CN107532177A - 腺相关病毒变体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含例如衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白的变体AAV衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体。本公开的rAAV病毒粒体可表现出更大的靶细胞感染性。本公开还提供了通过向个体施用本公开的rAAV将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开还提供了产生具有衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法。

Description

腺相关病毒变体及其使用方法
交叉引用
本申请要求于2015年3月24日提交的美国临时专利申请No.62/137,580的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号HG004483和EY022975的政府支持下进行的。政府对发明享有一定权利。
引言
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒(Parvoviridae)科和依赖病毒(Dependovirus)属，其成员在与辅助病毒(例如，腺病毒)共感染时复制。AAV可在没有辅助物的情况下建立潜伏感染。病毒粒体由25nm二十面体衣壳构成，包含具有两个开放阅读框：rep和cap的4.9kb单链DNA基因组。非结构性rep基因编码病毒复制所必需的四种调节蛋白，而cap编码装配成60聚体衣壳的三种结构蛋白(VP1-3)。这种病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物学障碍(包括细胞表面受体结合、胞吞作用、细胞内运输和细胞核中的解包装)的能力。
概述
本公开提供了包含变体AAV衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，所述变体AAV衣壳蛋白例如衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。本公开的rAAV病毒粒体可表现出更大的靶细胞感染性。本公开还提供了通过向个体施用本公开的rAAV将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开还提供了产生具有衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法。
本公开的一些方面包括含有以下的rAAV病毒粒体：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：13所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：14所示序列具有至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：15所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当存在于rAAV病毒粒体中时，变体AAV衣壳蛋白赋予rAAV病毒粒体对靶细胞增加的感染性。在某些情况下，靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。在某些实施方案中，与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体对靶细胞的感染性相比，rAAV病毒粒体显示出增加至少5倍的靶细胞感染性。
在一些实施方案中，与由野生型AAV血清型衣壳蛋白赋予的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。在一些实施方案中，与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，rAAV病毒粒体就感染性而言对唾液酸或硫酸肝素蛋白聚糖具有降低的依赖性。
在本文讨论的任意实施方案中，基因产物可以是多肽，例如分泌的多肽。在任意实施方案中，多肽可以是肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、乙酰葡糖胺转移酶样1A(也称为LARGE1)、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶或含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。在本文讨论的任意实施方案中，分泌的多肽可以是脂蛋白脂肪酶、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
在任意实施方案中，基因产物可以是基因组编辑基因产物，包括锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和Cas9/引导RNA(gRNA)系统或其组分。
在任意实施方案中，基因产物可以是核酸基因产物，包括干扰RNA、核酶、反义核酸或适体。
本文还提供了药物组合物，其含有a)根据上文或下文所述的任意实施方案的rAAV病毒粒体，和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。
本文还提供了将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法，所述方法包括向个体施用根据上文或下文所述的任意实施方案的rAAV病毒粒体。在一些实施方案中，靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。
本公开的其它方面包括经分离的核酸，其含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。在一些实施方案中，与含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，变体衣壳蛋白在存在于AAV病毒粒体中时提供AAV病毒粒体对肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。
本文还提供了分离的、经遗传修饰的宿主细胞，其含有上文或下文所述的任意实施方案的核酸。
本文还提供了变体AAV衣壳蛋白，其中变体AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。在一些实施方案中，与包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，变体衣壳蛋白赋予对肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。
本公开还包括产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法，包括对rAAV病毒粒体的初始文库在靶细胞中进行第一轮选择，其中初始文库中的rAAV病毒粒体分别含有具有AAV衣壳蛋白氨基酸序列的初始AAV衣壳蛋白，并且其中所述AAV衣壳蛋白氨基酸序列含祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基彼此不同的祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列，从而产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的第二文库。在一些实施方案中，所述方法还包括通过以下确定祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列：i)重构多种野生型AAV衣壳蛋白氨基酸序列的系统发生树，ii)选择系统发生树的节点，以及iii)确定节点处最可能的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述方法还包括评价系统发生树的每个节点处的置信度值，并且所述选择步骤包括基于所述节点处评价的置信度值来选择系统发生树的节点。在一些情况下，初始AAV衣壳蛋白具有与SEQ ID NO：7所示序列有至少94％相同的氨基酸序列。
在任意实施方案中，该方法可包括使rAAV病毒粒体的第二文库经历第二轮选择。在一些实施方案中，第二轮选择在与第一轮选择中使用的靶细胞相同的靶细胞类型中进行。在一些实施方案中，相对于第一轮选择，第二轮选择增加了严格性。
在任意实施方案中，靶细胞可以是肌细胞、上皮细胞、皮肤细胞或神经胶质细胞。在一些情况下，靶细胞是人胚肾细胞。
在一些实施方案中，经历步骤包括a)用rAAV病毒粒体文库感染靶细胞，用辅助病毒超感染受感染的细胞，以及收获从超感染细胞释放的rAAV病毒粒体。
在任意实施方案中，该方法可包括分离含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体，其中与含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，分离的rAAV病毒粒体具有增加的感染性、增强的向性或两者。
本文还提供了包括本发明的rAAV病毒粒体或rAAV病毒粒体的文库的试剂盒，并且在实践本发明方法中可用。
附图说明
图1A-1C是示出祖先腺相关病毒(AAV)序列重构的图像。图B：hu.31和hu.32-SEQID NO：1；cy.6和rh.13-SEQ ID NO：2；rh.2、rh.50、hu.67、rh.10和rh.55-SEQ ID NO：3；rh.51-SEQ ID NO：4；rh.49-SEQ ID NO：5；cy.4-SEQ ID NO：6。图C：SEQ ID NO：18。
图2示出AAV祖先序列重构的完整系统发生树。
图3示出根据本公开的实施方案的祖先AAV cap氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图4示出祖先AAV cap蛋白与天然血清型的比对(祖先-SEQ ID NO：7；AAV1-SEQ IDNO：8；AAV6-SEQ ID NO：9；AAV7-SEQ ID NO：10；AAV 8-SEQ ID NO：11；AAV9-SEQ ID NO：12)。
图5示出根据本公开的一个实施方案，在六轮选择之后，祖先AAV变体的AAV cap蛋白中的可变位置处的显性氨基酸。
图6A-6B是在选择之后，祖先AAV变体中AAV cap氨基酸的可变残基的图像，其被作图至同源AAV1的晶体结构。
图7示出根据本公开的一个实施方案，三轮选择后祖先AAV变体的AAV cap蛋白中的可变位置处的显性氨基酸。
图8示出根据本公开的一个实施方案，六轮选择后祖先AAV变体的AAV cap蛋白中的可变位置处的氨基酸频率变化。
图9示出根据本公开的一个实施方案，在三轮选择后祖先AAV变体的AAV cap蛋白中可变位置处的氨基酸频率变化。
图10示出根据本公开的一个实施方案，通过贝叶斯狄利克雷-多项式模型(Bayesian Dirichlet-multinomial model)比较检验，在选择之后祖先AAV变体的AAV cap蛋白中的关键变量残基。
图11示出根据本公开的一个实施方案，相对于天然AAV血清型进化祖先文库基准测试的转导效率。
图12A-12B示出根据本公开的一个实施方案，针对祖先AAV变体的聚糖依赖性测试的结果。
图13示出根据本公开的一个实施方案，针对祖先AAV变体对细胞进入的糖蛋白依赖性的测试结果。
图14示出关于转导效率，人静脉内免疫球蛋白(IVIG)对祖先AAV变体的体外中和结果。
图15示出根据本公开的一个实施方案通过祖先AAV变体评估腓肠肌转导。
图16示出祖先AAV变体、C4(SEQ ID NO：13)、C7(SEQ ID NO：14)和G4(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列。
图17示出祖先AAV变体C4、C7和G4(上图，SEQ ID NO：16)的共有氨基酸序列和祖先AAV变体C4和C7(下图，SEQ ID NO：17)的共有氨基酸序列。
图18示出选择后祖先AAV变体的热稳定性。
定义
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可被非核苷酸组分中断。如果存在的话，则可在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。本文所用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本文所述本公开的任意实施方案的多核苷酸可包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式的每一个。
多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有一定“序列同一性”百分比，这意味着在进行比对时，该碱基或氨基酸的百分比在比较两条序列时是相同的。序列相似性可以多种不同的方式确定。为了确定序列同一性，可以使用方法和计算机程序比对序列，所述方法或计算机程序例如在世界范围的网络上以ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可获得的BLAST。另一种比对算法是FASTA，可从Madison，Wisconsin，USA(Oxford Molecular Group，Inc.的全资子公司)于Genetics Computing Group(GCG)数据包获得。其他比对技术描述于Enzymology，第266卷：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)版.Doolittle，Academic Press，Inc.(Harcourt Brace&Co.，San Diego，California，USA的分部)。特别感兴趣的是允许序列中的空位的比对程序。Smith-Waterman是一种允许序列比对中的空位的算法。参见Meth.Mol.Bioll.70：173-187(1997)。此外，可利用使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序来比对序列。参见J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。
感兴趣的是使用Smith Waterman来确定序列同一性的本地同源性算法的最佳匹配程序(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))。空位产生罚分通常在1至5之间，通常为2至4，在许多实施方案中为3。空位扩展罚分通常在约0.01至0.20的范围内，并且在许多情况下为0.10。程序具有由输入要比较的序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列同一性。该程序也可得自美国威斯康星州麦迪逊的遗传计算组(GCG)数据包。
另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods inSequence Comparison and Analysis，Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications，第127-149页，1988，Alan R.Liss，Inc.中。序列同一性百分比由FastDB基于以下参数计算：
不匹配罚分：1.00；
空位罚分：1.00；
空位大小罚分：0.33；和
连接罚分：30.0。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，该开放阅读框能够在转录和翻译后编码特定的蛋白质。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向感兴趣的基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA靶向基因，因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度可以为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19至25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可不同。在一些实施方案中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可包含3′或5′突出部分。在一些实施方案中，突出端是3′或5′突出端，长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸。
本文所用术语“微小RNA”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于内源性微小RNA和人造微小RNA(例如合成miRNA)。内源性微小RNA是在基因组中天然编码的能够调节mRNA的生产利用的小RNA。人造微小RNA可以是能够调节mRNA活性的任何类型的RNA序列，而不是内源性微小RNA。微小RNA序列可以是由这些序列中的任意一个或多个构成的RNA分子。微小RNA(或“miRNA”)序列已描述于诸如Lim等，2003，Genes&Development，17，991-1008，Lim等，2003，Science，299，1540，Lee和Ambrose，2001，Science，294,862，Lau等，2001，Science294,858-861，Lagos-Quintana等，2002，Current Biology，12，735-739，Lagos-Quintana等，2001，Science，294，853-857和Lagos-Quintana等，2003，RNA，9，175-179的公开中。微小RNA的实例包括作为较大RNA的片段的任何RNA或miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其他小的非编码RNA。参见例如美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“微小RNA前体”(或“前miRNA”)是指具有微小RNA序列并入其中的茎-环结构的核酸。“成熟微小RNA”(或“成熟miRNA”)包括已从微小RNA前体(“前体miRNA”)切割的或已经合成(例如，通过无细胞合成在实验室中合成)的微小RNA，并且具有约19个核苷酸至约27个核苷酸的长度，例如，成熟的微小RNA可具有19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt，或27nt的长度。成熟的微小RNA可以与靶mRNA相结合并抑制靶mRNA的翻译。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指任意长度的氨基酸的聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分缀合。当在向哺乳动物受试者递送基因产物的上下文中讨论时，多肽(例如抗血管生成多肽、神经保护多肽等)及其组合物是指完整多肽或其任意片段或经遗传改造的衍生物，其保留了完整蛋白质的期望的生物化学功能。类似地，提及编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护性多肽的核酸以及用于向哺乳动物受试者递送基因产物的其它此类核酸(其可称为待递送至受体细胞的“转基因”)包括编码完整多肽或具有所需生化功能的任意片段或经遗传改造的衍生物的多核苷酸。
本文所用术语“治疗”指获得所需的药理学和/或生理学作用。该作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响方面是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易于患病或有获得疾病风险但尚未诊断为患病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)减轻疾病，即导致疾病消退。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猿和人；哺乳动物竞技动物(例如马)；哺乳动物农场动物(如羊、山羊等)；哺乳动物宠物(狗、猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有亚型和天然形式与重组形式两者，另有要求除外。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、9型AAV(AAV-9)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。
本文所用的“rAAV载体”是指包含不是AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸序列)的AAV载体，通常是细胞遗传转化所关注的序列。通常，异源多核苷酸侧接至少一个、通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒两者。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”或“rAAV病毒粒体”是指由至少一种AAV衣壳蛋白构成的病毒颗粒(通常是野生型AAV的所有衣壳蛋白)和包封的多核苷酸rAAV载体。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，通常将其称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV病毒粒体”。因此，rAAV病毒粒体的产生必然包括产生rAAV载体，因为这种载体包含在rAAV病毒粒体内。
“包装”是指导致AAV颗粒的装配和包封的一系列细胞内事件。
AAV“rep”基因和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和包封蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
AAV的“辅助病毒”是指允许哺乳动物细胞复制和包装AAV(例如，野生型AAV)的病毒。用于AAV的各种这样的辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒例如痘苗病毒。腺病毒包含许多不同的亚组，但亚型C的5型腺病毒是最常用的。人、非人哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒是已知的并且可从诸如ATCC的存储库获得。疱疹家族的病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；这些也可从诸如ATCC的存储库获得。
“辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所述复制和包装的其它要求)。如本文所述，可以多种方式提供“辅助病毒功能”，包括通过向生产细胞提供辅助病毒或提供例如编码所需功能的多核苷酸序列。
“感染性”病毒或病毒粒体是包含能够递送到病毒物种为热带的细胞中的多核苷酸组分的病毒或病毒粒体。该术语不一定指示病毒的任何复制能力。如本文所用，“感染性”病毒或病毒颗粒是可接近靶细胞、可感染靶细胞并且可在靶细胞中表达异源核酸的病毒或病毒颗粒。因此，“感染性”是指病毒颗粒进入靶细胞、感染靶细胞并在靶细胞中表达异源核酸的能力。感染可指体外感染性或体内感染性。用于对感染性病毒颗粒进行计数的测定在本公开和本领域的其它地方有述。病毒感染性可表示为感染性病毒颗粒占总病毒颗粒的比例。总病毒颗粒可表达为病毒基因组拷贝数。病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力可称为“转导”。可使用许多技术来测定病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力，包括测定标记基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如，其中病毒包含编码GFP的核苷酸序列)，其中GFP在被病毒颗粒感染的细胞中产生并被检测和/或测量；或测量产生的蛋白质，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)。
“具有复制能力(replication-competent)”的病毒(例如，具有复制能力的AAV)是指具有感染性的表型野生型病毒，并且还能够在被感染的细胞中复制(即，在辅助病毒或辅助病毒功能的存在下)。在AAV的情况下，复制能力通常需要功能性AAV包装基因的存在。通常，由于缺乏一个或多个AAV包装基因，本文所述的rAAV载体在哺乳动物细胞(特别是人细胞)中是无复制能力的。通常，这样的rAAV载体缺少任何AAV包装基因序列，以便使通过AAV包装基因和进入rAAV载体之间的重组产生有复制能力的AAV的可能性最小化。在许多实施方案中，如本文所述的rAAV载体制备物是那些含有少量(如果存在的话)有复制能力的AAV(rcAAV，也称为RCA)(例如，每102个rAAV颗粒小于约1个rcAAV、每104个rAAV颗粒小于约1个rcAAV、每108个rAAV颗粒小于约1个rcAAV、每1012个rAAV颗粒小于约1个rcAAV或没有rcAAV)的rAAV载体制备物。
rAAV病毒粒体的“文库”是含有多个rAAV病毒粒体的组合物，其表现出结构(例如，AAV衣壳蛋白的结构)和/或其中所含核酸序列彼此不同的两种或多种rAAV病毒粒体变体。
术语“向性”是指与一种或多种其它细胞类型相比，一种细胞类型具有较高感染性的病毒颗粒。向性也可指病毒颗粒的组织特异性。例如，与非肌细胞的感染性相比，对肌细胞具有向性的病毒颗粒具有较高的肌细胞感染性。在AAV中，向性受到AAV衣壳血清型的影响，所述AAV衣壳血清型即AAV衣壳蛋白氨基酸序列。相比之下，当病毒颗粒显示出对广泛范围的细胞类型的感染性时，病毒颗粒被认为是混杂的。在一些情况下，病毒颗粒表现出对一种或多种细胞类型的向性，并且也可能是混杂的。
应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合以及导致与天然多核苷酸不同的构建体的其它过程的产物。重组病毒是含重组多核苷酸的病毒颗粒。这些术语分别包括原始多核苷酸构建体和原始病毒构建体的后代的复制物。
“控制元件”或“控制序列”是参与有助于多核苷酸的功能调节的分子的相互作用的核苷酸序列，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。该调节可能影响该过程的频率、速度或特异性，并且可能在性质上增强或抑制。本领域已知的控制元件包括例如转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是能够在一定条件下结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(3′方向)的编码区的转录的DNA区。
“可操作地连接”或“能够操作地连接”是指遗传元件并置，其中所述元件处于允许它们以期望的方式操作的关系。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。只要保持该功能关系，则启动子与编码区之间可能存在中间残基。
“表达载体”是包含编码感兴趣的多肽的区域的载体，并用于在预期靶细胞中实现蛋白质的表达。表达载体还包含可操作地连接到编码区以促进蛋白质在靶中表达的控制元件。控制元件与其可操作地连接用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中大量已知并且在本领域可获得或者可容易地由现有技术中可得的组分构建。
“异源”意指从与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体衍生出来。例如，通过遗传改造技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中移出并且可操作地连接到其天然不连接的编码序列的启动子是异源启动子。因此，例如，包含编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是包含天然野生型AAV中通常不包括的核酸的rAAV，并且编码的异源基因产物是并非通常由天然野生型AAV编码的基因产物。
术语“遗传改变”和“遗传修饰”(及其语法变体)在本文中可互换地用于指其中将遗传元件(例如，多核苷酸)引入细胞而不是通过有丝分裂或减数分裂的过程。元件可与细胞异源，或者它可以是已经存在于细胞中的元件的附加拷贝或改进形式。遗传改变可例如通过本领域已知的任何方法(例如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸-脂质体复合物接触)用重组质粒或其他多核苷酸转染细胞来实现。遗传改变也可例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。通常，将遗传元件引入细胞中的染色体或小染色体；但是在该术语中包括改变细胞及其后代的表型和/或基因型的任何改变。
如果该序列可用于在细胞的体外扩展培养期间执行其功能，则称细胞被“稳定地”改变、转导、遗传修饰或用遗传序列转化。通常，这样的细胞被“遗传地”改变(经遗传修饰)，因为引入遗传改变，其也可被改变的细胞的后代所遗传。
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒粒体，宿主细胞或其他物质是指不含也可存在的至少一些其它组分的物质的制备物，其中物质或类似物质天然地自然发生或最初由其制备。因此，例如，可通过使用纯化技术来制备分离的物质，以使其从源混合物中富集。富集可以绝对基础测量，例如每体积溶液的重量，或者可相对于存在于源混合物中的第二潜在干扰物质来测量。越来越多地分离出本发明实施方案的增加富集物。在一些实施方案中，分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质被纯化，例如约80％至约90％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或至少约99％或更高纯度。
术语“祖先”是指从直系同源序列推断并且可能表示直系同源序列从其向下(descended)的序列的一个或多个氨基酸序列。在一些情况下，直系同源序列是天然地在家庭成员中发现的野生型序列。沿着祖先序列的一些残基的氨基酸同一性通常不能超出置信度值的阈值水平(例如高于90％)。因此，祖先序列的氨基酸同一性通常被确定为90％至99％，例如，92％至98％、93％至97％或94％至96％的残基，而在阈值置信水平以上无法推断的残基处的氨基酸同一性将是可变的。因此，祖先氨基酸序列可以是在某些残基处彼此不同的两个或更多个序列的集合，例如在高达约5％的残基处彼此不同。
术语“基因组编辑”是指通过使用异源核酸酶插入、取代或除去序列来改变细胞内遗传序列的过程。异源核酸酶可以是经遗传改造的核酸酶，包括成员锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas9/引导RNA(gRNA)系统或经改造大范围核酸酶。
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这当然可变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
当提供一系列值时，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则本发明包括每个中间值至该下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间以及任意其它所述值或所述范围内的中间值。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明中，在所述范围内受到任何具体排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除这些所包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有公开通过引用并入本文以公开和描述与引用公开有关的方法和/或材料。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式包括复数指称，上下文另有明确规定除外。因此，例如，提及“rAAV病毒粒体”包括多个这样的rAAV病毒粒体，并且提及“经分离的核酸”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种经分离的核酸及其等同物等等。还应注意，权利要求可被撰写成排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为使用与记载权利要求要素限制有关“单独”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的在先基础。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可单独提供或以任何合适的子组合提供。涉及本发明的实施方案的所有组合具体包括在本发明中，并且在本文中公开，就如同每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也具体地包括在本发明中，并且在本文中公开，就如同每个这样的子组合在本文中单独地和明确地公开一样。
本文所讨论的公开仅仅是为了在本申请的申请日之前的其公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于现有发明而不具有在先于这样的公开的权利。此外，提供的公开的日期可能与可能需要独立确认的实际公开日期不同。
详述
提供了包含变体AAV衣壳蛋白(例如，源自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白)的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体。在某些实施方案中，包含变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体表现出更大的靶细胞感染性，所述靶细胞例如肌细胞和神经胶质细胞。本文还提供了通过施用含变体AAV衣壳蛋白的个体rAAV病毒粒体将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开进一步提供了产生具有衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法。
重组腺相关病毒病毒病毒粒体
本公开提供了包含变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体，例如衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。
包含祖先AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体
本公开的一些方面包括含有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体。在某些实施方案中，从来自不同宿主物种(例如人、猕猴、恒河猴等)的野生型AAV血清型的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列推断祖先AAV衣壳蛋白的氨基酸序列。任何合适的方法均可用于推断祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列，如下文进一步描述的方法。
在某些实施方案中，祖先AAV衣壳蛋白与SEQ ID NO：7所示的序列具有至少94％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，祖先AAV衣壳蛋白与SEQ ID NO：7所示的序列在除了SEQ ID NO：7的第264、266、268、448、459、460、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719和723位处的氨基酸残基之外的所有位置相同。
本公开的某些方面包括含有多个rAAV病毒粒体的组合物，所述rAAV病毒粒体例如祖先AAV文库，其中每个rAAV病毒粒体包含与SEQ ID NO：7所示的序列具有至少94％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的祖先AAV衣壳蛋白。因此，在某些实施方案中，祖先文库含有多个祖先AAV衣壳蛋白，其与SEQID NO：7所示的序列具有至少94％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，对于祖先文库中多种祖先AAV衣壳蛋白在第264、266、268、448、459、460、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719和723位的残基处的氨基酸而言，不同祖先AAV文库中的这些氨基酸有所不同。在一些实施方案中，祖先文库被合成地制备成使得在这些残基处存在的氨基酸类型分布反映了来自野生型AAV血清型的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列推断出的理论分布。因此，在这样一些实施方案中，存在于祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列中的每个可变残基处的最常见氨基酸的频率与推断的理论分布的平均频率相差-10％至10％的时间范围，例如-6％至6％，包括-4％至4％。在一些实施方案中，存在于这些残基处的氨基酸类型的分布是通过包装祖先文库、将包装的文库转染到宿主细胞中并回收复制的病毒获得的rAAV病毒粒体文库中的分布。在一些实施方案中，存在于这些残基处的氨基酸类型的分布是在靶细胞中一轮或多轮选择后获得的rAAV病毒粒体文库中的分布，如在下文中进一步描述的。在某些实施方案中，靶细胞是肌细胞系(C2C12)、肺上皮细胞系(IB3-1)、成胶质细胞瘤细胞、黑素瘤细胞系(B16)或人胚肾293T细胞系。存在于这些残基处的氨基酸类型的示例性分布示于图3所示的表中。
在某些实施方案中，如上所述，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的感染性相比，包含多个含有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的祖先AAV文库显示出对靶细胞增加的感染性。
在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV1或AAV2衣壳蛋白)的AAV病毒粒体的依赖性相比，包含多个具有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的祖先AAV文库显示出就传染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。例如，可通过将用于具有感兴趣的靶细胞受体的亲本细胞系的病毒粒体的转导效率与缺乏靶细胞受体的衍生细胞系的转导效率相比较来确定对靶细胞受体的依赖性。因此，如果与亲本细胞系相比，衍生的细胞系的病毒粒体的转导效率没有降低，则病毒粒体不会对感染性的靶细胞受体表现出依赖性。
因此，在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，包含多个含有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的祖先AAV文库显示出就感染性而言对靶细胞受体降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或者95％或更多的依赖性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV2衣壳蛋白)的AAV病毒粒体相比，祖先AAV文库显示出就感染性而言对硫酸肝素蛋白聚糖降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的依赖性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV1衣壳蛋白)的AAV病毒粒体相比，祖先AAV文库显示出就感染性而言对唾液酸降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的依赖性。
在某些实施方案中，含有多个具有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的祖先AAV文库显示出就靶细胞感染性而言的混杂性。在某些实施方案中，祖先AAV文库对于多种靶细胞类型中的每一种表现出至少高于背景的感染性。示出针对多种靶细胞类型的混杂感染性的这样的祖先AAV文库可能适于通过定向进化衍生具有针对特定细胞类型(包括非感染性细胞类型)的向性的变体rAAV病毒粒体，如在下文中进一步描述的。
在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的突变耐受性和/或可进化性相比，包含多个具有祖先AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的祖先AAV文库具有更高的突变耐受性和/或可进化性。突变耐受性可反映为病毒粒体对热处理的耐性，测量为与未暴露于高温的的病毒粒体相比，病毒粒体在瞬时暴露(例如，10分钟)于高温后保留至少10％、例如至少20％或至少30％的靶细胞感染性。不受理论约束，具有增加的热稳定性的AAV病毒粒体可能更容易耐受破坏整体衣壳稳定性的突变。因此，祖先AAV文库的rAAV病毒粒体耐受对75至79℃范围内的温度(例如76至78℃、76.5至78℃，包括77至78℃)的瞬时暴露(例如，暴露10分钟)。在某些情况下，与未暴露于高温的病毒粒体相比，祖先AAV文库的rAAV病毒粒体所瞬时(例如，10分钟)暴露以及感染性降低至50％的温度高出2至20℃，例如2至15℃、3至10℃，包括3至5℃。
包含变体AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体
本公开的另一些方面包括如上所述的包含源自祖先AAV衣壳蛋白的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体。在某些实施方案中，rAAV病毒粒体包括a)变体AAV衣壳蛋白，其中变体AAV衣壳蛋白含有与SEQ ID NO：16所示的序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
因此，本公开的一个方面包括rAAV病毒粒体，该rAAV病毒粒体包括a)变体AAV衣壳蛋白，其中变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：13所示的序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
本公开的另一方面包括rAAV病毒粒体，该rAAV病毒粒体包含a)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：14所示序列的具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予对靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
本公开的另一方面包括rAAV病毒粒体，该rAAV病毒粒体包含a)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：15所示序列的具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予对靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
在某些实施方案中，靶细胞是体内组织中的细胞、组织切片中的细胞、培养物中解离的原代细胞、包括诸如永生化细胞系的细胞系等。在一些实施方案中，靶细胞是健康细胞，例如，健康组织中的细胞或从健康组织获得的细胞。在一些情况下，靶细胞是病理细胞，例如患病组织或被诊断为患病的个体中的细胞从其获得的细胞。在某些实施方案中，靶细胞是肺上皮细胞系(例如但不限于IB3-1细胞)、人胚肾细胞系(例如，HEK293T细胞)、小鼠成肌细胞系(例如，C2C12细胞)、皮肤黑素瘤细胞系(例如，B16-F10细胞)；并且可包括CHO细胞。适合作为靶细胞的其它细胞系可容易地从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。在一些情况下，靶细胞是原发性肿瘤细胞(例如，成胶质细胞瘤细胞)。在一些情况下，靶细胞是以下中的细胞：肌肉，例如骨骼肌或心肌；神经组织，例如中枢神经系统(脑、脊髓、视网膜)或周围神经系统；皮肤(表皮、真皮等)；免疫系统(骨髓、脾、胸腺、淋巴结、血液等)等。在某些实施方案中，靶细胞是神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、放射状神经胶质细胞、成胶质细胞瘤等)、神经元、肌细胞、角化细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、软骨细胞、骨细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。本文所用的神经胶质细胞意在包括体外或体内健康或病理性神经胶质细胞。因此，靶神经胶质细胞可以是健康的神经胶质细胞或成胶质细胞瘤细胞。在一些实施方案中，健康的神经胶质细胞或成胶质细胞瘤细胞在个体中，例如，胶质瘤患者中的成胶质细胞瘤细胞。
