR-1에서 25,000개 세포/cm2로 접종됐다. 합류에 도달하면, 배양물은 인슐린이 없는 B27 보충제(RB-, ThermoFisher)와 함께 RMPI 1640에서 Wnt 경로의 순차적인 GSK3ß 및 Porcupine 억제를 받았다. 6일째에 세포에 RMPI 1640과 B27 보충제(RB+, ThermoFisher)를 공급했다. 15일까지 가시적인 박동(beating)을 보인 파브리병에 걸린 심근세포를 RB+의 GFR Matrigel로 코팅된 12개의 웰 플레이트에 1:2 비율로 계대했다. 계대 후, Fabry 심근세포는 이전에 공개된 분화 패러다임에 따라 포도당 결핍을 통해 정제됐다(Lian et al., PNAS, 109(27):E1848-57). 첫 박동은 통과 7일 후에 나타났다. 정제 후 2주 후, 패브리병에 걸린 심근세포를, (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 입자를 사용한 세포 특성화 및 형질도입에 사용했다.
파브리병에 걸린 iPSC 심근세포 형질도입
심근세포를 rAAV가 있는 실험 플레이트에서의 계대 14일 후에 형질도입했다. 형질도입일에 3개의 웰을 수확하여 세포 수를 얻었다. 세포 수 및 바이러스 역가를 기준으로 25, 100, 250의 감염 다중도(MOI)에서 세포를 형질도입했다. 비히클을 가장 높은 볼륨으로 추가했다. 세포를 48시간 동안 바이러스와 함께 배양한 다음 배지 교체를 했다. 배지는 형질도입 후 6일째인 수확 때까지 격일로 교체했다.
면역세포화학(ICC)
iPSC 및 배엽(germ layer) ICC
iPSC 또는 30일령 플레이트된 EB를 마그네슘 또는 칼슘이 없는 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline without Magnesium or Calcium)(PBS-/-)로 1회 세척하고 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 그런 다음 세포를 PBS-/-로 3회 세척하고 PBS-/- 중 0.2% Triton X-100의 2% 소 혈청 알부민 및 5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단했다. Nanog, Oct-4, Sox-2 또는 ß-tubulin II, HNF-α 및 α-SMA 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 배양한 후 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 AlexaFluor(ThermoFisher) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양했다. 세포를 DAPI로 대조염색하여 핵을 시각화하고 Zeiss Axiovert.A1 도립 현미경에서 이미지화했다.
심근세포 ICC
감염 6일 후, 세포를 PBS-/-로 1회 세척하고 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 그런 다음 세포를 PBS-/-로 3회 세척하고 PBS-/- 중 0.2% Triton X-100의 2% 소 혈청 알부민 및 5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단했다. 알파 갈락토시다아제 A(Abnova) 및 심장 트로포닌 T(cTNT, R&D)에 대한 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 차단 용액에서 세포와 함께 배양한 후 염소 항-마우스 AlexaFluor-555(ThermoFisher) 2차 항체에서 1시간 동안 실온에서 배양했다. 또한, 접합된 CD77(Gb3)-AlexaFluor647(BD)을 차단 완충액에서 고정 세포와 함께 1시간 동안 배양했다. 세포를 3회 세척하고 DAPI 또는 Hoechst 33342로 대조염색하여 핵을 시각화하고 Zeiss Axiovert.A1 도립 현미경으로 이미지화했다.
웨스턴 블롯
감염 6일 후, 세포를 0.05% 트립신으로 리프팅시키고 300 xg에서 5분 동안 펠렛화했다. RIPA 완충액과 프로테아제 억제제를 사용하여 용해물을 만들었다. 용해물을 얼음 위에서 15분 동안 배양하고 21,000 xg에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하고, 단백질 농도를 결정하기 위해 비신코닌산 분석(bicinchoninic acid　assay)(BCA)을 실행했다. 농도를 정규화하고 겔을 동일하게 로딩했다. SDS-PAGE는 4-12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 200볼트에서 30분 동안 실행됐다. 단백질을 0.2μm 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 항-알파 갈락토시다아제 A(Atlas) 항-GAPDH(Stem Cell Technologies) 항체로 프로빙(probe) 후 종 특이적 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 이차 항체로 밤새 프로빙했다. 향상된 화학발광 기질을 사용하여 단백질 밴드를 현상(develop)하고 밴드 검출을 BioRad ChemiDoc MP에서 캡처했다.
AGA 활성 분석
AGA 활성 분석은 알파-갈락토시다아제 합성 형광 기질(BioVision, K407)을 사용하여 수행됐다. AGA 활성 분석은 다음 변경 사항과 함께 제조업체의 프로토콜에 따라 수행됐다. 세포를 0.25% 트립신을 사용하여 분리하고 300 xg에서 3분 동안 원심분리했다. 세포를 알파-갈락토시다아제 완충액으로 용해시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 12,000 xg에서 원심분리하고 상청액을 -80℃에서 보관했다. 다음 날, 샘플을 얼음 위에서 해동하고 BCA 분석을 통한 단백질 정량화를 수행하여 분석 동안 단백질 농도 정규화를 허용했다. AGA 활성 분석 반응을 실온에서 1시간 동안 배양하고 적절한 부피 정지 완충액을 사용하여 중단시켰다. AGA 활성 분석 반응은 AGA 표준 곡선의 최고 농도로 설정된 게인(gain)과 함께 360 여기/445 방출에서 Cytation3 플레이트 판독기(BioTek)에서 즉시 판독됐다.
표 2. 항체 목록
Antibody Host Company-Catalog No. Dilution
Primary Antibodies
SOX2 Rabbit Abcam- ab92494 1:50
OCT4 Mouse Millipore- MAB4401 1:50
Nanog Rabbit Abcam- ab21624 1:50
Alpha smooth muscle actin (aSMA) Mouse Sigma Aldrich- A2547 1:500
Beta-Tubulin III Mouse Sigma- T8578 1:200
HNF4-α Rabbit Santa Cruz-SC-8987 1:100
Cardiac Troponin T (cTNT) - ICC Mouse R&D, MAB1874 1:100
Cardiac Troponin T (cTNT) - Flow Cytometry Mouse BD Biosciences- 565744 1:50
Alpha Galactosidase A - ICC Mouse Abnova- H00002717-B01P 1:100
Alpha Galactosidase A - Western Rabbit Atlas- HPA000237 1:200
Alpha Galactosidase A-PE - Flow Rabbit Abnova-A1VMRPSAM001664 1:100
GAPDH Rabbit Stem Cell Technologies- 5174 1:5000
Globotriaosylceramide-FITC (Gb3) - ICC Mouse BD- 551353 1:50
Secondary Antibodies
Hoechst 33342 Solution NA Thermo-62248 1:10000
Alexa Fluor555 anti-rabbit Goat Invitrogen-A21428 1:500
Alexa Fluor647 anti-rabbit Goat Invitrogen- A-21244 1:500
Alexa Fluor488 anti-rabbit Goat Invitrogen-A11078 1:500
Alexa Fluor555 anti-mouse Goat Invitrogen-A21422 1:500
Alexa Fluor647 anti-mouse Goat Invitrogen- A-21235 1:500
Alexa Fluor488 anti-mouse Goat Invitrogen-A11029 1:500
Horseradish Peroxidase anti-Rabbit IgG (H+L) Goat Thermo- 31460 1:5000
결과 및 논의
파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포의 유도 및 특성화
GLA 유전자에 돌연변이(W162X, 일반적으로 AGA 단백질 활성 부재를 초래하는 잘 기술된 병원성 돌연변이)가 있는 파브리 환자 섬유아세포를 Coriell Institute로부터 입수했다. 재프로그래밍하기 전에, 질병 표현형을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 통해 AGA 단백질 수준을 검출했다. 정상 섬유아세포주 및 재조합 인간 AGA 단백질을 AGA 단백질 수준에 대한 양성 대조군으로 사용했다. 파브리 병에 걸린 섬유아세포는 야생형(WT) 섬유아세포와 비교하여 AGA 단백질이 부족한 것으로 나타났다(도 1). 이 질병 특성이 확인된 후 재프로그래밍이 시작됐다.
파브리 환자 섬유아세포는 인간 파브리병 세포 모델을 생성하기 위해 Simplicon RNA 재프로그래밍 키트를 사용하여 재프로그래밍됐다. 섬유아세포는 RNA 레플리콘을 포함하는 만능 인자로 형질감염되었고 작은 줄기세포 콜로니가 나타날 때까지 제조업체의 지침에 따라 배양됐다. 유도 만능 줄기세포(iPSC) 콜로니를 클론으로 확장하고 만능 전사 인자 발현을 특성화했다. 재프로그래밍된 Fabry iPSC 콜로니는 3가지 중요한 만능 전사 인자인 Nanog, Oct4 및 Sox2의 양성 발현과 적절한 국소화(localization)를 보여주었다(도 2A, 상단 패널). 만능 단백질을 발현하는 것 외에도 iPSC는 각 배엽으로 분화할 수 있어야 한다. Fabry iPSC에서 형성된 배아체의 자발적 분화에 따라 β-tubulin III에 의한 외배엽, HNF-α에 의한 내배엽 및 α-평활근 액틴에 의한 중배엽의 세 가지 배엽 모두가 검출됐다. Fabry iPSC에 재프로그래밍 중에 발생할 수 있는 염색체 이상이 포함되지 않았는지 확인하기 위해 핵형 분석이 수행됐다. 이상형(aberration)은 감지되지 않았다(도 2B).
파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포의 특성화
Fabry iPSC를 심근세포로 분화시켜 임상적으로 관련된 세포 유형에서 파브리병 모델을 개발했다. 생성된 심근세포는 분화 후 약 7일 동안 박동을 시작했으며 종점 분석까지 계속 박동했다(데이터는 표시되지 않음). 심장 특이적 메이커인 심장 트로포닌 T(cTNT)를 사용하여 순도를 검사하기 위해 Fabry iPSC 심근세포에서 유동 세포분석 및 면역세포화학을 수행했다. 분화는 면역세포화학 염색(도 3B)에 의해 확인된 97% cTNT 양성 세포(도 3A)를 산출했다.
파브리병에 걸린 iPSC-심근세포에서 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA 유전자를 보유하는 rAAV를 사용한 형질도입은 AGA의 강력한 단백질 발현을 유도한다
Fabry iPSC 심근세포는 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 입자의 형질도입 전에 실험 플레이트에 접종 후 14일 동안 배양됐다. Fabry iPSC 심근세포는 MOI 25, 100 또는 500에서 형질도입됐다. 용량은 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 EFGP 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV를 사용하여 이전 형질도입 효율 데이터로부터 결정됐다. 세포를 형질도입 6일 후에 수확했다. 중요하게는, 비형질도입 Fabry iPSC 심근세포는 ICC, 유동 세포분석 및 웨스턴 블롯에 의해 AGA 단백질의 결핍을 나타내어, 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA 유전자 도입 후 AGA 발현 수준 및 활성을 조사하기 위한 관련 질병 모델이 됐다. 비형질도입 세포의 면역세포화학(ICC)은 AGA 단백질 발현의 결핍을 나타낸 반면, rAAV로 형질도입된 세포는 강력한 AGA 염색을 나타냈다(도 4A).
세포를 또한 유동 세포분석을 위해 수확하고 생존력, AGA 및 cTNT를 위해 염색했다. 이중(double) 양성 집단은 정량화됐으며, 이는 AGA의 발현을 갖는 성숙한 심근세포(cTNT 양성)를 나타낸다(도 4B). 성숙한 심근세포에서 rAAV로 형질도입한 후 현저한 용량 의존적 AGA 단백질 발현 반응이 관찰됐다. 단지 25의 MOI는 67%의 cTNT 및 AGA 이중 양성 세포(cTNT+/AGA+)로 이어졌으며, 이는 rAAV가 Fabry iPSC 심근세포를 강력하게 형질도입하고 코돈 최적화된 이식유전자 페이로드(payload)를 발현할 수 있음을 나타낸다. MOI가 100이면 cTNT+/AGA+가 89%, MOI가 250이면 이중 양성 집단이 93%로 증가했다.
세포 용해물에서 총 AGA 단백질을 조사하기 위해 웨스턴 블롯을 위해 형질도입된 Fabry iPSC 심근세포로부터 총 단백질을 추출했다. 비형질도입 세포에는 질병 표현형의 지표인 AGA 단백질이 부족했다. rAAV로 형질도입된 Fabry iPSC 심근세포는 항-AGA 항체로 프로빙한 후 49kDa의 정확한 크기에서 강력한 AGA 단백질 발현을 나타냈다(도 4C).
파브리병에 걸린 iPSC-심근세포에서 rAAV 형질도입 후 향상된 AGA 활성
형질도입된 Fabry iPSC 심근세포를 알파-갈락토시다아제 완충액으로 용해시키고 알파 결합 절단성에 대한 알파-갈락토시다아제 활성을 정량화하는 데 사용했다. Fabry iPSC 심근세포 샘플을 알파-갈락토시다아제 특이적 합성 기질과 함께 1시간 동안 배양하여 절단된 기질의 양을 형광측정법으로 정량화했다. 데이터는 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) Fabry iPSC 심근세포의 서열 식별 번호 5의 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 형질도입 후 AGA 활성의 용량 의존적 증가를 나타냈다(도 5A).
파브리병의 특징적인 병리는 세포성 Gb3 축적이다((Waldek et al., Life expectancy and cause of death in males and females with Fabry disease: findings from the Fabry Registry. Genetics in Medicine : Official Journal of the American College of Medical Genetics, 11(11), 790-796 (2009)). 비형질도입 Fabry iPSC 심근세포에서는 Gb3 면역염색 및 형광 현미경 검사를 통해 관찰된 상당한 Gb3 세포 축적이 있었다(도 5B, 좌측 상단 패널). 25만큼 낮은 MOI에서 rAAV의 형질도입은 Gb3 면역염색의 감소를 통해 시각화된 Gb3 축적을 크게 감소시켰다(도 5B).
결론
GLA 세포를 자율적으로 발현하여 Gb3를 감소시켜 임상 결과를 개선하는 주요 조직을 표적으로 하는 단일 투여 정맥내 유전자 치료제와 같은 내구성 치료에 대한 강력하고 시급한 요구가 있다. 실험 데이터는 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 갖는 AAV를 통한 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA 유전자의 전달이 파브리병 주요 장기, 특히 심장 조직을 효율적으로 표적화한다는 것을 입증한다. Fabry 병에 걸린 iPSC 심근세포에서 이 AAV의 형질도입은 기저 수준을 훨씬 능가하는 세포 내에서 신속한 세포 자율 용량 관련 AGA 단백질 발현 및 활성을 초래했다. AGA 활성의 증가는 Gb3의 제거를 가져왔고, 이의 축적은 인간의 파브리병 발병의 핵심으로 간주된다.
