JP2002516092A

JP2002516092A - Ａａｖ５ベクターおよびその使用

Info

Publication number: JP2002516092A
Application number: JP2000550986A
Authority: JP
Inventors: ジョンエイ．チオリニ，; ロバートエム．コティン，
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2002-06-04
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: AU4220599A; WO1999061601A3; EP1082413B1; US7479554B2; WO1999061601A2; WO1999061601A9; CA2329060C; JP2007209347A; JP4191771B2; CA2329060A1; EP1082413A2; JP4060531B2; CA2745131C; ES2313784T3; US20050255089A1; CA2745131A1; DE69939169D1; AU762220B2; ATE402254T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）ウイルスならびに、それに由来するベクターおよび粒子を提供する。さらに、本発明は、ＡＡＶ５ベクターおよび粒子を使用して細胞に核酸を送達する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、１９９８年５月２８日出願の米国仮出願第６０／０８７０２９号に対
する優先権を主張する。この第６０／０８７０２９号仮特許出願は、その全文が
参考として本明細書中に援用される。

【０００２】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、アデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）およびそれに由来するベクター
を提供する。従って、本発明は、被験体の細胞に核酸を送達するためのＡＡＶ５
ベクターおよび被験体の細胞に核酸を送達する方法に関する。

【０００３】（背景技術）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小型の非病原性ウイル
スである（概説については２８を参照のこと）。ＡＡＶは、複製についてのその
ヘルパーウイルス依存性によって、この科の他のメンバーと異なる。ヘルパーウ
イルスが存在しない場合、ＡＡＶは、遺伝子座特異的な様式で、第１９染色体の
ｑアームへと組み込むことが示されている（２１）。ＡＡＶの約５ｋｂのゲノム
は、＋または−いずれかの極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。物
理的には、パルボウイルスビリオンは、エンベロープで包まれず、そしてその正
二十面体キャプシドは、直径約２０〜２５ｎｍである。

【０００４】今日までに、血清学的に異なる８つのＡＡＶが同定されている。そして６つが
ヒトまたは霊長類から単離され、かつＡＡＶ１〜６型と呼ばれている（１）。こ
れらの単離体のうち最も広範に研究されたのは、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）である
。ＡＡＶ２のゲノムは、長さ４６８０ヌクレオチドであり、そして２つのオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（右のＯＲＦおよび左のＯＲＦ）を含む。左
のＯＲＦは、非構造的Ｒｅｐタンパク質である、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅ
ｐ６８およびＲｅｐ７８をコードし、これらは複製および転写の調節、さらに一
本鎖子孫ゲノムの生成に関与する（５〜８、１１、１２、１５、１７、１９、２
１〜２３、２５、３４、３７〜４０）。さらに、Ｒｅｐタンパク質のうちの２つ
が、ヒト第１９染色体のｑアームの領域へのＡＡＶゲノムの優先的組み込みに関
係している。Ｒｅｐ６８／７８もまた、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡヘリカー
ゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性を保有することが示されている。Ｒｅｐタン
パク質は、核局在化シグナルならびにいくつかの潜在的リン酸化部位を保有する
。これらのキナーゼ部位のうちの１つの変異は、複製活性の損失を生じた。

【０００５】ゲノムの末端は、短い逆方向末端反復であり、この反復は、Ｔ型ヘアピン構造
へと折り畳まれ、ウイルスＤＮＡ複製の起点として作用する能力を有する。この
ＩＴＲ（逆方向末端反復）領域内において、ＩＴＲの機能に重要である２つのエ
レメント（ＧＡＧＣ反復モチーフおよび末端解離部位（ＴＲＳ））が記載されて
いる。この反復モチーフは、ＩＴＲが直線またはヘアピンいずれかの立体構造で
ある場合に、Ｒｅｐと結合することが示されている（７、８、２６）。

【０００６】この結合は、切断のためにＲｅｐ６８／７８をＴＲＳに配置するように作用し
、部位特異的かつ鎖特異的様式で生じる。複製におけるその役割に加えて、これ
ら２つのエレメントは、ウイルス組み込みに対して重要であるようである。第１
９染色体組み込み遺伝子座に含まれるのは、隣接するＴＲＳを伴うＲｅｐ結合部
位である。これらのエレメントは、遺伝子座特異的組み込みにとって機能的かつ
必要であることが示されている。

【０００７】ＡＡＶ２ビリオンは、エンベロープでつつまれない、正二十面体粒子（直径約
２０〜２５ｎｍ）である。そのキャプシドは、３つの関連タンパク質（ＶＰ１、
２、および３と呼ばれる）から構成され、これらは右のＯＲＦにコードされてい
る。これらのタンパク質は、それぞれ１：１：１０の比であることが見出されて
いる。このキャプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび珍しい開始コ
ドンの使用により、互いに異なる。欠失分析により、選択的にスプライシングさ
れたメッセージから翻訳されたＡＡＶ２ＶＰ１の除去または変化は、感染生粒
子の産生量の減少を生じることが、示された（１５、１６、３８）。ＶＰ３コー
ド領域内での変異は、いかなる一本鎖子孫ＤＮＡも感染性粒子も生成できなくす
る（１５、１６、３８）。

【０００８】特徴付けられたＡＡＶの以下の特徴により、ＡＡＶは遺伝子移入のための魅力
的なベクターとなっている（１６）。ＡＡＶベクターは、インビトロで細胞のゲ
ノムに安定に組み込まれ；広い宿主域を有し；インビトロおよびインビボで、分
裂中の細胞および分裂中でない細胞両方に形質導入（１３、２０、３０、３２）
して高レベルの形質導入遺伝子の発現を維持する（４１）ことが示されている。
ウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨ変化、温度変化に耐
性であり、そしてＣｓＣｌ勾配により濃縮され得る（１、２）。ＡＡＶプロウイ
ルスの組み込みは、細胞増殖または細胞分化に対するいかなる長期の負の効果と
も関連がない（３、４２）。ＩＴＲは、複製、パッケージングおよび組み込みに
必要とされる唯一のシスエレメントであり（３５）、そしていくつかのプロモー
ター活性を含み得る（１４）ことが示されている。

【０００９】ＡＡＶ２は、適切なヘルパーウイルスが存在する条件で、霊長類細胞型および
非霊長類細胞型に感染すると、元来考えられていた。しかし、ＡＡＶ２が特定の
細胞型に感染できないことは、ＡＡＶ２ウイルスにより提示される特定の細胞親
和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）に帰因することが現在知られている。最近の研究により
、いくつかの細胞株が、ＡＡＶ２によって非常に乏しくしか形質導入されないと
いうことが示された（３０）。結合研究により、硫酸ヘパリンプロテオグリカン
が、ＡＡＶ２を用いる高効率の形質導入に必要であることが示された。ＡＡＶ５
は、パルボウイルスの独特のメンバーである。本発明のＤＮＡハイブリダイゼー
ションデータは、公開されたＡＡＶ１〜４配列（３１）との低レベルの相同性を
示す。本発明は、ＡＡＶ２と異なり、ＡＡＶ５形質導入は、ＡＡＶ２形質導入が
ヘパリンによってもたらされるようには、ヘパリンによりもたらされないこと、
従って、ＡＡＶ２と同じ細胞型に対して拘束されないことを示す。

【００１０】本発明は、ＡＡＶ５ウイルスを含むベクター、またはこのウイルスのサブパー
ト（ｓｕｂｐａｒｔ）を含むベクター、ならびにＡＡＶ５ウイルス粒子を提供す
る。ＡＡＶ５は、ＡＡＶ２と類似しているが、この２つのウイルスは、物理的お
よび遺伝学的に異なることが、本明細書中で見出される。これらの差異は、ＡＡ
Ｖ５にいくつかの独特の特性および利点を付与し、これらによりＡＡＶ５は、遺
伝子治療のためのベクターとしてより適する。例えば、ＡＡＶ２を遺伝子治療の
ためのベクターとして使用することの制限的特徴の１つは、大量のウイルスの生
成である。標準的生成技術を使用して、ＡＡＶ５は、ＡＡＶ２と比較して１０〜
５０倍高いレベルで生成される。その独特のＴＲＳ部位およびｒｅｐタンパク質
が原因で、ＡＡＶ５はまた、ＡＡＶ２と比較して異なる組み込み遺伝子座を有す
るはずである。

【００１１】さらに、本明細書中に示されるように、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、ま
た驚くべきことに、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と異なり、そして異なる組織
親和性を提示し、これによりＡＡＶ５キャプシド含有粒子は、ＡＡＶ２が適しな
いかまたは十分には適していない細胞型に形質導入するのに適切である。ＡＡＶ
２およびＡＡＶ５は、血清学的に異なることが示されており、従って、遺伝子治
療適用において、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ５由来のベクターにより、すでにＡＡ
Ｖ２に対する中和抗体を保有する患者（天然の免疫学的防御の結果としてかまた
は以前のＡＡＶ２ベクターへの曝露からかのいずれか）の形質導入が可能である
。ＡＡＶ５の別の利点は、ＡＡＶ５は、他の血清型によりレスキューされ得ない
ことである。ＡＡＶ５のみが、組み込まれたＡＡＶ５ゲノムをレスキューし得、
そして複製をもたらし得、それにより他のＡＡＶ血清型により生じるＡＡＶ５の
意図されない複製を避け得る。従って、本発明は、これらの新規な組換えベクタ
ーおよびＡＡＶ５に基く粒子を提供することにより、新規かつ非常に有用な一連
のベクターを提供する。

【００１２】（発明の要旨）本発明は、一対のアデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）逆方向末端反復およびそ
の逆方向末端反復間のプロモーターを含む核酸ベクターを提供する。

【００１３】本発明は、一対のＡＡＶ２逆方向末端反復を含むベクターを含むＡＡＶ５粒子
をさらに提供する。

【００１４】さらに、本発明は、配列番号１（ＡＡＶ５ゲノム）に示されるヌクレオチド配
列を含む単離された核酸を提供する。さらに、本発明は、本質的に配列番号１（
ＡＡＶ５ゲノム）に示されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸を提供す
る。

【００１５】本発明は、ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質をコードする単離された核酸（例えば、
配列番号１０に示される核酸）を提供する。さらに、単離された全長ＡＡＶ５Ｒ
ｅｐタンパク質またはその独特のフラグメントが、提供される。さらに、配列番
号１２に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐ４０タンパク
質、またはその独特のフラグメントが、提供される。さらに、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列を有する単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐ５２タンパク質、またはそ
の独特のフラグメントが、提供される。さらに、配列番号１４に示されるアミノ
酸配列を有する単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐ６８タンパク質、またはその独特のフ
ラグメントが、提供される。さらに、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有す
る単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐ７８タンパク質、またはその独特のフラグメントが
、提供される。これらのタンパク質の配列は、以下の配列表およびタンパク質が
記載される本出願の他の部分において提供される。

【００１６】本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＡＡＶ５キ
ャプシドタンパク質（ＶＰ１）、またはその独特のフラグメントをさらに提供す
る。さらに、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＡＡＶ５キ
ャプシドタンパク質（ＶＰ２）、またはその独特のフラグメントが、提供される
。また、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＡＡＶ５キャプ
シドタンパク質（ＶＰ３）、またはその独特のフラグメントが、提供される。

【００１７】本発明は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質をコードする単離された核酸（例え
ば、配列番号７に示される核酸）、またはその独特のフラグメントをさらに提供
する。

【００１８】本発明は、本質的に配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるキャプシドタ
ンパク質を含むＡＡＶ５粒子、またはその独特のフラグメントをさらに提供する
。

【００１９】さらに、本発明によって、配列番号１８に示される核酸配列を有するＡＡＶ５
ｐ５プロモーターを含む単離された核酸、またはその独特のフラグメントが、提
供される。

【００２０】本発明は、細胞をＡＡＶ５による感染性についてスクリーニングする方法を提
供する。この方法は、この細胞とＡＡＶ５とを接触する工程およびこの細胞中の
ＡＡＶ５の存在を検出する工程を包含する。

【００２１】本発明は、核酸を細胞に送達する方法をさらに提供する。この方法は、一対の
ＡＡＶ逆方向末端反復間に挿入された核酸を含むベクターを含むベクターを含む
ＡＡＶ５粒子をこの細胞に投与し、それによってこの核酸をこの細胞に送達する
工程を包含する。

【００２２】本発明はまた、核酸を被験体に送達する方法を提供する。この方法は、一対の
ＡＡＶ逆方向末端反復間に挿入された核酸を含むＡＡＶ５粒子をこの被験体由来
の細胞に投与し、そしてこの細胞をこの被験体に戻し、それによってこの核酸を
この被験体に送達する工程を包含する。

【００２３】本発明はまた、核酸を被験体中の細胞に送達する方法を提供する。この方法は
、一対のＡＡＶ逆方向末端反復間に挿入された核酸を含むＡＡＶ５粒子をこの被
験体に投与し、それによってこの核酸をこの被験体中の細胞に送達する工程を包
含する。

【００２４】本発明は、核酸をＡＡＶ２に対する抗体を有する被験体中の細胞に送達する方
法をさらに提供する。この方法は、核酸を含むＡＡＶ５粒子をこの被験体に投与
し、それによってこの核酸をこの被験体中の細胞に送達する工程を包含する。

【００２５】（発明の詳細な説明）明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」は、使用される
状況に依存して、１またはそれ以上を意味し得る。用語「有する」および「含む
（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして開放
端の意味を示す。

【００２６】本出願は、組換えアデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）を提供する。このウイル
スは、以下に記載される１つ以上の特徴を有する。本発明の組成物は、野生型Ａ
ＡＶ５を含まない。本発明の方法は、野生型ＡＡＶ５かまたは組換えＡＡＶ５ベ
ースの送達のいずれかを使用し得る。

【００２７】本発明は、ＡＡＶ５粒子、組換えＡＡＶ５ベクター、組換えＡＡＶ５ビリオン
および新規なＡＡＶ５核酸ならびにポリペプチドを提供する。ＡＡＶ５粒子は、
ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ５ベク
ターは、ＡＡＶ５の少なくとも１つの独特の核酸を含む核酸構築物である。組換
えＡＡＶ５ビリオンは、組換えＡＡＶ５ベクターを含む粒子である。ここで、こ
の粒子は、本明細書中で記載されるようなＡＡＶ５粒子か、または非ＡＡＶ５粒
子のいずれかであり得る。あるいは、組換えＡＡＶ５ビリオンは、組換えベクタ
ーを含むＡＡＶ５粒子である。ここで、このベクターは、本明細書中で記載され
るようなＡＡＶ５ベクターか、または非ＡＡＶ５ベクターのいずれかであり得る
。これらのベクター、粒子、ビリオン、核酸およびポリペプチドは、以下で記載
される。