在一些情况下，与具有野生型AAV衣壳蛋白(例如野生型AAV1衣壳蛋白)的AAV病毒粒体对靶细胞的感染性相比，包含变体AAV衣壳蛋白的本发明的rAAV病毒粒体显示出增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或多于50倍的对靶细胞的感染性。可通过检测由rAAV病毒粒体携带的核酸编码并由其表达的可检测标记蛋白来确定靶细胞的感染性。例如，rAAV病毒粒体可包含编码荧光素酶的核酸，并且可通过测量来自靶细胞的荧光素酶活性来确定靶细胞的感染性。在这种情况下，与由用野生型rAAV病毒粒体感染的靶细胞测量的荧光素酶活性相比，由被变体rAAV病毒粒体感染的靶细胞测量的更高的荧光素酶活性指示变体rAAV病毒粒体具有比野生型rAAV病毒粒体更高的感染性。其他合适的可检测标记蛋白包括但不限于荧光蛋白例如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白等。
因此，在某些实施方案中，与具有野生型AAV衣壳蛋白(例如，野生型AAV1衣壳蛋白)的AAV病毒粒体对肌细胞的感染性相比，包含变体AAV衣壳蛋白的本发明的rAAV病毒粒体显示出对肌细胞增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或多于50倍的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV衣壳蛋白(例如，野生型AAV1衣壳蛋白)的AAV病毒粒体对肌细胞的感染性相比，变体rAAV病毒粒体显示出对神经胶质细胞或成胶质细胞瘤增加至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或多于50倍的感染性。
与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV1或AAV2衣壳蛋白)的AAV病毒粒体相比，具有变体AAV衣壳蛋白的本发明的rAAV病毒粒体显示出就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，病毒粒体显示出就感染性而言对靶细胞受体降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的依赖性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV2衣壳蛋白)的AAV病毒粒体相比，该病毒粒体显示出就感染性而言对硫酸肝素蛋白聚糖降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的依赖性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白(例如，野生型AAV1衣壳蛋白)的AAV病毒粒体相比，该病毒粒体显示出就感染性而言对唾液酸降低50％或更多、例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多的依赖性。
基因产品
由本发明的rAAV病毒粒体的异源核酸中的核苷酸序列编码的基因产物可以是任何合适的基因产物，例如但不限于多肽、核酸或基因组编辑基因产物。
多肽基因产物可包括任何合适的多肽，例如但不限于肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、LARGE、O-连接的甘露糖β1，2-N乙酰葡糖胺转移酶和含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。在一些实施方案中，多肽基因产物是分泌的多肽。在一些实施方案中，分泌的多肽是治疗性蛋白质。合适的分泌的多肽包括但不限于脂蛋白脂肪酶、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
脂蛋白脂肪酶(LPL)是参与甘油三酯水解的脂质代谢酶。LPL缺乏与高甘油三酯血症相关。由本发明的异源核酸编码的合适的LPL氨基酸序列包括人LPL(Gene ID：4023)、小鼠LPL(Gene ID：16956)、大鼠LPL(Gene ID：24539)、非人灵长类LPL(Gene ID：464031)、鸡LPL(Gene ID：396219)、狗LPL(Gene ID：403626)、猫LPL(Gene ID：727696)等。
因子IX(凝血因子IX)是在凝血中发挥作用的丝氨酸蛋白酶。因子IX缺乏引起血友病B。由本发明的异源核酸编码的合适的因子IX氨基酸序列包括人因子IX(Gene ID：2158)、小鼠因子IX(Gene ID：14071)、大鼠因子IX(Gene ID：24946)、非人灵长类动物因子IX(GeneID：465887)、鸡因子IX(Gene ID：374258)、猫因子IX(Gene ID：404015)、cat因子IX(GeneID：493973)等。
α1-抗胰蛋白酶是在炎症中发挥作用的蛋白酶抑制剂。α1抗胰蛋白酶缺乏与肺气肿和慢性组织分解的其他症状相关。由本发明的异源核酸编码的合适的α1-抗胰蛋白酶氨基酸序列包括人α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：5265)、小鼠α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：20700)、大鼠α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：24648)、非人灵长类动物α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：467541)、鸡α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：423434)、狗α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：480422)、猫α1-抗胰蛋白酶(Gene ID：101098107)等。
α-半乳糖苷酶是从糖脂和糖蛋白水解α-半乳糖基部分的酶。α-半乳糖苷酶缺乏与法布里氏病相关，该病可用重组产生的α-半乳糖苷酶(agalsidaseα或agalsidaseβ)进行治疗。由本发明的异源核酸编码的合适的α-半乳糖苷酶氨基酸序列包括人α-半乳糖苷酶(GeneID：2717)、小鼠α-半乳糖苷酶(GeneID：11605)、大鼠α-半乳糖苷酶(GeneID：363494)、非人灵长类动物α-半乳糖苷酶(GeneID：465761)、鸡α-半乳糖苷酶(GeneID：422188)、狗α-半乳糖苷酶(GeneID：480988)、猫α-半乳糖苷酶(GeneID：101091428)等。
艾杜糖醛酸酶是催化在皮肤、血管、心脏瓣膜、腱和肺中发现的硫酸皮肤素糖胺聚糖中未硫酸化的α-L-艾杜糖苷键水解的酶。将重组产生的艾杜糖醛酸酶称为洛伦酵素(laronidase)。艾杜糖醛酸酶缺乏与I型粘多糖贮积症(MPS)(MPS-I，也称为Hurler-Scheie综合征)相关。由本发明的异源核酸编码的合适的艾杜糖醛酸酶氨基酸序列包括人艾杜糖醛酸酶(GeneID：3425)、小鼠艾杜糖醛酸酶(GeneID：15932)、大鼠艾杜糖醛酸酶(GeneID：360904)、非人灵长类动物异构酶(GeneID：461056)、鸡艾杜糖苷酶(GeneID：427294)、狗艾杜糖苷酶(GeneID：100505382)、猫艾杜糖醛酸酶(GeneID：101095896)等。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶是硫酸肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解所需的硫酸酯酶。艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的缺失突变与MPS-II(也称为Hunter综合征)有关。艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶重组产生为用于治疗的艾杜糖硫酶(idursulphase)。由本发明的异源核酸编码的合适的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶氨基酸序列包括人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：3423)、小鼠艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：15931)、大鼠艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：363513)、非人灵长类动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：465896)、鸡艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：422392)、狗艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(GeneID：492194)、猫艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(101081450)等。
α-葡糖苷酶是淀粉水解酶，并且酶的缺乏与II型糖原贮积疾病(也称为庞培病)相关。重组产生α-葡糖苷酶类似物用于治疗用途，并且将其称为葡糖苷酶α。由本发明的异源核酸编码的合适的艾杜糖醛酸酶氨基酸序列包括人α-葡糖苷酶(GeneID：2548)、小鼠α-葡糖苷酶(GeneID：14387)、大鼠α-葡糖苷酶(GeneID：367562)、非人灵长类动物α-葡糖苷酶(GeneID：454940)、鸡α-葡糖苷酶(GeneID：416462)、狗α-葡糖苷酶(GeneID：483352)、猫α-葡糖苷酶(GeneID：101086359)等。
N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是催化硫酸软骨素和硫酸皮肤素的N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸酯单元的4-硫酸基团的水解的酶。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺乏与MPS IV(也称为Maroteaux-Lamy综合征)相关。重组产生N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶作为加硫酶(galsulfase)用于治疗。由本发明的异源核酸编码的合适的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶氨基酸序列包括人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：411)、小鼠N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：11881)、大鼠N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(GeneID：25227)、非人灵长类动物N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：737316)、鸡N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：771459)、狗N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：610364)、猫N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(GeneID：100216331)等。
在某些实施方案中，分泌的多肽可与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已知Fc融合偶联物增加分泌蛋白质的产生或全身半衰期。在某些实施方案中，可对分泌蛋白质的氨基酸序列进行修饰以用增强多肽从靶细胞分泌的异源信号肽代替内源信号肽。合适的信号肽描述于例如Sun等，Mol Ther.200614：822和美国申请公开No.20070142623和20040115775中，这两篇申请通过引用并入本文。
肌钙蛋白(肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T)是参与骨骼肌和心肌收缩的调节蛋白。肌钙蛋白缺乏与家族性肥厚型心肌病有关。由本发明的异源核酸编码的合适的肌钙蛋白氨基酸序列包括人肌钙蛋白(Gene ID：7134、7137、7139)、小鼠肌钙蛋白(Gene ID：21954、21956、21957)、大鼠α1-肌钙蛋白(Gene ID：24838、24837、29248)、非人灵长类动物α1-肌钙蛋白(Gene ID：466317、457618、746369)等。
1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-1 Tk)是可用于治疗癌症的一种酶，例如神经胶质瘤。不受理论约束，表达HSV-1 Tk的细胞可将胸苷激酶底物类似物(例如，更昔洛韦，GCV)转化成对分裂细胞(例如，肿瘤细胞)具有高毒性的代谢物。由本发明的异源核酸编码的合适的HSV-1 Tk氨基酸序列包括人HSV-1 Tk(Gene ID：2703374)、人HSV-2Tk(Gene ID：1487307)等。
可用于本公开的其它示例性多肽基因产物描述于例如美国专利申请公开No.2006/0276376中，该申请通过引用并入本文。
基因组编辑基因产物可包括锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和Cas9/gRNA系统或其组分，其中基因组编辑基因产物是多组分基因产物。
锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域相融合而产生的人造DNA内切核酸酶。可以将ZFN改造成靶向所需的DNA序列，这使得锌指核酸酶能够切割独特的靶序列。当引入细胞时，ZFN可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。有关使用ZFN的更多信息，请参见例如：Asuri等，Mol Ther.2012年2月；20(2)：329-38；Bibikova等Science.2003年5月2日；300(5620)：764；Wood等.Science.2011年7月15日；333(6040)：307；Ochiai等.Genes Cells.2010Aug；15(8)：875-85；Takasu等，Insect Biochem Mol Biol.2010年10月；40(10)：759-65；Ekker等，Zebrafish 2008年夏；5(2)：121-3；Young等，Proc Natl Acad Sci U S A.2011年4月26日；108(17)：7052-7；Goldberg等，Cell.2010年3月5日；140(5)：678-91；Geurts等，Science.2009年7月24日；325(5939)：433；Flisikowska等，PLoS One.2011；6(6)：e21045.doi：10.1371/journal.pone.0021045.电子出版物，2011年6月13日；Hauschild等，Proc Natl Acad SciU S A.2011年6月19日；108(29)：12013-7；和Yu等，Cell Res.2011年11月；21(11)：1638-40；所有这些因其教导与ZFN相关而通过引用并入本文。术语“ZFN试剂”包括锌指核酸酶和/或包含编码锌指核酸酶的核苷酸序列的多核苷酸。
转录激活物样效应核酸酶(TALEN)是通过将TAL(转录激活物样)效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人造DNA内切核酸酶。可将TALENS快速改造为在实践上结合任何所需的DNA序列，并且当引入细胞时，TALEN可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。有关使用TALEN的更多信息，请参见例如：Hockemeyer等.Nat Biotechnol.2011年7月7日；29(8)：731-4；Wood等.Science.2011年7月15日；333(6040)：307；Tesson等.Nat Biotechnol.2011 Aug 5；29(8)：695-6；以及Huang等，NatBiotechnol.2011年8月5日；29(8)：699-700；所有这些均因其教导与TALEN相关而通过引用并入本文。术语“TALEN试剂”包括TALEN和/或包含编码TALEN的核苷酸序列的多核苷酸。
Cas 9是含有DNA内切核酸酶活性的聚集的有规律地间隔开的短回文重复(CRISPR)相关(Cas)蛋白(或其功能等同物和/或变体，例如Cas9样蛋白)，其依赖于具有称为crRNA和tracrRNA(也称为引导RNA(gRNA))的两种天然或合成的RNA分子的蛋白质的缔合。在一些情况下，两种分子共价连接以形成单个分子(也称为单指导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与DNA靶向RNA(该术语包括双分子指导RNA构型和单分子指导RNA构型两者)缔合，其激活Cas9或Cas9样蛋白并引导蛋白质靶向核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶功能，则它将切割靶DNA以产生双链断裂，这可导致基因组改变(即，编辑：缺失、插入(当供体多核苷酸存在时)、取代等)，从而改变基因表达。已经改变Cas9(其变体由术语Cas9样涵盖)的一些变体，使得它们具有降低的DNA切割活性(在某些情况下，它们切割单链而不是靶DNA的两条链，而在另一些情况下，它们严重降低至无DNA切割活性)。具有降低的DNA切割活性(甚至没有DNA切割活性)的Cas9样蛋白仍可被引导到靶DNA并且可阻断RNA聚合酶活性。因此，使Cas9样蛋白酶促失活可通过DNA靶向RNA靶向靶DNA中的特定位置，以阻断靶DNA的转录。
关于Cas 9/gRNA系统的详细信息可在以下中找到：例如(a)Jinek等，Science.2012年8月17日；337(6096)：816-21：″A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity″；(b)Qi等，Cell.2013年2月28日；152(5)：1173-83：″Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression″，和(c)WO 2013/176772；其各自的全部内容通过引用并入本文。因此，本文所用术语“CRISPR试剂”包括可用于基于Cas9的系统(例如Cas9或Cas9样蛋白；DNA靶向RNA的任何组分，例如crRNA样RNA、tracrRNA样RNA、单指导RNA等；供体多核苷酸等)中的任何试剂(或编码这样的试剂的核酸)，其包含天然的和/或合成的序列)。
合适的核酸基因产物包括干扰RNA、反义RNA、核酶和适体。当基因产物是干扰RNA(RNAi)时，合适的RNAi包括降低细胞中疾病相关蛋白质水平的RNAi。例如，RNAi可以是降低肌细胞中的例如FRG1的水平或成胶质细胞瘤细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的水平的miRNA、shRNA或siRNA。核酸基因产物的合适靶标描述于例如Bortolanza等，MolTher.201119：2055；美国专利申请No.2013/0347136、2009/0087434、2011/0059114、2011/0165227；PCT公开No.WO2006/128063、WO2011/134023中。
控制元件
如上所述，本公开的rAAV病毒粒体包括含有异源核酸的rAAV载体，所述异源核酸包含编码基因产物的核苷酸序列。异源核苷酸序列可以可操作地连接到在体内指导其在核苷酸序列中的转录或表达的控制元件。这样的控制元件可包含通常与所选基因相关的控制序列(例如，内源性细胞控制元件)。或者，可使用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括衍生自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、与感兴趣的基因异源的内源性细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，还可使用衍生自非病毒基因(例如，鼠金属硫蛋白基因)的序列。这样的启动子序列可从例如Stratagene(San Diego，Calif.)商购获得。
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性启动子将可操作地连接到编码异源基因产物的异源核酸，使得基因产物选择性地或优先地在特定细胞类型或组织中产生。在一些实施方案中，诱导型启动子将可操作地连接到异源核酸。
用于产生rAAV病毒粒体的方法
可使用本领域公知的方法构建包含异源核酸并用于产生rAAV病毒粒体的AAV表达载体。参见例如Koerber等.(2009)Mol.Ther.17：2088；Koerber等.(2008)Mol Ther.16：1703-1709；美国专利No.7,439,065，6,951,758和6,491,907。例如，可将异源序列直接插入AAV基因组，该AAV基因组中的主要AAV开放阅读框(“ORF”)已被切除。AAV基因组的其他部分也可被缺失，只要足够部分的ITR仍允许复制和包装功能即可。可使用本领域公知的技术设计这样的构建体。参见例如美国专利No 5,173,414和5,139,941；国际公开No.WO 92/01070(1992年1月23日公开)和WO 93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等(1990)Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka，N.(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158：97-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；和Zhou等，(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。