실시예 3 - 코돈 최적화된 GLA cDNA 서열은 파브리병 환자의 내피 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다
재료 및 방법
내피 분화
Fabry iPSC는 분화 전에 3-4일마다 6웰 플레이트에서 유지되고 계대 배양됐다. 2개의 12웰 플레이트에 성장 인자 감소 Matrigel(Corning)이 미리 코팅됐다. Fabry iPSC는 mTESR1에서 80-100% 합류가 될 때까지 성장했다. 적절한 밀도에 도달하면, 배양물을 순차적으로 GSK3ß 및 VEGF 활성화한 다음 이전에 발표된 분화 패러다임((Chalet Meylan, L., Patsch, C., & Thoma, E. (2015). Endothelial cells differentiation from hPSCs. Protocol Exchange. https://doi.org/10.1038/protex.2015.055)에 따라 StemPro-34 배지에서 확장했다. 6일째에 내피 세포를 자기(magnetic) 세포 분류에 의해 정제하고 CryoStor10(Stem Cell Technologies)에서 5x106 분취량으로 동결했다. 내피 세포를 VEGF165(Peprotech), 1X Glutamax(Thermo Fisher) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신(Gibco 22140-1)이 보충된 StemPro-34 SFM(1X) 배지에서 피브로넥틴( Fibronectin) 코팅된 플레이트에 cm2당 2.6E+4개의 세포로 해동했다. 악큐타제(Accutase) 세포 분리 용액을 사용하여 해동 5일 후 내피 세포를 1:2로 분할했다.
내피 세포 형질도입
(i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 내피 세포를 접종 후 4일 동안 형질도입했다. 형질도입 24시간 후에 배지를 흡출하고 새로운 StemPro-34 SFM(1X) 배지를 추가했다. 배지는 격일로 교체했다. 3개의 웰을 수확하여 세포 수를 얻었다. 세포 수 및 바이러스 역가를 기준으로 50, 100, 500 및 1000의 감염 다중도(MOI)에서 세포를 형질도입했다. 가장 높은 MOI의 볼륨과 동일하도록 비히클을 추가했다. 세포를 24시간 동안 배양한 다음 배지 교체를 받았다. 배지는 형질도입 4일 후 수확 때까지 격일로 교체했다.
면역세포화학을 위해, 하루 전에 바이러스와 함께 10μM Gb3(Matreya, LLC.)을 첨가하고, Gb3의 파브리병 관련 축적을 촉진하기 위해 형질도입 후 임의의 공급물에 첨가했다.
면역세포화학(ICC)
Fabry iPSC 내피 ICC
rAAV를 사용한 형질도입에 반응하여 Gb3 검출을 가능하게 하기 위해 세포 배양에 대한 특정 변형이 이루어졌다. 먼저 피브로넥틴(Fibronectin)이 코팅된 유리 챔버 슬라이드(LabTek)에서 세포를 배양했다. 2일 전 형질도입 및 바이러스 세척 시 세포에 10μM Gb3를 로딩했다. 감염 4일 후, 세포를 마그네슘 또는 칼슘이 없는 인산염 완충 식염수(PBS-/-)로 1회 세척하고 실온에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 그런 다음 세포를 PBS-/-로 3회 세척하고 PBS-/- 중 0.2% Triton X-100의 2% 소 혈청 알부민 및 5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단했다. AGA(Abnova H00002717-B01P, custom Phycoerythroitin conjugate)에 대해 1:100으로 희석된 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 차단 용액에서 세포와 함께 배양했다. 세포를 DAPI로 대조염색하여 핵을 시각화하고 Zeiss Axiovert.A1 도립 현미경에서 이미지화했다. 또한, 접합된 BD 클론 b5b CD77-Alexa-647(BD 563632) 및 Miltenyi CD31-FITC를 ICC 차단 완충액에서 1:100 항체와 함께 고정 배양물을 1시간 동안 배양하여 사용했다.
웨스턴 블롯
형질도입 4일 후, 세포를 Accutase로 리프팅하고 5분 동안 300 xg에서 펠렛화했다. RIPA 완충액(Thermo)과 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 사용하여 용해물을 만들었다. 용해물을 얼음 위에서 15분 동안 배양하고 21,000 xg에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하고, 단백질 농도를 결정하기 위해 비신코닌산 분석(BCA)을 실행했다. 농도가 정규화됐다. SDS-PAGE는 4-12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 200V에서 30분 동안 실행됐다. 단백질을 0.2um 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 항-AGA(Atlas, HPA000237, 1:200) 및 항-GAPDH(Stem Cell Technologies, 5174, 1:5000) 항체로 프로빙한 다음 종 특이적 양고추냉이 퍼옥시다제 이차 항체로 밤새 프로빙했다. 향상된 화학발광은 단백질 밴드를 현상하는 데 사용되었으며 밴드 검출은 BioRad ChemiDoc MP에서 캡처됐다. 밴드 정량화는 Image Lab, Microsoft Excel 소프트웨어 및 GraphPad Prism8을 사용하여 분석됐다.
AGA 활성 분석
알파-갈락토시다아제 합성 형광 기질(alpha-galactosidase synthetic fluorometric substrate)(BioVision, K407)을 사용하여 AGA 활성 분석을 수행했다. AGA 활성 분석은 다음 변경 사항과 함께 제조업체의 프로토콜에 따라 수행됐다. 간단히 말해서, 사용된 배지를 수집하고 액체 질소를 사용하여 급속 냉동했다. 세포를 트립신 0.05%를 사용하여 분리하고 300 xg에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 그런 다음 세포를 AGA 완충액으로 용해하고 얼음 위에서 10분 동안 배양했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 12,000 xg에서 원심분리했다. 상층액을 수집해 -80℃에 보관했다. 다음 날, 샘플을 얼음 위에서 해동하고 AGA 활성 분석에 추가하여 BCA 분석을 통한 단백질 정량화를 수행했다. AGA 반응 시간은 1시간이었고, 샘플은 360 여기/445 방출에서 Cytation3 플레이트 판독기(BioTek)에서 판독되었으며 게인은 AGA 표준 곡선의 최고 농도로 설정됐다.
표 3- 항체 목록
Antibody Host Company-Catalog No. Dilution
Primary Antibodies
CD31-FITC Mouse Miltenyi-130-110-668 1:100
CD144-APC Mouse Miltenyi-130-102-738 1:100
GLA-PE Mouse Abnova- H00002717-B01P 1:100
CD77-Alexa-647 Mouse BD-563632 1:50
결과
파브리병에 걸린 유도 만능 줄기세포 유래 내피 세포의 특성화
Fabry iPSC는 내피 세포로 분화되어 파브리병에 영향을 받는 세포 유형의 관련 모델을 생성했다. 생성된 내피 세포를 CD144에 대해 6일째에 MACS에 의해 정제했다. Fabry iPSC 내피 세포에서 유동 세포분석 및 면역세포화학을 수행하여 내피 특이적 메이커인 CD31을 사용하여 순도를 조사했다. 분화는 99.2% CD31 양성 세포를 산출했으며(도 6A), 원형질막에서 면역세포화학 염색으로 확인했다(도 6B).
파브리병 iPSC-내피 세포에서 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA를 보유하는 rAAV를 사용한 형질도입은 강력한 AGA 단백질 발현을 유도한다
Fabry iPSC 내피 세포는 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질를 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 서열 식별 번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 형질도입 전에 해동 후 11일 동안 MOI 50, 100, 500 및 1000에서 배양됐다. 용량은 CAG 프로모터의 제어 하에 EGFP를 보유하는 다른 동일한 rAAV를 사용하여 형질도입 효율 데이터로부터 결정됐다. 세포를 형질도입 4일 후에 수확했다. 유동 세포분석은 AGA-양성 세포의 용량 의존적 증가를 보여주었다(도 7A). 비형질도입 세포의 면역세포화학(ICC)은 AGA 단백질 발현의 결여를 나타낸 반면, rAAV로 형질도입된 세포는 강력한 AGA 염색을 나타냈다(도 8B).
전체 AGA 단백질을 조사하기 위해 웨스턴 블롯팅을 위해 형질도입된 Fabry iPSC 유래 내피 세포로부터 단백질을 추출했다. 비형질도입 세포는 ICC에 의해 입증된 바와 같이 AGA 단백질이 결여되어 있다. 그러나, (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 형질도입된 Fabry iPSC 내피 세포는 항-AGA 항체로 프로빙한 후 49kDa의 정확한 크기에서 강한 AGA 단백질 밴드(도 7B)를 나타냈다. 밴드 밀도가 결정됐다(도 7B). rAAV를 사용한 형질도입은 비형질도입 세포와 비교하여 두 MOI에 대한 총 AGA 단백질을 유의하게 증가시켰다.
파브리병에 걸린 iPSC-내피 세포에서 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV로 형질도입한 후 향상된 AGA 활성
형질도입된 Fabry iPSC 내피 세포를 AGA 완충액(Biovision, LLC.)으로 용해시키고 AGA 활성을 정량화하는 데 사용했다. Fabry iPSC 내피 세포 샘플을 AGA 특이적 합성 기질과 함께 1시간 동안 배양하여 절단된 기질의 양을 형광 측정법으로 정량화했습니다. 데이터는 rAAV로 형질도입된 Fabry iPSC 내피 세포가 Fabry iPSC 내피 세포와 비교하여 향상된 AGA 활성을 가짐을 보여준다. 도 8A 및 8B 참조
결론
파브리병에 걸린 iPSC 내피 세포에서 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 rAAV의 형질도입은 기저 수준보다 상당히 높은 빠른 세포 자율(cell-autonomous), 용량 의존적 AGA 단백질 발현 및 세포내 활성을 초래했다. 코돈 최적화된 GLA 이식유전자의 발현을 통한 AGA 활성의 증가는 Gb3의 제거를 가져왔고, 이의 축적은 인간에서 파브리병의 발병기전의 중심으로 간주된다.
실시예 4 - Fabry 마우스 모델의 혈장 및 조직에서 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA로부터 발현된 AGA의 발현 및 기능 분석
재료 및 방법
생체 내 연구 설계 및 샘플 수집
10-11주령의 Fabry 모델 B6;129-Gla tm1Kul /J(Jackson Labs #003535)(이하 GLA-null로 지칭) 또는 정상 C57BL/6 마우스는 (i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV의 1 x 1012, 1 x 1013 또는 5 x 1013 vg/kg를 0.005% Pluronic F-68 또는 비히클만을 포함하는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1일째에 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 받았다(표 4 참조). 사망률, 임상 관찰, 체중, 음식 소비, AGA 활성 및 Gb3 기질 축적에 대한 생물학적 분석 및 육안 부검 소견을 평가했다. 추가로, 마우스 서브세트(그룹당 n=3)의 조직을 처리하고 면역조직화학(immunohistochemistry)(IHC)에 의한 AGA 발현 및 국소화에 대해 조사했다.
α-갈락토시다아제 A(AGA) 활성 및/또는 혈장 내 Gb3 기질 축적 측정을 위해 이산화탄소 흡입(56일만) 후 상악 정맥 또는 대정맥을 통해 모든 동물로부터 혈액 샘플(1일, 15일 및 29일) 또는 얻을 수 있는 최대값(56일만)을 수집했다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈장으로 처리하고, 샘플이 테스트될 때까지 -60℃ ~ -90℃에서 보관했다. 1일, 15일 및 29일에 투여하기 전에 그리고 56일에 연구 종료 시에 혈장을 AGA 활성에 대해 분석했다. 혈장 Gb3 및 lysoGb3 수준을 56일에 분석했다. 심장, 신장, 간 및 소장의 샘플도 연구 종료 시 수집하고 AGA 활성 및 Gb3 기질 수준에 대해 분석했다. 각 그룹의 동물 서브 세트(subset)에서 선택된 조직(심장, 간, 신장 및 소장)의 대표적인 샘플을 수집하고 즉시 10% 중성 완충 포르말린(조직의 20-30X 부피)에 보존했다. 조직을 실온에서 약 48시간(±1시간) 동안 고정한 다음 70% 에탄올로 옮겼다.
표 4 Fabry 마우스 용량 범위 및 효능 연구를 위한 치료군의 도식
Group Genotype rAAV (vg/kg) N
1 C57BL/6 Vehicle 15
2 GLA-null Vehicle 15
3 GLA-null 1x1012 15
4 GLA-null 1x1013 15
5 GLA-null 5x1013 15
혈장 및 조직 활성 분석
검증된 분석을 사용하여 4-메틸움벨리페론(methylumbelliferone)의 생산을 통해 AGA 효소 활성을 검출하고 정량화했다. 간단히 말해서, 샘플을 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside를 함유하는 활성 완충액에 희석하고 실온에서 1시간 동안 배양했다. 형광 방출은 366 여기/450-475 방출에서 형광 검출이 장착된 플레이트 판독기를 사용하여 정량화하고 표준 곡선과 비교했다. 조직 샘플 내의 총 단백질은 BCA 분석을 사용하여 정량화됐다.
플라즈마 기질 분석
혈장 내 LysoGb3(m/z 786) 및 이의 유사체(m/z 784, m/z 802 및 m/z 804), 및 Gb3 및 이의 동형(isoform)(C16:0, C18:0, C22:0, C24:1 및 C24:0)을 (Boutin & Auray-Blais, 2014, Analytical Chemistry, 86(7), 3476-3483. //doi.org/10.1021/ac404000d; Provencal et al. 2016, Bioanalysis, 8(17), 1793-1807. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0116)에 기재된 바와 같이 분석했다. 간단히 말해서, 투여 후 56일에 채취한 혈장 샘플(42일 샘플을 저장하고 보관했지만 분석하지 않음)에 내부 표준으로 glycinated-lysoGb3(Matreya LLC; State College, PA)를 스파이킹하고 혼합-모드 강 양이온 교환(mixed-mode strong cation exchange)(MCX) 카트리지(Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 고체상 추출에 의해 정제했다. 수집된 상을 질소 기류 하에 건조시키고, 50% 아세토니트릴/0.1% 포름산으로 재구성하고, BEH C18 컬럼을 사용하여 Acquity I-Class 초고성능 액체 크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography)(UPLC) 시스템(Waters Corporation, Milford, MA)에 주입하고 lysoGb3를 Xevo TQ-S(Waters Corporation) 삼중 사중극자 탠덤 질량 분석기(micro triple quadrupole tandem mass spectrometer)를 사용하여 스파이크-인(spiked-in) 내부 표준(glycinated-lysoGb3)과 동시에 검출했다.
Gb3 분석을 위해, 혈장 샘플에 Gb3(C18:0D3)(Matreya LLC; State College, PA)를 내부 표준으로 스파이킹하고 tert-butyl methyl ether(터트-부틸 메틸 에테르)를 사용한 액체-액체 추출로 정제했다. 샘플을 수산화칼륨으로 비누화하고, 아세트산으로 중화하고, 원심분리하고, 유기층을 수집하고 질소 기류하에 건조시켰다. 샘플을 재구성하고 Zorbax Bonus-RP Guard 컬럼 카트리지(4.6 × 12.5mm, Agilent Technologies)를 사용하여 Alliance HPLC 2795 시스템(Waters Corporation, Milford, MA)에 주입했다. 그런 다음 분석물을 Quattro 마이크로 삼중 사중극자 탠덤 질량 분석기(Waters Corporation)를 사용하여 스파이크-인 내부 표준과 동시에 검출했다.