【００２８】本発明は、ＡＡＶ５ゲノムのヌクレオチド配列ならびにそれら由来のベクター
および粒子を提供する。詳細には、本発明は、一対のＡＡＶ５逆方向末端反復（
ＩＴＲ）を含む核酸ベクターおよび逆方向末端反復間のプロモーターを提供する
。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５のｒｅｐタンパク質が２型ＩＴＲまたは５型ＩＴＲの
いずれかに結合する一方、効率的なゲノム複製は、２型Ｒｅｐが２型ＩＴＲを複
製し、そして５型Ｒｅｐが５型ＩＴＲを複製する場合にのみ生じる。この特異性
は、複製に必要である２つのＲｅｐのＤＮＡ切断特異性の差異から生じる。ＡＡ
Ｖ５Ｒｅｐは、ＣＧＧＴ＾ＧＴＧＡ（配列番号２１）で切断し、そしてＡＡＶ２
Ｒｅｐは、ＣＧＧＴ＾ＴＧＡＧ（配列番号２２）で切断する（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ
ら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）４２９３〜４２９８）。ＡＡＶ５Ｉ
ＴＲ末端分解部位（ＴＲＳ）のマッピングは、この別個の切断部位、ＣＧＧＴ＾
ＧＴＧＡを同定し、これは、他のＡＡＶ血清型のＩＴＲにはない。従って、ＡＡ
Ｖ５とＡＡＶ２とを区別するために必要な最小の配列は、ＴＲＳ部位であり、こ
こでＲｅｐは、ウイルスを複製するために切断する。５型ＩＴＲの例は、配列番
号１９および配列番号２０（それぞれ、ＡＡＶ５ＩＴＲ「フリップ」およびＡＡ
Ｖ５「フロップ」）において示される。いずれかの配向のＩＴＲにおける少数の
改変が企図され、そしてこれは、本明細書中に記載されそして当該分野で公知の
ＡＡＶ５ＩＴＲによって形成されるヘアピン構造を妨害しない。さらに、用語「
ＡＡＶ５ＩＴＲ」において考慮されるように、このヌクレオチド配列は、ＡＡＶ
５ＩＴＲと他の血清型のＩＴＲとを区別する、本明細書中に記載される１つ以上
の特徴を保持しなければならない。例えば、これは、本明細書中に記載されるＲ
ｅｐ結合部位を保持しなければならない。

【００２９】ＡＡＶ５ＩＴＲのＤ−領域（配列番号２３）（ＩＴＲの一本鎖領域、ＴＲＳ部
位のインボード）は、そのリン酸化状態が、一本鎖ゲノムからウイルスＤＮＡの
発現を可能にする転写的に活性形態へのＡＡＶの変換に相関することに依存する
因子に結合することが示されている。この領域は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ
４、およびＡＡＶ６の間で保存されているが、ＡＡＶ５では異なる。Ｄ＋領域は
、Ｄ−領域の逆方向相補物である。

【００３０】プロモーターは、公知の考慮（例えば、プロモーターに機能的に連結される核
酸の発現レベルおよびベクターが使用される細胞型）によって選択される、任意
の所望のプロモーターであり得る。すなわち、プロモーターは、組織／細胞特異
的であり得る。プロモーターは、原核生物、真核生物、真菌、核、ミトコンドリ
ア、ウイルスまたは植物プロモーターであり得る。プロモーターは、ベクターに
よって形質導入される細胞型に対して外因性であり得るか、または内因性であり
得る。プロモーターとしては、例えば、細菌プロモーター、公知の強力なプロモ
ーター（例えば、ＳＶ４０もしくは誘導性のメタロチオネインプロモーター）、
またはＡＡＶプロモーター（例えば、ＡＡＶｐ５プロモーター）が挙げられ得る
。さらに、標的された遺伝子発現のためのキメラ調節プロモーターが利用され得
る。これらの調節系の例（当該分野で公知である）は、ｔｅｔトランスアクチベ
ータータンパク質（ｔＴＡ）を利用するテトラサイクリンベースの調節系、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのｔｅｔレプレッサに融合されるＶＰ１６活性化
ドメインを含むキメラタンパク質、ＩＰＴＧベースの調節系、ＣＩＤベースの調
節系、およびＥｃｄｙｓｏｎｅベースの調節系が挙げられる（４４）。他のプロ
モーターとしては、アクチン遺伝子由来のプロモーター、免疫グロブリン遺伝子
、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス
、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター
、誘導性熱ショックプロモーター、ＲＳウイルス、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）など）が挙げられる。詳細には、プロモーターは、ＡＡＶ２ｐ５プロモータ
ーまたはＡＡＶ５ｐ５プロモーターであり得る。より詳細には、対応するＡＡＶ
２の公開された配列におけるＡＡＶ２ｐ５プロモーターのように、ＡＡＶ５ｐ５
プロモーターは、配列番号１においてほぼ同じ位置であり得る。さらに、ｐ５プ
ロモーターは、配列番号１のヌクレオチド１〜１３０によって増強され得る。さ
らに、プロモーター活性を保持するｐ５プロモーターのより小さなフラグメント
は、標準的手順（例えば、ｐ５プロモーターにおける一連の欠失の構築、レポー
ター遺伝子への欠失の結合、およびレポーター遺伝子が発現される（すなわち、
転写および／または翻訳される）か否かの決定）によって容易に決定され得る。
プロモーターは、任意のＡＡＶ血清型のプロモーターであり得、そしてｐ１９プ
ロモーター（配列番号１６）、または配列番号１７として配列表に示されるｐ４
０プロモーターであり得る。

【００３１】本明細書中で開示される任意のヌクレオチド配列における任意の誤差が、例え
ば、記載される配列由来の種々のプローブを用いて、以下に記載されるハイブリ
ダイゼーション手順を使用することによって補正され得、その結果、そのコード
配列が、再び単離され得、そして再配列決定され得ることは、認識されるべきで
ある。点変異のための迅速なスクリーニングもまた、ポリメラーゼ鎖反応−一本
鎖コンホメーション多型性（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）の使用によって達成され得る（
４３）。次いで、対応するアミノ酸配列は、結果的に補正され得る。

【００３２】本発明のＡＡＶ５由来のベクターは、プロモーターに機能的に連結される異種
核酸をさらに含み得る。「異種核酸」とは、任意の異種核酸または外因性核酸（
すなわち、野生型ＡＡＶ５において通常見出されない）が、細胞、組織または生
物への移入のためにベクターへ挿入され得ることを意味する。「機能的に連結さ
れる」とは、プロモーターが、当該分野で公知である異種核酸の発現を促進し得
、そして異種核酸に対してプロモーターの適切な配向を含み得ることを意味する
。さらに、異種核酸は、好ましくは、核酸の発現のために、全ての適切な配列を
有する。核酸は、例えば、エンハンサーのような発現制御配列、および必要な情
報をプロセシングする部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部
位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列）を含み得る。

【００３３】異種核酸は、ベクターが移入される細胞または被験体によって必要とされる欠
失タンパク質または欠損タンパク質に置換する有益なタンパク質またはポリペプ
チドをコードし得るか、または例えば、癌細胞もしくは他の細胞（その死が被験
体に有益である）に指向され得る細胞傷害性ポリペプチドをコードし得る。異種
核酸はまた、被験体によって作製される有害なタンパク質をコードするｍＲＮＡ
に結合し得、そしてそれによって不活化するアンチセンスＲＮＡをコードし得る
。異種核酸はまた、ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害をもたら
し得るリボザイムをコードし得る。１つの実施態様において、アンチセンスポリ
ヌクレオチドは、ＡＡＶ５ベクター構築物において異種発現カセットから産生さ
れ得る。ここで、発現カセットは、細胞特異的発現を促進する配列を含む（Ｗｉ
ｒａｋら、ＥＭＢＯ１０：２８９（１９９１））。アンチセンスポリヌクレオ
チドに関する一般的方法については、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡａｎｄＤ
ＮＡ、Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）
を参照のこと。

【００３４】本発明のＡＡＶ５ベクターの一部として細胞または被験体に投与され得る異種
核酸の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：分泌タンパク質
および非分泌タンパク質をコードする核酸、治療用薬剤をコードする核酸（例え
ば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ−α）；インターフェロン（例え
ば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−
γ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、およびＩＬ−２〜Ｉ
Ｌ−１４）；ＧＭ−ＣＳＦ；アデノシンデアミナーゼ；細胞性増殖因子（例えば
、リンホカイン）；可溶性ＣＤ４；第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；Ｔ細胞レセプ
ター；ＬＤＬレセプター；ＡｐｏＥ；ＡｐｏＣ；α−１アンチトリプシン；オル
ニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）；嚢胞性線維症膜貫通レセプター（Ｃ
ＦＴＲ）；インスリン；抗体の抗原結合ドメインに対するＦｃレセプター（例え
ば、免疫グロブリン）；抗ＨＩＶデコイｔａｒ（ｄｅｃｏｙｔａｒ）エレメン
ト；およびウイルス複製を阻害するアンチセンス配列（例えば、Ｂ型肝炎ウイル
スまたは非Ａ型肝炎ウイルス、非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害する））。核酸
は、いくつかの因子（トランスフェクトされるべき細胞を含む）を考慮して選択
される。標的細胞が血球である場合、例えば、使用のために特に有用な核酸は、
血球が治療的効果を及ぼすことを可能にする核酸（例えば、血友病の処置におけ
る使用のための、凝固因子をコードする遺伝子）である。別の標的細胞は肺気道
細胞であり、これは、核酸（例えば、線維症膜貫通レセプターをコードする核酸
）を投与するために使用され得る。これは、嚢胞性線維症の遺伝子治療的処置を
提供し得る。他の標的細胞は、筋肉細胞を含み、ここで有用な核酸（例えば、サ
イトカインおよび増殖因子をコードする核酸）が形質導入され、そしてこの核酸
がコードするタンパク質は、他の細胞、組織および器官（例えば、肝臓）に対し
て効果を及ぼすために発現および分泌され得る。さらに、核酸は、１つ以上の遺
伝子産物をコードし得、核酸がパッケージされ得る核酸のサイズによって、キャ
プシドにパッケージされるべきである場合のみ限定される。

【００３５】さらに、適切な核酸は、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）細胞（例えば、血球）へ移入
された場合、移入された細胞がその細胞の存在が有益である身体中の部位を標的
にするようにする核酸を含み得る。例えば、ＴＩＬ細胞のような血球は、例えば
、細胞へのモノクローナル抗体のＦａｂ部分の移入によって改変されて、選択さ
れた抗原を認識し得る。別の例は、腫瘍細胞へ治療的血球を標的する核酸を導入
することである。癌細胞を治療することにおいて有用な核酸としては、特定の部
位で炎症応答を生じ、それによって治療的効果を有する、化学走性因子をコード
する核酸が挙げられる。

【００３６】細胞、特にそれらへ移入されるこのような核酸を有する血球、筋肉細胞、気道
上皮細胞、脳細胞および内皮細胞は、種々の疾患、症候群および状態において有
用である。例えば、適切な核酸としては、可溶性ＣＤ４（ＡＩＤＳの処置におい
て使用される）およびα−アンチトリプシン（α−アンチトリプシン欠損によっ
て生じる気腫の処置において使用される）をコードする核酸が挙げられる。この
ような細胞が有用であり得る他の疾患、症候群および状態としては、例えば、ア
デノシンデアミナーゼ欠損、鎌状赤血球欠損、脳障害（例えば、アルツハイマー
病）、サラセミア、血友病、糖尿病、フェニルケトン尿症、増殖障害および心臓
疾患（例えば、コレステロール代謝における変化によって生じる疾患）、および
免疫系の欠損が挙げられ得る。

【００３７】別の例として、肝細胞は、肝臓疾患を処置するために有用な核酸を有する本発
明のベクターを用いてトランスフェクトされ得る。例えば、ＯＴＣをコードする
核酸を使用して肝細胞をトランスフェクトして（エキソビボで、そして肝臓に戻
されるか、またはインビボで）、先天性高アンモニア血症（ＯＴＣにおける遺伝
した欠損によって生じる）を処置し得る。別の例は、エキソビボまたはインビボ
で肝細胞を標的して、遺伝したＬＤＬレセプター疾患を処置するために、ＬＤＬ
をコードする核酸を使用することである。このようなトランスフェクトされた肝
細胞はまた、後天性の感染疾患（例えば、ウイルス感染から生じる疾患）を処置
するために使用され得る。例えば、形質導入された肝細胞前駆体は、例えば、ウ
イルス複製を阻害するアンチセンスＲＮＡをコードする核酸を用いて肝細胞前駆
体を形質導入することによって、ウイルス肝炎（例えば、Ｂ型肝炎および非Ａ型
肝炎、非Ｂ型肝炎）処置するために使用され得る。別の例としては、肝炎ウイル
スに対する耐性を付与し得るα−インターフェロンのようなタンパク質をコード
する核酸を有する本発明のベクターを移入することが挙げられる。

【００３８】トランスフェクトした肝細胞または肝細胞前駆体を使用する手順のために、本
発明のベクターを移入されて有する肝細胞前駆体が、組織培養容器から取り出さ
れた組織培養物中で増殖され、そして例えば、外科的方法によって体内に導入さ
れ得る。この実施例において、その組織は、移植組織または移植片として、その
肝臓へ直接か、または肝臓の近くの体腔へと配置される。あるいは、その細胞は
、肝臓へと、門脈循環系へと、または脾臓へと単に直接注入され得、そこから、
その細胞が肝臓へと循環系を介して移送され得る。さらに、その細胞が、マイク
ロキャリアビーズのような支持体に結合され得、次いでそれは腹腔へと注射など
によって導入され得る。一旦、その細胞が、どんな手段によってであれ、肝臓に
存在するようになると、次いで、その細胞は、核酸を発現し、そして／またはそ
の核酸を発現し得る成熟肝細胞へと分化し得る。

【００３９】ＡＡＶ５由来のベクターは、ＩＴＲおよびプロモーターに加えて、任意の通常
に存在するＡＡＶ５配列を含み得る。ベクター構築物の例を、以下に提供する。

【００４０】本発明のベクターまたはＡＡＶ５粒子または組換えＡＡＶ５ビリオンは、これ
らの本発明のＡＡＶ５核酸の任意の独特のフラグメント（配列番号１および７〜
１１、１３、１５、１６、１７、および１８に示されるＡＡＶ５核酸を含む）を
利用し得る。独特であるためには、そのフラグメントは、それを他の公知の配列
から区別するために（任意の核酸フラグメントを、ＧｅｎＢａｎｋのようなコン
ピュータデータべースにおける核酸のヌクレオチド配列と比較することによって
最も容易に決定される）十分なサイズでなければならない。このような比較検索
は、当該分野で標準的である。代表的には、プライマーまたはプローブとして有
用な独特のフラグメントは、その配列の特定のヌクレオチド含有量に依存して、
少なくとも約８または１０、好ましくは、少なくとも２０または２５ヌクレオチ
ド長である。さらに、例えば、フラグメントは、少なくとも約３０、４０、５０
、７５、１００、２００、または５００ヌクレオチド長であり得、そしてポリペ
プチドをコードし得るかもしくはプローブであり得る。その核酸は、それが意図
される目的に依存して、１本鎖または２本鎖であり得る。所望であれば、その核
酸は、ＲＮＡであり得る。