为了产生rAAV病毒粒体，使用已知技术例如通过转染将AAV表达载体引入合适的宿主细胞中。许多转染技术是本领域公知的。参见例如，Graham等(1973)，Virology，52：456，Sambrook等(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，New York，Davis等(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier和Chu等，(1981)Gene 13：197。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等.(1973)Virol.52：456-467)、直接微注射入培养细胞(Capecchi，M.R.(1980)Cell 22：479-488)、电穿孔(Shigekawa等.(1988)BioTechnigues 6：742-751)、脂质体介导的基因转移(Mannino等，(1988)BioTechniques 6：682-690)、脂质介导的转导(Felgner等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417)和使用高速微射(microprojectiles)的核酸递送(Klein等.(1987)Nature 327：70-73)。
用于产生rAAV病毒粒体的合适的宿主细胞包括可被或已被用作异源DNA分子的接受者的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文使用的“宿主细胞”通常是指已经用外源DNA序列转染的细胞。可使用来自稳定的人细胞系293(可容易地通过例如美国典型培养物保藏中心以登记号ATCC CRL1573获得)的细胞。例如，人细胞系293是已经用5型腺病毒DNA片段转化的人胚肾细胞系(Graham等(1977)，J.Gen.Virol.36：59)，并且表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等(1979)Virology94：460)。293细胞系易于转染，并提供了一种方便的用于产生rAAV病毒粒体的平台。
在昆虫细胞中产生AAV病毒粒体的方法是本领域已知的，并且可用于产生本发明的rAAV病毒粒体。参见例如美国专利公开No.2009/0203071；美国专利No.7,271,002；和陈(2008)Mol.Ther.16：924。
药物组合物
本公开提供了药物组合物，其包含：a)如上所述的本发明的rAAV病毒粒体；和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂适用于人。
这样的赋形剂、载体、稀释剂和缓冲剂包括任何可施用而没有不适当毒性的药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水、盐水、甘油和乙醇。其中可包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐和有机酸盐，所述无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；所述有机酸盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，这样的载体中可能存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。各种药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的，并且不需要在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已经在各种出版物中广泛描述，包括例如A.Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”，第20版，Lippincott，Williams，&Wilkins；药物剂型和药物递送系统(1999)H.C.Ansel等编著，第7版，Lippincott，Williams，&Wilkins；和Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等编著，第3版，Amer.PharmaceuticalAssoc。
本发明的组合物可包含在溶液、混悬液或两者中包含本发明的rAAV病毒粒体的液体。如本文所用，液体组合物包括凝胶。在一些情况下，液体组合物是水性的。在一些实施方案中，组合物是原位可胶凝的水性组合物，例如原位可凝胶的水溶液。水性组合物具有生理上相容的pH和重量摩尔渗透压浓度。
核酸和宿主细胞
本公开的其他方面包括经分离的核酸，该经分离的核酸包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的感染性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
在某些实施方案中，经分离的核酸包括编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：13所示序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
在某些实施方案中，经分离的核酸包括编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：14所示序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
在某些实施方案中，经分离的核酸包括编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：15所示序列具有至少95％、例如至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
在某些实施方案中，经分离的核酸包括编码祖先AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中祖先AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：7所示序列具有至少94％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的感染性相比，祖先AAV衣壳蛋白赋予靶细胞增加的感染性。在某些实施方案中，与具有野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体的依赖性相比，祖先AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
本发明还提供宿主细胞，例如分离的(经遗传修饰的)宿主细胞，其包含本发明的核酸。本发明的宿主细胞可以是分离的细胞，例如体外培养的细胞。本发明的宿主细胞可用于产生本发明的rAAV病毒粒体，如下所述。当使用本发明的宿主细胞产生本发明的rAAV病毒粒体时，将其称为“包装细胞”。在一些实施方案中，用本发明的核酸对本发明的宿主细胞进行稳定的遗传修饰。在另一些实施方案中，用本发明的核酸对本发明的宿主细胞进行瞬时遗传修饰。
使用成熟技术将本发明的核酸稳定或瞬时引入宿主细胞，所述成熟技术包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、杆状病毒感染等。为了稳定转化，本发明的核酸通常还包括选择性标记，例如任意几种公知的选择性标记，例如新霉素抗性等。
通过将本发明的核酸引入任意多种细胞来产生本发明的核酸，所述多种细胞例如哺乳动物细胞，包括例如鼠细胞和灵长类动物细胞(例如，人细胞)。合适的哺乳动物细胞包括但不限于原代细胞和细胞系，其中合适的细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC No.CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCC No.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC No.CCLI.3)、Sf9细胞、人胚肾(HEK)细胞(ATCC No.CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些实施方案中，如上所述，除了包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸之外，本发明的经遗传修饰的宿主细胞还包含核酸，该核酸包含编码一个或多个AAV rep蛋白的核苷酸序列。在另一些实施方案中，本发明的宿主细胞还包含rAAV载体。可使用本发明的宿主细胞产生rAAV病毒粒体。产生rAAV病毒粒体的方法描述于例如美国专利公开No.2005/0053922和美国专利公开No.2009/0202490中。
方法
本公开提供了通过向个体施用本公开的rAAV病毒粒体将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开提供了治疗疾病的方法，该方法包括向有此需要的个体施用有效量如上所述本发明的rAAV病毒粒体。本公开进一步提供了产生rAAV病毒粒体的方法，该rAAV病毒粒体包含衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白。
将基因产物递送至靶细胞的方法
本公开提供了将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法，所述靶细胞例如肌细胞或神经胶质细胞，该方法包括向所述个体施用如上所述的本公开的rAAV病毒粒体。rAAV病毒粒体进入靶细胞，并且在靶细胞中产生由存在于rAAV病毒粒体中的异源多核苷酸编码的基因产物。在一些情况下，所述方法包括将本公开的rAAV病毒粒体引入到靶细胞近端位点，rAAV病毒粒体在该位点进入靶细胞，并且其中存在于rAAV病毒粒体中的异源多核苷酸编码的基因产物在靶细胞中产生。
当将基因产物递送至肌细胞时，可使用任何合适的方法例如通过胃肠外途径如肌内注射来递送本发明的rAAV病毒粒体。使用rAAV病毒粒体将基因产物递送至肌肉的方法描述于例如Wang等，2014Expert Opin Drug Deliv.11：345中，其通过引用并入本文。
当基因产物被递送到脑中时，本发明的rAAV病毒粒体的一种施用方法是通过任何合适的技术沉积到或靠近该部位，例如通过直接注射(如果需要，通过注射器的立体定位辅助)或通过将奥马耶(Ommaya)储器的尖端放置在空腔或囊肿中来施用。或者，可将对流增强的递送导管直接植入该部位，进入天然或手术产生的囊肿或正常脑组织(参见例如美国申请No.20070254842，通过引用并入本文)。这样的对流增强的药物组合物递送装置极大地改善了组合物在整个脑组织中的扩散。这些递送装置的植入的导管利用高流量微灌注(流速在约0.5至15.0μl/分钟范围内)而非扩散流将rAAV病毒粒体递送至脑和/或肿瘤块。在美国专利No.5,720,720中描述了这种装置，其全部内容通过引用并入本文。
在一些情况下，本发明的rAAV病毒粒体在被引入个体的靶组织中时提供由靶组织中的rAAV编码的异源基因产物的高水平产生。例如，由rAAV编码的异源多肽可在靶组织中以约1μg至约50μg或大于50μg的水平产生。
在一些情况下，本发明的rAAV病毒粒体在被引入个体的靶组织中时提供由靶细胞的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或对于80％中的rAAV编码的异源基因产物的产生。
在一些实施方案中，本发明的rAAV病毒粒体在被引入个体的靶组织中时，提供由rAAV编码的异源基因产物的产生，保持约2天至约6个月的时间，例如约2天至约7天、约1周至约4周、约1个月至约2个月、或约2个月至约6个月。在一些实施方案中，本发明的rAAV病毒粒体在被引入个体的靶组织中时，提供由rAAV编码的异源基因产物的产生超过6个月的时间，例如约6个月至20个月年或更长、或大于1年、例如约6个月至约1年、约1年至约2年、约2年至约5年、约5年至约10年、约10年至约15年、约15年至约20年或多于20多年。
治疗疾病的方法
本公开提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的如上所述的本发明的rAAV病毒粒体。本发明的rAAV病毒粒体可通过局部注射施用于病理组织，如上所述，通过任何其它方便的方式或施用途径。在某些实施方案中，个体是已被诊断为患有疾病的患者，所述疾病例如如上所述的癌症，例如神经胶质瘤或遗传性障碍例如先天性酶缺乏或退行性疾病。
“治疗有效量”将落在可通过实验和/或临床试验确定的相对宽的范围内。例如，对于体内注射，例如直接注入肌肉，治疗有效剂量约为rAAV病毒粒体的约106至约1015，例如约108至1012个rAAV病毒粒体。例如，对于体内注射，例如直接注入肌肉，治疗有效剂量约为约106至约1015个感染单位，例如约108至约1012个感染单位。本领域普通技术人员通过建立剂量反应曲线的常规试验可容易地确定其它有效剂量。
在一些情况下，本发明的rAAV病毒粒体的治疗有效量是当以一个或多个剂量施用于个体(例如，通过肌内注射个体施用)时有效地减缓个体中肌肉变性进展的量。例如，本发明的rAAV病毒粒体的治疗有效量可以是当以一个或多个剂量施用于个体(例如，经由肌内注射施用于个体)时与不用rAAV病毒粒体治疗的肌肉变性进展相比可有效地将肌肉变性的进展减缓至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或多于80％的量。
在一些情况下，本发明的rAAV病毒粒体的治疗有效量是当以一个或多个剂量施用于个体时有效地改善个体中患病组织的功能的量。例如，本发明的rAAV病毒粒体的治疗有效量可以是当以一个或多个剂量施用于个体(例如，经由肌内注射施用于个体)时与不用rAAV病毒粒体治疗的个体肌肉功能相比可有效地将肌肉功能改善至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或多于80％的量。
在一些情况下，本发明的rAAV病毒粒体的治疗有效量是当以一个或多个剂量施用于个体(例如，通过肌内注射施用)时有效降低受损肌肉中肌肉强度损失速率的量。
用变体AAV衣壳蛋白产生rAAV病毒粒体的方法
本文还提供了通过数轮选择产生含变体AAV衣壳蛋白(例如，源自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白)的rAAV病毒粒体的方法。在某些实施方案中，该方法包括使多个rAAV病毒粒体(例如，rAAV病毒粒体的文库)在靶细胞中进行第一轮选择，其中初始文库中的rAAV病毒粒体各自含有具有AAV衣壳蛋白氨基酸序列的初始AAV衣壳蛋白，并且其中所述AAV衣壳蛋白氨基酸序列含有祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基处彼此不同的祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列，从而产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白氨基酸序列衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列。在这种情况下，如本文所述，从多个直系同源野生型AAV衣壳蛋白序列推断出祖细胞AAV衣壳蛋白氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，rAAV病毒粒体文库含有不同种群的AAV衣壳蛋白，其氨基酸序列各自表示通过设定祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列中的对于特定氨基酸而言可变的残基而获得的多个AAV衣壳蛋白序列之一，所述残基即不能在置信度值的阈值水平之上推断的那些残基。
可使用任何合适的方法从多个直系同源的野生型AAV衣壳蛋白序列推断祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列。一般来说，基于多个直系同源的现有氨基酸序列重构祖先氨基酸序列可涉及祖先氨基酸序列的统计重构，其中基于现有氨基酸序列将祖先氨基酸序列的每个残基与氨基酸的置信度值相关联。统计重构可包括序列比对的马尔可夫链蒙特卡洛取样、树和进化模型参数，以及给定的已知序列的后验概率分布的估计，如Westesson等，Bioinformatics.201228：1170中所述，其通过引用并入本文。
通常，不重构全长祖先序列，因为不能在阈值置信水平以上确定一个或多个残基的氨基酸同一性。这些残基可表示为祖先序列中的多态位点。因此，祖先文库包含多个多肽，其中每个多态性位点处的残基的氨基酸同一性可由分子到分子可变，但跨文库对应于由基于统计重构而预测的概率来表示。在某些实施方案中，跨文库的每个多态性位点处的残基的氨基酸同一性适合由统计重构所预测的概率定义的两个或三个氨基酸的分布。在某些情况下，如本文所述，可基于统计重构方法自动(即，不进行手动选择)设计包含推断但可变的祖先氨基酸序列的祖先文库。在这种情况下，将祖先文库中氨基酸序列的任何多态性残基处的氨基酸分布设计为反映统计重构所预测的概率。
因此，从多个直系同源野生型AAV衣壳蛋白序列推断祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的方法可包括重构多种野生型AAV衣壳蛋白氨基酸序列的系统发生树，选择系统发生树的节点，并确定该节点处最可能的氨基酸序列。在某些情况下，使用合适的方法(例如，贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛模拟)来估计系统发生树的每个节点处的置信度值。在每个节点处的置信度值可提示选择用于推断祖先序列的系统发生树的特定节点的决定。一旦选择了系统发生树的特定节点，即可通过比对属于该节点的野生型序列来推断祖先序列，例如通过马尔可夫链蒙特卡洛比对方法，如上所述。在一些情况下，最可能的祖先衣壳蛋白氨基酸序列可包含不分配给具有高于预定阈值的置信水平的特定氨基酸的多态性残基。可将祖先AAV文库中祖先衣壳蛋白氨基酸序列的这些多态性残基的任何一个氨基酸的分布设计成反映如上所述基于野生型AAV衣壳蛋白序列的统计学重构所预测的概率。
用于推断祖先序列的其它方法描述于如下中：例如，Stackhouse，J，Presnell，SR，McGeehan，GM，Nambiar，KP和Benner，SA(1990).The ribonuclease from an extinctbovid ruminant.FEBS letters 262：104-106；Gaucher，EA，Govindarajan，S和Ganesh，OK(2008).Nature 451：704-707；Ortlund，EA，Bridgham，JT，Redihbo，MR，和Thornton，JW(2007).Science 317：1544-1548；Ugalde，JA，Chang，BS，和Matz，MV(2004).Evolution ofcoral pigments recreated.Science 305：1433；Alcolombri，U，Elias，M，和Tawfik，DS(2011).Directed evolution of sulfotransferases and paraoxonases by ancestrallibraries.Journal of molecular biology 411：837-853；Kothe，DL，Li，Y，Decker，JM，Bibollet-Ruche，F，Zammit，KP，Salazar，MG等.(2006).Virology 352：438-449；Ducatez，MF，Bahl，J，Griffin，Y，Stigger-Rosser，E，Franks，J，Barman，S，et al.(2011).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 108：349-354；Rolland，M，Jensen，MA，Nickle，DC，Yan，J，Learn，GH，Heath，L等.(2007).Journal of virology 81：8507-8514；Gullberg，M，Tolf，C，Jonsson，N，Mulders，MN，Savolainen-Kopra，C，Hovi，T等.(2010).Journal of virology 84：9695-9708，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，初始(例如，祖先)AAV衣壳蛋白具有与SEQ ID NO：7所示的序列有至少94％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
当文库的各个rAAV病毒粒体在宿主细胞中相互竞争感染和复制时，可实现选择。不受理论约束，存在于rAAV文库中的初始(例如，祖先)AAV衣壳蛋白氨基酸序列中的一些变体赋予病毒粒体有差异的感染性，因此，具有与所有其它变体AAV衣壳蛋白相比赋予更高感染性的变体AAV衣壳蛋白的那些病毒粒体将趋于变得更丰富。在某些情况下，选择产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV变体文库，其赋予病毒粒体一般较高的感染性，例如对于多种细胞类型，或者在其他情况下，选择产生含有对一种或几种特定细胞类型具有较高的感染性的病毒粒体的rAAV变体文库，所述细胞例如肌细胞和/或神经胶质细胞/成胶质细胞瘤细胞。
在一些情况下，与包含初始AAV衣壳蛋白氨基酸序列的rAAV病毒粒体的初始文库相比，相对于文库中变体AAV衣壳蛋白群体，rAAV病毒粒体的第二文库在祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基处具有不同的氨基酸分布。在一些情况下，与包含初始AAV衣壳蛋白氨基酸序列的rAAV病毒粒体的初始文库相比，相对于文库中变体AAV衣壳蛋白群体，rAAV病毒粒体的第二文库在SEQ ID NO：7的第264、266、268、448、459、460、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719和723位处残基中的一个或多个处具有不同的氨基酸分布。
通常，经历步骤可包括用多个rAAV病毒粒体感染靶细胞，用辅助病毒超感染感染的细胞，以及收获从超感染细胞释放的rAAV病毒粒体。感染、超感染和从靶细胞收获rAAV病毒粒体的方法如在上述宿主细胞中产生rAAV病毒粒体所述。
可根据任何合适的方法来控制选择的严格性。在某些实施方案中，选择的严格性与用rAAV病毒粒体感染靶细胞时使用的感染复数(MOI)相关联。一般而言，MOI是病毒颗粒数与当用病毒粒体感染靶细胞时存在的靶细胞数的比例。感染复数越高，选择的严格性越弱，反之亦然。