조직 기질 분석
파브리병의 치료에 중요한 조직에서 Gb3 동형 및 유사체(C16:0, C18:0, C20:0, C22:0, 및 C24:1)를 (Provencal et al. 2016, Bioanalysis, 8(17), 1793-1807. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0116))에 기재된 바와 같이 분석했다. 간단히 말해서, 강화된 튜브에서 냉동된 심장, 신장, 간, 소장 및 비장 조직 샘플을 해동하고, 각 튜브에 5개의 세라믹 비드를 추가하고, 샘플을 Bead Disruptor 12 비드 밀 균질화기(bead mill homogenizer)(Omni International; Kennesaw, GA)를 사용하여 메탄올에서 균질화했다. 그런 다음 용해물을 추출하고 위에서 설명한 혈장 샘플과 동일한 방식으로 분석했다. 다른 6마리 동물의 AGA 활성 분석을 가능하게 하는 조직 크기 제한으로 인해 그룹당 n=6마리 동물의 심장을 제외하고 그룹당 n=12마리 동물로부터 모든 조직을 수집했다. 각 치료군의 나머지 3마리의 동물을 면역조직화학 분석에 사용했다.
데이터는 샘플 분석물의 질량 분석기 피크 면적을 Gb3 내부 표준(Gb3(C18:0D3))의 피크 면적으로 나눈 비율인 응답 비율로 표시된다. 각 조직에 대해 6가지 모든 Gb3 동형/유사체의 총 반응 비율을 조사했다. 이 비율의 특성으로 인해 이 응답 비율에 해당하는 단위가 없다.
통계 분석
Charles River Laboratories - Mattawan(Mattawan, MI)의 생물통계학 그룹에 의해 통계 분석이 수행됐다. 모든 lysoGb3 및 Gb3 동형/유사체의 집계 값에 대해 데이터 분석을 수행하여 데이터가 광범위한 AGA 기질을 포착하고 있음을 확인했다. 혈장 lysoGb3 및 조직 Gb3 데이터 세트 모두에서 모든 "검출되지 않은"(not detected)(N.D.)) 값은 데이터 분석을 위해 값이 0인 것으로 처리됐다. 이들 N.D. 값을 LLOD(lower limit of detection)(검출 하한) 값으로 대체하여 민감도 분석을 수행했다.
그룹 분산의 균질성 및 잔차의 정규성을 평가하기 위한 테스트를 0.01 유의 수준에서 수행했다. Gb3 데이터 분석에 사용된 실험 단위는 개별 동물이었다.
미가공 데이터를 각 시간 간격 내에서 표로 작성하고 그룹별로 각 종점에 대해 평균 및 표준 편차를 계산했다. 각 종점에 대해 아래에 요약된 분석을 사용하여 치료군을 대조군과 비교했다. 일부 종점에 대한 데이터는 특정된 분석을 수행하기 전에 로그 또는 순위 변환을 통해 적절하게 변환됐다.
표 5 계산된 통계적 비교(Statistical Comparison)
Table 5. Statistical Comparisons
Group Versus Groups
1 2, 3, 4, 5
2 3, 4, 5
가변성을 입증하고, 모든 그룹에 대한 샘플 크기가 3 이상인 종점 및/또는 파라미터(각 수집 간격 내)의 경우, 시스템은 데이터가 대략적으로 정규인지 또는 로그 변환 또는 순위 변환을 사용해야 하는지 여부를 확인하기 위해 잔차의 정규성과 분산의 동질성을 테스트했다. Levene의 테스트는 그룹 분산의 동질성을 평가하는 데 사용되었고 Shapiro-Wilk의 테스트는 잔차의 정규성을 테스트하는 데 사용됐다.
미가공 데이터에서, Levene의 테스트가 유의하지 않은 경우(p≥0.01) 및 Shapiro-Wilk의 테스트가 유의하지 않은 경우(p≥0.01), 정규 분포가 사용됐다. Levene의 테스트가 유의한 경우(p<0.01) 또는 Shapiro-Wilk의 테스트가 유의한 경우(p<0.01), 데이터에 사용된 로그 변환을 사용하여 분산의 정규성과 동질성을 테스트했다.
로그 변환된 데이터에서, Levene의 테스트가 유의하지 않은 경우(p≥0.01) 및 Shapiro-Wilk의 테스트가 유의하지 않은 경우(p≥0.01), 로그 정규 분포가 사용됐다. Levene의 테스트가 유의하거나(p<0.01) Shapiro-Wilk의 테스트가 유의한 경우(p<0.01) 데이터에 순위 변환이 사용됐다.
적절하게 변환된 데이터를 사용한 분산의 일원 분석을 사용하여 치료 효과에 대한 각 종점을 테스트했다(Edwards & Berry, 1987, Biometrics, 43(4), 913-928.).
치료 효과가 유의한 경우(p<0.05), 상기 기재된 바와 같이 치료군의 쌍대 비교를 위해 선형 대조를 구성했다. 이러한 쌍대 비교의 결과는 Edwards와 Berry의 방법을 사용하여 다중 비교에 대한 조정 후 0.05 및 0.01 유의 수준에서 보고됐다(Edwards & Berry, 1987, Biometrics, 43(4), 913-928.). 달리 명시되지 않는 한 모든 테스트는 양측 검정(two-tailed test)이였다.
결과 및 논의
혈장 및 조직 AGA 분석
상기 기재된 바와 같은 ((i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는) rAAV의 단일 IV 용량은 모든 평가 시점에서 혈장 AGA 활성의 일관되고 용량 의존적 증가를 초래했다(도 9A). 이러한 증가는 연구의 8주 기간 동안에 걸쳐 유지됐다(도 9A).
연구 종료 시, 비히클-치료된 마우스와 비교하여 신장 및 소장에서 AGA 활성의 증가가 검출되었으며, 5 x 1013 vg/kg의 고용량에서 심장에서 더 높은 수준을 나타낸다(도 9B). 간에서 1 x 1013 및 5 x 1013 vg/kg으로 치료된 마우스에서 높은 AGA 활성 수준이 관찰됐다(도 9B). 이들 데이터는 ((i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는) 상기 기재된 바와 같은 rAAV의 단일 IV 용량은 특히 1 x 1013 이상의 용량에서 혈장에서 AGA 활성의 상당한 발현을 초래함을 시사한다. 투여 후 8주까지 심장과 간에서 상당한 발현이 관찰됐다. 조직에서 AGA 발현을 육안으로 확인하기 위해 심장, 신장, 소장 및 간을 수집하고 고정하고 파라핀 포매(paraffin-embedded)하고 상기한 바와 같이 AGA에 대한 IHC를 수행했다. 검사된 모든 조직에서 AGA 발현의 용량 의존적 증가가 관찰됐다(도 10).
혈장 lysoGb3 분석
상기 기재된 바와 같은 rAAV((i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함)의 단일 IV 용량은 투여 후 8주에 혈장 내 총 lysoGb3 수준의 모든 수준에서 용량 의존적이고 유의한(P<0.01) 감소를 초래했다. 질량 대 전하 비율(mass-to-charge ratio)(m/z)로 표시되는 4가지 다른 lysoGb3 유사체를 조사했다: m/z 786, m/z 784, m/z 802 및 m/z 804. 유사체와 함께, lysoGb3은 rAAV의 모든 용량 수준에서 실질적으로 감소됐다.
야생형 마우스는 혈장에서 검출된 2.11±0.26 nM의 lysoGb3만을 나타내는 반면, 비히클-치료된 Fabry 마우스는 혈장에서 477.37±88.5 nM 이상의 상당한 lysoGb3 축적을 갖는다(도 11). 1 x 1012 vg/kg의 rAAV의 단일 낮은 IV 용량은 Fabry 마우스의 혈장에서 lysoGb3의 농도를 197.5±124.5 nM으로 58% 이상 감소시켰다(P<0.01). 1 x 1013 vg/kg의 rAAV의 중간 용량은 Fabry 마우스에서 혈장 lysoGb3를 19.1±13.46 nM으로 96% 감소를 초래했다(P<0.01). rAAV의 용량을 5 x 1013 vg/kg으로 추가로 증가시키면 lysoGb3가 10.57±13.85 nM으로 유사한 감소를 초래했다(P<0.01). 모든 유사체의 집계된 변화의 데이터는 아래 표 6에 요약되어 있다.
표 6 IV 주사 후 56일째의 혈장 lysoGb3 수준
Group Genotype Treatment Dose (vg/kg) Mean of All LysoGb3 Analogs (nM) Control LSMEAN minus Treatment LSMEAN P Value compared to Group 2 Significant At
1 WT Vehicle N/A 2.11±0.26 N/A N/A N/A
2 GLA-null Vehicle N/A 477.37±88.5 N/A N/A N/A
3 GLA-null rAAV 1x1012 197.5±124.5 -13.3905 0.0000 <0.01
4 GLA-null rAAV 1x1013 19.1±13.46 -30.5238 0.0000 <0.01
5 GLA-null rAAV 5x1013 10.57±13.85 -42.0571 0.0000 <0.01
Gb3 및 Gb3 유사체도 혈장에서 조사되었지만 혈장에서 lysoGb3가 임상 질환에 대한 기질의 보다 적절한 형태이기 때문에 lysoGb3 데이터만 여기에서 논의된다(Boutin & Auray-Blais, 2014, Analytical Chemistry, 86(7), 3476-3483. //doi.org/10.1021/ac404000d).
조직 Gb3 분석
조사된 모든 조직은 야생형 C57BL/6에 비해 GLA-null Fabry 마우스에서 상당히 더 많은 양의 Gb3을 나타내며, 이는 파브리병 표현형과 관련된 AGA 기질의 예상 축적을 확인시켜준다. 모든 조직 및 모든 용량 수준에서 단일 IV 용량의 rAAV로 치료한 후 Gb3의 용량 의존적 감소가 있다. 심장, 신장, 간 및 소장의 특정 결과는 아래에 기술되어 있다. 비장도 수집 및 분석되었지만 비장은 파브리병에 임상적으로 중요하지 않기 때문에 이러한 결과는 여기에서 논의되지 않는다. 조직 Gb3 데이터는 샘플 분석물의 질량 분석기 피크 면적을 Gb3 내부 표준의 피크 면적으로 나눈 비율인 응답 비율로 표시된다(Gb3(C18:0D3)).
심장 Gb3 분석
야생형 C57BL/6 마우스는 심장에서 2.9±0.2의 응답 비율을 나타내는 반면, GLA-null Fabry 마우스는 285.5±56.5(P<0.01)에서 측정된 상당한 기질 축적을 나타낸다. rAAV의 단일 IV 주사는 Fabry 마우스에서 Gb3의 용량 의존적 제거를 초래한다(도 12). 1 x 1012 vg/kg의 저용량은 심장의 Gb3 함량을 30.1±30.5로 89.4% 감소시켰다. 1 x 1013 vg/kg의 rAAV의 중간 용량 수준은 Gb3 수준을 9.9±3.7로 96% 이상 감소시켰다. 5 x 1013 vg/kg의 고용량은 4.4±2.2로 Gb3의 98% 이상을 제거했다. 이러한 결과는 그룹당 평균 n=6 동물을 나타낸다. 심장의 모든 Gb3 감소는 그룹 2(비히클 치료된 GLA-null)와 비교하여 통계적으로 유의했다(P<0.01).
신장 Gb3 분석
비히클 치료된 야생형 C57BL/6 마우스는 25±4.1의 응답 비율을 나타내는 반면 GLA-null Fabry 마우스는 373±71을 나타낸다. rAAV의 단일 IV 용량은 각각 1 x 1012, 1 x 1013, 또는 5 x 1013 vg/kg으로 치료 56일 후에 28.3%, 74.4% 및 90.7% 감소를 나타내는 용량 의존적이고 통계적으로 유의한(P<0.01) Gb3 제거를 초래했다. 중간 및 고용량 수준에서 신장의 Gb3 감소는 그룹 2(비히클 치료된 GLA-null)와 비교하여 통계적으로 유의했다(P<0.01). 저용량 1 x 1012 vg/kg은 유의한 수준(P = 0.0537)을 달성하지 못했지만 치료제는 이 저용량 수준에서도 Gb3의 감소세를 나타낸다(도 12).
간 Gb3 분석
야생형 C57BL/6 및 GLA-null Fabry 마우스의 간 용해물에서 반응 비율로 측정된 Gb3 수준은 각각 2.9±0.5 및 377±75였다. 간 Gb3 축적은 rAAV의 저용량으로도 거의 완전히 제거됐다(도 12). 1 x 1012 vg/kg 용량은 Gb3를 26±24로 93.1% 감소시켰다. 1 x 1013 또는 5 x 1013 vg/kg의 중간 및 고용량은 거의 완전한(>99%) 기질 제거를 초래하여 각각 2.6±0.5 및 2.5±0.3의 야생형 수준으로 되돌아갔다.
소장 Gb3 분석
소장은 1164±276의 응답 비율을 나타내는 GLA-null Fabry 마우스에서 훨씬 더 높은 Gb3 축적을 보인 반면, 야생형 C57BL/6 마우스의 소장에서는 3.4±0.3만이 검출됐다. rAAV의 단일 IV 용량은 비히클-치료된 GLA-null 제거율에 비해 모든 용량 수준에서 용량-의존적이고 유의한(P<0.01) 결과를 초래했다(도 12). 1 x 1012, 1 x 1013 또는 5 x 1013 vg/kg 용량 수준은 Gb3에서 각각 33.6%(772±148), 73%(314±190) 및 94.8%(60±59) 감소를 초래했다.