【００４１】本発明はさらに、そのベクターを含むためのＡＡＶ５キャプシドタンパク質を
提供する。特に、本発明は、３つ全てのＡＡＶ５コートタンパク質（すなわち、
ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）を含むポリペプチドのみでなく、各ＡＡＶ５コ
ートタンパク質（それぞれ配列番号４、５、および６）を個々に含むポリペプチ
ドもまた提供する。従って、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ５粒子
は、少なくとも１つのＡＡＶ５タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３を含む
。ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ５粒子は、核酸ベクターを、細胞
、組織、または被験体に送達するために利用され得る。例えば、本明細書に記載
されるＡＡＶ５ベクターは、ＡＡＶ５キャプシド由来粒子中にキャプシド化され
得、そして遺伝子送達方法において利用され得る。さらに、他のウイルス核酸が
、ＡＡＶ５粒子中にキャプシド化され得、そしてそのような送達方法において利
用され得る。例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、または６ベクター（例えば、ＡＡ
Ｖ１、２、３、４、または６ＩＴＲおよび目的の核酸）は、ＡＡＶ５粒子中にキ
ャプシド化され、そして投与され得る。さらに、ＡＡＶ２キャプシド配列および
ＡＡＶ５キャプシド配列の両方を組み込んだＡＡＶ５キメラキャプシドは、標準
的なクローニング方法によって、所望のように各タンパク質の公知の配列からの
領域を選択して、生成され得る。例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の特に
抗原性の領域は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質の対応する領域と置換され得る
。ＡＡＶ２キャプシド配列を組み込んだキメラキャプシドに加えて、ＡＡＶ１、
３、４、または６、およびＡＡＶ５キャプシド配列を組み込んだキメラキャプシ
ドは、標準的なクローニング法により、所望のように各タンパク質の公知の配列
からの領域を選択して、生成され得る。

【００４２】そのキャプシドはまた、細胞表面レセプターに対する特定のリガンドをコード
するようにキャプシドを遺伝的に改変することによって、それらの特定の親和性
を変更するために改変され得る。あるいは、そのキャプシドは、リガンドを細胞
表面レセプターに結合体化することによって、化学的に改変され得る。遺伝的に
または化学的に、そのキャプシドを改変することによって、その親和性が、特定
の細胞または細胞の集団にＡＡＶ５を向かわせるように改変され得る。キャプシ
ドはまた、そのキャプシドを、標的の細胞または細胞の集団上の特定のタンパク
質を認識する抗体に結合させることによって免疫学的に改変され得る。

【００４３】キャプシドはまた、哺乳動物、細菌、真菌、または昆虫細胞における発現によ
って、空の粒子へとアセンブリされ得る。例えば、ＡＡＶ２粒子は、バキュロウ
イルス中のＶＰ３およびＶＰ２キャプシドタンパク質から作製されることが公知
である。その同じ基本プロトコルは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む空の
ＡＡＶ５粒子を産生し得る。

【００４４】本明細書中に記載される組換えＡＡＶ５由来ベクターは、ＡＡＶ粒子中にキャ
プシド化され得る。特に、ＡＡＶ１粒子、ＡＡＶ２粒子、ＡＡＶ３粒子、ＡＡＶ
４粒子、ＡＡＶ５粒子、またはＡＡＶ６粒子、これらの任意のキャプシドの部分
、または上記のキメラキャプシド粒子中に、キャプシド化プロセスにおいて適切
なキャプシドタンパク質を使用する標準的な方法によって、その核酸ベクターが
使用されるその粒子のサイズ制限内に適合する限り、キャプシド化され得る。そ
のキャプシド化プロセス自体は、当該分野において標準的である。ＡＡＶ５複製
機構（すなわち、ｒｅｐイニシエータータンパク質および複製に必要とされる他
の機能）は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、または６キャプシド中にパッケージン
グされ得るＡＡＶ５ゲノムを産生するために使用され得る。

【００４５】ベクターを含有する組換えＡＡＶ５ビリオンはまた、複数のプラスミドを使用
する組換え法によって産生され得る。１つの例において、ＡＡＶ５ｒｅｐ核酸
は、１つのプラスミドにクローニングされ、ＡＡＶ５ＩＴＲ核酸は、別のプラ
スミドにクローニングされ、そしてＡＡＶ１、２、３、４、５または６キャプシ
ド核酸は別のプラスミド上にクローニングされる。次いで、これらのプラスミド
は、細胞に導入される。３つ全てのプラスミドによって効率的に形質導入された
その細胞は、特定の組み込み、ならびにＡＡＶ５組換えウイルスを産生する能力
を示す。さらに、２つのプラスミドは、ＡＡＶ５ｒｅｐ核酸が、１つのプラス
ミドにクローニングされ、そしてＡＡＶ５ＩＴＲおよびＡＡＶ５キャプシドが
、別のプラスミドにクローニングされる場合に、使用され得る。次いで、これら
のプラスミドは、細胞に導入される。両方のプラスミドによって効率的に形質導
入されたその細胞は、特定の組み込み、ならびにＡＡＶ５組換えウイルスを産生
する能力を示す。

【００４６】ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードするＡＡＶ５キャプ
シドポリペプチドは、図４および５に示される配列番号７、８、および９のヌク
レオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、全
体として、５６％よりも大きい相同性を有し得る。そのキャプシドタンパク質は
、配列番号７、８、または９に示されるヌクレオチドによってコードされるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質に対して、約７０％の相同性、約７５％の相同性、
８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の
相同性、９９％の相同性、またはさらに１００％の相同性を有し得る。本明細書
におけるタンパク質を同定するためのその相同性パーセントは、ヌクレオチドご
との比較に基づき得る。または、より好ましくは、本明細書に記載されるコンピ
ュータアルゴリズムに基づく。ＡＡＶ５キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に
おける変異は、その結果得られるＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む粒子が、
抗原的にまたは免疫学的に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、または
ＡＡＶ６キャプシドとは異なったままである限り（標準的な方法によって慣用的
に決定され得る）、本明細書中で意図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ
およびウエスタンブロットが、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的にＡＡＶ
２またはその他の血清型から区別されるか否かを決定するために使用され得る。
さらに、ＡＡＶ５粒子は、好ましくは、ＡＡＶ２とは区別される組織親和性（例
えば、本明細書の実施例で例示されるようなもの）を保持する。少なくとも１つ
のＡＡＶ５コートタンパク質を含むＡＡＶ５キメラ粒子は、ＡＡＶ５コートタン
パク質のみからなるＡＡＶ５粒子の組織特異性とは異なる組織親和性を有し得る
が、しかし、なおＡＡＶ２粒子の親和性とは区別される。

【００４７】本発明はさらに、一対のＡＡＶ５逆方向末端反復を含むベクターを含有（すな
わち、キャプシド化）するＡＡＶ５粒子を含む組換えＡＡＶ５ビリオンを提供す
る。組換えベクターは、ＡＡＶ５Ｒｅｐコード核酸をさらに含み得る。その粒
子にキャプシド化されたベクターは、その逆方向末端反復の間に挿入された外因
性核酸をさらに含み得る。ＡＡＶ５Ｒｅｐは、標的化された組み込みおよび効
率的な複製、従って、ＡＡＶ５Ｒｅｐを含む組換えＡＡＶ５の産生を与え、組
換えＡＡＶ２の産生よりも多くの粒子を生じる。ＡＡＶ５は、そのゲノムの複製
およびパッケージングにおいてより効率的であるので、挿入された、または本発
明のＡＡＶ５キャプシド中の、逆方向末端反復間のその外因性核酸は、ＡＡＶ１
、２、３、４、または６キャプシドにパッケージングされ、そのキャプシドタン
パク質によって与えられる特異的な組織親和性を達成し得る。

【００４８】本発明はさらに、そのＲｅｐタンパク質によって認識されるｒｅｐ結合部位お
よびＴＲＳ部位を含有するキメラ組換えＩＴＲを意図する。「Ｒｅｐタンパク質
」は、４つ全てのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２、Ｒ
ｅｐ６８を意味する。あるいは、「Ｒｅｐタンパク質」は、本明細書に記載され
る１つ以上のＲｅｐタンパク質であり得る。キメラＩＴＲの１つの例は、ＡＡＶ
５Ｄ領域（配列番号２３）、ＡＡＶ５ＴＲＳ部位（配列番号２１）、ＡＡＶ
２ヘアピン、およびＡＡＶ２結合部位からなる。別の例は、ＡＡＶ５Ｄ領域、
ＡＡＶ５ＴＲＳ部位、ＡＡＶ３ヘアピン、およびＡＡＶ３結合部位である。こ
れらのキメラＩＴＲにおいて、Ｄ領域は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、または６
由来であり得る。そのヘアピンは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６由来であり得
る。その結合部位は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、または６のいずれかに由来し
得る。好ましくは、Ｄ領域およびＴＲＳは、同じ血清型由来である。

【００４９】そのキメラＩＴＲは、ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質および任意のＡＡＶ血清型
キャプシドと組み合わされ得、組換えビリオンを得る。例えば、組換えビリオン
は、ＡＡＶ５Ｄ領域、ＡＡＶ５ＴＲＳ部位、ＡＡＶ２ヘアピン、ＡＡＶ２結
合部位、ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質、およびＡＡＶ１キャプシドによって産生
され得る。この組換えビリオンは、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質によって付与
された細胞親和性を保持し、そしてＡＡＶ５Ｒｅｐによって付与された効率的
な複製を保持する。

【００５０】組換えウイルスを産生するＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドの他
の例は、以下のリストに提供される：

【００５１】

【表１】本明細書に記載される任意の構築物において、プロモーターを含むことは好ま
しい。本明細書の構築物において使用されるように、特に断らない限り、Ｃａｐ
（キャプシド）は、本明細書に記載される、ＡＡＶ５ＶＰ１、ＡＡＶ５ＶＰ
２、ＡＡＶ５ＶＰ３のいずれか、これらの組み合わせ、ＶＰ１、ＶＰ２、もし
くはＶＰ３のいずれかの機能的フラグメント、またはキメラキャプシドのいずれ
かをいう。本明細書に記載される構築物のＩＴＲは、本出願の他のところに記載
されるキメラ組換えＩＴＲであり得る。

【００５２】組換えまたは野生型ＡＡＶ５ビリオンと核酸またはタンパク質との結合体は、
細胞へこれらの分子を送達するために使用され得る。例えば、精製ＡＡＶ５は、
ウイルスの外側に結合したＤＮＡを送達するためのビヒクルとして使用され得る
。この実施例は、ポリ−Ｌ−リジンまたは他の荷電分子を使用する架橋によって
、ＤＮＡをビリオンに結合させることである。細胞にＤＮＡを導入するための、
ＡＡＶ５構造タンパク質（ＡＡＶ５キャプシドタンパク質）、脂質（例えば、Ｄ
ＯＴＡＰ）、および荷電相互作用を介して複合体化された核酸を含むビロゾーム
もまた、意図される。

【００５３】ＡＡＶ５キャプシドまたはＡＡＶ５キャプシドタンパク質の独特の領域（例え
ば、ＶＰ１、ＶＰ２、もしくはＶＰ３、またはこれらの組み合わせ）を利用して
ＤＮＡを細胞に導入する結合体もまた、本発明によって提供される。例えば、５
型ＶＰ３タンパク質もしくはそのフラグメントは、脂質に結合体化されたプラス
ミド上のＤＮＡに結合体化され得る。細胞は、ＡＡＶ５に特異的な所望の組織親
和性を達成するために、ＶＰ３キャプシドタンパク質の標的化能力を使用して感
染され得る。５型ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質はまた、ＤＮＡまたは他の分子
を細胞に導入するために利用され得る。Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶＴＲＳ
をＤＮＡ含有結合体にさらに組み込むことによって、細胞は、形質導入され得、
そして標的化された組み込みが達成され得る。例えば、ＡＡＶ５特異的標的化組
み込みが所望される場合、ＡＡＶ５ＶＰ３キャプシド、ＡＡＶ５ｒｅｐもし
くはＡＡＶ５ｒｅｐのフラグメント、ＡＡＶ５ＴＲＳ、ｒｅｐ結合部位、目
的の異種ＤＮＡ、および脂質から構成される結合体が、ゲノム中でＡＡＶ５特異
的親和性およびＡＡＶ５特異的標的化組み込みを達成するために利用され得る。

【００５４】本発明により、キメラウイルスがさらに提供される。ここで、ＡＡＶ５は、別
のウイルスと関連する所望の親和性を達成するために、ヘルペスウイルス、バキ
ュロウイルス、もしくは他のウイルスと組み合わせられ得る。例えば、ＡＡＶ５ＩＴＲは、ヘルペスウイルスに挿入され得、そして細胞が感染され得る。感染
後、ＡＡＶ５のＩＴＲは、その系においてまたはＡＡＶ５をゲノムからレスキュ
ーするための別のビヒクルにおいて提供されるＡＡＶ５ｒｅｐによって作用さ
れ得る。従って、単純ヘルペスウイルスのその細胞親和性は、ＡＡＶ５ｒｅｐ
媒介標的化組み込みと組み合わされ得る。キメラウイルスを構築するために利用
され得る他のウイルスには、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター
、偽型レトロウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが含まれる。

【００５５】本発明は、ＡＡＶ５の単離された核酸をさらに提供する。例えば、配列番号１
に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸（ＡＡＶ５ゲノム）が提供さ
れる。この核酸またはその一部は、プラスミド、酵母人工染色体、または他のウ
イルスベクター（粒子）のようなベクターに、所望であれば、標準的なクローニ
ング法によって、挿入され得る。本発明はまた、配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列から本質的になる単離された核酸を提供する。配列番号１のヌクレオチ
ドは、マイナーな改変を有し得、そしてそれでもなお本発明によって意図される
。例えば、任意の所定のコドン（例えば、コドンの３番目の「ゆらぎ（ｗｏｂｂ
ｌｅ）」位置の改変によるもの）によってコードされるアミノ酸を変更しない改
変が、容易に作製され得、そしてこのような変更は、当該分野で公知である。さ
らに、類似のアミノ酸の結果としての中性（保存された）アミノ酸置換を引き起
こす改変は、ゲノムのコード領域において作製され得る。さらに、ＡＡＶ５成分
（例えば、ＩＴＲ、ｐ５プロモーターなど）について本明細書に記載されるよう
な改変は、本発明において意図される。さらに、ＩＴＲ、ＴＲＳＲｅｐ結合部
位およびヘアピン以外の配列番号１の領域に対する改変は、組換えベクターとし
てのその核酸の機能に対して重大な影響なしに、許容されるようである。