在某些实施方案中，根据上述选择方法产生的rAAV变体经受第二轮选择。在一些情况下，第二轮选择可具有与第一轮选择相同或更高的严格性。例如，如果第一轮选择的MOI为5,000，则第二轮选择可具有比500更高的严格性MOI等。以这种方式，产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的第三文库。在一些情况下，与rAAV病毒粒体的初始或第二文库相比，相对于文库中变体AAV衣壳蛋白群体，在第二轮选择之后产生的rAAV病毒粒体的第三文库在祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基处具有不同的氨基酸分布。在某些实施方案中，与rAAV病毒粒体的初始文库或第二文库相比，相对于文库中变体AAV衣壳蛋白群体，在第二轮选择之后产生的rAAV病毒粒体的第三文库在SEQ ID NO：7的第264、266、268、448、459、460、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719和723位处残基中的一个或多个处具有不同的氨基酸分布。
在某些实施方案中，相继进行多轮选择以产生rAAV变体，例如2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多或者10或更多轮。在某些实施方案中，在相同的靶细胞类型中进行多轮选择。在某些情况下，多轮选择产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV变体，其赋予rAAV病毒粒体一般高的感染性，即对于多种细胞类型而言高于背景，或在其他情况下，与具有野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，所述多轮产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV变体，其赋予rAAV病毒粒体对于一种或几种特定细胞类型(例如，肌细胞和/或胶质细胞/成胶质细胞瘤细胞)较高的感染性。
用途
如上所述，包含变体AAV衣壳蛋白的本发明的rAAV病毒粒体可用于需要在靶细胞中表达异源基因产物的许多应用中。在某些实施方案中，对于特定细胞类型，当变体AAV衣壳蛋白赋予rAAV病毒粒体更高的感染性(即，赋予靶细胞类型向性)时，rAAV病毒粒体可用于在有治疗需要的患者中于含靶细胞的组织中或来自含靶细胞的组织表达治疗基因产物。例如，本发明的rAAV病毒粒体可含有赋予肌细胞向性的AAV衣壳蛋白和用于治疗患者遗传缺陷的基因产物。在某些实施方案中，遗传缺陷包括LPL、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、LARGE、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺转移酶和含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质等的编码序列或调节序列中的缺失突变。在某些情况下，患者被诊断为患有由缺乏如上所述的酶和其他蛋白质的功能表达引起的先天性病症。因此，在某些情况下，将本发明的rAAV病毒粒体施用于诊断为患肌营养不良症、高甘油三酯血症、血友病B、遗传性肺气肿、家族性肥大性心肌病、囊性纤维化、早发性视网膜变性、肌萎缩性侧索硬化症、莱伯先天性黑斑病(Leber’s congenital amaurosis)、卡纳万病(Canavan disease)、晚期婴幼儿神经元蜡样脂褐质炎等的患者。
在某些实施方案中，可以将rAAV病毒粒体施用于诊断为患有由遗传突变引起或加重的病症的患者。在某些情况下，该病症由与肿瘤相关的遗传突变引起或加剧。在某些实例中，肿瘤是神经胶质瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌等。在某些实施方案中，可将rAAV病毒粒体施用于诊断为患有由遗传突变引起或加剧的神经障碍(例如帕金森病(Parkinson’sdisease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、癫痫等)的患者。用于基因治疗的AAV病毒粒体的示例性用途描述于例如Santos Coura等，2007 Virol J.4：99中，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，施用包含为患者中的病理细胞赋予向性的AAV衣壳蛋白和用于治疗患者的核酸基因产物或基因组编辑基因产物的本发明的rAAV病毒粒体以治疗诊断为患先天性疾病的患者。在一些实施方案中，先天性疾病可以是由例如由患者基因组中由突变基因表达的缺陷蛋白质引起的显性负作用导致的显性遗传障碍。在某些实施方案中，缺陷蛋白的表达被靶向由突变基因编码的mRNA的核酸基因产物(例如，干扰RNA)降低或抑制。在一些实施方案中，将基因组编辑基因产物，例如ZFN试剂、TALEN或Cas9/gRNA系统配置为靶向患者基因组中的突变基因，以实现导致显性遗传障碍的遗传基因座的等位基因特异性敲低。在某些实施方案中，患者被诊断为患亨廷顿病(Hungtinton’s disease)、马凡综合征(Marfan syndrome)等。
本公开的rAAV病毒粒体和方法还可用于通过选择产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体，所述变体AAV衣壳蛋白孵育对预期目的而言期望的与野生型AAV衣壳蛋白相比对宿主细胞受体更高的感染性、向性和/或改变的依赖性。在某些实施方案中，祖先AAV衣壳蛋白序列可用作产生含有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的起始点，所述变体AAV衣壳蛋白赋予非感染性细胞类型(即，耐受含野生型AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的感染的细胞类型)高感染性和向性。在某些实施方案中，非感染性细胞类型是成胶质细胞瘤细胞、人巨核细胞白血病细胞等。
试剂盒
本文还提供了包含本发明的rAAV病毒粒体或rAAV病毒粒体的文库并且可用于实践所公开的方法的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒包含感染性rAAV病毒粒体，其含有变体AAV衣壳蛋白和编码基因产物的异源核酸，如上所述。在一些情况下，基因产物可以是治疗性基因产物。在一些实施方案中，该试剂盒还可在与容纳感染性rAAV病毒粒体的容器相同或分开的容器中含有药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。
在某些实施方案中，该试剂盒含有感染性rAAV病毒粒体的文库，其中该文库含有多个源自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。在某些情况下，与含有野生型AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体相比，祖先AAV衣壳蛋白赋予rAAV病毒粒体增加的感染热稳定性和/或混杂性。在某些实施方案中，该试剂盒还包含辅助病毒。在某些实施方案中，该试剂盒包含一种或多种含有在被rAAV病毒粒体感染的宿主细胞中复制rAAV病毒粒体所需的基因的质粒。
本发明的试剂盒的组分可以在单独的容器中；或者可以组合在单个容器中。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括使用试剂盒组分和实施本发明方法的说明书。实施本发明方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可印刷在诸如纸或塑料等的基材上。因此，说明书可作为包装插入物存在于试剂盒中，或存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在另一些实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，所述电子可读存储介质例如CD-ROM、软盘、闪存驱动器等。在另一些实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供了用于从远程源(例如，通过互联网)获得说明书的方式。该实施方案的一个实例是包括其中可查看说明书和/或可从其下载说明书的网址。与说明书一样，用于获得说明书的方式被记录在合适的基材上。
实施例
提出了以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，并且无意于限制发明人所认为其发明的范围，也无意于表示下文的实验是所有或唯一进行的实验。已经努力确保所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c.，皮下(地)等。
实施例1：AAV祖先重构库能够选择有广泛感染性的病毒变体
方法
祖先重构
将来自Genbank的腺苷相关病毒(AAV)cap序列(n＝52)(包括来自人和非人灵长类来源的那些)(n＝52)纳入本分析中，从先前的系统发生分析中公开的AAV序列列表开始。使用MrBayes包进行树空间的贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛(Bayesian Markov chain MonteCarlo，MCMC)模拟，并估计每个内部节点的置信度值。然后使用马尔科夫链蒙特卡洛比对取样器HandAlign来探索比对空间并估计节点27处最可能的比对的区域置信度，舍弃除从该节点向下的序列之外的所有序列。HandAlign产生多重序列比对，将不同变体的序列排列在比对的“列”中，使得在列中分组的残基共享共同的祖先。将每个比对柱建模为使用从比对的蛋白质编码序列的数据库估计的氨基酸和经验密码子取代率矩阵来进行字符进化的标准系统发生连续时间马尔可夫过程的实现。HandAlign与比对同时执行重构，并负责序列插入、缺失和字母取代。使用密码子级模型来解释在DNA水平上用表型进行同义取代的概率；还检查所检查重叠阅读框(“套印”基因)双重选择的概率。这些微小的影响都没有显示出足够的重要性，以相对于许多非同义氨基酸变体保证同义(沉默的DNA水平)变体的优先级。利用JalView程序可视化映射到装配的衣壳结构上的变体氨基酸位置。
文库构建和载体包装
重构的祖先AAV cap序列用大小为5.6×1011的文库合成(GeneArt，LifeTechnologies)，用Hind III和Not I消化，并连接到具有复制能力的AAV包装质粒pSub2中。将所得的连接反应物电穿孔到大肠杆菌中以进行质粒生产和纯化。然后通过如前所述的碘克沙醇密度离心包装并纯化具有复制能力的AAV。通过使用Biorad iCycler(Bio-Rad，Hercules，CA)和Taqman探针(Biosearch Technologies，Novato，CA)的实时定量聚合酶链反应(PCR)获得抗DNA酶基因组效价。
细胞培养
从加利福尼亚大学伯克利分校的组织培养机构(Tissue Culture Facility atUniversity of California，Berkeley)获得C2C12小鼠成肌细胞、B16-F10皮肤黑素瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)-K1、pgsA、Pro5、Lec1和Lec2细胞。从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)获得IB3-1肺上皮和人胚肾293T细胞。除非另有说明，否则在37℃和5％CO2下于杜尔贝科氏改良的伊戈尔培养基(Dulbecco′sModified Eagle′s medium，DMEM，Gibco)中培养所有细胞系。L0人成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤起始细胞由Brent Reynolds博士(University of Florida，Gainesville)友情提供，并在无血清培养基(Neurocult NS-A Proliferation试剂盒，Stem Cell Technologies)的神经球测定生长条件下繁殖，所述无血清培养基含有表皮生长因子(EGF，20ng/ml，R&D)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10ng/ml，R&D)和肝素(0.2％稀释在磷酸盐缓冲盐水中，Sigma)。在DMEM/F-12(1：1)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养IB3-1细胞。在F-12K培养基(ATCC)中培养CHO-K1和pgsA细胞，并在MEMα核苷(Gibco)中培养Pro5、Lec1和Lec2细胞。除GBM培养物外，所有培养基均补充有10％胎牛血清(Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)。
文库选择和进化
将所有细胞系以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔组织培养板中。接种后一天，用具有复制能力的AAV文库感染细胞。暴露24小时后，用腺病毒血清型5(Ad5)对细胞进行超感染。大约48小时后，观察到细胞病变效应，并通过三次冷冻/解冻步骤收获病毒粒体，然后在37℃下用Benzonase核酸酶(1单位/mL)(Sigma-Aldrich)处理30分钟。然后将病毒裂解物在56℃孵育30分钟以使Ad5失活。如上所述测定病毒基因组效价。为了分析cap序列，将AAV病毒基因组在包装及3轮和6轮选择后提取，通过PCR扩增，并在UC Berkeley DNA测序机构(UC Berkeley DNA Sequencing Facility)进行测序。
进化的祖先文库中可变位置的统计分析
在每个可变氨基酸位置处进行两组可变氨基酸的比较，以鉴定选择期间其文库比例显著变化的可变位置。假设以低假计数狄利克雷分布的概率参数反映观察到的稀疏计数，计算两组可变氨基酸来自两个不同概率分布的后验概率。为了比较合成文库和理论文库，将通过狄利克雷多项式(Dirichlet-multinomial)分布的合成后氨基酸频率与通过多项式分布的文库的理论概率进行比较。
体外转导分析
将通过六轮进化选择的祖先文库病毒基因组克隆到pXX2重组AAV包装质粒中。为了将重组AAV(rAAV)祖先文库对一组天然AAV血清型的感染性基准化，使用先前描述的瞬时转染方法，用自身互补的巨细胞病毒绿色荧光蛋白(CMV-GFP)盒包装载体。将细胞系(293T、C2C12、IB3-1、B16-F10、CHO-K1、pgsA、Pro5、Lec1和Lec2)以15,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。接种后1天，以如下基因组感染复数(MOI)用rAAV感染细胞：2000(293T、C2C12、IB3-1、B16-F10、GBM)、10,000(Pro5、Lec1、Lec2)、32,000(C2C12)、或50,000(CHO-K1、pgsA)(n＝3)。对于研究糖蛋白用途的实验，如前所述，将Pro5细胞在转导之前用0.05％胰蛋白酶(Gibco)处理或用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行模拟处理，并将细胞以5,000(祖先AAV、AAV2、AAV6)或15,000(AAV5)的基因组MOI感染。为了分析抗体回避特性(evasion properties)，将祖先rAAV文库用连续稀释的热灭活IVIG(Gammagard)在37℃下孵育1小时，然后用于以2000(n＝3)的基因组MOI感染HEK293T细胞。为了表征热稳定性，将包装有自身互补CMV-GFP的病毒粒体用补充有2％FBS的DMEM稀释，并在热循环仪(Bio-Rad)中于59.6℃至78℃的温度下孵育10分钟，然后冷却至37℃，并且用于以1,500-16,000的基因组MOI感染293T细胞；调整MOI以确保有足够数量的GFP阳性细胞进行分析。对于所有研究，用Guava EasyCyte6HT流式细胞仪(EMD/Millipore)(UC Berkeley Stem Cell Center，Berkeley，CA)对感染后72小时的表达GFP的细胞的分数进行定量。
体内动物成像和荧光素酶表达的定量
通过碘克沙醇梯度纯化高效价rAAV dsCAG-荧光素酶载体，然后浓缩并使用Amicon Ultra-15离心过滤器单元(Millipore)交换到PBS中。为研究骨骼肌转导，如前所述将5×1010个抗rAAV-Luc DNA酶基因组颗粒以30μl的体积注射入7周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories，n＝3)的每只腓肠肌。注射后6周，处死动物，并且收获腓肠肌并冷冻。测定荧光素酶活性并如前所述归一化至总蛋白。所有动物程序均由加利福尼亚大学伯克利分校实验动物护理办公室(Office of Laboratory Animal Care at the Universityof California，Berkeley)批准，并按照美国国家卫生研究院(NIH)实验室动物护理指南进行。
结果
祖先AAV序列重构
给定一组现有DNA序列，祖先序列重构的目的是产生与这些序列相关的系统发生树和序列比对，以及推断在不同祖先节点处祖先变体的序列。由于现有变体(其影响系统发生树建立步骤)之间的进化关系不明确以及高度可变残基处的序列收敛(其影响序列比对和祖先重构步骤)，准确的序列重构是具有挑战性的。作为AAV祖先重构的起点，重构了从Genbank(n＝52)检索的选定的人、猕猴和恒河猴AAV cap序列的系统发生。使用执行贝叶斯马可夫链蒙特卡洛(MCMC)树空间模拟的MrBayes估计每个内部节点(图1a和2中的花括号所示)处的置信度值。该方法产生一个关于现有序列的系统发生树，这本质上是关于AAV的进化历史的假设。这棵树上的每个分支描述了使序列多样化的进化过程，并且每个内部节点代表两个AAV谱系分叉的“分裂”事件。鉴于有许多祖先节点可供选择，基于其高置信度值(1.00)而选择节点27(图1，图a)，其最小化一个潜在的不确定性来源(在整个序列之间的系统发生关系水平)，因此提高对各个氨基酸进化历史的细化下游重构的置信度。该节点也是具有所示临床疗效(AAV1，Glybera)、生物医学兴趣(AAV6)或对中和抗体(AAV7)相对抗性的血清型的祖先。
图1.祖先AAV序列重构。a)在节点27处与现有AAV变体的子集相关的系统发生树。弯折括起的数字表示分化枝后验概率。系统发生树图形在Dendroscope中生成。b)AAV变体子集的多重序列比对，其具有沿着顶部添色并且注释的具有单数位的列特异性置信度(hu.31和hu.32-SEQ ID NO：1；cy.6和rh.13-SEQ ID NO：2；rh.2、rh.50、hu.67、rh.10和rh.55-SEQ ID NO：3；rh.51-SEQ ID NO：4；rh.49-SEQ ID NO：5；cy.4-SEQ ID NO：6)。高于0.9至0.3-0.4的置信度范围示于头一行。c)节点27处第451至481位残基的预测祖先氨基酸序列的分布。每个氨基酸的字符高度与其后验概率成比例。
图2.用于AAV祖先序列重构的完整系统发生树。弯折括起的数字表示分化枝后验概率。系统发生树图形在Dendroscope中生成。
然后使用马尔科夫链蒙特卡洛比对取样器HandAlign来探索比对空间并预测节点27处最可能的比对的祖先序列。HandAlign产生多重序列比对，从而将不同变体的序列排列在比对的“列”，使得分组在列中的残基共享共同的祖先(图1，图b)。HandAlign在比对同时执行祖先重构，并负责序列插入、缺失和字母取代。如图1c所示，预测的氨基酸作为序列标志的分布，其特征高度与后验概率成比例。大多数氨基酸位置可以高置信度(≥0.90)预测，因此表示进化过程中高度保守的残基。然而，如在祖先重构中常见的，其他位置的进化保守性较低，因此可以较低的概率进行预测。
基于这些结果设计DNA文库，并且在0.90置信度值之上的残基是固定的，而低于该置信水平但高于阈值0.08的那些则通过引入两个或三个最可能的氨基酸来改变，使得在给定位置含有每个氨基酸的文库成员的分数反映在序列重构中出现该氨基酸的概率。32个可变残基的位置、身份(identity)和合成频率列于表1，并且完整的祖先cap氨基酸序列显示于图3(SEQ ID NO：7)中，并与图4中现有血清型比对。合成祖先cap文库(GeneArt，LifeTechnologies)，并对该文库中61个测序克隆进行的分析，披露了可变位置处的氨基酸频率与文库的理论概率没有显著差异(P＜0.001，参见材料和方法)，这突出了文库合成的正确性。
图3.祖先AAV cap氨基酸序列。可变残基用粗体、加下划线的字母X标记。
图4.祖先AAV cap蛋白与天然血清型的比对。使用Geneious程序(Biomatters)对衣壳氨基酸进行比对。着色的氨基酸代表与参考祖先cap序列的不同之处。祖先文库中的可变位置用黑色注释，并用字母X指定。
表1
祖先AAV文库的遗传选择
在验证了在32个可变位置处的氨基酸的初始合成分布后，对当经受针对包装和感染性的选择压力时这些位置将如何变化进行了探测，这是AAV自然进化期间成功的病毒复制适应度的关键因素。将祖先文库克隆到AAV包装质粒中，并如前所述，通过转染入人胚肾293T细胞产生病毒颗粒。病毒基因组效价与基于现有AAV血清型的包装文库中获得的水平相当，这表明祖先文库可支持稳健的包装效价。可变位置处的氨基酸分布仅通过一轮包装略微改变(图5)，并且假设就感染性而言的附加选择压力可能更多地披露每个可变位置的显著性。选择代表不同组织的五个细胞系进行数轮选择：C2C12小鼠成肌细胞、IB3-1肺上皮细胞、B16-F10皮肤黑素瘤细胞、人胚肾293T细胞和L0人成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤起始细胞。简言之，将1×105个细胞以104的最初基因组复数(MOI)用碘克糖醇纯化的具有复制能力的AAV文库感染。两天后，通过用5型腺病毒超感染细胞来回收成功的病毒粒体。对每个细胞系进行6轮选择，并通过降低基因组MOI在随后轮期间增加选择的严格性(表2)。
图5.六轮选择后可变位置处的显性氨基酸。基于不同文库中每个位置处最常见的氨基酸的频率产生热图。基于各个克隆n＝61(合成文库)、n＝23(包装后)和n＝14(在各细胞系上选择后的祖先文库)的测序结果确定每个位置处的显性氨基酸和频率。
表2.在祖先AAV库选择中应用的选择严格性。
选择的轮数 基因组感染复数
1 5,000
2 500
3 250
4 250
5 50
6 25