표 7: 코돈 최적화된 GLA를 보유하는 rAAV를 사용한 IV 처리 후 56일째에 수집된 조직에서 Gb3 감소의 요약
Group Genotype Dose (vg/kg) Tissue Response Ratio of Mean Total Gb3 Content % Reduction from Vehicle-Treated GLA-Null
1 WT Vehicle Heart 2.9 N/A
2 GLA-null Vehicle Heart 285.5 0%
3 GLA-null 1 x 1012 Heart 30.1 89.4%
4 GLA-null 1 x 1013 Heart 9.9 96.5%
5 GLA-null 5 x 1013 Heart 4.4 98.5%
1 WT Vehicle Kidney 25.0 N/A
2 GLA-null Vehicle Kidney 373.1 0%
3 GLA-null 1 x 1012 Kidney 267.4 28.3%*
4 GLA-null 1 x 1013 Kidney 95.5 74.4%
5 GLA-null 5 x 1013 Kidney 34.6 90.7%
1 WT Vehicle Small Intestine 3.4 N/A
2 GLA-null Vehicle Small Intestine 1164.2 0%
3 GLA-null 1 x 1012 Small Intestine 772.7 33.6%
4 GLA-null 1 x 1013 Small Intestine 313.8 73.0%
5 GLA-null 5 x 1013 Small Intestine 60.5 94.8%
1 WT Vehicle Liver 2.9 N/A
2 GLA-null Vehicle Liver 377.3 0%
3 GLA-null 1 x 1012 Liver 25.9 93.1%
4 GLA-null 1 x 1013 Liver 2.6 99.3%
5 GLA-null 5 x 1013 Liver 2.5 99.3%
결론
파브리병은 장기 및 조직에서 Gb3 및 lysoGb3 기질 분자의 축적으로 인해 발생한다. 이 연구는 마우스 모델에서 파브리병에 대한 치료로서 AGA를 발현하고 Gb3를 이화하는 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA를 보유하는 rAAV의 단일 용량의 능력을 평가했다. 이 연구의 결과는 검사된 모든 조직과 혈장에서 Gb3 및 lysoGb3의 상당한 감소를 입증한다. 1 x 1012 vg/kg의 저용량은 심장과 간 모두에서 매우 활동적이어서, 각 장기에서 89% 이상의 기질 감소를 야기한다. 저용량은 소장에서 33.4%의 기질 감소를 일으켰고, 신장의 데이터에서 볼 수 있는 변동성은 그 결과가 통계적 유의성을 달성하지 못한 것과 같았지만 신장에서 감소를 보였다. 1 x 1013 vg/kg의 중간 용량은 심장에서 96% 이상의 기질 감소, 간에서 거의 완전한(>99%) 제거, 신장에서 74.4% 감소 및 소장에서 73% 감소를 가져왔으며 이는 테스트된 모든 조직에서 매우 활성적이고 상당한 용량이다. 5 x 1013 vg/kg의 고용량은 심장에서 98% 이상의 기질 제거, 신장에서 90% 이상의 제거, 소장에서 거의 95%의 제거, 및 간에서 99% 이상의 제거를 초래했다. 테스트된 모든 용량은 Fabry 마우스 모델에서 활성이고 효과적이며 축적된 AGA 기질 수준을 일부 경우에 야생형 수준 또는 그 근처까지 감소시켰다.
실시예 5 - 야생형 마우스의 혈장 및 조직에서 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA로부터 발현된 AGA의 발현 및 기능 분석
(i) 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 및 (ii) 서열 식별 번호 6의 핵산을 포함, CAG 프로모터(4D-310)에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA를 포함하는, rAAV의 단일 용량 비-GLP 급성 내성 연구를 실험적으로 나이브(naive) C57BL/6 수컷 마우스(투여 개시 시 연령 8주)에서 정맥내 주사에 의해 수행했다. 단일 IV 주사(꼬리 정맥을 통해) 후 최대 허용 용량(maximum tolerated dose)(MTD)을 측정했다.
연구 설계는 하기 표 8에 제공된다:
Group No. Dose Level (vg/kg) Dose Volume (mL/kg) No. of Male Animals
1 0 10 6
2 1.0 x 1013 10 6
3 5.0 x 1013 10 6
4 1.5 x 1014 10 6
혈장에서 GLA 활성의 측정을 위해 상악 혈관을 통해 모든 생존 동물로부터 1일(투여 전(predose)) 및 15, 29 및 43일의 동일한 시간에 혈액 샘플을 수집했다.
사후 연구 평가는 30일째에 안락사된 1마리의 동물 및 예정된 말기 부검(투여 후 ~6주)에서 모든 생존 동물에 대해 수행됐다. 심장, 간(좌측 측엽), 신장(좌측) 및 소장(십이지장, 회장 및 공장의 비슷한 크기의 섹션)을 모든 동물에서 분리하고 GLA 활성에 대해 평가했다.
투여 후, 모든 치료된 혈장 샘플은 대조군 동물보다 상당히 높은 GLA 활성을 가졌다(도 13 참조, 1.0 x 1013 vg/kg 용량에 대한 비히클 대조군에 비해 1200배 증가, 5.0 x 1013 vg/kg 용량에 대한 비히클 대조군에 비해 5000배 증가 및 1.5 x 1014 vg/kg 용량에 대한 비히클 대조군에 비해 26,000배 증가를 예시함). 또한, 각각의 고용량은 저용량(들)보다 상당히 높은 혈장 GLA 활성을 가졌다. 수집된 모든 조직에서 동일한 경향(용량 반응성)이 관찰됐다(도 14 참조). 종합하면, 데이터는 각 용량에서 4D-310의 단일 IV 용량 후 GLA 및 결과적인 GLA 활성의 명확한 발현을 입증한다. 특히, 십이지장, 심장, 회장, 공장, 심장, 신장 및 간 조직은 GLA 생물반응기 역할을 하는 간에서 GLA의 발현과 함께 파브리병 치료에 가장 적절한 조직 중 하나이다.
4D-310 치료된 동물의 혈장에서 GLA 값의 요약은 하기 표 9에 제공된다:
Dose (vg/kg) Sample Type Day 1 Day 15 Day 29 Day 43
(plasma, nmol/hr/mL)
0 Plasma 85.18 114.33 109.33 100.72
1.0 x 1013 113.43 134116.67b 148983.33b 136833.33b
5.0 x 1013 100.43 549500.00b,d 600000.00b,d 637000.00b,d
1.5 x 1014 91.03 3211666.67b,d,f 2980000.00b,d,f 3023333.33b,d,f
(tissues, nmol/hr/mg)
0 Duodenum - - - 397.67
1.0 x 1013 - - - 1646.33b,
5.0 x 1013 - - - 4188.00b,d
1.5 x 1014 - - - 27883.33b,d,f
0 Heart - - - 146.67
1.0 x 1013 - - - 6246.67b
5.0 x 1013 - - - 24380.00b,d
1.5 x 1014 - - - 71833.33b,d,f
0 Ileum - - - 432.75
1.0 x 1013 - - - 2253.33b
5.0 x 1013 - - - 13450.00b,d
1.5 x 1014 - - - 39466.67b,d,f
0 Jejunum - - - 366.33
1.0 x 1013 - - - 2471.50b
5.0 x 1013 - - - 6564.00b,c
1.5 x 1014 - - - 26783.33b,d,f
0 Kidney - - - 132.67
1.0 x 1013 - - - 1389.17b
5.0 x 1013 - - - 3828.00b,d
1.5 x 1014 - - - 12356.67b,d,f
0 Liver - - - 282.00
1.0 x 1013 - - - 86816.67b
5.0 x 1013 - - - 2020000.00b,d
1.5 x 1014 - - - 401333.33b,d,f
- Not Applicable
b = different from 0 vg/kg, p < 0.01
c = different from 1.0 x 1013 vg/kg p < 0.05
d = different from 1.0 x 1013 vg/kg p < 0.01
f = different from 5.0 x 1013 vg/kg p < 0.01
연구에서 4D-310 관련 거시적 관찰은 없었다. 연구에서 전신 또는 국소 독성에 대한 4D-310 관련 임상 관찰은 없었고, 체중의 4D-310 관련 변화 또는 음식 소비에 대한 효과도 관찰되지 않았다. 연구에서 4D-310 관련 사망은 없었다.
수컷 마우스에 대한 1.0 x 1013, 5 x 1013 및 1.5 x 1014 vg/kg의 단일 정맥내 용량 후 평가된 파라미터 중 임의의 것에 대해 유해한 4D-310 관련 효과가 없었기 때문에, 관찰되지 않은 효과 수준(no-observed-effect-level)(NOEL) 및 최대 허용 용량은 테스트된 최고 용량인 1.5 x 1014 vg/kg으로 측정됐다.
실시예 6 - 전신 투여된 4D-310(서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA를 갖는 핵산 포함)의 독성 및 생물학적 분포
꼬리 정맥을 통한 단일 정맥내 주사에 이어 14일 및 91일 또는 92일 관찰 기간을 통해 C57BL/6(wt) 마우스에 투여된 4D-310의 잠재적 독성 및 조직 생물학적 분포를 조사했다. 연구 설계는 하기 표 10에 제공된다:
Group No. Dose Level (vg/kg) Dose Volume (mL/kg) No. of Male Animals
Day 15 Necropsya Day 92 +/-1 Necropsya
1 0 10 22+2b 22+2b
2 1.0 x 1013 10 22+2b 22+2b
3 5.0 x 1013 10 22+2b 22+2b
4 1.5 x 1014 10 22+2b 22+2b
a 각 부검일에 동물을 다음과 같이 설계했다: 임상 화학 파라미터에 대한 5/그룹 및 현미경 검사; 혈액학 파라미터에 대한 5/그룹; 항-캡시드 및 항-페이로드 항약물 항체 분석에 대한 5/그룹; GLA 활성 분석 및 조직 및 전혈 qPCR 및 RT-qPCR에 대한 7/그룹.
b 가능한 대체물로 추가 동물/치료군. 대체물로 사용되지 않는 경우, 추가 동물을 안락사시키고 92±1일 간격으로 폐기.
하기 파라미터 및 종점을 이 연구에서 평가했다: 사망률, 임상 관찰, 체중 및 음식 소비, 검안경 검사, 임상 병리학 파라미터(혈액학 및 임상 화학), 항-캡시드 및 항페이로드 항약물 항체 분석, GLA 활성 분석, 생물학적 분포 분석(조직 및 전혈 qPCR 및 RT-qPCR), 육안 부검 소견, 장기 중량 및 조직병리학적 검사.
4D-310 관련 사망 또는 전신 또는 직접적인 국소 독성의 임상 징후가 없었고, 체중, 음식 소비, 검안경 검사, 임상 병리학 파라미터, 장기 중량, 또는 육안 부검 소견에 대한 어떠한 영향도 없었다.
모든 4D-310(서열 식별 번호 4의 4D-C102 캡시드 단백질을 포함함) 처리된 동물은 측정된 스크리닝 컷 포인트(screening cut-point) 이상인 것에 기초하여 항-4D-C102 캡시드 항체에 대해 양성으로 스크리닝됐다. 그러나 모든 4D-310 치료된 동물이 양성으로 스크리닝되었음에도 불구하고; 16/30개의 샘플만이 확증적(confirmatory) 컷 포인트에 대한 평가에 따라 양성으로 확인됐다. 이 16개의 확인된 양성 샘플은 1.0 x 1013 vg/kg에서 7/10, 5.0 x 1013 vg/kg에서 5/10, 1.5 x 1014 vg/kg에서 4/10의 용량 수준 분석을 보였다. 항-캡시드 항체 반응과 명백한 용량 관계는 없었다.
동물의 일부는 4D-310을 투여한 후 연구에서 항-캡시드 항체를 발생시켰지만, 명백한 용량-관계는 없었다. 모든 대조군 동물을 스크리닝하고 항-4D-C102 캡시드 항체에 대해 음성인 것으로 확인했다. 4D-310 치료는 치료된 모든 동물이 음성인 것으로 밝혀졌기 때문에 항-알파 갈락토시다아제 A 항체가 형성되지 않는 결과를 초래했다. 4D-310을 사용한 치료는 대조군과 비교할 때 연구 기간 내내 존재하는 혈장 GLA 활성의 용량 의존적이고 통계적으로 유의한 증가를 가져왔다. 대부분의 치료된 그룹은 또한 통계적으로 유의한 방식으로 이전 용량 그룹보다 더 높았다.
용량 및 시점 모두에 대해 관찰된 최고 수준의 벡터 게놈 중에는 심장, 간, 폐, 신장 및 주사 부위가 있다. 모든 그룹에서 뇌와 척수에서 검출된 4D-310 벡터 DNA의 농도는 앞서 언급한 조직에 비해 전반적으로 낮았다. 간 샘플에서 최고 수준의 4D-310 벡터 DNA가 검출된 생물학적 분포 분석과 유사하게, 벡터 유래 유전자 발현은 간 샘플에서 가장 높은 농도에서 관찰되었고, 심장, 폐 및 주사 부위 샘플이 그 뒤를 이었다.
간 샘플 내에서, 4D-310 발현은 총 RNA μg당 44,662,881개 카피를 갖는 심장 샘플과 비교하여 총 RNA μg당 645,293,620개 카피에서 대략 14배 더 컸다. 동일한 시점 및 용량 수준에서 생물학적 분포 분석에서 검출된 4D-310 벡터 DNA의 단지 1,884개 카피와 비교하여 고환 샘플은 총 RNA의 μg당 평균 2,888,001개 카피에서 비정상적으로 증가된 수준의 유전자 발현을 나타냈다. 이것은 동물 4043에 직접 기인할 수 있으며, 여기서 4D-310 발현은 15,095,299개 카피이고 다른 5마리 동물 사이의 평균은 446,541개이다. 또한, 동물 4043은 생물학적 분포 분석 중에 검출된 4D-310 벡터 DNA의 1,443개 카피의 개별 카운트만 가졌고 연구 기간 동안 임상/수의학적 소견이 없었다. 따라서, 비정상적으로 높은 수준의 유전자 발현은 동물의 전반적인 건강에 영향을 미치지 않기 때문에 불리하지 않는 것(non-adverse)으로 간주됐다.
전체 벡터-유래된 4D-310 유전자 발현은 모든 조직에서 나타났으며, 간, 심장, 폐 및 주사 부위 샘플에서 가장 높은 농도로 나타났다. 4D-310 거시적 소견은 없었다. 5.0 x 1013 vg/kg 이상에서 최소에서 중간 정도의 주사 부위 혈관주위/혈관 염증을 제외하고는 4D-310 관련 현미경 소견이 없었다. 이 소견은 Day 92 ± 1 동물에서는 나타나지 않았으며 가역적인 것으로 간주됐다.
조직 벡터 DNA μg당 평균 카피의 요약은 하기 표 11에 요약되어 있다.
TISSUE Vehicle - Day 15 Low Dose - Day　15 High Dose -Day　15 High Dose Day -92/93
Brain, Cerebrum 0 2,886.20 21,176.88 17,799.26
Brain, Cerebellum 29.56 2,657.93 13,488.98 18,107.84
Dorsal Root Ganglia (DRG) 0 709.87 6,138.45 1,847.41
Epididymis 0 521.96 7,207.75 2,930.27
Heart 8.38 19,243.03 81,560.75 61,892.67
Injection Site 0 224,576.42 3,989,305.62 850,106.33
Kidney Left 0 6,932.66 85,867.02 28,735.23
Liver 0 425,413.55 6,798,453.78 3,379,680.04
Lung with Bronchi 0 85,046.08 340,084.19 246,525.53
Lymph Node, Mandibular 0 1,703.21 12,431.13 3,621.43
Lymph Node, Mesenteric 0 1,786.74 13,209.12 4,528.63
Sciatic Nerve 0 1,304.78 15,593.00 6,724.72
Seminal Vesicles Left 0 240.72 1,845.50 1,149.30
Spinal Cord 429.92 2,888.00 22,941.23 21,961.64
Spleen 0 16,851.98 237,296.48 10,989.76
Testis 7.14 508.36 4,745.76 1,884.38
Whole Blood 0 - 208,234.43 146.80
Bone Marrow 0 140.94 5,641.30 790.94
BLOD = Below Limit of Quantitation, 9.97 Copies/reaction
BLOQ = Below Lower Limit of Quantitation, 50 copies/reaction
N/A = Total DNA Concentration (㎍/μL) is ≤ 0
- = No samples available for analysis.