【００５６】本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、天然に存在する生物の少
なくともいくつかのその他の成分（例えば、ウイルスおよび／または他の核酸の
環境において、一般に、核酸と関連して見出される細胞構造成分またはウイルス
成分）から分離されているか、またはそれらを顕著に含まない核酸をいう。天然
の核酸の単離は、例えば、細胞溶解、次いでフェノールおよびクロロホルム抽出
、次いで核酸のエタノール沈殿のような技術によって、達成され得る。本発明の
核酸は、当該分野で周知の任意の多くの方法に従って細胞から単離され得る。

【００５７】本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、
またはそれらの任意の組み合わせ（それらの核酸に対する改変を含む）であり得
る単一および複数の鎖化された分子をいう。核酸は、コーディング鎖もしくはそ
の相補鎖、またはこれらの任意の組み合わせを表し得る。核酸は、本明細書にお
いて考察される任意の新規の遺伝子についての天然に存在する配列に、その配列
が同一であり得るか、または本明細書において提供されるものと同一のアミノ酸
をコードする代替のコドン（天然に存在する配列において見出されるものを含む
）を含み得る。これらの核酸はまた、その代表的な構造から改変され得る。この
ような改変には、メチル化核酸、リン酸残基上の非架橋酸素の、イオウ（ホスホ
ロチオエートデオキシヌクレオチドを生じる）、セレニウム（ホスホロセレノエ
ートデオキシヌクレオチドを生じる）、またはメチル基（メチルホスホネートデ
オキシヌクレオチドを生じる）のいずれかでの置換が含まれるが、これらに限定
されない。

【００５８】本発明はさらに、本明細書に開示される任意の核酸（全ＡＡＶ５ゲノムおよび
その任意の独特のフラグメント（Ｒｅｐおよびキャプシドコード配列を含む）（
例えば、配列番号１、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、および２３）を含む）と選択的にハイブリダイズす
る単離された核酸を提供する。具体的には、その核酸は、配列番号１（ＡＡＶ５
ゲノム）に示されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸と選択的にまたは
特異的にハイブリダイズし得る。本発明はさらに、配列番号１（ＡＡＶ５ゲノム
）に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸と選択的にまたは特異的に
ハイブリダイズする単離された核酸を提供する。本発明において使用される場合
、「選択的にハイブリダイズする」は、十分にストリンジェントな条件下で、無
関係なタンパク質をコードする核酸と有意にハイブリダイズせずに、そして特に
、ＡＡＶ２の核酸に検出可能にハイブリダイズしないで、開示された核酸の１つ
にハイブリダイズする核酸を意味する。従って、本発明の核酸と選択的にハイブ
リダイズする核酸は、ストリンジェントな条件下で、異なるタンパク質またはそ
のウイルスの異なる血清型由来の対応するタンパク質をコードする核酸と選択的
にハイブリダイズしない。そしてその逆も同じである。「特異的にハイブリダイ
ズする」核酸は、ストリンジェント条件下で、ＡＡＶ５に見出される核酸のみに
ハイブリダイズするものである。従って、例えば、標的核酸を検出または増幅す
るためのプライマーおよびプローブとしての使用のための核酸は、本明細書にお
いて意図される。任意の所定の核酸に選択的にハイブリダイズする核酸フラグメ
ントは、例えば、プライマーおよびプローブとして、さらなるハイブリダイゼー
ションまたは増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖
反応（ＬＣＲ））のために使用され得る。さらに、例えば、ＡＡＶ５およびＡＡ
Ｖ５ベクター内に担持された目的の遺伝子（すなわち、キメラ核酸）の両方と選
択的にハイブリダイズするプライマーまたはプローブが、設計され得る。

【００５９】ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工
程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって制御
される。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのそのハイ
ブリダイゼーションのストリンジェンシーは、Ｔ_m（分子の半分がそのハイブリ
ダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度
で、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイ
ゼーション、次いで、その洗浄温度がＴ_mより約５℃〜２０℃低い温度であるよ
うに選択された温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄を含む。その温度および
塩濃度は、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルが、目的の標識され
た核酸にハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗
浄される予備実験において経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション
温度は、代表的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョンについてより高い。洗浄温度は、当該分野で公知のように、選択されたスト
リンジェンシーを達成するために上記のように使用され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９
；Ｋｕｎｋｅｌら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６
７，１９８７）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＰ
Ｅにおいて約６８℃（水溶液中）、続いて、６８℃での洗浄であり得る。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望であれば、所望の相
補性の程度が減少されるに従って、そしてさらに、多様性が検索される場合、任
意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔリッチ度に依存して、減少され得る。同様に、ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望であれば、所望
の相同性が減少するに従って、そしてさらに、高い相同性が所望である場合、任
意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔリッチ度に依存して、増大され得る。これらは全
て当該分野で公知である。

【００６０】ＡＡＶ５ゲノムの任意の部分に選択的にハイブリダイズする核酸は、本明細書
で意図される。それゆえ、ＡＡＶ５に選択的にハイブリダイズする核酸は、ＡＡ
Ｖ５ゲノムよりも長い長さであり得、それは、ＡＡＶ５ゲノムとほぼ同じ長さで
あり得るか、またはＡＡＶ５ゲノムよりも短いものであり得る。その核酸の長さ
は、ＡＡＶ５に対するハイブリダイゼーションについてのその特異性によっての
み、サイズ範囲のより短い端に限定される。すなわち、一旦それが短すぎる場合
、代表的には約５〜７ヌクレオチド長よりも短い場合、それは、ＡＡＶ５にはも
はや特異的に結合しないが、むしろ、多数のバックグランド核酸とハイブリダイ
ズする。さらに、本発明によって意図されるのは、ＡＡＶ５に特異的にハイブリ
ダイズする部分およびＡＡＶ５内に挿入された目的の遺伝子と特異的にハイブリ
ダイズする部分を有する核酸である。

【００６１】本発明はさらに、アデノ随伴ウイルス５Ｒｅｐタンパク質をコードする単離さ
れた核酸を提供する。ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ５ゲノムのオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１によってコードされる。ＡＡＶ５Ｒｅｐ
遺伝子の例は、配列番号１に示される核酸に示され、そして本質的に配列番号１
０（Ｒｅｐ５２）、１１（Ｒｅｐ７８）、１３（Ｒｅｐ４０）、および１５（Ｒ
ｅｐ６８）に示されるヌクレオチド配列からなる核酸、ならびに配列番号１０、
１１、１３、および１５に示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。しかし
、本発明は、Ｒｅｐ核酸が、４つのＲｅｐタンパク質の任意の１つ、２つ、３つ
、または４つを、任意の順番で、このような核酸中に含み得ることを意図する。
さらに、マイナーな改変（例えば、コード配列におけるサイレント変異、および
コードされたアミノ酸配列中に天然のまたは保存された変化をつくる変異、なら
びにその遺伝子の発現を破壊しない調節領域における変異）が、その核酸におい
て意図される。その他のマイナーな改変の例は、当該分野で公知である。さらな
る改変は、例えば、１つ以上のＲｅｐタンパク質の発現を破壊または変更するた
めに、例えば、そのような破壊の効果を決定するために；１つ以上のＲｅｐタン
パク質を変異して、その得られる効果を決定するなどのために、核酸においてな
され得る。しかし、一般に、Ｒｅｐタンパク質をコードする改変された核酸は、
本明細書に記載されるＲｅｐ核酸配列（例えば、配列番号１０、１１、１３、お
よび１５）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約
９８％、または１００％の相同性を有し、そしてそこでコードされるＲｅｐポリ
ペプチドは、全体として、本明細書に記載されるアミノ酸配列（例えば、配列番
号２、３、１２、および１４）と、約９３％、約９５％、約９８％、約９９％、
または１００％の相同性を有する。相同性％は、本明細書に記載される技術によ
って決定される。

【００６２】本発明はまた、配列番号１０、１１、１３および１５に示されるヌクレオチド
配列から本質的になる核酸と選択的にまたは特異的にハイブリダイズする単離さ
れた核酸、ならびに配列番号１０、１１、１３および１５に示されるヌクレオチ
ド配列を含む核酸と選択的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。「
選択的にハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシー」は、本明細書中の他の場所で定義される。

【００６３】上記のように、本発明は、Ｒｅｐ４０タンパク質をコードする核酸、ならび
に特に配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸、配列番
号１３に示されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸、および配
列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス５タンパク質を
コードする核酸を提供する。本発明はまた、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードす
る核酸、ならびに特に配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む単離され
た核酸、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された
核酸、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス５
Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明は、Ｒｅｐ６８タンパ
ク質をコードする核酸、ならびに特に配列番号１５に示されるヌクレオチド配列
を含む単離された核酸、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列から本質的に
なる単離された核酸、および配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するアデ
ノ随伴ウイルス５タンパク質をコードする核酸をさらに提供する。そしてさらに
、本発明は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする核酸、ならびに特に配列番号１
１に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸、配列番号１１に示される
ヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸、および配列番号３に示され
るアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス５Ｒｅｐタンパク質をコードする核
酸を提供する。本明細書中の他の場所に記載されるように、これらの核酸は、少
々の改変（サイレントなヌクレオチド置換、コードされた配列中の保存的アミノ
酸置換をもたらす変異、ならびにコードされたアミノ酸配列に影響しないかまた
は最小限の影響を与える制御領域における変異を含む）を有し得る。

【００６４】本発明は、ＡＡＶ５キャプシドポリペプチド全体をコードする核酸をさらに提
供する。さらに、本発明は、３つのＡＡＶ５コートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２
およびＶＰ３のそれぞれをコードする核酸を提供する。従って、本発明は、ＡＡ
Ｖ５ＶＰ１をコードする核酸、ＡＡＶ５ＶＰ２をコードする核酸、およびＡ
ＡＶ５ＶＰ３をコードする核酸を提供する。従って、本発明は、配列番号４に
示されるアミノ酸配列（ＶＰ１）をコードする核酸；配列番号５に示されるアミ
ノ酸配列（ＶＰ２）をコードする核酸、および配列番号６に示されるアミノ酸配
列（ＶＰ３）をコードする核酸を提供する。本発明はまた、配列番号７を含む核
酸（ＶＰ１遺伝子）；配列番号８を含む核酸（ＶＰ２遺伝子）；および配列番号
９を含む核酸（ＶＰ３遺伝子）を特に提供する。本発明はまた、本質的に配列番
号７からなる核酸（ＶＰ１遺伝子）、本質的に配列番号８からなる核酸（ＶＰ２
遺伝子）、および本質的に配列番号９からなる核酸（ＶＰ３遺伝子）を特に提供
する。キャプシドタンパク質またはコートタンパク質をコードするヌクレオチド
配列中の少々の改変は、上記のように他のＡＡＶ５核酸について意図される。し
かし、概して、キャプシドタンパク質をコードする、改変された核酸は、本明細
書中に記載されるキャプシド核配列（例えば、配列番号７、８、および９）に対
して、少なくとも約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９８％または１
００％の相同性を有し、そして本明細書中でコードされるキャプシドポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるアミノ酸配列（例えば、配列番号４、５、および
６）と、全体的に約９３％、約９５％、約９８％、約９９％または１００％の相
同性を有する。上記の条件下で、配列番号７、８および９の核酸と選択的にハイ
ブリダイズする核酸もまた提供される。

【００６５】本発明はまた、１つ以上の、本明細書中に記載の核酸（例えば、ＡＡＶ５ゲノ
ム、ＡＡＶ５ＯＲＦ１およびＯＲＦ２、各ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質遺伝子
、または各ＡＡＶ５キャプシドタンパク質遺伝子）を含む細胞を提供する。この
ような細胞は、任意の所望の細胞であり得、そして意図される使用に基づいて選
択され得る。例えば、細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ヒトＨｅ
Ｌａ細胞およびシミアンＣｏｓ細胞、ならびに他のヒト細胞および哺乳動物細胞
およびヒト細胞株および哺乳動物細胞株が挙げられ得る。初代培養物ならびに樹
立された培養物および細胞株が、使用され得る。本発明の核酸は、任意の選択さ
れた手段によって、特に標的細胞に依存して、細胞中に送達され得る。多くの送
達手段が当該分野において周知である、例えば、エレクトロポレーション、リン
酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リ
ポソーム、および核への送達のための核局所化シグナルペプチドと組み合せたリ
ポソームが、当該分野で公知として利用され得る。さらに、核酸がウイルス粒子
中に存在する場合、細胞は、ＡＡＶ形質導入についての当該分野で公知の標準的
手段によって、ビリオンで簡単に形質導入され得る。少量の組換えＡＡＶ５ウイ
ルスは、細胞に感染し、そしてより多くのそれ自体が産生するようになされ得る
。

【００６６】本発明は、精製されたＡＡＶ５ポリペプチドを提供する。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーをいい、そして全長
タンパク質およびそのフラグメントを含む。従って、「タンパク質」、「ポリペ
プチド」および「ペプチド」は、本明細書中でしばしば互換的に使用される。置
換は、中立であるように公知のパラメータによって選択され得る（例えば、Ｒｏ
ｂｉｎｓｏｎＷＥＪｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌＷＭ．、ＡＩＤＳ４：Ｓ
１５１〜Ｓ１６２（１９９０）を参照のこと）。当業者によって理解されるよう
に、本発明はまた、アミノ酸配列または他の特性におけるわずかなバリエーショ
ンを有するポリプチドを含む。そのような改変は、対立遺伝子のバリエーション
（例えば、遺伝的多型に起因する）として天然に生じ得るか、または点変異体、
欠失変異体、挿入変異体および置換変異体の誘導のようなヒトの介入により（例
えば、クローニングしたＤＮＡ配列の変異誘発により）、生成され得る。アミノ
酸配列中の少々の変化（例えば、保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失または内
部挿入、および分子の末端での付加または欠失）が、一般的に好ましい。置換は
、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅ
ｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ１９７８，Ｎａｔ’ｌＢｉｏｍｅｄ．
Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに基づいて
設計され得る。これらの改変は、アミノ酸配列において変化を生じ得るか、サイ
レントな改変を提供し得るか、制限部位を改変し得るか、または他の特定の変異
を提供し得る。ポリペプチドに対する任意の改変の位置は、しばしば、機能に対
するその影響力を決定する。特に、タンパク質の機能において必須でない領域に
おける変更は、機能に対するより小さな効果で許容される。ＡＡＶ５タンパク質
の適用領域の他の場所は、置換、付加または欠失が、改変体の機能を妨害する可
能性を最小にし得るような指針を提供するように記載される。