为了评估在每个可变位置处选择的进展，在初次病毒包装后(在下文中称为包装后)，经过三轮选择以及经过六轮的选择后，将克隆从每个文库测序(n≥14)。该分析披露了跨越不同细胞系的每个可变位置的一系列结果。图6示出作图至AAV1的晶体结构(具有解析结构的最同源血清型)上的可变氨基酸的位置，并且图5和7描绘了分别在六轮和三轮选择之后每个选择的汇集物的这些位置中的每一个处的显性氨基酸。如预期的那样，细胞系感染的选择导致收敛性增加，并且图8和9示出相对于包装后分别在第6轮和第3轮中氨基酸频率的变化百分比。一些氨基酸位置在所有细胞系接近完全收敛于相同的残基(268、460、474、516、547、583、665、710、717、719)；这些位置分布在整个衣壳中，且例如可对核心病毒功能例如衣壳稳定性、非包衣或内体逃逸而言是重要的。其他细胞在不同的细胞系(264、467、593、664、723)之间显示出更多样化的结果，并且在整体适应性方面可能是中性的。最后，一些位置(459、470、471、553、555、596、662、718)获得了对于给定细胞系具有特异性的特征，并且可对每个相应细胞系赋予感染性优势。这些特定残基中的大多数暴露在衣壳表面，因此它们可例如在改变衣壳与细胞表面受体相互作用的亲和力中起作用。
图6.作图至同源AAV1的晶体结构的变量残基，与可用结构相关的最接近的AAV。在PyMOL中产生AAV1衣壳的三维分子模型。使用具有AAV1的祖先AAV序列的氨基酸比对来将突出显示的残基作图到a)各个不对称单位和b)完全生物装配体。
图7.三轮选择后可变位置处的显性氨基酸。基于不同文库中每个位置处最常见的氨基酸的频率产生热图。基于各个克隆的测序结果(n≥14)测定每个位置处的显性氨基酸和频率。
图8.六轮选择后可变位置处氨基酸频率的变化。计算了对每个细胞系进行六轮选择后，包装后文库和进化文库之间氨基酸频率的百分比变化。如果显性氨基酸的身份没有变化，则显示频率的增加或减少。如果选择导致该位置处的氨基酸身份发生变化，则示出新的氨基酸和频率。
图9.三轮选择后可变位置处氨基酸频率的变化。计算了对每个细胞系进行三轮选择后，包装后文库和进化文库之间氨基酸频率的百分比变化。如果显性氨基酸的身份没有变化，则显示频率的增加或减少。如果选择导致该位置处的氨基酸身份发生变化，则示出新的氨基酸和频率。
为了确定由遗传选择赋予的氨基酸频率的变化是否与初始合成分布具有统计学显著差异，进行贝叶斯狄利克雷多项式模型比较测试(如材料和方法中所述)，以计算后验概率，两组可变氨基酸来自不同的分布。该分析确定了在选择后显著不同(P＜0.05)和更多的中等程度(P＜0.5)不同的几个氨基酸位置(图10)。
图10.通过贝叶斯狄利克雷多项式模型比较测试来确定关键变量残基。进行两组可变氨基酸的比较，以鉴定选择期间显著变化的位置。假设以低假计数狄利克雷分布的概率参数反映观察到的稀疏计数，计算两组氨基酸来自两个不同概率分布的后验概率。结果绿色表明所述组来自不同分布的机率＞95％，黄色＞50％机率，红色＞5％机率，且无色＜5％机率。Synth，合成的文库；PP，包装后；R3，第三轮选择；R6，第六轮选择。
进化祖先文库的转导效率
遗传选择可想象地导致给定细胞系的特异性感染性，或者可替代地增加整体感染性，但是以混杂方式跨越所有细胞类型。通过评价细胞系组上进化祖先文库的转导效率来研究这些概率。六轮选择并没有驱动完全收敛至单一序列，这可能是由于存在不赋予选择性优势的中立位置。因此，最初将整个进化文库包装为重组病毒(以低比例的AAV辅助质粒/生产细胞以使嵌合衣壳最小化)而非包装各个克隆，结果因此代表了整体或平均文库感染性以用于比较转导效率和向性。针对祖先文库和天然血清型AAV1-6、8和9产生编码绿色荧光蛋白(GFP)的高效价、碘克沙醇纯化的重组AAV(rAAV)。基因组MOI为2,000(或C2C12为32,000)的感染披露一系列性质(图11)。进化的祖先文库介导与AAV1和AAV6最相当的且一般优于AAV4、AAV5、AAV8和AAV9的高递送效率。祖先文库相对于天然血清型感染C2C12和GBM细胞系特别成功。重要的是，比较合成的文库与进化的祖先文库时观察到感染性的大幅增加，这表明在可变位置处有利氨基酸的遗传选择。有趣的是，进化的文库通常在所有细胞系中显示出广泛的感染性，这表明祖先AAV是混杂的，这种性质已知对天然进化适应性有利。
图11.针对天然AAV血清型将进化祖先文库的转导效率基准化。经过六轮进化后，从祖先文库中回收病毒基因组DNA，并与野生型AAV 1-6、8和9一起包装为rAAV scCMV-GFP。以2000(293T、IB3、B16-F10、GBM)或32,000(C2C12)的基因组感染复数(MOI)感染细胞系。72小时后用流式细胞术对表达GFP的细胞的分数进行定量。数据表示为平均值±SEM表示，n＝3，AL，祖先文库。
在先AAV聚糖依赖性和对中和抗体的易感性的表征
我们的体外转导实验证明了重构变体的广泛感染性。鉴于祖先节点27产生AAV1和AAV6，无论祖先克隆是否共享相同的聚糖依赖性，或者是否确定了随后进化的那些。AAV1和AAV6利用α2，3和α2，6N-连接的唾液酸作为其主要受体，并且AAV6对硫酸肝素蛋白聚糖具有适度的亲和力。为了探测硫酸肝素蛋白聚糖(HPSG)用途，转导了亲本CHO-K1细胞和缺乏HPSG的pgsA CHO变体系。为了检查唾液酸依赖性，转导呈递具有N-和O-连接的唾液酸两者的聚糖的亲本Pro5 CHO细胞、缺乏所有N-和O-连接的唾液酸的Lec2 CHO变体细胞系和缺乏复合和混合型N-聚糖的Lec1系(图12，图b)。有趣的是，祖先AAV显示出不依赖于HPSG或N-和O-连接的唾液酸(图12，图a)。此外，Pro5细胞的蛋白酶处理导致祖先AAV和对照血清型的转导减少，表明某种糖蛋白用于细胞结合(图13)。
图12.祖先AAV变体的聚糖依赖性。a)在以2000(Pro5、Lec1、Lec2)和50,000(CHO-K1、pgsA)基因组MOI感染后72小时通过流式细胞术对携带scCMV-GFP的祖先AAV变体C4、C7和G4的转导效率进行定量。CHO-K1/pgsA比较检测硫酸肝素蛋白多糖依赖性，而Pro5/Lec1和Pro5/Lec2探测唾液酸依赖性。数据以平均值±SEM表示，n＝3。b)存在于CHO糖基化突变体上的聚糖。AL，祖先文库。
图13.祖先AAV变体使用糖蛋白进行细胞进入。在用已知使用糖蛋白的祖先AAV或天然血清型转导之前，将Pro5细胞用胰蛋白酶处理或用PBS模拟处理。在基因组MOI为5,000(祖先AAV、AAV2、AAV6)或15,000(AAV5)的感染后48小时通过流式细胞术对GFP表达进行定量。用胰蛋白酶处理的样品和用相同病毒转导的相应模拟物处理样品之间的差异均具有统计学意义(P＜0.01，双尾学生t检验)。数据以平均值±SEM表示，n＝3，AL，祖先文库。
检查祖先AAV是否被含有针对现有血清型的多克隆抗体的人静脉内免疫球蛋白(IVIG)中和。用IVIG体外孵育大大减少了祖先文库和AAV1对照的转导(图14)，表明祖先与其后代不具有高度血清学差异。
图14.在体外用人静脉内免疫球蛋白(IVIG)中和祖先AAV变体。将重组的第6轮祖先AAV文库和AAV1用自我互补的CMV-GFP盒包装，在37℃下用连续稀释的热灭活的IVIG孵育1小时，然后用于以基因组MOI为2，000感染HEK293T细胞(n＝3)。72小时后用流式细胞术对表达GFP的细胞的分数进行定量。数据以平均值±SEM表示，n＝3，AL，祖先文库。
在小鼠腓肠肌中体内祖先变体的表征
在发现祖先AAV文库表现出与来自代表性组织的一组细胞系上的现有血清型相当或在某些情况下高于现有血清型的效率后，探测体内感染性。基于祖先AAV对大多数非感染性细胞系(C2C12小鼠成肌细胞)的高转导效率，评价小鼠腓肠肌的体内转导。基于这些文库在体外转导C2C12成肌细胞的效率选择与在C2C12(克隆C4，C7)和成胶质细胞瘤细胞(克隆G4)上进化的文库的共有序列最接近的选定病毒汇集物(表3)的各个祖先变体克隆。鉴于其在肌肉靶向基因治疗中的临床疗效，将变异体针对AAV1基准化。在掺混CAG(CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白/β-球蛋白基因的剪接受体)启动子的控制下产生表达萤火虫荧光素酶的自互补AAV载体。将30μl体积的抗DNA酶基因组颗粒(5×1010个病毒基因组(vg))注射到BALB/c小鼠的每个腓肠肌中，并且6周后处死小鼠并分析组织荧光素酶活性(图15)。祖先变体在腓肠肌中产生比AAV1高19至31倍的转基因表达，变体C7产生最高表达。有趣的是，变体C7是与在C2C12细胞上进化的祖先文库中的可变位置处的显性氨基酸匹配的精确共有序列。这些结果证实，混杂的祖先AAV在体内也表现出高感染性，甚至提供超过基因治疗应用中最佳天然血清型性能的潜力。
图15.腓肠肌转导的评价。在成年小鼠中肌内施用5×1010个祖先克隆C4、C7、G4或野生型AAV1的病毒颗粒后48天，在腓肠肌组织匀浆中测定每毫克蛋白质相对光单位(RLU)的荧光素酶活性。用磷酸盐缓冲盐水注射的对照显示没有活动。*，通过双尾学生t检验得到的统计学差异P＜0.05。
表3.在体内评价的祖先克隆中存在的32个可变氨基酸的身份。
实施例2：祖先AAV热稳定性
高热稳定性和增强的对突变的耐受性也是可赋予祖先病毒衣壳的进化优势的性质。通过在热处理后测定其转导效率，将从重构汇集物中选出的AAV变体的热稳定性相对于天然血清型AAV1、AAV2、AAV5和AAV6基准化。具体来说，为了初步分析，选择C2C12细胞上选出的祖先文库和来自该文库C7的代表性变体。在不同温度下使用热梯度将用自身互补的CMV-GFP包装的病毒粒体处理10分钟，然后冷却至37℃并用于感染293T细胞。将在于37℃下孵育的样品的每个温度下处理后的表达GFP的细胞的所得分数归一化(图18)。祖先变体显示出比天然血清型更高的热稳定性，并且即使在最高的处理温度(78℃)也显示出中等的转导水平，这消除了天然血清型的转导。获得的热稳定性证实了先前对天然血清型报道的那些，这表明AAV5比AAV1更稳定，且AAV2比两者都不太稳定。一般来说，祖先变体的增强的热稳定性可实现对不稳定突变更高的耐受性并且因此具有更高的进化适应性。
图18.候选祖先变体显示出比天然血清型更高的热稳定性。表征C2C12细胞上选择的祖先文库的和代表性祖先变体C7的热稳定性，并与天然血清型1、2、5和6的热稳定性进行比较。在59.6℃至78℃的温度范围下将与scCMV-GFP一起包装的病毒粒体孵育10分钟，然后冷却至37℃并用于感染293T细胞。72小时后通过流式细胞术对表达GFP的细胞的分数进行定量。在37℃孵育后，将数据标准化至表达GFP的细胞的分数，然后将数据表示为平均值±SEM，n＝3。
虽然已经参考其具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变并且可替换等同变化形式。此外，可进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤适应于本发明的目标、精神和范围。所有这些修改旨在在所附权利要求的范围内。
 序列表
<110> D·S·欧加拉
J·桑蒂阿格-欧蒂兹
O·韦斯特桑
D·V·沙弗尔
I·H·霍尔米斯
J·温斯特恩
<120> 腺相关病毒变体及其使用方法
<130> BERK-278WO
<150> 62/137,580
<151> 2015-03-24
<160> 18
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu
1 5 10 15
Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala
35 40 45
Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu
50 55 60
Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ser
65 70
<210> 2
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu
1 5 10 15
Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala
35 40 45
Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Ile Glu Ser Pro Asp Ser Ser
50 55 60
Thr Gly Ile Gly Lys Lys
65 70
<210> 3
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Leu Gln Glu Arg Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu
1 5 10 15
Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Gly Lys Lys Arg Pro Ile Glu Ser Pro Asp Ser Ser
50 55 60
Thr Gly Ile Gly Lys Lys
65 70
<210> 7
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(737)
<223> Xaa可以是任何氨基酸。
<400> 7
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
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Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
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405 410 415
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485 490 495
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Leu
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<212> PRT
<213> 腺相关病毒1
<400> 8
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
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260 265 270
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275 280 285
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<210> 9
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相关病毒6
<400> 9
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
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355 360 365
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<211> 737
<212> PRT
<213> 腺相关病毒7
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Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
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Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
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Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Arg Phe Lys Leu Phe Asn Ile
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Leu
<210> 11
<211> 738
<212> PRT
<213> 腺相关病毒8
<400> 11
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
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130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
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Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
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Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
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Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
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Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325 330 335
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420 425 430
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595 600 605
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Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645 650 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
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675 680 685
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Asn Leu
<210> 12
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相关病毒9
<400> 12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
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<222> (1)..(737)
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<222> (1)..(737)
<223> Xaa可以是任何氨基酸。
<400> 17
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180 185 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210 215 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Xaa Ser Ser Gly Ser Thr Asn Asp Asn
260 265 270
His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr
405 410 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Xaa
435 440 445
Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Asn Arg Glu Leu Leu Phe
450 455 460
Ser Gln Gly Gly Pro Xaa Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Ser Gln
485 490 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu
500 505 510
Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His
515 520 525
Lys Asp Asp Glu Xaa Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe
530 535 540
Gly Lys Xaa Gly Ala Gly Ala Asn Asn Thr Xaa Leu Xaa Asn Val Met
545 550 555 560
Xaa Thr Xaa Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565 570 575
Gln Tyr Gly Val Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro
580 585 590
Xaa Thr Gly Xaa Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595 600 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610 615 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625 630 635 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645 650 655
Ala Asn Pro Pro Ala Xaa Phe Xaa Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660 665 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675 680 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690 695 700
Asn Tyr Ala Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Xaa Glu Gly
705 710 715 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725 730 735
Leu
<210> 18
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Arg Glu Leu Leu Phe Ser Gln