Note: Individual BLOD results were reported as "0" and Individual BLOQ results were reported as "50"for the calculation of the mean copy number; N/A results are not included in the mean copy number
가장 높은 수준의 4D-310 벡터 DNA가 간 샘플에서 검출된 생물학적 분포 분석과 유사하게, 벡터 유래 유전자 발현은 간 샘플에서 가장 높은 농도로 검출됐으며, 그 다음으로 심장, 폐 및 주사 샘플이 그 뒤를 이었다. 간 샘플 내에서 4D-310 발현은 총 RNA μg당 44,662,881개 카피의 심장 샘플과 비교하여 총 RNA μg당 645,293,620개 카피로 약 14배 더 컸다.
전체 벡터-유래된 4D-310 유전자 발현은 모든 조직에서 나타났으며, 간, 심장, 폐 및 주사 부위 샘플에서 가장 높은 농도로 나타났다. 조직 벡터 RNA의 μg당 평균 카피의 요약은 아래 표 12에 요약되어 있다.
TISSUE High Dose Day - 92/93
Brain, Cerebrum 913,078.68
Brain, Cerebellum 741,324.07
Dorsal Root Ganglia (DRG) N/A
Heart 44,662,881.13
Injection Site 12,798,244.57
Kidney 278,022.32
Liver 645,293,620.04
Lung with Bronchi 15,668,829.48
Spinal Cord 252,581.65
Spleen 510,369.25
Testis 2,888,000.80
BLOD = Below Limit of Quantitation, 57.34 Copies/reaction
BLOQ = Below Lower Limit of Quantitation, 500 copies/reaction
N/A = Total DNA Concentration (㎍/μL) is ≤ 0
- = No samples available for analysis.
Note: Individual BLOD results were reported as "0" and Individual BLOQ results were reported as "500"for the calculation of the mean copy number; N/A results are not included in the mean copy number
결론적으로, 4D-310의 단일 정맥내 투여 후, 평가된 임의의 파라미터에서 어떠한 부작용도 나타나지 않았다. 그 결과, 국소 및 전신 독성에 대한 관찰되지 않은 역효과 수준(No-Observed-Adverse-Effect-Level)(NOAEL)은 테스트된 최고 용량 수준인 1.5 x 1014 vg/kg이었다.
실시예 7 - 비인간 영장류에 대한 4D-310의 IV 투여에 대한 연구
4D-310 및 4D-C102.CAG-EGFP(4D-310과 동일한 캡시드 및 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 EGFP를 인코딩하는 이종성 핵산을 갖는 rAAV)의 독성, 약력학 및 생물학적 분포를 인간 임상 시험 전에 단일 정맥내(주입) 용량 후 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서 평가했다. 연구 설계는 하기 표 13에 제시되어 있다:
Cohort Group N Treatment Route Dose
(vg/kg) 		In-
Life 		Immune Suppression Endpoints
1 2 3 4D-310 IV 3e12 8 wks Drug:
Methylprednisolone
Dosing: IM q.w.
Dose Levels:
40 mg/kg: Day -15 to 28
20 mg/kg: Day 29 to 42
10 mg/kg: Day 43 to 56		 In-Life
Figure pct00003
Cageside observations (2x daily)
Figure pct00004
Food consumption (2x daily)
Figure pct00005
Detailed Clinical Observations (weekly)
Figure pct00006
Body weights (weekly)
Figure pct00007
Hematology (Week 1, 2, 4, 6, EOS)
Figure pct00008
Clinical chem (Week 1, 2, 4, 6, EOS)
Figure pct00009
Plasma AGA activity (pre-dose, Week 2, 4, 6, EOS)
After sacrifice:
Figure pct00010
Tissues (primary):
○Heart
○Liver
○Kidney
○Small
Intestines
Figure pct00011
AGA activity
Figure pct00012
Histopathology
Immunohistochemistry for AGA
Figure pct00013
qPCR (biodistribution)
Figure pct00014
RT-qPCR (transgene expression)
3 3 4D-310 IV 1e13 8 wks
4 3 4D-310 IV 5e13 8 wks
2 1 1 Vehicle IV N/A 8 wks
5 3 C102.EGFP IV 5e13 8 wks
시노몰구스 원숭이에게 2개의 상이한 이식유전자: GLA(서열 식별 번호 1)(그룹 2-4) 또는 EGFP(그룹 5) 중 하나가 투여되었으며, 각각은 서열 식별 번호 4의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드 내 또는 단일 비히클 대조(그룹 1)에 포함된다. 4D-310(서열 식별 번호 1의 코돈 최적화된 GLA 및 서열 식별 번호 4의 캡시드 포함) 치료된 동물에서 현저하게 크린 세이프티 프로파일(clean safety profile)이 관찰됐다. 트랜스아미니티스(Transaminitis)는 EGFP 투여 동물에서만 관찰됐다.
연구 종료를 통해 테스트 물품 투여 2주 전에 시작하여 모든 동물에 면역억제제를 투여했다. 이 억제 요법은 임상 실습과 일치하도록 의도됐다. 간단히 말해서, -15일부터 28일까지 메틸프레드니솔론 아세테이트(methylprednisolone acetate)(40 mg/kg)를 그룹 2, 3 및 4의 모든 동물에게 근육 주사를 통해 매주 1회 투여했다. 용량은 29일부터 42일까지 20mg/kg으로 절반으로 줄였고 43일부터 56일까지 다시 10mg/kg으로 절반으로 줄였다. 예정된 말기 부검 주에 면역억제 투여가 필요하지 않았다. -14일부터 29일까지 메틸프레드니솔론 아세테이트(40mg/kg)를 그룹 1 및 5의 모든 동물에게 IM 주사를 통해 매주 1회 투여했다. 면역억제는 연구 수의사의 재량에 따라 증가하거나(최대 80mg/kg/week까지) 감소했다. 16일에 한 그룹 5 남성에게 추가 용량(40mg/kg)이 제공됐다.
비히클 및 테스트 물품은 4D-310에 대해 0(비히클), 3.0 x 1012, 1.0 x 1013, 5.0 x 1013 vg/kg 및 4D-C102.CAG.EGFP에 대해 5.0 x 1013 vg/kg의 용량 수준에서 3mL/min의 속도로 IV 주입을 통해 연구 동안 1회 투여됐다. 투여 첫날을 각 개별 동물에 대해 1일로 지정했다.
IV 경로는 인간 대상체에서 4D-310의 의도된 투여 경로이다. 용량 수준은 1 x 1012 vg/kg에서 1.5 x 1014 vg/kg의 용량이 모두 안전한 것으로 나타난 마우스에 대한 안전성/유효성 연구 범위의 별도 용량을 기반으로 선택됐다.
GLA 혈장 샘플 수집을 위해, 아래 표 14의 일정에 따라 GLA 분석을 위해 대퇴 정맥을 통해 모든 동물로부터 혈액 샘플(약 3mL)을 수집했다.
Group No. Sample Collection Time Points
Day 1 (predose) Day 15 Day 29 Day 43 Day of Necropsy
1-4 X X X X X
X = 수집된 샘플
항-AAV 평가를 위해, 하기 표 15의 일정에 따라 대퇴 정맥을 통해 모든 동물로부터 혈액 샘플(약 5mL)을 수집했다:
Group No. Sample Collection Time Points
Day 1 (predose) Day 8 Day 15 Day 29 Day 43 Day of Necropsy
1-4 X X X X X X
X = 수집된 샘플
qPCR 분석을 위한 조직 샘플(비장(50-80mg/샘플)을 제외한 각 조직 샘플에 대해 100 내지 180mg)을 수집하고 2개의 샘플로 분할하고 급속 냉동 액체 질소로 분석할 때까지 냉동 보관했다. DNA 조직 수집 및 평가는 하기 표 16에 따른 것이다:
Groups 2-4 Group 1 Group 5
Tissuea Region DNA 1 (GLA) DNA 1 (GLA) DNA 2 (GFP)
Blood vessel Aorta 1 1 1
Carotid 1 1 1
Pulmonary Artery - - 1
Brainb Left Hemisphere 1 1 1
Right Hemisphere 1 1 1
Brain Stem 1 1 1
Cerebellum 1 1 1
Dorsal Root Ganglia Thoracic - - -
All remaining (L) 1 1 1
All remaining (R) - - -
Nerve Sciatic Nerve 1 1 1
Heart Left Ventricular Free Wall 2 2 2
Left Atrium 1 1 1
Right Ventricle 1 1 1
Right Atrium 1 1 1
Ventricular Septum 1 1 1
Kidney Right Kidney 1 1 1
Left Kidney 1 1 1
Liver Right Lobe 1 1 1
Left Lobe 1 1 1
Lung 2 2 2
Skeletal Muscle Deltoid (p) 1 1 1
Deltoid (d) 1 1 1
Diaphragm (L) 1 1 1
Diaphragm (R) 1 1 1
Latissimus Dorsi (L) - - 1
Latissimus Dorsi (R) - - 1
Pectoralis Major (p) 1 1 1
Pectoralis Major (d) 1 1 1
Tibialis Anterior (p) - 1 1
Tibialis Anterior (d) - 1 1
Triceps Brachii (p) 1 1 1
Triceps Brachii (d) 1 1 1
Bicep Femoris (p) 1 1 1
Bicep Femoris (d) 1 1 1
Tongue - - -
Small Intestine Jejunum 1 1 1
Duodenum - - 1
Ileum - - 1
Spinal Cord Cervical 1 1 1
Thoracic 1 1 1
Lumbar 1 1 1
Testes Left 1 1 1
Right - - 1
a 장기/조직이 부족하여 모든 수집을 완료할 수 없는 경우, DNA 분석을 위해 1차 샘플에 우선순위를 둔다.
b 표준 Bolon et al., 2013 차단 방식(The standard Bolon et al., 2013 blocking scheme)은 양쪽 반구에 대해 따랐다(표준 블록 2세트). 현미경 평가를 위해 우측 반구만 슬라이드 처리됐다.
(p) = 근위(proximal); (d) = 원위(distal); (L) = 좌측(Left side); (R) = 우측(right side).
그룹 1 내지 4의 DNA 1 조직을 qPCR에 의해 벡터 생물학적 분포에 대해 분석했다. 그룹 5의 DNA 2 조직을 qPCR에 의해 벡터 생물학적 분포에 대해 분석했다.
다양한 시노몰구스 원숭이 조직에서 4D-310의 유전자 발현을 측정하기 위한 RT-qPCR 분석을 위한 조직 샘플(사용 가능한 경우, 각 조직 샘플에 대해 100 내지 180mg)을 수집하고 하기 표 17에 따라 2개의 샘플로 분할했다:
Groups 2-4 Group 1 Group 5
Tissuea Region RNA 1 (GLA) RNA 1 (GLA) RNA 2 (GFP)
Blood vessel Aorta 1 1 1
Carotid 1 1 1
Pulmonary Artery - - 1
Brainb Left Hemisphere 1 1 1
Right Hemisphere 1 1 1
Brain Stem 1 1 1
Cerebellum 1 1 1
Dorsal Root Ganglia Thoracic - - -
All remaining (L) - - -
All remaining (R) 1 1 1
Nerve Sciatic Nerve 1 1 1
Heart Left Ventricular Free Wall 2 2 2
Left Atrium - - -
Right Ventricle 1 1 1
Right Atrium - - -
Ventricular Septum 1 1 1
Kidney Right Kidney 1 1 1
Left Kidney 1 1 1
Liver Right Lobe 1 1 1
Left Lobe 1 1 1
Lung 2 2 2
Skeletal Muscle Deltoid (p) 1 1 1
Deltoid (d) 1 1 1
Diaphragm (L) 1 1 1
Diaphragm (R) 1 1 1
Latissimus Dorsi (L) - - 1
Latissimus Dorsi (R) - - 1
Pectoralis Major (p) 1 1 1
Pectoralis Major (d) 1 1 1
Tibialis Anterior (p) - 1 1
Tibialis Anterior (d) - 1 1
Triceps Brachii (p) 1 1 1
Triceps Brachii (d) 1 1 1
Bicep Femoris (p) 1 1 1
Bicep Femoris (d) 1 1 1
Tongue - - 1
Small Intestine Jejunum 1 1 1
Duodenum - - 1
Ileum - - 1
Spinal Cord Cervical 1 1 1
Thoracic 1 1 1
Lumbar 1 1 1
Testes Left 1 1 -
Right - - -
a 장기/조직이 부족하여 모든 수집을 완료할 수 없는 경우, IHC, 단백질, DNA 및 RNA 분석을 위해 1차 샘플에 우선순위를 둔다.
b 표준 Bolon et al., 2013 차단 방식(The standard Bolon et al., 2013 blocking scheme)은 양쪽 반구에 대해 따랐다(표준 블록 2세트). 현미경 평가를 위해 우측 반구만 슬라이드 처리됐다.
(p) = 근위(proximal); (d) = 원위(distal); (L) = 좌측(Left side); (R) = 우측(right side).
RNA를 조직 샘플로부터 추출하고, 정량화한 다음, 4D-310에 특이적인 RNA 서열의 검출 및 정량화를 위해 RT-qPCR에 의해 분석했다. 간단히 말해서, RT-qPCR 분석을 위해 수집된 샘플을 1.5mL RNALater로 미리 채워진 표지된 2mL 마이크로퓨지 극저온 튜브(microfuge cryogenic tube)에 완전히 담궜다. 샘플을 습한 얼음 위에 놓고 RNALater에서 최소 24시간 동안 최대 1주일 동안 냉장(2℃ ~ 8℃) 보관한 다음 유전자 발현 분석(RT qPCR)까지 RNALater를 제거한 상태로 냉동(-60℃ ~ -90℃) 보관했다. 그룹 1-4에 있는 동물의 모든 DNA 1 샘플은 분석을 위해 드라이아이스에 담아 인디애나주 그린필드에 있는 Covance Laboratories로 배송됐다. 그룹 5의 모든 DNA 2 샘플은 분석을 위해 테스트 시설의 생물분석 실험실로 옮겨졌다.
그룹 1 내지 4의 RNA 1 조직을 RT-qPCR에 의해 GLA 유전자 발현에 대해 분석했다. 그룹 5의 RNA 2 조직을 RT-qPCR에 의해 GFP 유전자 발현에 대해 분석했다.
단백질 조직 수집 - 샘플(사용 가능한 경우, 각 조직 샘플에 대해 100~180mg)을 액체 질소(LN2)에서 급속 동결하고 냉동(-60℃ ~ -90℃) 보관했다. 하기 표 18에 따라 단백질 1(Protein 1) 조직을 GLA 활성에 대해 분석했다:
Figure pct00015
Figure pct00016
a 장기/조직이 부족하여 모든 수집을 완료할 수 없는 경우, IHC, 단백질, DNA 및 RNA 분석을 위해 1차 샘플에 우선순위를 둔다.
b 표준 Bolon et al., 2013 차단 방식(The standard Bolon et al., 2013 blocking scheme)은 양쪽 반구에 대해 따랐다(표준 블록 2세트). 현미경 평가를 위해 우측 반구만 슬라이드 처리됐다. (p) = 근위(proximal); (d) = 원위(distal); (L) = 좌측(Left side); (R) = 우측(right side).