【００６７】本発明のポリペプチドは、任意のいくつかの手段によって容易に得られ得る。
例えば、目的のポリペプチドは、標準的方法により化学的に合成され得る。さら
に、その遺伝子のコード領域は、組換え的に発現され得、そして標準的方法によ
り単離されたポリぺプチドを生じ得る。さらに、得られたポリペプチドに対して
特異的な抗体は、標準的方法により惹起され得（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬ
ａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８８を参照のこと）、そして
タンパク質は、その抗体と選択的にハイブリダイズすることにより、そのポリペ
プチドをコードする核酸を発現する細胞から単離され得る。このタンパク質は、
タンパク質精製の標準的な方法により、所望の程度まで精製され得る（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、１９８９を参照のこと）。

【００６８】代表的には、本発明の独特のポリペプチドフラグメントは、少なくとも約５ア
ミノ酸の長さである：しかし、独特のフラグメントは、６、７、８、９、１０、
２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の長
さであり得る。独特のポリペプチドは、代表的には、そのような独特のフラグメ
ントを含む；しかし、独特のポリペプチドはまた、その全体的な相同性により決
定され得る。独特のポリペプチドは、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の長さであり得る。ポ
リペプチドフラグメントの独特性（Ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ）は、当該分野で公知
の標準的方法によって（例えば、公知のペプチド配列または核酸配列のコンピュ
ーターデータベースの検索、あるいは、タンパク質をコードする核酸またはその
タンパク質自体に対するハイブリダイゼーション研究によって）容易に決定され
得る。ポリペプチドフラグメントの独特性はまた、免疫学的および機能的に決定
され得る。独特性は、ポリペプチドのアミノ酸ごとの比較において簡単に決定さ
れ得る。

【００６９】本発明の抗原性フラグメントまたは免疫反応性フラグメントは、代表的には、
少なくとも約５つの連続したアミノ酸のアミノ酸配列であり、そしてそれはＡＡ
Ｖ５ポリペプチドアミノ酸配列由来であり得る。抗原性ＡＡＶ５フラグメントは
、本明細書中に記載されるように、標準的な方法により、ＡＡＶ５特異的抗体が
惹起され得るＡＡＶ５タンパク質に対して独特な任意のフラグメントである。従
って、得られた抗体−抗原反応は、ＡＡＶ５に対して特異的であるべきである。

【００７０】本発明は、単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質を提供する。ＡＡＶ５Ｒ
ｅｐポリペプチドは、ＡＡＶ５のＯＲＦ１によりコードされる。本発明はまた、
それぞれの個々のＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質を提供する。従って、本発明は、
ＡＡＶ５Ｒｅｐ４０（例えば、配列番号１２）またはその独特のフラグメント
を提供する。本発明は、ＡＡＶ５Ｒｅｐ５２（例えば、配列番号２）またはそ
の独特のフラグメントを提供する。本発明は、ＡＡＶ５Ｒｅｐ６８（例えば、
配列番号１４）またはその独特のフラグメントを提供する。本発明は、ＡＡＶ５Ｒｅｐ７８（例えば、配列番号３）の例またはその独特のフラグメントを提供
する。「その独特のフラグメント」とは、Ｒｅｐポリペプチド中にのみ見出され
るのに十分な長さである、ＡＡＶ５ｒｅｐ遺伝子によりコードされる、より小
さい任意のポリペプチドフラグメントを意味する。アミノ酸配列の置換および改
変は、上記のようになされ得、そしてさらにポリぺプチドに対するタンパク質の
プロセシング修飾（例えば、グリコシル化）を含み得る。

【００７１】本発明はさらに、ＡＡＶ５キャプシドポリペプチドまたはその独特のフラグメ
ントを提供する。ＡＡＶ５キャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ５のＯＲＦ２によ
りコードされる。本発明はさらに、個々のＡＡＶ５キャプシドタンパク質、ＶＰ
１、ＶＰ２およびＶＰ３、またはそれらの独特のフラグメントを提供する。従っ
て、本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列（ＶＰ１）を有する単離され
たポリペプチドを提供する。本発明はさらに、配列番号５に示されるアミノ酸配
列（ＶＰ２）を有する単離されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列
番号６に示されるアミノ酸配列（ＶＰ３）を有する単離されたポリペプチドを提
供する。「その独特のフラグメント」とは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質中に
のみ見出されるのに十分な長さである、任意のＡＡＶ５キャプシド遺伝子により
コードされる、任意のより小さなポリペプチドフラグメントを意味する。アミノ
酸配列の置換および改変は、上記の様になされ得、そしてさらにそのポリペプチ
ドに対するタンパク質のプロセシング修飾（例えば、グリコシル化）を含み得る
。しかし、３つ全てのコートタンパク質を含むＡＡＶ５キャプシドポリペプチド
は、配列番号４、５、または６に示されるヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドに対して、全体的に約５６％より大きい相同性を有する。タンパク質は
、配列番号４、５または６に示されるヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
配列に対して、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％
、９３％、９５％、９７％またはさらに１００％の相同性を有し得る。ＡＡＶ５ＶＰ１ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なく
とも約５８％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、９３％、９５％、９
７％または約１００％の相同性を有し得る。ＡＡＶ５ＶＰ２ポリペプチドは、
配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約５８％、約６０％、
約７０％、約８０％、約９０％、９３％、９５％、９７％または約１００％の相
同性を有し得る。ＡＡＶ５ＶＰ３ポリペプチドは、配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列に対して、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、９３
％、９５％、９７％または約１００％の相同性を有し得る。

【００７２】本発明はさらに、ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質またはその独特のエピトープを
特異的に結合する、単離された抗体を提供する。それぞれ、配列番号２、配列番
号１２、配列番号１４および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＡ
Ｖ５Ｒｅｐ５２タンパク質、ＡＡＶ５Ｒｅｐ４０タンパク質、ＡＡＶ５Ｒ
ｅｐ６８タンパク質およびＡＡＶ５Ｒｅｐ７８タンパク質を特異的に結合する
か、またはそれらの独特のフラグメントを特異的に結合する、単離された抗体も
また提供される。明らかに、任意の所定の抗体は、ポリペプチド中に存在する多
くの可能性のあるエピトープのうちの１つを認識し得、そして結合し得る；従っ
て、ポリペプチドの独特の一部（エピトープを有する）のみが、抗体がポリペプ
チドを特異的に結合するか否かを決定するアッセイにおいて存在することを必要
とし得る。

【００７３】本発明はさらに、任意のアデノ随伴ウイルス５キャプシドタンパク質（ＶＰ１
、ＶＰ２、またはＶＰ３）、それらの独特のエピトープ、または３つ全てのＡＡ
Ｖ５コートタンパク質を含むポリペプチドを特異的に結合する、単離された抗体
を提供する。配列番号４に示されるアミノ酸配列（ＶＰ１）を有するＡＡＶ５キ
ャプシドタンパク質を特異的に結合するか、またはその独特のフラグメントを特
異的に結合する、単離された抗体もまた提供される。本発明はさらに、配列番号
５に示されるアミノ酸配列（ＶＰ２）を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質を
特異的に結合するか、またはその独特のフラグメントを特異的に結合する、単離
された抗体を提供する。本発明はさらに、配列番号６に示されるアミノ酸配列（
ＶＰ３）を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質を特異的に結合するか、または
その独特のフラグメントを特異的に結合する、単離された抗体を提供する。再び
、任意の所定の抗体は、ポリペプチド中に存在する可能性のある多くのエピトー
プのうちの１つを認識し得、そして結合し得る；従って、ポリペプチドの独特の
一部（そのエピトープを有する）のみが、抗体がそのポリペプチドを特異的に結
合するか否かを決定するアッセイにおいて存在することを必要とし得る。

【００７４】抗体は、ＡＡＶ５タンパク質を特異的に結合する抗体を含む組成物の成分であ
り得る。この組成物はさらに、例えば、血清、血清を含まない培地、または生理
学的生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアなどを含み得る。

【００７５】ＡＡＶ５ポリペプチドまたはタンパク質を「特異的に結合する抗体」とは、抗
体が有意なバックグラウンドなしで対応するＡＡＶ５ポリペプチドに特異的に結
合するような、ＡＡＶ５ペプチドの任意の一部分においてエピトープと選択的に
結合する抗体を意味する。抗体による特異的な結合はさらに、抗体がポリペプチ
ドを含むサンプルから標的ポリペプチドを選択的に取り出すために使用され得、
そしてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ、または酵素結合免疫
吸着（ＥＬＩＳＡ）技術により容易に決定され得ることを意味する。特異的抗体
−抗原結合の検出に有効なＥＬＩＳＡ法は、例えば、以下のようであり得る：（
１）基質に抗体を結合させる；（２）結合した抗体を、抗原を含むサンプルと接
触させる；（３）上記のものを、検出可能な部分（例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）に結合した二次抗体と接触さ
せる；（４）上記のものをその酵素の基質と接触させる；（５）上記のものを呈
色試薬と接触させる；（６）その色の変化を観察する。

【００７６】抗体は、Ｆａｂフラグメントのような、結合活性を保持する抗体フラグメント
を含み得る。抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、
ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）中に記載されるように生成され得る。簡単に言う
と、精製された抗原は、免疫応答を誘発するのに十分な量および間隔で動物に注
射され得る。抗体が、直接的に精製され得るか、または脾細胞が、動物から得ら
れ得るかのいずれかであり得る。次いで、細胞は不死化細胞株と融合され、そし
て抗体分泌についてスクリーニングされる。個々のハイブリドーマは、次いで、
特定のモノクローナル抗体についての供給源として供する個々のクローンとして
増殖する。

【００７７】本発明はさらに、ＡＡＶ５による感染性について細胞をスクリーニングする方
法を提供し、この方法は、細胞をＡＡＶ５と接触させる工程、およびその細胞中
でＡＡＶ５の存在を検出する工程を包含する。ＡＡＶ５粒子は、任意の標準的な
物理的方法または生化学的方法を使用して検出され得る。例えば、この検出のた
めに使用され得る物理的方法としては、１）ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡについ
てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいは２）標識されたプローブとの直
接的なハイブリダイゼーションのようなＤＮＡに基づく方法、および３）ウイル
ス構造タンパク質または非構造タンパク質に対する抗体によるような免疫学的方
法が挙げられる。ウイルス検出の触媒的方法としては、Ｒｅｐタンパク質の部位
および鎖特異的ＤＮＡニッキング活性、またはＡＡＶ起点含有基質の複製の検出
が挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子はまた、ＡＡＶ−５
が形質導入された細胞を検出するために利用され得る。例えば、β−ｇａｌ、グ
リーン蛍光タンパク質またはルシフェラーゼが、組換えＡＡＶ−５中に挿入され
得る。次いで、細胞は、組換えＡＡＶ−５とインビトロまたはインビボのいずれ
かで接触され得、そして比色定量アッセイにより、細胞中のＡＡＶ−５の形質導
入を示す細胞における色の変化を検出する。さらなる検出方法がＦｉｅｌｄｓ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮｅｗＹ
ｏｒｋ、１９９６中に要約される。

【００７８】ＡＡＶ５による感染性について細胞をスクリーニングするために（ここで細胞
中のＡＡＶ５の存在は、核酸ハイブリダイゼーション方法により決定される）、
このような検出のための核酸プローブは、例えば、本明細書中に提供されるＡＡ
Ｖ５核酸の任意の独特のフラグメントを含み得る。任意の核酸プローブの独特性
は、本明細書中に記載されるように容易に決定され得る。さらに、細胞における
ＡＡＶ５の存在は、蛍光、遺伝子産物に対する抗体、焦点形成（ｆｏｃｕｓｆ
ｏｒｍｉｎｇ）アッセイ、プラークリフト、ウェスタンブロットおよび色素形成
アッセイにより決定され得る。核酸は、例えば、そのヌクレオチド配列が、配列
番号１、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３またはそれらの独特のフラグメントにおいて示される核酸で
ある。

【００７９】本発明は、被験体への投与のための、ＡＡＶ５ベクターの適合性を決定する方
法を含み、その方法は、被験体由来の抗体を含むサンプルに、単離されたＡＡＶ
５Ｒｅｐタンパク質またはキャプシドタンパク質の抗原性フラグメントを投与
する工程、ならびにサンプル中の中和抗体−抗原反応を検出する工程であって、
中和反応の存在は、ＡＡＶ５ベクターが被験体における使用について不適切であ
り得ることを示す、工程、を包含する。被験体への投与のための、ＡＡＶ５ベク
ターの適合性を決定する本発明の方法は、被験体由来の抗体を含むサンプルを、
ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ
６８、Ｒｅｐ７８）の独特の抗原性フラグメントまたは免疫原性フラグメント
と接触させる工程、およびサンプル中で抗体−抗原反応を検出する工程であって
、反応の存在は、ＡＡＶ５ベクターが被験体における使用に不適切であることを
示す、工程、を包含し得る。ＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質は、本明細書中に提供
され、そしてそれらの抗原性フラグメントは、慣用的に決定される。ＡＡＶ５キ
ャプシドタンパク質は、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列（ＶＰ１）
、配列番号５に示されるアミノ酸配列（ＶＰ２）、または配列番号６に示される
アミノ酸配列（ＶＰ３）からの抗原性フラグメントまたは免疫原性フラグメント
を選択するために使用され得る。あるいは、またはさらに、単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質の抗原性フラグメントまたは免疫原性フラグメントは、この
決定方法において利用され得る。抗原性フラグメントが選択されるＡＡＶ５Ｒ
ｅｐタンパク質は、配列番号１に示される核酸によりコードされるアミノ酸配列
、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または配列番号３に示されるアミノ酸配
列、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１４に示されるアミ
ノ酸配列を有し得る。

【００８０】ＡＡＶ５ポリペプチドフラグメントは、その抗原性、免疫原性および／または
特異性を決定するために分析され得る。簡単に言うと、種々の濃度の推定免疫原
性特異的フラグメントが調製され、そして被験体に投与され、そして各濃度に対
する動物の免疫学的応答（例えば、抗体の産生または細胞媒介免疫）が決定され
る。投与される抗原の量は、被験体（例えば、ヒト、ウサギ、またはモルモット
）、被験体の状態、被験体の大きさなどに依存する。その後、そのように抗原を
接種された動物は、特異的免疫原性フラグメントの免疫反応性または抗原性を試
験するために、ＡＡＶ５ウイルス粒子またはＡＡＶ５タンパク質に曝露され得る
。推定抗原性フラグメントまたは推定免疫原性フラグメントの特異性は、接種し
た動物由来の血清、他の体液またはリンパ球を、他の密接に関連したウイルス（
例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５）との交差反
応性について試験することによって確認され得る。