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro
20 25 30

Claims (43)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：
a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示的序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和
b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
2.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：
a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：13所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和
b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
3.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：
a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：14所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和
b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
4.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：
a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：15所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和
b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白赋予对靶细胞增加的感染性。
6.如权利要求5所述的rAAV病毒粒体，其中所述靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。
7.如权利要求5和6中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体对靶细胞的感染性相比，所述rAAV病毒粒体显示出至少5倍增加的对所述靶细胞的感染性。
8.如权利要求1至7中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中与野生型AAV血清型衣壳蛋白赋予的依赖性相比，所述变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。
9.如权利要求8所述的rAAV病毒粒体，其中与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，所述rAAV病毒粒体就感染性而言对唾液酸或硫酸肝素蛋白聚糖具有降低的依赖性。
10.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是多肽。
11.如权利要求10所述的rAAV病毒粒体，其中所述多肽是分泌的多肽。
12.如权利要求11所述的rAAV病毒粒体，其中所述分泌的多肽选自由以下组成的组：脂蛋白脂肪酶、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
13.如权利要求10所述的rAAV病毒粒体，其中所述多肽选自由以下组成的组：肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、LARGE、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺转移酶和含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。
14.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是基因组编辑基因产物。
15.如权利要求14所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因组编辑基因产物选自由以下组成的组：锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和Cas9/引导RNA系统或其组分。
16.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是核酸基因产物。
17.如权利要求16所述的rAAV病毒粒体，其中所述核酸基因产物是干扰RNA、核酶、反义核酸或适体。
18.一种药物组合物，其包含：
a)根据权利要求1至16中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体；和
b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。
19.一种将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1至17中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。
21.如权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述多肽是分泌的多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述分泌的多肽选自由以下组成的组：脂蛋白脂肪酶、因子IX和α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述多肽选自由以下组成的组：肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、LARGE、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺转移酶和含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。
25.如权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述基因产物是基因组编辑基因产物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述基因组编辑基因产物选自由以下组成的组：锌指核酸酶、TALEN和Cas9/引导RNA系统或其组分。
27.如权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述基因产物是核酸基因产物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述核酸基因产物是干扰RNA、核酶、反义核酸或适体。
29.一种包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的经分离的核酸，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。
30.如权利要求29所述的经分离的核酸，其中与包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，当所述变体衣壳蛋白存在于AAV病毒粒体中时，提供所述AAV病毒粒体对肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。
31.一种经分离的、经遗传修饰的宿主细胞，其包含如权利要求29和30中任一项所述的核酸。
32.一种变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。
33.如权利要求32所述的变体AAV衣壳蛋白，其中与包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，所述变体衣壳蛋白赋予所述肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。
34.一种产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法，所述方法包括：
使rAAV病毒粒体的初始文库在靶细胞中进行第一轮选择，
其中所述初始文库中的所述rAAV病毒粒体各自包含具有AAV衣壳蛋白氨基酸序列的初始AAV衣壳蛋白，并且其中所述AAV衣壳蛋白氨基酸序列包含祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列，所述祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列在所述祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基处彼此不同，从而产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的第二文库。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法包括：通过以下步骤确定所述祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列：
i)重构多个野生型AAV衣壳蛋白氨基酸序列的系统发生树；
ii)选择所述系统发生树的节点；和
iii)确定所述节点处最可能的氨基酸序列。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法还包括估计所述系统发生树的每个节点处的置信度值，并且所述选择步骤包括基于所述节点处估计的置信度值来选择所述系统发生树的节点。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述初始AAV衣壳蛋白具有与SEQID NO：7所示的序列至少94％相同的氨基酸序列。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括使rAAV病毒粒体的所述第二文库进行第二轮选择。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第二轮选择在与所述第一轮选择中使用的所述靶细胞相同的靶细胞类型中进行。
40.根据权利要求38和39中任一项所述的方法，其中所述第二轮选择相对于所述第一轮选择具有增加的严格性。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肌肉、上皮、皮肤、胶质细胞和人胚肾细胞。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中所述经受步骤包括：
a)用所述rAAV病毒粒体的文库感染靶细胞；
b)用辅助病毒对受感染的细胞进行超感染；和
c)收获从超感染细胞释放的rAAV病毒粒体。
43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述方法包括分离包含变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体，其中与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，所述经分离的rAAV病毒粒体具有增加的感染性、增强的向性或两者。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295151A (zh) * 2019-07-17 2019-10-01 博鑫仪器(天津)有限公司 一类腺依赖病毒病毒重组质粒、重组病毒及构建方法
CN110950934A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 复旦大学 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用
CN111909246A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 高效感染支持细胞的aav突变体
CN112041442A (zh) * 2018-02-28 2020-12-04 北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校 用于逃避抗体的病毒载体的方法和组合物
CN112226461A (zh) * 2020-08-21 2021-01-15 华侨大学 Cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
CN112424217A (zh) * 2018-05-14 2021-02-26 生物马林药物股份有限公司 肝脏靶向的腺病毒相关病毒载体
CN112566923A (zh) * 2018-06-12 2021-03-26 北卡罗来纳大学教堂山分校 合成嗜肝性腺相关病毒衣壳及其用途
WO2021073568A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
CN113121654A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 信念医药科技(上海)有限公司 新型腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的新型腺相关病毒载体
CN113121653A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 上海信致医药科技有限公司 肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白
CN113717248A (zh) * 2020-09-30 2021-11-30 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN114502575A (zh) * 2019-06-10 2022-05-13 同源药物公司 用于arsa基因转移的腺相关病毒组合物和其使用方法
CN114729384A (zh) * 2019-09-12 2022-07-08 博德研究所 工程化腺相关病毒衣壳
CN115087738A (zh) * 2019-08-29 2022-09-20 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于穿越人血脑屏障的腺相关病毒载体
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3633041A3 (en) 2013-09-26 2020-07-29 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CA2966620A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
EP3218484A4 (en) 2014-11-14 2018-05-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US10570395B2 (en) 2014-11-14 2020-02-25 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
PT3356390T (pt) 2015-09-28 2021-04-21 Univ Florida Métodos e composições para vetores virais que se evadem a anticorpos
AU2016362477A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
WO2018022905A2 (en) 2016-07-29 2018-02-01 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
JP7237843B2 (ja) 2017-02-21 2023-03-13 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． 修飾されたａａｖキャプシドタンパク質およびその使用
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
WO2018211409A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Core master regulators of glioblastoma stem cells
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
UA127455C2 (uk) 2017-09-20 2023-08-30 4Д Молекьюлар Терапьютикс Інк. Капсид аденоасоційованого вірусу і спосіб його застосування
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP3697905A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
KR20210102870A (ko) 2018-08-30 2021-08-20 테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드 미오카르딘 및 ascl1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍
WO2020068990A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 California Institute Of Technology Adeno-associated virus compositions for targeted gene therapy
WO2021007515A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
EP4010357A2 (en) * 2019-08-09 2022-06-15 University of Florida Research Foundation, Incorporated Aav capsid variants for targeting human glioblastoma cells
AU2020367532A1 (en) 2019-10-17 2022-05-12 Ginkgo Bioworks, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick disease type C
EP4103214A2 (en) 2020-02-13 2022-12-21 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
WO2021163357A2 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
AU2021230476A1 (en) 2020-03-02 2022-10-20 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed microRNAs
IL297404A (en) 2020-04-27 2022-12-01 4D Molecular Therapeutics Inc Codon-optimized gla genes and their uses
CN111560399B (zh) * 2020-05-22 2021-07-06 苏州君盟生物医药科技有限公司 细胞大规模瞬时转染方法
CN112080521B (zh) * 2020-09-07 2022-05-31 山东农业大学 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
WO2022087104A1 (en) * 2020-10-21 2022-04-28 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US20220175845A1 (en) * 2020-12-08 2022-06-09 Duke University Multicistronic mirna delivery for cardiac reprogramming
WO2023106256A1 (ja) * 2021-12-06 2023-06-15 学校法人順天堂 改変型アデノ随伴ウイルスベクター
WO2024054864A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective heart disease therapies
CN116789738B (zh) * 2022-12-08 2023-12-19 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005610A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-20 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CN103561774A (zh) * 2011-04-22 2014-02-05 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN106232618A (zh) * 2013-10-11 2016-12-14 马萨诸塞眼科耳科诊所 预测祖先病毒序列的方法及其用途

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2197145T3 (es) 1991-08-20 2004-01-01 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Deptm. Of Health And Human Services Transferencia de genes mediada por adenovirus al gastrointestinal.