단백질 2(Protein 2) 조직을 ELISA에 의해 GFP에 대해 분석했다.
조직학 및 면역조직화학(IHC)을 위해, 각각의 특정 조직의 샘플을 수집하고 처리했다. 샘플을 중성 완충 포르말린에 24 ~ 48시간 동안 고정하고, 필요에 따라 최대 72시간 동안 70% EtOH로 옮기고, 조직학 및 IHC를 위한 차단 단계로 처리했다. 조직의 형태/해부학적 완전성을 보존하기 위해 노력했다. 지정된 각 조직의 포르말린 고정, 파라핀 포매 블록의 서브 세트는 후원자에게 배송됐다. IHC 평가를 위해 슬라이드를 준비하고 염색했다.
항-갈락토시다아제 알파(GLA) 면역조직화학(IHC) 분석은 Roche Discovery antibody RUO(catalog # 05266319001)에 희석된 10ug/mL의 최종 농도에서 재조합 토끼 항-인간 단일클론 항-갈락토시다아제 알파 항체(Abcam clone EP5858, catalog # ab168341)를 사용하여 수행됐다. GLA IHC는 Roche Discovery ChromoMap DAB RUO(catalog # 05266645001), Roche Discovery Anti-Rabbit HQ RUO (catalog # 07017812001) 및 Roche Discovery Anti-HQ HRP RUO (catalog # 07017936001)를 사용하여 Roche Discovery ULTRA 자동 염색기 플랫폼에서 수행됐다.
GLA IHC 분석 항원 검색은 Roche Cell Conditioning 1(CC1) antigen retrieval solution(catalog # 950-124)을 사용하여 32분 동안 100℃에서 수행됐다. GLA IHC 1차 항체 및 토끼 IgG 동형 대조군 항체(Cell Signaling Technology Rabbit(DA1E) mAb IgG XP Isotype control catalog # 3900)를 실온에서 32분 동안 배양했다. GLA IHC 분석 2차 항체 및 HRP 중합체 검출 시약을 각각 실온에서 16분 동안 배양했다. 슬라이드는 8분 동안 Roche Hematoxylin(catalog # 05266726001) 및 8분 동안 Roche Bluing Reagent(catalog # 05266769001)를 사용하여 실온에서 대조염색됐다. Roche Discovery ULTRA 기기에서 제거한 후 Dawn 액체 비누를 사용하여 DI 수(water)에서 슬라이드를 헹구어 잔류 오일을 제거한다. 그런 다음 GLA IHC 슬라이드는 등급이 매겨진 에탄올/자일렌을 통해 탈수되고 Leica XL 및 CV5030 염색기/커버슬리퍼 기기를 사용하여 커버슬립된다. 그런 다음 GLA IHC 슬라이드는 Mikroscan SL2 기기 및 관련 Q2 이미징 소프트웨어를 사용하여 고해상도 전체 슬라이드 이미지로 변환됐다. GLA IHC 슬라이드는 승인된(board-certified) 병리학자가 평가했다. QuPath 및 ImageScope 소프트웨어를 사용하여 대표적인 이미지를 캡처했다.
하기 파라미터 및 종점을 이 연구에서 평가했다: 사망률, 임상 징후, 체중, 체중 변화, 안과 검사, 임상 병리학 파라미터(혈액학, 응고 및 임상 화학), 육안 부검 소견, 장기 중량, 및 조직 병리학 검사. 또한, 향상된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein)(EGFP) 및 알파-갈락토시다아제 A(GLA)에 대한 DNA(qPCR), RNA(RT-qPCR) 및 단백질(혈장 및/또는 조직) 분포를 수행하여 테스트 물품의 생물학적 분포 및 상대적 유전자 발현 효율을 평가했다. 탐색 면역조직화학(IHC) 평가도 수행됐다.
결과
사망률 - 모든 동물은 예정된 부검까지 생존했다.
상세한 임상/수의학적 관찰 - 명확한 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 임상 징후가 없었다.
체중 및 체중 증가 - 체중 또는 체중 증가에 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 변화가 없었다. 치료 기간 동안 모든 그룹의 동물에서 약간의 증가 및/또는 감소가 관찰되었으며 이 종의 정상 변동 범위 내에 있는 것으로 간주됐다.
안과 검사 - 검안 검사에서 언급된 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 효과는 나타나지 않았다. 나타난 관찰은 이 연령 및 종의 동물에 대해 예상되는 대표적인 병리이며 테스트 물품과 관련된 것으로 간주되지 않는다.
혈액학 - 임의의 용량 수준에서 혈액학 종점에 대한 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 효과가 없었다.
응고 - 응고 종점에 대한 명백한 4D-C102.CAG-EGFP 관련 효과가 없었다.
qPCR GLA(DNA)_생물학적 분포 분석
각 샘플에 존재하는 4D-310 벡터 DNA의 양은 qPCR로 분석된 2개의 스파이크되지 않은 복제물의 평균으로부터 계산됐다. 결과는 분석된 DNA의 μg당 존재하는 4D-310의 카피로 보고된다(0.2μg/μL 미만의 농도 및 희석 인자에 대해 조정됨). 그룹 1은 비히클/대조군이다. 비히클 치료 동물(동물 ID 1001)에서 테스트한 모든 샘플은 GLA DNA에 대해 <LOD(검출 한계(limit of detection))인 것으로 밝혀졌다. 3.0 x 1012 vg/kg 4D-310을 투여한 동물 중에서 GLA DNA가 양성으로 검출되었으며, 아래에 언급된 샘플을 제외하고 테스트된 모든 조직 샘플에 대해 총 DNA ㎍당 51.72(Jejunum of Animal 2003)에서 6,309,088.75(Liver, Right Lobe of Animal 2002) 카피 범위에 갖는다. 동물 2001 및 2003의 좌측 고환과 동물 2002 및 2003의 척수, 요추는 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. 사용 가능한 잔여 조직이 없기 때문에 동물2002의 심장, 좌심방에 대해 보고할 결과가 없다. 동물 2002의 경동맥(carotid)에 대한 결과는 후원자의 요청에 따라 실패한 추출 작업의 DNA를 분석하여 얻었다. 1.0 x 1013 vg/kg 4D-310을 투여한 동물 중에서 GLA DNA는 테스트된 모든 조직 샘플에서 양성으로 밝혀졌다. 얻은 테스트 결과의 범위는 총 DNA 1㎍당 178.65(동물 3002의 공장)에서 3,379,109.30(동물 4001의 간, 좌측 엽) 카피이다. 동물 3002 및 3003의 간, 우엽 및 간, 좌엽의 원래 테스트 결과는 >ULOQ(정량의 상한)(upper limit of quantification)인 것으로 밝혀졌으며, 이러한 조직 샘플에서 추출한 DNA는 추가로 1:10 희석을 수행하여 다시 테스트했다.
5.0 x 1013 vg/kg 4D-310이 투여된 동물 중에서, GLA DNA는 테스트된 모든 조직 샘플에서 양성인 것으로 밝혀졌다. 얻은 테스트 결과의 범위는 총 DNA ㎍당 168.86(동물 4003의 고환)에서 21,116,311.46(동물 4001의 간, 우엽)이다. 동물 4001, 4002 및 4003의 간, 우엽 및 간, 좌엽의 원래 테스트 결과는 모두 >ULOQ인 것으로 밝혀졌다. 이러한 조직 샘플에서 추출한 DNA를 추가로 1:50(4001의 경우), 1:20(4002의 경우) 및 1:25(4003의 경우) 희석을 수행하여 다시 테스트했다.
비인간 영장류에 3 x 1012 vg/kg을 IV 투여한 후 주요 Fabry 조직에 대한 4D-310의 qPCR 분포가 도 15에 나타나 있으며, 간으로의 용량 반응성 생물학적 분포가 달성됐다. 이러한 데이터는 4D-310 전달된 IV가, 심장 및 신장을 포함한, 파브리병 병리의 주요 조직에 성공적으로 국소화됨을 보여준다. 이러한 데이터는 또한 가용성 치료 단백질의 전신 발현을 위한 표적으로서 간에서의 용량 반응성 발현을 지지한다.
GLA 혈장 정량화
1일(투여 전), 15, 29, 43일 및 부검일에 3.0 x 1012 내지 5.0 x 1013 vg/kg 4D-310을 투여한 동물로부터 얻은 총 50개의 혈장 샘플을 자격을 갖춘 방법을 사용하여 GLA 활성에 대해 분석했다. 교정 표준 및 품질 관리 샘플의 결과는 보고된 모든 농도에 대해 방법의 허용 가능한 성능을 보여주었다.
GLA 수준은 투여 전(1일) 모든 동물에 걸쳐 비슷했다. 15일까지 혈장 GLA 수준은 3.0 x 1012 vg/kg 4D-310에서 3마리 동물 중 1마리(최대 23.6x), 1.0 x 1013 vg/kg 4D-310에서 3마리 동물 중 3마리(최대 8.1x), 및 5.0 x 1013 vg/kg 4D-310에서 동물 3마리 중 3마리(최대 152.2x)에서 증가했다. 혈장 GLA 수준은 일반적으로 15일째부터 부검일까지 유사했다(15일째 값의 약 2.5배 이내). 이 데이터는 다음과 같이 요약된다.
Figure pct00017
도 16은 용량별로 그룹화된 4D-310의 단일 정맥내 용량 후 NHP 혈장 중 AGA를 도시한다(혈장 AGA 수준의 54.7배 증가는 비히클 치료 대조군에 비해 5.0 x 1013 vg/kg 용량에서 관찰됐다). 동물 #2002의 높은 AGA 수준으로 인해 저용량 그룹 평균이 중간 용량 그룹 평균보다 높았다. 그렇지 않으면 용량 의존성이 관찰됐다. 평가된 모든 용량 그룹에서 4D-310의 전달은 내인성 AGA 수준(비히클)보다 높은 혈장 AGA 수준을 초래했으며, 이는 4D-310 제품으로부터 성공적인 유전자 전달 및 유전자 발현을 입증한다.
도 17은 4D-310의 단일 정맥내 투여 후 개별 동물의 혈장 AGA 수준을 도시한다. 동물 2002는 예상외로 높은 혈장 AGA 활성을 가지고 있다-이 동물은 간에 높은 DNA, RNA 및 단백질을 가지고 있다. 4D-310의 전달은 모든 개별 동물에 대해 내인성 AGA 수준(비히클)보다 높은 혈장 AGA 수준을 초래했으며, 이는 4D-310 제품으로부터 성공적인 유전자 전달 및 유전자 발현을 입증한다.
GLA 단백질 조직 생물학적 분포 분석
항-갈락토시다아제 알파(GLA) 면역조직화학(IHC) 분석은 항원 검색 조건, 1차 항체 및 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded)(FFPE) 세포 펠렛(pellet) 및 조직의 검출 조건을 포함하는 분석 조건의 매트릭스를 사용하여 다수의 상업적으로 입수 가능한 GLA 항체를 스크리닝함으로써 개발됐다. GLA IHC 분석의 특이성 및 민감도는 야생형 HEK293T 및 4D-310 형질감염된 HEK293T 세포 및 4D-310 치료된 Fabry 마우스 조직의 평가에 의해 측정됐다.
4D-310 치료된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 비인간 영장류(non-human primate)(NHP) 조직 샘플을 GLA IHC 발현에 대해 평가했다. 대조군 세포 펠릿은 품질 관리 및 실행 사이의 일관된 결과를 보장하기 위해 각 실험 실행에 포함됐다. 토끼 IgG Isotype 항체 대조군은 GLA IHC 분석의 특이성을 보장하기 위해 각 조직 샘플에 포함됐다.
비히클 치료된 조직에서 낮은 수준의 내인성 GLA 발현이 관찰됐다. 모든 용량 수준(3 x 1012, 1 x 1013 및 5 x 1013)에서 4D-310 치료된 NHP 심장 조직에서 GLA IHC 발현의 증가가 관찰됐다. GLA 발현의 증가는 5 x 1013 용량 수준에서만 4D-310 치료된 NHP 간 조직에서 관찰됐다. IHC에 의한 더 저용량 수준에서의 검출은, 비히클 치료된 동물에서 관찰된 발현에 기초하여, 높은 내인성 간 발현에 의해 잠재적으로 혼란스러웠다. NHP 골격근, 횡격막, 신장, 대동맥, 경동맥 또는 소장 조직 샘플에서 GLA IHC 염색의 증가가 관찰되지 않았다. 결과는 검증되었고 외부의 승인된 병리학자가 세포 유형을 식별했다.
4D-310이 투여된 동물에서 연구 종료 시, 비히클 대조군에 대한 GLA 발현의 증가는 간, 경동맥, 심장(좌심실 자유벽 및 좌심방 포함), 폐, 대동맥, 골격근(삼각근, 대흉근 및 횡격막 포함), 신장 및 뇌(좌반구)의 서브 세트로 제한됐다. GLA의 가장 큰 발현은 간(최대 21.1x), 경동맥(최대 15.5x), 좌심실 자유벽(최대 12.2x) 및 폐(최대 10.1x)에서 나타났다. 대동맥(최대 7.4x), 삼각근(최대 4.3x) 횡격막(최대 3.7x), 대흉근(최대 3.4x), 신장(2.5x), 대퇴이두근(2.5x), 뇌(최대 2.4x), 좌심방(2.2x)에서 더 낮은 수준의 GLA 발현(<10x)이 나타났다. GLA의 상승은 항상은 아니지만 때때로 용량 반응성이었다. 이러한 변화는 4D-310과 관련된 것으로 간주됐다. 다른 모든 조직은 대조군의 2배 미만이었고 따라서 GLA 발현이 상승된 것으로 간주되지 않았다. 4D-310이 투여된 동물의 상대적 GLA 조직 발현의 요약은 아래 표 19에서 찾을 수 있다:
Incidence by Dose Level (fold-change from control)
Tissue 3.0 x 10 12 vg/kg 1.0 x 10 13 vg/kg 5.0 x 10 13 vg/kg
Liver 3 of 3 (3.0-11.5x) 3 of 3 (2.0-7.2x) 3 of 3 (4.6-21.1)
Carotid 0 of 3 2 of 3 (3.9-15.5x) 1 of 3 (4.2x)
Left ventricular free wall (a + b) 1 of 3 (2.0x) 1 of 3 (2.0-3.2x) 3 of 3 (2.0-12.2x)
Lung 0 of 3 1 of 3 (3.7x) 2 of 3 (2.5-10.1x)
Aorta 1 of 3 (2x) 3 of 3 (2.3-7.4x) 2 of 3 (2.0-2.4x)
Deltoid (proximal and distal) 0 of 3 2 of 3 (2.1-4.3x) 0 of 3
Diaphragm (left and right) 3 of 3 (2.0-3.7x) 2 of 3 (2.3-2.8x) 3 of 3 (2.2-3.6x)
Pectoralis Major (proximal and distal) 2 of 3 (2.0-3.4x) 2 of 3 (2.2-3.0x) 3 of 3 (2.1-2.6x)
Bicep femoris 0 of 3 0 of 3 1 of 3 (2.5x)
Kidney 0 of 3 0 of 3 1 of 3 (2.5x)
Left atrium 0 of 3 0 of 3 1 of 3 (2.2x)
Brain (left and right hemisphere) 0 of 3 1 of 3 (2.4x) 1 of 3 (2.1x)
도 18-19에서 볼 수 있는 바와 같이, NHP로의 4D-310의 정맥내 전달은 비히클만으로 처리된 대조군 NHP와 비교하여 Fabry-관련 조직에서 AGA 발현의 상당한 증가를 초래했다. 따라서 4D-310의 전달은 치료 관련 조직에서 4D-310 제품으로부터 성공적인 유전자 전달 및 유전자 발현을 초래했다. 상승된 AGA 발현은 고용량 동물의 심장에서 나타난다(도 19).