【００８１】血球凝集アッセイはまた、ＡＡＶ５ウイルス粒子を迅速に同定および検出する
ために使用され得る。血球凝集活性の検出は、感染性と相関し、そしてウイルス
を力価測定（ｔｉｔｅｒ）するために使用される。このアッセイはまた、ウイル
スと相互作用し得る、患者の血清中の抗体を同定するために使用され得る。血球
凝集は、感染性と相関することを示しており、従って、血球凝集は、ＡＡＶ５に
ついての細胞レセプターを同定するための有用なアッセイであり得る。

【００８２】「被験体への投与に対するＡＡＶ５ベクターの適合性」とは、ＡＡＶ５ベクタ
ーが特定の被験体への投与の際、中和免疫反応を誘発するか否かの決定を意味す
る。有意な免疫応答を誘発しないベクターは、潜在的に適切なベクターであり、
一方、有意な中和免疫応答（例えば、少なくとも９０％）を誘発するベクターは
、従って、その被験体における使用に適切でないようである。任意の検出可能な
免疫応答の有意性は、当業者により理解される標準的パラメータである。例えば
、当業者は、ウイルスと被験体の血清をインキュベートし、次いで、ウイルスが
培養物中で細胞に形質導入するその能力を保持するか否かを決定し得る。そのよ
うなウイルスが、培養物中で細胞に形質導入し得ない場合、ベクターは、有意な
免疫応答を誘発したようである。

【００８３】あるいは、またはさらに、当業者は、ＡＡＶ５投与が被験体の特定の細胞型に
ついて適切であるか否かを決定し得る。例えば、当業者は、インビトロで筋細胞
を培養し得、そして被験体の血清の存在下または非存在下で、その細胞にＡＡＶ
５を形質導入し得た。形質導入の効率において減少が存在する場合、これは、中
和抗体または形質導入を阻害し得る他の因子の存在を示し得た。通常、９０％よ
り大きい阻害が、ベクターとしてのＡＡＶ−５の使用を除外するために、観察さ
れなければならない。しかし、この制限は、形質導入を阻害する因子をブロック
し得る免疫抑制薬で被験体を処置することによって克服され得た。

【００８４】当業者により認識されるように、多くの型のイムノアッセイは、抗体と本発明
のＡＡＶ５ポリペプチドとの間の結合を検出するために、本発明における使用の
ために利用可能である。例えば、直接的および間接的な結合アッセイ、競合アッ
セイ、サンドイッチアッセイなどは、一般的に、例えば米国特許第４，６４２，
２８５号；同第４，３７６，１１０号；同第４，０１６，０４３号；同第３，８
７９，２６２号；同第３，８５２，１５７号；同第３，８５０，７５２号；同第
３，８３９，１５３号；同第３，７９１，９３２号；ならびにＨａｒｌｏｗおよ
びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ
．（１９８８）において記載される。例えば、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、酵
素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびイムノブロッティングのような酵
素イムノアッセイが、容易に適用されて抗体の検出を達成し得る。抗原に結合し
た抗体の検出について有効なＥＬＩＳＡ法は、例えば、以下のようであり得る：
（１）抗原を基質に結合させる；（２）結合した抗原を、抗体を含む体液または
組織サンプルと接触させる；（３）上記のものを、その抗原に特異的、かつ検出
可能な部分（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファ
ターゼ酵素）に結合した二次抗体と接触させる；（４）上記のものをその酵素の
基質と接触させる；（５）上記ものを呈色試薬に接触させる；（６）色の変化を
観察する。

【００８５】この方法の抗体を含有するサンプルは、抗体または抗体を含有する細胞（例え
ば、血液、血漿、血清、骨髄、唾液および尿）を含む任意の生物学的サンプルを
含み得る。

【００８６】本発明はまた、ウイルスをコードする核酸で細胞を形質導入することによりＡ
ＡＶ５ウイルスを産生する方法を提供する。

【００８７】本発明の方法は、さらに、ＡＡＶ逆方向末端反復の対の間に挿入された核酸を
含有するベクターを含むＡＡＶ５粒子を細胞に投与する工程、それにより細胞に
核酸を送達する工程を包含する、細胞への外来（異種の）核酸を送達する方法を
提供する。

【００８８】本明細書中に記載される送達方法のためのベクターにおけるＡＡＶＩＴＲは
、ＡＡＶ５ＩＴＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９および２０）であり得る。さら
に、本明細書中に記載される核酸送達方法についてのベクターにおけるＡＡＶ
ＩＴＲはまた、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４またはＡＡＶ６の逆方
向末端反復を含み得る。

【００８９】本発明はまた、異種核酸を被験体に送達する方法であって、ＡＡＶの逆方向末
端反復の対の間に挿入された核酸を含むベクターを含むＡＡＶ５粒子を被験体由
来の細胞に投与し、そしてその細胞を被験体に戻し、それにより被験体に核酸を
送達する工程を包含する。このＡＡＶＩＴＲは、任意のＡＡＶＩＴＲであり
得、これは、ＡＡＶ５ＩＴＲおよびＡＡＶ２ＩＴＲを含む。例えば、エキソ
ビボ投与において、細胞は、その細胞型に従って標準的な手段により被験体から
単離され、そして再び、細胞型に従って適切な培養培地に配置される（例えば、
ＡＴＣＣカタログを参照のこと）。次いで、ウイルス粒子は、上記の細胞と接触
され、そしてウイルスを、その細胞に導入することが可能である。次いで、細胞
は、再びその細胞型および組織について標準的な手段により被験体の身体に移植
して戻され得る（例えば、一般的には、米国特許第５、３９９、３４６号；神経
細胞については、Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．およびＢｊｏｅｒｋｌｕｎｄ，Ａ．
編、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＮｅｕｒａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ−ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２））。所望であれば、移
植の前に、細胞は、公知の検出手段により、および本明細書中に記載されるよう
に、ウイルスによる形質導入の程度を研究され得る。エキソビボでの形質導入に
続いて被験体に移植される細胞は、上記に挙げた細胞から選択され得るか、また
は任意の他の選択された細胞であり得る。好ましくは、選択された細胞型は、Ａ
ＡＶ５によりトランスフェクトされるその能力について試験される。好ましくは
、選択される細胞は、ＡＡＶ５粒子で容易に形質導入される細胞である；しかし
、この適用に依存して、比較的低い形質導入効率を有する細胞でさえも有用であ
り得、特に、細胞が組織または器官に由来する場合、ベクターにコードされるタ
ンパク質またはアンチセンスＲＮＡがたとえ低い産生量でも、被験体に有利であ
る。

【００９０】本発明はさらに、被験体の細胞に核酸を送達する方法を提供する。これは、Ａ
ＡＶ逆方向末端反復の対の間に挿入された核酸を含むベクターを含むＡＡＶ５粒
子を被験体に投与し、それにより被験体の細胞に核酸を送達する工程を包含する
。投与は、被験体から取り出した細胞（例えば、上記で列挙した任意の細胞）へ
直接的にエキソビボで投与され、続いてその細胞は被験体に戻され得るか、また
は投与は、被験体の細胞へのインビボ投与であり得る。エキソビボ投与のために
、細胞は、細胞型に従った標準的な手段により被験体から単離され、そして再び
細胞型に従って適切な培養培地に配置される（例えばＡＴＣＣカタログを参照の
こと）。次いで、ウイルス粒子は、上記のように細胞と接触され、そしてウイル
スは、細胞にトランスフェクトされる。次いで、細胞は、再びその細胞型および
組織に標準的な手段により被験体の身体に移植して戻され得る（例えば、神経細
胞については、Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．およびＢｊｏｅｒｋｌｕｎｄ，Ａ．編
、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＮｅｕｒａｌＴｌａｎｓｐｌａｎｔａｔ
ｉｏｎ−ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２））。所望であれば、移植
の前に、細胞は、公知の検出手段によりおよび本明細書中に記載されるように、
ウイルスによるトランスフェクションの程度を研究され得る。

【００９１】本発明は、さらに、ＡＡＶ２に対する中和抗体を有する被験体の細胞に核酸を
送達する方法を提供する。これは、核酸を含むベクターを含むＡＡＶ５粒子を被
験体を投与し、これにより、被験体の細胞に核酸を送達する工程を包含する。Ａ
ＡＶ２に対する中和抗体を有する被験体は、任意のいくつかの公知の手段（例え
ば、ＡＡＶ２タンパク質を、被験体からの抗体を含有するサンプル（例えば、血
液）と接触させ、そしてサンプル中の抗原抗体反応を検出すること）により容易
に決定され得る。ＡＡＶ５粒子の送達は、本明細書に記載されるようにエキソビ
ボまたはインビボのいずれかでの投与による送達であり得る。従って、ＡＡＶ２
ウイルス粒子中で投与されるベクターに対する有害な免疫原性反応を有し得る被
験体は、ＡＡＶ５粒子を使用して送達される所望の核酸を有し得る。この送達系
は、過去にＡＡＶ２粒子を利用する治療を受けた被験体およびＡＡＶ２に対する
抗体を発達させた被験体に特に有用であり得る。ＡＡＶ５レジメは、現在、所望
の核酸を送達するために代用され得る。

【００９２】本明細書中に記載される細胞または被験体に異種核酸を送達する任意の方法に
おいて、本明細書中に記載されるＡＡＶ５結合体化核酸またはＡＡＶ５粒子結合
体化核酸が使用され得る。

【００９３】ヒト被験体または動物モデルに対するインビボ投与は、標的の器官、組織また
は細胞に依存して、ウイルスを投与するための任意の多くの標準的な手段により
得る。ウイルス粒子は、経口的に、非経口的（例えば、静脈内）に、筋肉注射に
より、組織または器官への直接注入により、腹腔内注射により、局所的に、経皮
的に、エアロゾル送達を介して、粘膜を介してなどにより投与され得る。ウイル
ス核酸（非キャプシド化）はまた、例えば、カチオン性リポソームとの複合体と
して投与され得るか、またはアニオン性リポソーム中にカプセル化され得る。本
組成物は、薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせにおける種々の量の選択
されたウイルス粒子または非キャプシド化ウイルス核酸を含み得、さらに所望で
あれば、他の医薬剤、薬剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。
使用する場合、非経口投与は、一般的に注射により特徴づけられる。注射可能な
ものは、液体溶液または懸濁液、注射の前に液体中に溶解または懸濁するために
適切な固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、簡便な形態に調製さ
れ得る。投薬量は、投与の様式、処置される疾患または状態、および個々の被験
体の状態に依存するが、他のＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２ベクター）の投
与について代表的であり、そしてそれに使用される投薬量である。しばしば単回
用量が、十分であり得る；しかし、所望される場合、この用量は、反復され得る
。

【００９４】投与方法が使用されて、脳の障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー
病、および脱髄疾患）を処置し得る。これらの方法により処置され得る他の疾患
は、代謝障害（例えば、筋骨格（ｍｕｓｃｏｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ）疾患、心臓
血管疾患、癌および自己免疫障害）を含む。

【００９５】細胞へのこの組換えＡＡＶ５ビリオンの投与は、任意の手段により達成され得
る。これには、単に細胞と粒子（必要に応じて、組織培養培地のような所望の液
体または緩衝化生理食塩水溶液に含まれる）とを接触させることを含む。ビリオ
ンは、任意の所望される長さの時間で細胞と接触したまま維持され得、そして代
表的に、ビリオンは投与されてそして無期限に維持される。そのようなインビト
ロ方法について、ビリオンは、当該分野で公知でありかつ本明細書中で例示され
る、標準的なウイルス形質導入方法により細胞に投与され得る。投与のためのウ
イルスの力価は、特に細胞型に依存して変化し得るが、一般的に当該分野で周知
であるＡＡＶ形質導入について使用されるのに代表的なものである。さらに、本
実施例において特定の細胞を形質導入するために使用される力価が利用され得る
。

【００９６】本発明の組換えＡＡＶ５ビリオンにより形質導入され得る細胞は、任意の所望
の細胞を含み得、それは例えば、以下の細胞および以下の組織由来の細胞を含み
得る：ヒトおよびヒト以外の哺乳動物組織、例えば、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤ
ギ、ブタ、イヌ、ラット、およびマウス：脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、腺
分泌細胞、副腎皮質、羊膜、大動脈、腹水、星状細胞、膀胱、骨、骨髄、脳、乳
房、気管支、心筋、盲腸、頸、絨毛膜、結腸、結膜、結合組織、角膜、真皮、十
二指腸、子宮内膜、内皮、内皮細胞、上皮組織、上皮細胞、表皮、食道、目、筋
膜、線維芽細胞、包皮、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）、グリア細胞、神経膠芽細胞、性
腺、肝細胞、組織球、回腸、腸、小腸、空腸、ケラチノサイト、腎臓、喉頭、白
血球、脂肪細胞（Ｌｉｐｏｃｙｔｅ）、肝臓、肺、リンパ節、リンパ芽球、リン
パ球、マクロファージ、胸部肺胞小節（Ｍａｍｍａｒｙａｌｖｅｏｌａｒｎ
ｏｄｕｌｅ）、乳腺、肥満細胞、上顎骨、メラノサイト、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈ
ｙｍａｌ）、単球、口、ミエリン、筋芽細胞、神経組織、神経芽細胞、ニューロ
ン、神経膠、骨芽細胞、骨形成原細胞、卵巣、口蓋、膵臓、乳頭腫、腹膜、下垂
体細胞、咽頭、胎盤、プラスマ細胞、胸膜、前立腺、直腸、唾液腺、骨格筋、皮
膚、平滑筋、体細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ）、脾臓、扁平上皮細胞（Ｓｑｕａｍｏｕ
ｓ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、顎下腺（Ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒｇｌａｎ
ｄ）、顎下腺（Ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙｇｌａｎｄ）、滑膜細胞（Ｓｙｎｏ
ｖｉｏｃｙｔｅ）、精巣、胸腺、甲状腺、小柱、気管、鼻甲介、臍帯、尿管、お
よび子宮。