GB9206016D0 (en) 1992-03-19 1992-04-29 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO1995005864A1 (en) 1993-08-27 1995-03-02 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Convection-enhanced drug delivery
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
AU2678097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
US6710036B2 (en) 1997-07-25 2004-03-23 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
AU9319198A (en) 1997-09-19 1999-04-05 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US6596539B1 (en) 1997-10-31 2003-07-22 Maxygen, Inc. Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
DE19827457C1 (de) 1998-06-19 2000-03-02 Medigene Ag Strukturprotein von AAV, seine Herstellung und Verwendung
DE69925134T2 (de) 1998-09-11 2006-01-19 The Regents Of The University Of California, La Jolla Rekombinante adenovirus für gewebespezifische genexpression ins herz
ES2340230T3 (es) 1998-11-10 2010-05-31 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores viricos y sus procedimientos de preparacion y administracion.
US6943153B1 (en) 1999-03-15 2005-09-13 The Regents Of The University Of California Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US6498244B1 (en) 1999-05-28 2002-12-24 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated virus capsid immunologic determinants
US7314912B1 (en) 1999-06-21 2008-01-01 Medigene Aktiengesellschaft AAv scleroprotein, production and use thereof
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
DE19933719A1 (de) 1999-07-19 2001-01-25 Medigene Ag Strukturprotein in Adeno-assoziiertem Virus mit veränderten chromatographischen Eigenschaften, seine Herstellung und Verwendung
US8232081B2 (en) 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
IL140110A0 (en) 2000-12-05 2002-02-10 Applied Research Systems Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
US7647184B2 (en) 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
US20030129203A1 (en) 2001-08-27 2003-07-10 Nautilus Biotech S.A. Mutant recombinant adeno-associated viruses
WO2003042361A2 (en) 2001-11-09 2003-05-22 Government Of The United States Of America, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
CN103555678B (zh) 2001-11-13 2018-02-09 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
US20050106558A1 (en) 2001-12-21 2005-05-19 Luca Perabo Library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
AU2003221733A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
AU2003237159A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 University Of Florida Treatment for phenylketonuria
WO2003092594A2 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US7254489B2 (en) 2002-05-31 2007-08-07 Microsoft Corporation Systems, methods and apparatus for reconstructing phylogentic trees
WO2004020600A2 (en) 2002-08-28 2004-03-11 University Of Florida Modified aav
WO2004083441A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Random peptide library displayed on aav vectors
WO2004108922A2 (en) 2003-04-25 2004-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
JP2007524386A (ja) 2003-06-19 2007-08-30 アビジェン， インコーポレイテッド 減少した免疫反応性を有するａａｖビリオン、およびその使用
JP2007524622A (ja) 2003-06-23 2007-08-30 エイアンドジー ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 抗癌治療に対する腫瘍細胞の感受性を回復させてアポトーシスを誘導するための組成物及び方法
GB0314856D0 (en) 2003-06-25 2003-07-30 Unitargeting Res As Protein expression system
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US8106180B2 (en) 2003-08-07 2012-01-31 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products for expression of micro RNAs
US20050142581A1 (en) 2003-09-04 2005-06-30 Griffey Richard H. Microrna as ligands and target molecules
CA2539947A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Igf-1 instructs multipotent adult cns neural stem cells to an oligodendroglial lineage
ES2874298T3 (es) 2003-09-30 2021-11-04 Univ Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
US20050266552A1 (en) 2003-12-05 2005-12-01 Doench John G Reagents and methods for identification of RNAi pathway genes and chemical modulators of RNAi
KR100614827B1 (ko) 2004-05-06 2006-08-25 재단법인서울대학교산학협력재단 양방향 은닉 마코프 모델을 이용한 완숙한마이크로알엔에이 위치예측방법 및 이를 구현하기 위한컴퓨터 프로그램을 기록한 저장매체
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
JP5136766B2 (ja) 2004-12-15 2013-02-06 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル キメラベクター
WO2006101634A1 (en) 2005-02-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of California Müller cell specific gene therapy
DK2359867T3 (en) 2005-04-07 2015-01-05 Univ Pennsylvania A method for increasing an AAV vector function
WO2006128063A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Irm Llc Methods and compositions for inhibiting glioma growth
US8119766B2 (en) 2005-06-02 2012-02-21 University Of Iowa Research Foundation Increasing functional glycosylation of alpha-dystroglycan in the treatment of muscle degeneration
WO2007089632A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
AU2007244826B2 (en) 2006-04-25 2013-04-11 The Regents Of The University Of California Administration of growth factors for the treatment of CNS disorders
US8470790B2 (en) 2006-05-04 2013-06-25 Wayne State University Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids
ATE553206T1 (de) 2006-08-24 2012-04-15 Virovek Inc Expression von genen mit überlappenden offenen leserastern in insektenzellen, verfahren und zusammensetzungen dafür
CN1966082B (zh) 2006-11-03 2010-06-30 许瑞安 一种防治结直肠癌的基因药物及其制备方法和用途
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
SI2147096T1 (sl) 2007-04-13 2015-07-31 Catalyst Biosciences, Inc., Modificirani polipeptidi faktorja VII in njihove uporabe
EP1985708B1 (en) 2007-04-27 2015-04-15 Universität Rostock Selective targeting of viruses to neural precursor cells
WO2009039442A1 (en) 2007-09-21 2009-03-26 California Institute Of Technology Nfia in glial fate determination, glioma therapy and astrocytoma treatment
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
EP2315833B8 (en) 2008-05-20 2015-05-27 Eos Neuroscience, Inc. Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
WO2009151539A1 (en) 2008-05-24 2009-12-17 Sirnaomics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS
US20110171262A1 (en) 2008-06-17 2011-07-14 Andrew Christian Bakker Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region
ES2634118T3 (es) 2009-02-11 2017-09-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de virus modificados y métodos para fabricar y utilizar los mismos
CN101532024A (zh) 2009-04-30 2009-09-16 许瑞安 一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US20110059114A1 (en) 2009-08-05 2011-03-10 Duke University Compositions and Methods for the Treatment of Radioresistant Glioma Stem Cells
EP2550021A2 (en) 2010-03-22 2013-01-30 Association Institut de Myologie Methods of increasing efficiency of vector penetration of target tissue
WO2011134023A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 The University Of Queensland Inhibition of glioma
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US9169299B2 (en) 2011-08-24 2015-10-27 The Board Of Trustees Of The Leleand Stanford Junior University AAV capsid proteins for nucleic acid transfer
US9260755B2 (en) 2012-04-11 2016-02-16 University Of Massachusetts Compositions and methods for characterizing and treating muscular dystrophy
US9677088B2 (en) 2012-05-09 2017-06-13 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
TWI702955B (zh) 2012-05-15 2020-09-01 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒（ａａｖ）ｓｆｌｔ-１治療老年性黃斑部退化（ａｍｄ）
PE20190844A1 (es) 2012-05-25 2019-06-17 Emmanuelle Charpentier Modulacion de transcripcion con arn de direccion a adn generico
JP6363958B2 (ja) 2012-12-25 2018-07-25 タカラバイオ株式会社 Ａａｖ変異体
EP3004339B1 (en) 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
JP6600624B2 (ja) 2013-05-31 2019-10-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
EP3633041A3 (en) 2013-09-26 2020-07-29 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
RS62078B1 (sr) 2014-05-02 2021-07-30 Genzyme Corp Aav vektori za gensku terapiju mrežnjače i cns
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
BR112017018846A2 (pt) 2015-03-02 2018-07-31 Adverum Biotechnologies, Inc. composições e métodos para entrega intravítrea de polinucleotídeos a cones retinianos.
HUE051491T2 (hu) * 2015-03-06 2021-03-01 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Gén-augmentációs terápiák a PRPF31 gén mutációi által okozott öröklött retina degenerációra
US20190000940A1 (en) 2015-07-31 2019-01-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of aadc deficiency
UA124343C2 (uk) * 2016-05-13 2021-09-01 4Д Молекьюлар Терапьютікс Інк. Капсиди аденоасоційованого вірусу і спосіб його використання

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005610A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-20 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CN103561774A (zh) * 2011-04-22 2014-02-05 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
CN106232618A (zh) * 2013-10-11 2016-12-14 马萨诸塞眼科耳科诊所 预测祖先病毒序列的方法及其用途

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112041442A (zh) * 2018-02-28 2020-12-04 北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校 用于逃避抗体的病毒载体的方法和组合物
CN112424217A (zh) * 2018-05-14 2021-02-26 生物马林药物股份有限公司 肝脏靶向的腺病毒相关病毒载体
CN112566923A (zh) * 2018-06-12 2021-03-26 北卡罗来纳大学教堂山分校 合成嗜肝性腺相关病毒衣壳及其用途
CN111909246B (zh) * 2019-05-08 2024-01-19 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 高效感染支持细胞的aav突变体
CN111909246A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 高效感染支持细胞的aav突变体
CN114502575A (zh) * 2019-06-10 2022-05-13 同源药物公司 用于arsa基因转移的腺相关病毒组合物和其使用方法
CN110295151A (zh) * 2019-07-17 2019-10-01 博鑫仪器(天津)有限公司 一类腺依赖病毒病毒重组质粒、重组病毒及构建方法
CN115087738A (zh) * 2019-08-29 2022-09-20 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于穿越人血脑屏障的腺相关病毒载体
CN114729384A (zh) * 2019-09-12 2022-07-08 博德研究所 工程化腺相关病毒衣壳
CN113518824A (zh) * 2019-10-16 2021-10-19 上海药明康德新药开发有限公司 新的aav变体
CN113518824B (zh) * 2019-10-16 2024-02-23 上海药明康德新药开发有限公司 新的aav变体
WO2021073568A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
CN110950934A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 复旦大学 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用
CN110950934B (zh) * 2019-12-31 2022-11-04 复旦大学 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用
CN112226461A (zh) * 2020-08-21 2021-01-15 华侨大学 Cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
CN112226461B (zh) * 2020-08-21 2022-04-22 华侨大学 Cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
CN113754727A (zh) * 2020-09-30 2021-12-07 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN113717248A (zh) * 2020-09-30 2021-11-30 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN113121654A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 信念医药科技(上海)有限公司 新型腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的新型腺相关病毒载体
CN113121654B (zh) * 2021-04-19 2023-11-17 信念医药科技(上海)有限公司 腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的腺相关病毒载体
CN113121653A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 上海信致医药科技有限公司 肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017012097A (es) 2018-06-15
EP3277819A4 (en) 2018-09-05
EP3277819A1 (en) 2018-02-07
HK1246355A1 (zh) 2018-09-07
WO2016154344A1 (en) 2016-09-29
JP6836999B2 (ja) 2021-03-03
CA2979065A1 (en) 2016-09-29
AU2016235163B2 (en) 2022-03-24
US10883117B2 (en) 2021-01-05
EP3277819B1 (en) 2021-03-03
JP2018514190A (ja) 2018-06-07
AU2016235163A1 (en) 2017-10-05
US20180066285A1 (en) 2018-03-08
US20210147876A1 (en) 2021-05-20
ES2860712T3 (es) 2021-10-05

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