RT-qPCR(RNA) 유전자 발현 분석
그룹 1(비히클/대조군) 동물로부터 테스트된 모든 샘플은 예상대로 4D-310에 대해 <LOD인 것으로 밝혀졌다.
그룹 2 동물(4D-310의 3.0 x 1012 vg/kg을 받은 동물) 중에서 4D-310 RNA가 양성으로 검출되었으며, 범위는 다음 샘플을 제외한 모든 테스트된 조직 샘플에 대해 총 RNA μg당 630.68(동물 2001의 고환, 좌측)에서 19,744,452.23(동물 2002의 간, 좌엽) 카피이다: (1) 동물 2001의 삼각근 원위, 횡격막 좌측, 횡격막 우측, 대흉근 및 대퇴이두근 원위 및 뇌 소뇌, 공장, 경동맥, 척수 흉부, 척수 요추 및 폐는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (2) 동물 2001의 뇌, 뇌간은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (3) 동물 2002의 삼각근 원위 및 대퇴 이두근 원위는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (4) 동물 2002의 삼각근 근위, 대흉근 근위, 대퇴 이두박근, 공장, 남아 있는 DRG 모두의 나머지 우측 및 척수 흉부는 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (5) 동물 2003의 횡격막 좌측, 횡격막 우측, 대흉근 근위, 대흉근 원위, 대퇴 이두근 원위, 좌골 신경 및 척수 요추는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (6) 동물 2003의 삼각근 근위, 대퇴이두근 근위, 뇌 우반구, 뇌 소뇌, DRG 모두의 나머지 우측 및 고환 좌측은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. 이러한 샘플에 대해 측정된 음성 총 RNA 농도로 인해 동물 2002의 좌골 신경 및 척수 요추에 대해 보고할 총 RNA 결과의 μg당 카피는 없다.
그룹 3 동물(1.0 x 1013 vg/kg의 4D-310을 받은 동물) 중에서 4D-310 RNA는 모든 테스트된 조직 샘플에서 양성인 것으로 밝혀졌다. 얻은 테스트 결과의 범위는 다음을 제외하고 테스트된 모든 조직 샘플의 총 RNA μg당 765.27(동물 2003의 공장)에서 10,387,886.08(동물 3002의 대동맥) 카피이다: (1) 동물 3001의 삼각근 근위, 삼각근 원위, 횡격막 좌측, 대흉근 근위, 대흉근 원위, 삼두근 근위, 삼두근 원위, 대퇴이두근 근위, 대퇴이두근 원위, 좌골신경 및 척수 요추는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (2) 동물 3001의 횡격막 우측에는 사용 가능한 RNA 결과의 μg당 카피는 없다. (3) 동물 3001의 뇌, 뇌간 및 폐는 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (4) 동물 3002의 횡격막 우측, 근위대흉근 근위, 공장, 좌골신경, 폐 및 척수 요추는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (5) 동물 3002의 대퇴이두근 원위 및 뇌 뇌간은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (6) 동물 3003의 DRG 모두의 나머지 우측은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다.
그룹 4 동물(4D-310의 5.0 x 1013 vg/kg을 받은 동물) 중에서, 4D-310 RNA는 모든 테스트된 조직 샘플에서 양성으로 발견됐다. 얻은 테스트 결과 범위는 다음을 제외하고 총 RNA μg당 930.51(동물 4001의 상완 삼두근, 근위)에서 127,602,838.22(동물 4002의 심장, 심실 중격) 카피이다: (1) 동물 4001의 뇌 소뇌, 공장 및 좌골 신경은 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (2) 동물 4001의 경동맥은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (3) 동물 4001의 뇌 좌반구, 뇌 우반구, 뇌 뇌간, DRG 나머지 모든 우측 및 폐는 음의 총 RNA 농도를 가졌으므로 이 샘플에 대해 사용할 수 있는 카피/μg RNA 결과가 없다. (4) 동물 4002의 횡격막 좌측 및 대퇴이두근 근위는 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (5) 동물 4002의 공장 및 좌골신경은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다. (6) 동물 4003의 대퇴이두근 원위 및 좌골 신경은 <LOD인 것으로 밝혀졌다. (7) 동물 4003의 삼각근 근위, 대흉근 근위 및 공장은 <LOQ인 것으로 밝혀졌다.
수동으로 정제된 RNA 샘플의 사용과 QIAcube HT 시스템을 사용하여 정제된 샘플 간의 차이를 식별하기 위한 브릿징 평가(bridging asscessment)는 두 방법 모두 방법의 정밀도나 정확성에 영향을 미치지 않으면서 유사한 결과를 산출했음을 보여주었다. 다른 QC 유형 간의 분석 간 정밀도는 모든 QC 수준에 대해 2%에서 20% 사이의 Qty %CV 값을 산출한 반면, 분석 간 정확도 Qty %RE 결과는 모든 QC 농도에서 -6%에서 -2% 범위였다.
정맥내 주입 후 대략 52일 후, 벡터 유래 유전자 발현의 최고 수준을 나타내는 조직은 좌심실 자유벽 및 심실 중격 심장 샘플, 좌측 및 우측 간엽, 경동맥 혈관 및 우심실 심장 샘플이었다. 좌심실 자유벽 및 심실 중격 심장 샘플은 분석된 총 RNA 10ng당 평균 5.48 x 103 및 5.46 x 103 카피를 산출한 반면, 6개 간 샘플의 평균 농도는 3.59 x 103 카피이었다. 경동맥 혈관 및 우심실 심장 샘플은 각각 3.33 x 103 및 1.78 x 103 카피를 산출했다. 나머지 조직 샘플의 대부분은 한계 또는 정량에서 또는 그 이하에서 테스트하는 샘플의 3/4 이상으로 벡터 유래 유전자 발현을 최소화하거나 전혀 산출하지 않았다. 바이러스 벡터의 존재만을 테스트한 생물학적 분포 결과를 유전자 발현 결과와 비교할 때 극명한 대조가 눈에 띈다. 생물학적 분포 데이터에서, 간 샘플에서 검출된 벡터의 수준은 좌심실 자유벽 샘플의 8.69 x 104 카피 및 심실 격막 샘플의 9.12 x 104 카피과 비교하여 샘플 DNA의 μg당 5.75 x 106 카피에서 60배 이상 더 컸다. 반대로, 관찰된 유전자 발현 수준은 간 샘플에 비해 2개의 심장 샘플에서 약 1.5배 더 높았다. 경동맥 및 우심실 심장 샘플은 벡터 수준이 간 샘플에서 ~128x 및 ~69x 더 높은 유사한 결과를 보인 반면, 유전자 발현 수준은 혈관과 간 샘플 간에 거의 동일했고 우심실 심장 샘플에 비해 간 샘플에서 2배만 더 높았다. 모든 동물의 전사되지 않은 간 샘플에서 벡터 DNA가 검출됐다. 벡터 DNA의 이러한 오염은 표적 서열 유전자 발현의 약 1% 내지 12%를 차지할 것이다. 벡터 오염은 분석된 나머지 샘플에서 검출되지 않았다. 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 Hprt1의 발현 수준은 RNA 샘플의 전반적인 완전성을 확인하는 각 동물의 개별 조직에 걸쳐 일관됐다.
도 20에서 알 수 있는 바와 같이, NHP에 대한 4D-310의 각각의 특정 용량의 단일 정맥내 투여는 파브리병을 치료하기 위한 두 주요 장기인 심장 및 간에서 일관된 발현이 관찰되는 GLA RNA 발현을 초래한다.
육안 병리학(Gross Pathology)
4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 거시적 소견은 없었다. 5.0 x 1013에서 4D-C102.CAG-EGFP를 투여받은 모든 테스트 물품 동물 및 단일 비히클 대조군 동물에서 거시적 소견은 대퇴사두근(양측 또는 일측)에 흰색 이물질로 구성됐다. 4D-C102.CAG-EGFP를 투여받은 동물 중 한 마리(동물 번호 5003)도 대퇴사두근에 일측 농양이 있었다. 이는 대조군 및 4D-C102.CAG-EGFP 치료 동물에서 발생했기 때문에 아마도 절차와 관련되었을 것이다. 3.0 x 1012(동물 번호 2002)에서 4D-310의 저용량을 투여받은 하나의 동물은 우측 뒷다리/사지의 피하 부종을 가졌다. 이후의 변경은 일방적인 국소적 변경이었기 때문에 직접적으로 관련된 테스트 물품이 아니었을 가능성이 크다. 거시적 변화는 프로토콜에 따라 미시적으로 평가되지 않았다.
조직병리학
명확한 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 관련 현미경 소견은 없었다. 명확한 테스트 물품 관계가 없는 동물의 조직에서 여러 소견이 발생했다. 4D-310 및 4D-C102.CAG-EGFP 치료 동물 및 비히클 대조군에서 나타난 소견은 심장, 다양한 골격근 및 좌골 신경을 비롯한 다양한 조직의 외막에 있는 단핵 세포의 최소 침윤으로 구성됐다. 또한, 4D-310 치료 동물의 뇌 수막에서 최소 단핵 침윤이 발생했지만 4D-C102.CAG-EGFP 처리된 동물 또는 비히클 대조군 동물에서는 발생하지 않았다. 4D-310 치료된 원숭이에서 나타난 다른 소견에는 다양한 골격근(일반적으로 국소적), 폐에서 최소 폐포 대식세포 응집 및 간세포의 최소(다초점) 공포에서 최소 근섬유 변성 또는 재생이 포함됐다. 이들은 일반적으로 발생률, 분포 또는 중증도에서 용량 관련 경향 없이 낮은 발생률이었다. 또한, 이러한 최소한의 변화는 종의 배경 소견으로 발생할 수 있으므로 테스트 물품과 관련된 것으로 간주되지 않았다. 이러한 소견 중 어느 것도 불리한 것으로 간주되지 않는다. 4D-310 치료 동물의 다양한 조직의 지방 조직에서 지방 괴사가 발생률이나 중증도에서 명확한 용량 관계 없이 심장 관상 동맥 홈, 대동맥 외막 및 골격근 외막을 포함하여 발생했다. 중증도는 최소에서 중간 정도였으며 용량과 관련이 없었다. 지방 괴사는 우리 연구실에서 고용량 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone) 치료의 결과로 나타났거나 우발적인 배경 변화로 나타날 수 있다. 메틸프레드니솔론 치료는 테스트 물품의 면역 반응을 제어 하는 데 사용됐다.
산재된 뉴런의 신경 세포체의 자가포식(세포질 희박화)은 4D-310의 각 용량에서 한 동물의 후근 신경절에서 나타났다. 중증도는 최소에서 경미한 정도였지만 용량과 관련이 없었다. 이 변화는 시노몰구스 원숭이(Butt M. et al., 2019)(Pardo I. et al., 2019)의 배경 소견이며 테스트 물품과 관련된 것으로 간주되지 않는다. 다른 모든 현미경 관찰은 부수적인 것으로 간주되었으며 테스트 물품과 관련되지 않았다. 이러한 관찰은 종에 대한 알려진 배경 소견이며, 발생률이 낮고, 대조군 및 테스트 물품으로 치료된 동물에 대해 유사한 발생률 및 중증도를 보였고/였거나, 용량 반응 관계가 없었다.
독성학 - 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP의 IV 투여와 관련된 변화는 임상 병리학에 대한 효과로 제한됐다. 5.0 x 1013 vg/kg 4D-310 및 4D-C102.CAG-EGFP의 단일 IV 투여 후, 각각 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)(ALT) 활성의 증가가 최소에서 현저하게 증가했다. 4D-C102.CAG-EGFP를 투여한 동물에서, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase)(AST) 활성, 감마-글루타밀트랜스퍼라제(gamma-glutamyltransferase)(GGT) 활성 및 총 빌리루빈(bilirubin) 농도가 동시에 최소에서 중간 정도로 증가했다. 이러한 변화는 14일째에 가장 두드러졌으며 나중 간격에서 부분적으로 또는 완전히 해소됐다. 이러한 변화는 4D-310 및 4D-C102.CAG-EGFP와 관련된 것으로 간주되었으며 간세포 및/또는 간담도 효과를 나타낸다. 종료 시 현미경적 상관관계는 관찰되지 않았다.
또한 5.0 x 1013 vg/kg 4D-C102.CAG-EGFP에서, 21일째에 평균 요소 질소 농도에서 일시적인 최소 감소가 있었고, 35일째에 시작하여 알부민 농도에서 최소 내지 경미한 감소가 있었으며, 이는 4D-C102.CAG-EGFP 관련으로 간주되었다. 위에서 논의한 간세포 효과가 이러한 변화에 기여했을 수 있다. ≥ 3.0 x 1012 vg/kg 4D-310에서 7일째에 크레아틴 키나제(creatine kinase)(CK) 활성이 일시적으로 최소에서 경미하게 증가했으며, 이는 4D-310과 관련된 것으로 간주되었으며 경미한 근육 효과를 나타낸다. 종료 시 현미경적 상관관계는 관찰되지 않았다.
GLA 약력학 및 생물학적 분포 - 순환(혈장) GLA 단백질은 15일째(테스트된 첫 번째 투여 후 시점)에 시작하여 종료까지 다소 용량 반응 방식으로 상승했다. 15일까지 혈장 GLA 수준은 3.0 x 1012 vg/kg 4D-310(최대 23.6x)에서 3마리 동물 중 1마리, 1.0 x 1013 vg/kg 4D-310(최대 8.1x)에서 3마리 동물 중 3마리, 및 5.0 x 1013 vg/kg 4D-310(최대 152.2x)의 동물 3마리 중 3마리에서 증가했다. 혈장 GLA 수준은 일반적으로 15일째부터 부검일까지 유사했다(15일째 값의 약 2.5배 이내). 4D-310이 투여된 동물에서 연구 종료 시, GLA DNA는 다소 용량 반응 방식으로 테스트된 대부분의 조직에서 발견됐다. 3.0 x 1012 vg/kg 4D-310을 투여한 동물에서 DNA의 벡터 카피/ug는 51.72에서 6.3 x 106 범위였으며 조직의 작은 서브 세트는 감지할 수 없는 수준의 GLA DNA를 가지고 있었다. 1.0 x 1013 vg/kg 4D-310에서 GLA DNA는 178에서 3.4 x 106 범위의 DNA 1ug당 카피로 분석된 모든 조직에서 발견됐다. 유사하게, 5.0 x 1013 vg/kg 4D-310에서 GLA DNA는 168에서 21.1 x 106 범위의 DNA ug당 카피로 분석된 모든 조직에서 검출 가능했다.