【００９７】（有用性の記載）本発明は、ＡＡＶ５に基づく組換えベクターを提供する。このようなベクター
は、赤血球系前駆体細胞またはＡＡＶ２に基づくベクターでは非常に非効率的で
あるヘパリン硫酸プロテオグリカンを欠く細胞の形質導入に有用であり得る。こ
れらのベクターはまた、目的の核酸の遺伝子産物と相互作用する因子をスクリー
ニングするために使用され得る細胞株の産生のために、目的の核酸を用いて細胞
を形質導入するために有用であり得る。他の細胞型の形質導入に加えて、赤血球
系細胞の形質導入は、適合ドナーを使用する骨髄移植により補正され得るガンお
よび遺伝子疾患の処置に有用である。処置のこの型のいくつかの例には、以下が
挙げられるがそれらに限定されない：治療遺伝子（例えば、インターフェロン、
インターロイキン、腫瘍壊死因子、アデノシンデアミナーゼ、細胞増殖因子（例
えば、リンホカイン）、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＶ
因子）、ＥｐｏＥレセプターおよびＬＤＬレセプターのようなタンパク質取り込
みおよびタンパク質輸送するコレステロール代謝物、ならびにウイルス（例えば
、肝炎またはＨＩＶ）の複製を阻害するアンチセンス配列をコードする遺伝子）
の形質導入。

【００９８】本発明は、ＡＡＶ５ウイルスおよびＡＡＶ５ウイルス粒子を含むベクターを提
供する。ＡＡＶ５は、ＡＡＶ２に類似しているが、この２つのウイルスは、本明
細書中で物理的および遺伝的な差異が存在することが見出される。これらの差異
は、遺伝子治療のためのベクターとしてより適合させるいくつかの独特の利点を
ＡＡＶ５に与える。

【００９９】さらに本明細書中に示されるように、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、ＡＡ
Ｖ２キャプシドタンパク質と異なり、そして異なる組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ
）を示す。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は、異なる細胞性レセプターを利用するよう
である。ＡＡＶ２およびＡＡＶ５は、血清学的に異なり、従って、遺伝子治療適
用において、ＡＡＶ５は、天然の免疫学的防御、または以前のＡＡＶ２ベクター
に対する曝露の結果としてのいずれかにより、すでにＡＡＶ２に対する中和抗体
を保有する患者の形質導入を可能にする。

【０１００】本発明は、より詳細に以下の実施例に記載され、これらの多くの変更および改
変が当業者に明らかであるので、これは、例示としてのみ意図される。

【０１０１】（実施例）ＡＡＶ５ウイルスの性質を理解するためおよび遺伝子輸送のためのベクターと
してのその有用性を決定するために、ＡＡＶ５をクローニングおよび配列決定し
た。

【０１０２】（細胞培養およびウイルス増殖）ＣｏｓおよびＨｅＬａ細胞をＤ１０培地（１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／
ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンおよびＩＸＦｕｎｇｉ
ｚｏｎｅを、製造者が推奨するように含むダルベッコ改変イーグル培地）中の単
層培養で維持した；（ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）
。全ての他の細胞型は、以前に報告された標準的な条件下で培養した。

【０１０３】ウイルスを、βガラクトシダーゼベクタープラスミドならびにＡＡＶ５Ｒｅ
ｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むヘルパープラスミドを用いて、ＡＡＶ２につ
いて以前に記載されたように（９）産生した。このヘルパープラスミドを、ヘル
パープラスミドとベクタープラスミドとの間の任意の相同な配列を最小化するよ
うな方法で構築した。この工程を、相同組換えにより野生型（ｗｔ）の粒子形成
能力を最小化するために取り入れた。

【０１０４】（ＤＮＡのクローニングおよび配列決定ならびに分析）ＡＡＶ５のゲノムをクローニングするために、感染細胞溶解物を接着性ｃｏｓ
細胞に展開し、次いで得られるウイルス粒子を有する懸濁ＨｅＬａ細胞を、Ｃｓ
Ｃｌ等密度勾配遠心分離により単離した。勾配画分のアリコートのＤＮＡドット
ブロットは、ウイルスゲノムの最も高い濃度が、約１．３７２の屈折率を有する
画分に含まれることを示した。ウイルスの最初の記載は、粒子の密度を決定しな
かったが、この値は、ＡＡＶ２のものと類似する。これらの画分から得られるア
ニールしたＤＮＡ由来のビリオンの分析は、４．６ｋｂ長の主要な種を示した。
これは、制限分析により、以前に報告されたそれらのバンドと類似したサイズの
バンドを与えた。さらなる制限マッピングは、ウイルスゲノムの片方の末端で独
特のＢｓｓＨＩＩ部位を示した。この部位を使用して、ウイルスゲノムの主要な
フラグメントをクローニングした。さらに重複しているクローンを単離し、そし
て配列を決定した。２つの異なるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同
定した。コンピューター分析は、ＯＲＦの左側が、ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子のＯ
ＲＦと約６０％類似性であることを示した。報告されたＡＡＶ血清型の他の４つ
全ては、このＯＲＦにおいて９０％より高い類似性を有する。ウイルスキャプシ
ドタンパク質の右側のＯＲＦはまた、ＡＡＶ２のキャプシドＯＲＦに対して約６
０％相同性である。報告された他のＡＡＶ血清型についてと同様に、ＡＡＶ５と
ＡＡＶ２との間の相違を、複数のブロックに分類した。イヌパルボウイルスの報
告された３次元構造および配列比較を助けるコンピューターを用いることにより
、これらの多くの相違領域がウイルスの外側に存在することが示され、従って、
変更された組織親和性を示唆した。

【０１０５】ｐ５プロモーター内で多くのコア転写エレメントが、ｔａｔａａボックスおよ
び転写開始部位の周囲のＹＹ１部位のように保存される。しかし、−６０部位で
のＹＹ１部位およびその上流のＥ−Ｂｏｘエレメントは、検出可能ではなく、こ
のことは、調節または活性化の代替的な方法を示唆する。

【０１０６】ウイルスの逆方向末端配列（ＩＴＲ）を、ゲノムの右端由来のフラグメントと
してクローニングした。得られたフラグメントが、ＡＡＶ２と比較して多くの配
列変化を含有することを見出した。しかし、これらの変化は、相補的であること
が見出され、そしてヘアピン構造中におりたたまれるこの領域の能力に影響しな
かった。ヘアピンの基部領域内の２つの配列エレメントは、ウイルス複製の起源
としてのＩＴＲの機能に重要であることが見出されている。Ｒｅｐの認識部位と
して働くＧＡＧＣ／Ｔの反復モチーフおよびＲｅｐ部位および鎖特異的切断反応
の位置であるＲｅｐ結合部位の下流であるＧＧＴＴＧＡＧ配列。この配列は、Ａ
ＡＶ５と他のクローニングされたＡＡＶとの間で保存されない。このことは、Ａ
ＡＶ５のＩＴＲタンパク質およびＲｅｐタンパク質が、他の公知のＡＡＶを補完
し得ないことを示唆する。

【０１０７】ＡＡＶ２ＩＴＲを含むゲノムおよびＡＡＶ５ＩＴＲを含むゲノムの交叉相
補性を試験するために、組換え粒子を、以前に記載したように２型のＲｅｐおよ
びＣａｐまたは５型のＲｅｐおよびＣａｐを発現するプラスミドのいずれかを用
いてパッケージングした。図２に示すように、それぞれの発現プラスミドを使用
して同族のＩＴＲをパッケージングした場合にのみ、ウイルス粒子を産生した。
この結果は、パッケージングにおいて交叉相補性を示したＡＡＶの他の血清型の
結果と異なる。

【０１０８】ＡＡＶ５ＩＴＲについてのＡＡＶ５Ｒｅｐのこの特異性を、Ｒｅｐタンパ
ク質により切断された１つのＩＴＲ内の部位を同定し得る末端分解アッセイ（ｔ
ｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｓａｙ）を使用して確認した。２
型のＩＴＲをともなう５型のＲｅｐタンパク質のインキュベーションは、切断産
物を全く生成しない。対照的に、２型Ｒｅｐの添加は、予想された部位でＤＮＡ
を切断した。しかし、ＡＡＶ５Ｒｅｐは、５型のＩＴＲとともにインキュベー
トした場合に、切断産物を生成しなかった。ＡＡＶ２のＴＲＳと類似するＲｅｐ
結合モチーフ由来の２１塩基の領域でこの部位をマッピングした。ＡＡＶ２のこ
の部位は、ＣＧＧＴＴＧＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）であるが、５型Ｉ
ＴＲのこの部位は、ＣＧＧＴＧＴＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）である。
ＡＡＶ５Ｒｅｐの異なる部位（しかし、同様に配置される部位）で切断する能
力は、ＡＡＶ２と比較して異なる染色体位置で、ＡＡＶ５の組み込みを生じ得る
。

【０１０９】ＡＡＶ５ＲｅｐおよびＣａｐを使用して生成された組換えウイルスを、２型
よりもより大きな力価で得た。例えば、比較研究において、ウイルスを、ＣｓＣ
ｌバンド形成により８×１０⁷のＣＯＳ細胞から単離し、そして勾配を横切るβ
ガラクトシダーゼゲノムの分布を、勾配画分のアリコートのＤＮＡドットブロッ
トにより決定した。ＤＮＡドットブロットの力価は、ＡＡＶ５粒子を、ＡＡＶ２
のレベルより１０〜５０倍高いレベルで産生したことを示した。

【０１１０】このキャプシドタンパク質のＯＲＦにおける配列の相違は、ＡＡＶ２およびＡ
ＡＶ５の組織親和性が異なることを意味する。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２の形質導
入効率を研究するために、種々の細胞型が、核に局在したβガラクトシダーゼ活
性についての遺伝子を発現する精製されたウイルスの段階希釈を用いて形質導入
された。約２×１０⁴の細胞を４８〜６０時間の間、培地を含有する１ｍｌの血
清中でウイルスに曝露した。この時間の後、細胞を固定し、そしてβガラクトシ
ダーゼ活性について５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Ｘｇａｌ）（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて染色
した。生物学的力価を、目盛りつき顕微鏡接眼レンズ（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｏｃｕｌａｒ）を用いて、異なる希釈で陽性細胞の数を
数え、次いで、ウェルの領域まで増やすことにより決定した。力価は、最小の１
０視野／ウェルにおける細胞数の平均により決定した。類似した数の粒子を有す
るｃｏｓ細胞、ＨｅＬａ細胞および２９３細胞ならびにＩＢ３細胞の形質導入は
、ＡＡＶ２の力価と比較してＡＡＶ５の力価の約１０倍の減少を示した。対照的
に、ＭＣＦ７細胞は、形質導入効率の５０〜１００倍の相違を示した。さらに、
両方のベクターは、比較的貧弱にＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入した。

【０１１１】最近の発表は、細胞の表面上のヘパリンプロテオグリカンが、ウイルスの形質
導入に関与することを報告した。可溶性ヘパリンの添加は、ウイルス結合をブロ
ックすることにより形質導入を阻害することが示されている。この形質導入のデ
ータは、ＡＡＶ５およびＡＡＶ２についての組織親和性の差異を示唆するので、
ヘパリンへのＡＡＶ５形質導入の感受性を決定した。１００のＭＯＩにおいて２
０μｇ／ｍｌのヘパリンの添加は、ＡＡＶ５の形質導入に対して効果を有さなか
った。対照的に、このヘパリンの量は、ＡＡＶ２の形質導入の９０％を阻害した
。１０００のＭＯＩにおいてさえ、ＡＡＶ５形質導入の阻害が、検出されなかっ
た。これらのデータは、この組織親和性の研究結果を支持する。すなわち、ＡＡ
Ｖ２およびＡＡＶ５は、異なる細胞表面分子を利用し得、それゆえ、この取り込
みの機構は、同様に異なり得る。

【０１１２】ＡＡＶ５は、配列分析、組織親和性、およびヘパリンに対する感受性に基づい
て、デペンドウイルスファミリーとは異なるウイルスである。Ｐ５プロモーター
のエレメントは、ＡＡＶ２〜６の間で保持されるが、いくつかのエレメントは、
ＡＡＶ５において欠失している。このことは、代替の調節機構を示唆する。ＩＴ
ＲおよびＲｅｐのＯＲＦは、以前に同定されたＯＲＦと異なり、そしてＡＡＶ２
に基づくゲノムのパッケージングを補完することができない。ＡＡＶ５のＩＴＲ
は、ＡＡＶの他の血清型と比較して異なるＴＲＳを含み、これは、ＩＴＲの相補
性の欠如の原因となり得る。この独特のＴＲＳはまた、ＡＡＶ２の組み込み部位
と比較して、ＡＡＶ５について異なる組み込み部位を生じるはずである。さらに
、標準的なパッケージング系を用いる組換えＡＡＶ５粒子の産生は、ＡＡＶ２よ
りも約１０〜５０倍優れている。キャプシドタンパクにおける主要な差異は、パ
ルボウイルスの表面の外側に存在すると提唱されている領域に存在する。これら
の変化は、交叉反応性抗体の欠如およびＡＡＶ２と比較した組織親和性の変化の
原因であるように最も思われる。

【０１１３】ＡＡＶ２のＲｅｐＯＲＦに由来する４つのタンパク質を産生する；ｐ５プロ
モーター（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）は、ｒｅｐ６８（スプライスされた部位
変異体）およびｒｅｐ７８を産生し、そしてｐ１９プロモーター（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）はｒｅｐ４０（スプライスされた部位変異体）およびｒｅｐ５２
を産生する。これらの領域は、ＡＡＶ５のＲｅｐＯＲＦ内で十分には保存され
ていないが、いくつかのスプライスアクセプターおよびドナー部位が、ＡＡＶ２
の部位とほぼ同じ領域に存在する。これらの部位は、標準的なコンピューター分
析プログラム（例えば、ＰＣＧＥＮＥプログラムにおけるシグナル）を用いて同
定され得る。従って、Ｒｅｐタンパク質の配列を、他のＡＡＶの血清型のように
慣用的に同定し得る。

【０１１４】（血球凝集アッセイ）血球凝集活性を基本的に以前に記載されたようにして測定した（Ｃｈｉｏｒｉ
ｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｏｌ．第７１巻６８２３−６８３３）。手短に言
えば、ウイルスのＥＤＴＡ−緩衝化生理食塩水での２倍の段階希釈を、プラスチ
ックのＵ底９６ウェルプレートにおいて０．４％の赤血球を等溶量と混合した。
反応を、８℃での２時間のインキュベーション後に完了した。血球凝集アッセイ
への精製されたＡＡＶ５の添加は、血球凝集活性を生じた。

【０１１５】（気道上皮細胞の形質導入）初代気道上皮細胞を培養し、そして以前に記載されたようにプレーティングし
た（Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．１９９８年７月１日
；１０２（１）：１８４−９３）。細胞を５０ウイルス粒子／細胞（ＭＯＩ５０
）を有する核局在化β−ｇａｌトランスジーンを含む等価な数のｒＡＡＶ２また
はｒＡＡＶ５粒子で形質導入し、そして１０日間培養を継続した。β−ｇａｌ活
性を、（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９５ＨＧＴ第６巻：１５３１−１５４１
）の手順に従って決定し、そして相対的な形質導入効率を比較した。図７に示す
ように、ＡＡＶ５は、これらの細胞にＡＡＶ２よりも５０倍より効率的に形質導
入された。これは、先端細胞（ａｐｉｃａｌｃｅｌｌ）または外気にさらされ
た細胞が遺伝子治療因子により感染されることを示した最初である。