번역은 간, 경동맥, 심장(좌심실 자유벽 및 좌심방 포함), 폐, 대동맥, 골격근의 서브 세트(삼각근, 대흉근 및 횡격막), 신장 및 뇌(좌측 반구)을 포함하는 조직 서브 세트에서 검출 가능한 GLA 단백질에 의해 확인됐다. 도 21A-B 및 22A-B를 참조. GLA의 가장 큰 발현은 간(최대 21.1x), 경동맥(최대 15.5x), 좌심실 자유벽(최대 12.2x) 및 폐(최대 10.1x)에서 나타났다. 대동맥(최대 7.4x), 삼각근(최대 4.3x) 횡격막(최대 3.7x), 대흉근(최대 3.4x), 신장(2.5x), 대퇴이두근(2.5x), 뇌(최대 2.4x), 좌심방(2.2x)에서 더 낮은 수준의 GLA 발현(<10x)이 나타났다. GLA의 상승은 항상은 아니지만 때때로 용량 반응성이었다.
EGFP 약력학 및 생물학적 분포 - 5.0 x 1013 vg/kg 4D-C102.CAG-EGFP가 투여된 동물에서 연구 종료시, EGFP DNA는 테스트된 대부분의 조직에서 발견되었으며, 벡터 유래 유전자 발현의 최고 수준을 나타내는 조직은 좌심실 자유벽 및 심실 중격(심장), 좌우 간엽, 경동맥 및 우심실(심장)이였다. 관찰된 유전자 발현(RNA) 수준은 간 샘플에 비해 2개의 심장 샘플에서 약 1.5배 더 높았다. 경동맥 및 우심실 심장 샘플은 간 샘플에서 ~128x 및 ~69x 더 높은 DNA 벡터 수준으로 유사한 결과를 보인 반면, 유전자 발현 수준은 혈관과 간 샘플 사이에서 대략 동일했고 우심실 심장 샘플에 비해 간 샘플에서 단지 2배 더 높았다. GFP 단백질의 번역은 분석된 대부분의 조직에서 관찰되었으며 일반적으로 생물학적 분포 및 유전자 발현 데이터로 정렬됐다. GFP의 가장 큰 발현(현저한 증가)은 심장(최대 8,956,503x), 혈관(최대 22,991x) 및 간(최대 5,194x)에서 나타났다. 중간 정도의 GFP 발현은 신장, 삼각근 및 횡격막 근육에서 각각 최대 247x, 989x 및 347x로 나타났다. 뇌, 신경, 혀, 척수, 이두박근 및 삼두근 근육에서 최소한의 발현이 관찰됐다. 종합하면, 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP의 단일 IV 주입은 최대 5.0 x 1013 vg/kg(4D-310에 대해 테스트된 최고 용량 및 4D-C102.CAG-EGFP에 대해 테스트된 유일한 용량)까지, 벡터 DNA, 다양한 조직, 특히 간, 심장 및 혈관에서 유전자 발현(RNA 및 단백질)을 측정 가능한수컷 시노몰구스 원숭이에서 내성이 우수했다. 불리한 변화가 없기 때문에 5.0 x 1013 vg/kg 용량 수준은 이 연구의 조건에 따라 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 모두에 대해 NOAEL(no-observed-adverse-effect level)로 결정됐다.
결론
4D-310 또는 4D-C102.CAG EGFP의 단일 정맥내 주입은 최대 5.0 x 1013 vg/kg(4D-310에 대해 테스트된 최고 용량 및 4D-C102.CAG-EGFP에 대해 테스트된 유일한 용량)까지, 벡터 DNA, 다양한 조직, 특히 간, 심장 및 혈관에서 유전자 발현(RNA 및 단백질)을 측정 가능한 수컷 시노몰구스 원숭이에서 내성이 우수했다. 불리한 변화가 없기 때문에 5.0 x 1013 vg/kg 용량 수준은 이 연구의 조건에 따라 4D-310 또는 4D-C102.CAG-EGFP 모두에 대해 NOAEL(no-observed-adverse-effect level)로 결정됐다.
벡터 게놈, RNA 메시지 및 기능적 단백질은 특히 고용량(5 x 1013 vg/kg)에서 심장에서 관찰됐다. 벡터 게놈과 RNA 메시지는 상관관계가 있는 것으로 나타났다. RNA 메시지와 AGA 활성 또한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. Fabry 관련 조직의 AGA 활성 데이터는 IHC에 의해 확인됐다. EGFP를 사용하여 측정된 RNA 메시지 및 단백질 수준은 GLA로 측정된 수준보다 더 낮았다.
본 발명의 재료 및 방법이 바람직한 실시 양태와 관련하여 기재되었지만, 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 설명된 방법에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 자명한 그러한 모든 유사한 대체물 및 수정은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> 4D Molecular Therapeutics, Inc. <120> CODON OPTIMIZED GLA GENES AND USES THEREOF <130> 090400-5014 WO <150> US 63/016,207 <151> 2020-04-27 <150> US 63/114,195 <151> 2020-11-16 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized GLA <400> 1 atgcagctgc ggaatcctga actgcacctg ggatgtgccc tggctctgag atttctggcc 60 ctggtgtctt gggacatccc tggcgctaga gccctggata atggcctggc cagaacacct 120 acaatgggct ggctgcactg ggagagattc atgtgcaacc tggactgcca agaggaaccc 180 gacagctgca tcagcgagaa gctgttcatg gaaatggccg agctgatggt gtccgaaggc 240 tggaaggatg ccggctacga gtacctgtgc atcgacgact gttggatggc ccctcagaga 300 gactctgagg gcagactgca agccgatcct cagagattcc ctcacggcat cagacagctg 360 gccaactacg tgcacagcaa gggcctgaag ctgggcatct atgccgacgt gggcaacaag 420 acctgtgccg gctttcctgg cagcttcggc tactacgata tcgacgccca gaccttcgcc 480 gattggggag tcgatctgct gaagttcgac ggctgctact gcgacagcct ggaaaatctg 540 gccgacggct acaagcacat gtcactggcc ctgaatcgga ccggcagatc catcgtgtac 600 agctgcgagt ggcccctgta catgtggccc ttccagaagc ctaactacac cgagatcaga 660 cagtactgca accactggcg gaacttcgcc gacatcgacg atagctggaa gtccatcaag 720 agcatcctgg actggaccag cttcaatcaa gagcggatcg tggacgtggc aggacctggc 780 ggatggaacg atcctgacat gctggtcatc ggcaacttcg gcctgagctg gaaccagcaa 840 gtgacccaga tggccctgtg ggccattatg gccgctcctc tgttcatgag caacgacctg 900 agacacatca gccctcaggc caaggctctg ctccaggaca aggatgtgat cgctatcaac 960 caggatcctc tgggcaagca gggctaccag ctgagacagg gcgacaattt cgaagtgtgg 1020 gaaagacccc tgagcggact ggcttgggcc gtcgccatga tcaacagaca agagatcggc 1080 ggaccccggt cctacacaat tgccgtggct tctctcggca aaggcgtggc ctgtaatccc 1140 gcctgcttta tcacacagct gctgcccgtg aagagaaagc tgggctttta cgagtggacc 1200 agcagactgc ggagccacat caatcctacc ggcacagtgc tgctgcaact ggaaaacaca 1260 atgcagatga gcctgaagga cctgctctaa 1290 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 3 <211> 1290 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60 ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttactttaa 1290 <210> 4 <211> 745 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant AAV capsid protein <400> 4 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Asn Lys Thr 580 585 590 Thr Asn Lys Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln 595 600 605 Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser 660 665 670 Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Ile Asn Val 705 710 715 720 Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 740 745 <210> 5 <211> 1664 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG promoter <400> 5 actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660 gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720 tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780 agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840 tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900 tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 960 cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020 ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080 gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140 ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200 ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260 ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320 cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380 tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440 gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500 cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560 gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620 gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acag 1664 <210> 6 <211> 3616 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV expression construct <400> 6 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctatcga ttgaattccc cggggatcca ctagttatta 180 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 240 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 300 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 360 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 420 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 480 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 540 ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 600 gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 660 cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 720 ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 780 gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcggggagt cgctgcgacg ctgccttcgc 840 cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta 900 ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta gcgcttggtt 960 taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct ccgggagggc 1020 cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc 1080 gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc ggggctttgt 1140 gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg 1200 ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt 1260 gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac 1320 ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc 1380 ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc 1440 tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc ggcgagccgc 1500 agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc 1560 tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cggggcgaag 1620 cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc 1680 cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg ccttcggggg 1740 ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 1800 aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagtctagag tcgacctgca ggtggatatc 1860 ttgctagcac gccaccatgc agctgcggaa tcctgaactg cacctgggat gtgccctggc 1920 tctgagattt ctggccctgg tgtcttggga catccctggc gctagagccc tggataatgg 1980 cctggccaga acacctacaa tgggctggct gcactgggag agattcatgt gcaacctgga 2040 ctgccaagag gaacccgaca gctgcatcag cgagaagctg ttcatggaaa tggccgagct 2100 gatggtgtcc gaaggctgga aggatgccgg ctacgagtac ctgtgcatcg acgactgttg 2160 gatggcccct cagagagact ctgagggcag actgcaagcc gatcctcaga gattccctca 2220 cggcatcaga cagctggcca actacgtgca cagcaagggc ctgaagctgg gcatctatgc 2280 cgacgtgggc aacaagacct gtgccggctt tcctggcagc ttcggctact acgatatcga 2340 cgcccagacc ttcgccgatt ggggagtcga tctgctgaag ttcgacggct gctactgcga 2400 cagcctggaa aatctggccg acggctacaa gcacatgtca ctggccctga atcggaccgg 2460 cagatccatc gtgtacagct gcgagtggcc cctgtacatg tggcccttcc agaagcctaa 2520 ctacaccgag atcagacagt actgcaacca ctggcggaac ttcgccgaca tcgacgatag 2580 ctggaagtcc atcaagagca tcctggactg gaccagcttc aatcaagagc ggatcgtgga 2640 cgtggcagga cctggcggat ggaacgatcc tgacatgctg gtcatcggca acttcggcct 2700 gagctggaac cagcaagtga cccagatggc cctgtgggcc attatggccg ctcctctgtt 2760 catgagcaac gacctgagac acatcagccc tcaggccaag gctctgctcc aggacaagga 2820 tgtgatcgct atcaaccagg atcctctggg caagcagggc taccagctga gacagggcga 2880 caatttcgaa gtgtgggaaa gacccctgag cggactggct tgggccgtcg ccatgatcaa 2940 cagacaagag atcggcggac cccggtccta cacaattgcc gtggcttctc tcggcaaagg 3000 cgtggcctgt aatcccgcct gctttatcac acagctgctg cccgtgaaga gaaagctggg 3060 cttttacgag tggaccagca gactgcggag ccacatcaat cctaccggca cagtgctgct 3120 gcaactggaa aacacaatgc agatgagcct gaaggacctg ctctaagcca cgcgtaacac 3180 gtgcatgcga gagatctgcg gccgcgagct cggggatcca gacatgataa gatacattga 3240 tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 3300 tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 3360 ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 3420 aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatcaatgc atcctagccg gaggaacccc 3480 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg 3540 caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3600 gagagggagt ggccaa 3616

Claims (25)

  1. 인간에서의 발현에 최적화된 인간 알파-갈락토시다아제 A(α-galactosidase A)(AGA) 단백질 코돈을 인코딩하는 핵산으로서,
    상기 핵산은 서열 식별 번호 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 핵산은 그렇지 않으면 동일한 세포에서 서열 식별 번호 3의 야생형 GLA 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 더 큰 수준으로 발현되는, 핵산.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열이 적어도 약 0.80, 적어도 약 0.83, 적어도 약 0.85, 적어도 약 0.88, 적어도 약 0.90, 적어도 약 0.92, 적어도 약 0.93, 또는 약 0.80 내지 약 0.99, 또는 약 0.85 내지 약 0.99, 또는. 0.88 내지 약 0.99 또는 약 0.90 내지 약 0.99 또는 약 0.93 내지 약 0.99의 코돈 적응 지수(codon adaptation index)를 갖는, 핵산.
  3. 제 1항에 있어서,
    서열 식별 번호 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고 이종성(heterologous)의 발현 제어 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 발현 제어 서열이 구성적 프로모터(constitutive promoter)인, 발현 카세트.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 발현 제어 서열이 근육 세포에서 핵산의 우선적인 발현을 지시하는 프로모터인, 발현 카세트.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 벡터가 재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터인, 벡터.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 rAAV 벡터가 혈청형 1, 2, 6 또는 8의 AAV 캡시드 또는 이의 변이체를 포함하는, 벡터.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 rAAV 벡터가 AAV2 캡시드 또는 이의 변이체를 포함하는, 벡터.
  11. 제 10항에 있어서,
    AAV2 캡시드 변이체가 서열 식별 번호 4의 서열을 포함하는, 벡터.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 rAAV 벡터가 5'로부터 3'로의 (a) AAV2 말단 반복부 (b) CAG 프로모터 (c) 청구항 제 3항에 따른 핵산 (d) 폴리아데닐화 서열 및 (e) AAV2 말단 반복부를 포함하는 핵산을 포함하는, 벡터.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 rAAV가 서열 식별 번호 6으로 표시된 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하거나 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
  14. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트 또는 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 cho 세포, hek293t 세포, hek293 세포, hela 세포, bhk21 세포 또는 vero 세포이며/이거나 상기 숙주 세포가 현탁 또는 부착 배양(adherent culture)에서 성장되고/되거나 상기 숙주 세포가 심장 또는 골격근 세포인, 숙주 세포.
  17. 파브리병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도로서, 바람직하게는 상기 핵산 또는 벡터는 대상체에서 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(Gb3)의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는, 용도.
  18. 파브리병을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (i) 서열 식별 번호 4의 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 및 (ii) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 감염성 rAAV의 용도로서, 바람직하게는 상기 핵산이 서열 식별 번호 6으로 표시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하거나 구성되며, 선택적으로 상기 rAAV가 약 1012 내지 약 1014 벡터 게놈(vector genome)(vg)/kg, 또는 약 1 x 1013, 3 x 1013 또는 5 x 1013 vg/kg 중 하나 이상의 용량으로 투여되며, 바람직하게는 상기 rAAV가 단일 정맥내 주사에 의한 투여용인, 용도.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
    상기 핵산 또는 벡터가 정맥내 및/또는 근육내 주사에 의한 투여용으로 제제화되는, 용도.
  20. 포유동물에서 감소된 수준의 AGA에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  21. 포유동물에서 AGA 수준을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  22. 발현 제어 서열에 선택적으로 작동 가능하게 연결되는, 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제을 포함하는 핵산을 포함하는, 약학적 조성물.
  24. (i) CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열 식별 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 (ii) 서열 식별 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 감염성 rAAV 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 핵산이 서열 식별 번호 6으로 표시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하거나 구성되는, 약학적 조성물.
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