【０１１６】（横紋筋の形質導入）ニワトリ筋芽細胞を培養し、そして以前に記載されたようにプレーティングし
た（ＲｈｏｄｅｓおよびＹａｍａｄａ１９９５ＮＡＲ第２３巻（１２）２
３０５−１３）。細胞を融合させ、次いで、５日間の培養後に、先に上記したよ
うに核に局在したβ−ｇａｌトランスジーンを含む同じ様な粒子数のｒＡＡＶ２
またはｒＡＡＶ５で形質導入した。細胞を（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９５Ｈ
ＧＴ第６巻：１５３１−１５４１）の手順に従ってβ−ｇａｌ活性について染
色し、そして相対的な形質導入効率を比較した。図８に示したように、ＡＡＶ５
は、これらの細胞にＡＡＶ２よりも約１６倍より効率的に形質導入された。

【０１１７】（ラットの脳の外植片の形質導入）初代のラット新生児の脳外植片を以前に記載されたように調製した（Ｓｃｏｒ
ｔｅｇａｇｎａら、Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．１９９７；１８（２）：
３３１−９）。培養の７日後、細胞を以前に上記したように核に局在したβ−ｇ
ａｌトランスジーンを含む同様な粒子数のｒＡＡＶ５で形質導入した。培養の５
日後、細胞を（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９５ＨＧＴ第６巻：１５３１−１
５４１）の手順に従ってβ−ｇａｌ活性について染色した。図９に示したように
、形質導入を、種々の細胞型（星状細胞、神経細胞およびグリア細胞を含む）に
おいて検出した。

【０１１８】（ヒト臍静脈内皮細胞の形質導入）ヒト臍静脈内皮細胞を以前に記載されたように（Ｇｎａｎｔｅｎｋｏら、Ｊ
ＩｎｖｅｓｔｉｇＭｅｄ．１９９７年２月；４５（２）：８７−９８）培養し
、そしてプレーティングした。細胞を、最少培地において、１０ウイルス粒子／
細胞（ＭＯＩ５）を用いて核に局在したβ−ｇａｌトランスジーンを含むｒＡ
ＡＶ２またはｒＡＡＶ５で形質導入し、次いで完全培地に戻した。培養の２４時
間後、細胞をＣｈｉｏｒｉｎｉら（１９９５ＨＧＴ第６巻：１５３１−１５
４１）の手順に従ってβ−ｇａｌ活性について染色し、そして相対的な形質導入
効率を比較した。図１０に示すように、ＡＡＶ５は、これらの細胞にＡＡＶ２よ
りも５〜１０倍より効率的に形質導入された。

【０１１９】本願を通して、種々の刊行物が参照された。その全体においてそれらの刊行物
の開示は、本発明が属する技術水準をより十分に記載するために、本願において
本明細書中に参照として援用される。

【０１２０】本発明のプロセスは、その特定の実施態様の詳細を参照して記載されるが、そ
のような詳細が、添付の特許請求の範囲に含まれる範囲を除いて本発明の範囲を
制限するとみなされることが意図されない。

【０１２１】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヘパリン阻害の結果を示す。Ｃｏｓ細胞を、１２ウェル皿中に１ウェ
ルあたり５×１０⁴個の細胞でプレートした。以前に記載されるように生成およ
び精製し、そして５×１０⁵粒子のｗｔアデノウイルスを補充したＡＡＶ２また
はＡＡＶ５の連続希釈物を、２０μｇ／ｍｌヘパリン（ｓｉｇｍａ）の存在下で
、室温にて１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、このウイ
ルスを、４００μｌの培地中の細胞に１時間添加し、その後この培地を除去し、
この細胞をリンスし、そして新鮮な培地を添加した。２４時間後、このプレート
をＢｇａｌ活性のために染色した。

【図２】図２は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５ベクターならびにヘルパー相補性を示す。組
換えＡＡＶ粒子を、グラフの下部に示されるような種々のベクターおよびヘルパ
ープラスミドを使用して、以前に記載されるように生成した。ベクタープラスミ
ドは、Ｂｇａｌ遺伝子、およびＡＡＶ２ＩＴＲ（２ＩＴＲ）またはＡＡＶ５
ＩＴＲ（５ＩＴＲ）のいずれかに隣接したＲＳＶプロモーターを含んでいた。試
験されるヘルパープラスミドは、変化する量（１）または（．５）あるいは空の
ベクター（ｐＵＣ）においてＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子（２ｒｅｐ）のみのＳＶ４０
プロモーター（それぞれ、５ｒｅｐｃａｐＡおよび５ｒｅｐｃａｐｂ）を有する
か、または有さないかのいずれかで、ＡＡＶ２Ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（２ｒ
ｅｐｃａｐ）ＡＡＶ５ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含んだ。次いで、得られたＡ
ＡＶ粒子を、ｃｏｓ細胞上に滴定した。同じ血清型のＩＴＲおよびＲｅｐが存在
した場合、ＡＡＶ粒子を生成するのみであった。

【図３】図３は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５の組織親和性を示す。種々の細胞型の形質導
入は、異なる効率を有するＡＡＶ２形質導入細胞およびＡＡＶ５形質導入細胞を
示した。同じ数のＡＡＶ２またはＡＡＶ５のいずれかの粒子を使用して、種々の
細胞型を形質導入し、そしてｂｇａｌ陽性細胞の数を報告した。

【図４】図４は、ＡＡＶ２ゲノムおよびＡＡＶ５ゲノムの配列の比較である。

【図５】図５は、ＡＡＶ２ＶＰ１キャプシドタンパク質およびＡＡＶ５ＶＰ１キャ
プシドタンパク質の配列の比較である。

【図６】図６は、ＡＡＶ２ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ５ｒｅｐ７８タンパク質
の配列の比較である。

【図７】図７は、ＡＡＶ５による気道上皮細胞の形質導入を示す。初代気道上皮細胞を
、培養およびプレートした。細胞を、５０個の粒子のウイルス／細胞（ＭＯＩ５
０）を用いて、核局在したβ−ｇａｌトランスジーンを含む等価な数のｒＡＡＶ
２粒子またはｒＡＡＶ５粒子を用いて形質導入し、そして１０日間培養を続けた
。β−ｇａｌ活性を決定し、そして相対的形質導入効率を比較した。ＡＡＶ５は
、ＡＡＶ２よりも５０倍効率的にこれらの細胞を形質導入した。これは、先端細
胞または空気に曝された細胞が遺伝子治療薬剤によって感染されたことを示した
最初の例である。

【図８】図８は、ＡＡＶ５による横紋筋の形質導入を示す。ニワトリ筋芽細胞を培養し
、そしてプレートした。細胞を融合させ、次いで、培養の５日後に、核局在した
β−ｇａｌトランスジーンを含む類似の数のｒＡＡＶ２粒子またはｒＡＡＶ５粒
子を用いて形質導入した。この細胞を、β−ｇａｌ活性のために染色し、そして
相対的な形質導入効率を比較した。ＡＡＶ５は、これらの細胞をＡＡＶ２よりも
約１６倍効率的に形質導入する。

【図９】図９は、ＡＡＶ５によるラット脳外植片の形質導入を示す。初代新生児ラット
脳外植片を調製した。培養の７日後、細胞を、核局在したβ−ｇａｌトランスジ
ーンを含む類似の数のｒＡＡＶ５粒子を用いて形質導入した。培養の５日後、こ
の細胞をβ−ｇａｌ活性のために染色した。形質導入を、種々の細胞型（星状細
胞、ニューロン細胞およびグリア細胞を含む）において検出した。

【図１０】図１０は、ＡＡＶ５によるヒト臍静脈内皮細胞の形質導入を示す。ヒト臍静脈
内皮細胞を、培養およびプレートした。細胞を、最小培地中の１０個の粒子のウ
イルス／細胞（ＭＯＩ５）を用いて、核局在したβ−ｇａｌトランスジーンを含
むｒＡＡＶ２粒子またはｒＡＡＶ５粒子を用いて形質導入し、次いで、完全培地
に戻した。培養の２４時間後、この細胞をβ−ｇａｌ活性のために染色し、そし
て相対的な形質導入効率を比較した。ＡＡＶ５において示されるように、これら
の細胞をＡＡＶ２よりも５〜１０倍効率的に形質導入した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者コティン，ロバートエム．アメリカ合衆国メリーランド 20817，ベセスダ，ブロックスバーンドライブ 6510 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB03 FB04 4B024 AA11 AA20 CA01 EA02 FA02 GA11 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ79 QQ96 QR48 QR56 QS33 QX01 4B065 AA95Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA45 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA01 DA50 EA29 EA31 EA53 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸ベクターであって、アデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）
の１対の逆方向末端反復、および該逆方向末端反復の間にプロモーターを含有す
る、ベクター。
【請求項２】前記プロモーターがＡＡＶプロモーターｐ５である、請求項
１に記載のベクター。
【請求項３】前記ｐ５プロモーターがＡＡＶ５ｐ５プロモーターである
、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】前記プロモーターに機能的に連結された外因性核酸をさらに
含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】アデノ随伴ウイルス粒子中にキャプシド化された、請求項１
に記載のベクター。
【請求項６】前記粒子がＡＡＶ５粒子である、請求項５に記載の粒子。
【請求項７】前記粒子がＡＡＶ１粒子、ＡＡＶ２粒子、ＡＡＶ３粒子、Ａ
ＡＶ４粒子、またはＡＡＶ６粒子である、請求項５に記載の粒子。
【請求項８】ＡＡＶ５の１対の逆方向末端反復を含むベクターを含む、組
換えＡＡＶ５ビリオン。
【請求項９】前記ベクターが、前記逆方向末端反復の間に挿入された外因
性核酸をさらに含む、請求項８に記載のビリオン。
【請求項１０】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、単離され
た核酸。
【請求項１１】配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる、単離さ
れた核酸。
【請求項１２】請求項１１に記載の核酸に選択的にハイブリダイズする、
単離された核酸。
【請求項１３】アデノ随伴ウイルス５のＲｅｐタンパク質をコードする、
単離された核酸。
【請求項１４】前記アデノ随伴ウイルス５のＲｅｐタンパク質が配列番号
２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】前記アデノ随伴ウイルス５のＲｅｐタンパク質が配列番号
３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】前記アデノ随伴ウイルス５のＲｅｐタンパク質が配列番号
１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１７】前記アデノ随伴ウイルス５のＲｅｐタンパク質が配列番号
１４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１８】単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質。
【請求項１９】配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する請求項１８に
記載の単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質、またはその独特のフラグメント
。
【請求項２０】配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する請求項１８に
記載の単離されたＡＡＶ５Ｒｅｐタンパク質、またはその独特のフラグメント
。
【請求項２１】請求項１８に記載のタンパク質に特異的に結合する、単離
された抗体。
【請求項２２】単離されたＡＡＶ５キャプシドタンパク質。
【請求項２３】配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２２
に記載の単離されたＡＡＶ５キャプシドタンパク質。
【請求項２４】請求項２３に記載のタンパク質に特異的に結合する、単離
された抗体。
【請求項２５】配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２２
に記載の単離されたＡＡＶ５キャプシドタンパク質。
【請求項２６】請求項２５に記載のタンパク質に特異的に結合する、単離
された抗体。
【請求項２７】配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２２
に記載の単離されたＡＡＶ５キャプシドタンパク質。
【請求項２８】請求項２７に記載のタンパク質に特異的に結合する、単離
された抗体。
【請求項２９】請求項２２に記載のタンパク質をコードする、単離された
核酸。
【請求項３０】配列番号７に示される核酸配列を有する、請求項２９に記
載の核酸。
【請求項３１】配列番号８に示される核酸配列を有する、請求項２９に記
載の核酸。
【請求項３２】配列番号９に示される核酸配列を有する、請求項２９に記
載の核酸。
【請求項３３】請求項２９に記載の核酸に選択的にハイブリダイズする、
単離された核酸。
【請求項３４】配列番号６に示されるアミノ酸配列から本質的になるキャ
プシドタンパク質を含む、ＡＡＶ５粒子。
【請求項３５】ＡＡＶ５のｐ５プロモーターを含む、単離された核酸。
【請求項３６】ＡＡＶ５による感染性について細胞をスクリーニングする
方法であって、該細胞をＡＡＶ５に接触させる工程および該細胞におけるＡＡＶ
５の存在を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３７】被験体への投与についてのＡＡＶ５ベクターの適合性を決
定する方法であって、該被験体由来の抗体含有サンプルを請求項２２に記載のタ
ンパク質の抗原性フラグメントに接触させる工程および該サンプルにおける抗体
−抗原反応を検出する工程であって、中和反応の存在が該ＡＡＶ５ベクターが該
被験体における使用に適切でないことを示す、工程を包含する、方法。
【請求項３８】被験体におけるＡＡＶ５特異的抗体の存在を決定する方法
であって、該被験体由来の抗体含有サンプルを請求項２２に記載のタンパク質の
抗原性フラグメントに接触させる工程および該サンプルにおける抗体−抗原反応
を検出する工程であって、反応の存在が該被験体におけるＡＡＶ５特異的抗体の
存在を示す、工程を包含する、方法。
【請求項３９】核酸を細胞に送達する方法であって、ＡＡＶの１対の逆方
向末端反復の間に挿入された該核酸を含むベクターを含むＡＡＶ５粒子を該細胞
に投与し、それにより該核酸を該細胞に送達する工程を包含する、方法。
【請求項４０】前記ＡＡＶの逆方向末端反復がＡＡＶ５の逆方向末端反復
である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】被験体に核酸を送達する方法であって、ＡＡＶの１対の逆
方向末端反復の間に挿入された該核酸を含むＡＡＶ５粒子を該被験体由来の細胞
に投与する工程、および該細胞を該被験体に戻し、これにより該核酸を該被験体
に送達する工程を包含する、方法。
【請求項４２】被験体中の細胞に核酸を送達する方法であって、ＡＡＶの
１対の逆方向末端反復の間に挿入された該核酸を含むＡＡＶ５粒子を該被験体に
投与し、これにより該核酸を該被験体中の細胞に送達する工程を包含する、方法
。
【請求項４３】ＡＡＶ２に対する抗体を有する被験体中の細胞に核酸を送
達する方法であって、該核酸を含むＡＡＶ５粒子を該被験体に投与し、これによ
り該核酸を該被験体中の細胞に送達する工程を包含する、方法。
【請求項４４】配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸。
【請求項４５】配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸。