BR112020008835A2 - genes de aga otimizados e cassetes de expressão e seu uso - Google Patents

Abstract

Essa invenção refere-se a polinucleotídeos que compreendem quadros de leitura abertos otimizados de aspartilglicosaminidase (AGA) e vetores e células que compreendem os mesmos. A invenção refere-se ainda a métodos de uso das mesmas para liberação do quadro de leitura aberto em uma célula ou um indivíduo e métodos de tratamento da aspartilglicosaminúria (AGU) em um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “GENES DE AGA OTIMIZADOS E CASSETES DE EXPRESSÃO E SEU USO”.

DECLARAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/ 582.664, depositado em 7 de novembro de 2017, cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência. Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se a polinucleotídeos que com- preendem sequências de quadro de leitura aberto (ORF) de AGA otimi- zado, vetores que compreendem as mesmas e métodos de uso das mesmas para liberação da ORF em uma célula ou em um indivíduo e para tratar aspartilglicosaminúria (AGU). Antecedentes da Invenção

[003] A aspartilglicosaminidase (AGA, N4-(B-N-acetilglicosaminil)- L-asparaginase, EC 3.5.1.26) é uma hidrolase lisossômica que participa de uma das etapas finais durante a degradação das proteínas N-glico- siladas. A AGA cliva a ligação entre a N-acetilglicosamina e a aspara- gina depois que o arcabouço do polipeptídeo foi degradado. AGA é sin- tetizado como uma molécula precursora de cadeia única que logo após a síntese no retículo endoplasmático é clivada em duas subunidades após a dimerização de duas moléculas precursoras. Essa clivagem au- tocatalítica ocorre entre os resíduos Asp205 e Thr206 e resulta na ati- vação da enzima. A forma ativa final de AGA é um heterotetrâmero de duas subunidades a e duas B (282). AGA pertence ao grupo das assim chamadas hidrolases de nucleófilo N-terminal (NTN), pois o grupo a- amino livre de Thr206 está envolvido na catálise como a base, enquanto que o grupo OH de Thr206 funciona como nucleófilo durante a catálise. Os membros da família da hidrolase NTN, que em adição de AGA tam- bém incluem, por exemplo, a subunidade B do proteassoma e a penici- lina acilase, mostram muito pouca similaridade a nível da sequência de aminoácidos, mas exibem uma estrutura enovelada altamente seme- lhante.

[004] Mutações no gene que codifica AGA resultam em aspartilgli- cosaminúria (AGU, OMIM 208400), um distúrbio de armazenamento li- sossômico que é caracterizado por retardo mental progressivo e algu- mas anormalidades esqueléticas. Os pacientes com AGU nascem apa- rentemente normais, mas o curso progressivo da doença se manifesta em, por exemplo, atraso no desenvolvimento, perda da fala e caracte- rísticas faciais grosseiras precoces na infância. Na idade adulta, a mai- oria dos pacientes com AGU é severamente retardada e requer cuida- dos especiais. A AGU é uma doença rara com prevalência desconhe- cida na maioria das populações, mas é elevada na população finlan- desa. Devido ao efeito fundador, um defeito genético específico desig- nado como AGUrFin-major, é encontrado na forma homozigótica na maioria dos pacientes finlandeses com AGU, embora os pais não mostrem ne- nhuma consanguinidade. O segundo alelo mais comum na Finlândia, e também em todo o mundo, é uma deleção chamada AGUrFin-minor. Fora da Finlândia, a maioria dos pacientes tem suas mutações individuais, na forma homozigótica, quando originadas de casamentos consanguíi- neos ou como mutações heterozigotas compostas.

[005] Nenhum tratamento está disponível para curar ou retardar o progresso da AGU. Transplantes de medula óssea para substituir a en- zima ausente foram tentados, mas os resultados foram inconclusivos. À terapia de reposição enzimática não é viável, pois a enzima AGA é difícil de produzir de forma recombinante devido a inúmeras modificações pós-traducionais, a estrutura complexa da subunidade, a frequência da dosagem e a incapacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (Dunder et al., FASEB J. 14:361 (2000); Dunder et al., J. Inhert. Metab. Dis.33: 611 (2010)).

[006] A presente invenção supera deficiências na técnica ao forne- cer genes AGA otimizados, cassetes de expressão e vetores capazes de fornecer níveis terapêuticos de expressão de AGA para o tratamento de distúrbios associados à expressão de AGA, tais como AGU. Sumário da Invenção

[007] A presente invenção é baseada, em parte, no desenvolvi- mento de genes AGA otimizados, cassetes de expressão e vetores ca- pazes de fornecer níveis terapêuticos de expressão de AGA para o tra- tamento de distúrbios associados com a expressão de AGA, tal como AGU.

[008] Assim, um aspecto da invenção se refere a um polinucleotí- deo que compreende um quadro de leitura aberto de AGA humano, em que a sequência de nucleotídeos foi otimizada por códon para expres- são em células humanas.

[009] Um aspecto adicional da invenção se refere a um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que compreende um quadro de leitura aberto de AGA humano e vetores, células transforma- das e animais transgênicos que compreendem o polinucleotídeo da in- venção.

[0010] Outro aspecto da invenção se refere a uma formulação far- macêutica que compreende o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada da invenção em um veículo farmaceuti- camente aceitável.

[0011] Um aspecto adicional da invenção se refere a um método de expressar um quadro de leitura aberto de AGA em uma célula, que com- preende o contato da célula com o polinucleotídeo, cassete de expres- são e/ou vetor da invenção, expressando dessa maneira o quadro de leitura aberto de AGA na célula.

[0012] Um aspecto adicional da invenção se refere a um método para expressar um quadro de leitura aberto de AGA em um indivíduo,

que compreende liberar no indivíduo o polinucleotídeo, cassete de ex- pressão, vetor e/ou célula transformada da invenção, expressando dessa maneira o quadro de leitura aberto de AGA no indivíduo.

[0013] Um aspecto adicional da invenção se refere a um método de tratamento de um distúrbio associado com a expressão aberrante de um gene de AGA ou atividade aberrante de um produto do gene de AGA em um indivíduo necessitado, que compreende liberar para o indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada da invenção, tratando dessa maneira o distúrbio associado à expressão aberrante do gene de AGA no indivíduo.

[0014] Outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada da invenção para uso em um método de tratamento de um distúrbio associado à expres- são aberrante de um gene de AGA ou atividade aberrante de um pro- duto genético de AGA em um indivíduo necessitado

[0015] Estes e outros aspectos da invenção são apresentados em mais detalhes na descrição da invenção abaixo. Breve Descrição dos Desenhos

[0016] A Figura 1 mostra um mapa do vetor de vírus adeno-associ- ado da invenção.

[0017] A Figura 2 mostra a biodistribuição de AAV9/GFP em ca- mundongos WT. Camundongos WT C57BL1/6 de oito semanas de idade receberam uma única injeção IT lombar do vetor scAAV9/CBh- GFP em uma dose de 4,15 x 10º vg por camundongo. 4 semanas após a injeção, a imuno-histoquímica do cérebro e da medula espinhal foi re- alizada para visualizar a distribuição espacial da expressão de GFP (pai- nel superior; n = 4) e a qPCR foi realizada para quantificar a biodistribui- ção do vetor através do sistema nervoso e dos tecidos periféricos (painel inferior; n = 5) Barras são a média, + SEM.

[0018] A Figura 3 mostra o plano de estudo de eficácia, duração e leituras. As doses foram administradas aos camundongos com idade de 2 meses (pré-sintomáticos) ou 6 meses (após o início da patologia ce- rebral degenerativa). As leituras do estudo em cada ponto de tempo após a administração da dose ou na idade especificada são listadas da esquerda para a direita.

[0019] A Figura 4 mostra a atividade de AGA no soro depois da terapia com AAV9/AGA. A terapia foi administrada aos camundongos com idade de 2 meses (esquerda; n 2 15 por coorte) ou 6 meses (direita; n> 15 por coorte) através de injeção IV ou IT. A atividade de AGA foi ensaiada no soro amostrado em 1, 4, 24 e/ou 48 semanas após a tera- pia com AAV9/AGA. Os dados são apresentados como média + sem, em uma escala logarítmica.

[0020] A Figura 5 mostra uma acumulação reduzida de substrato após terapia genética com AAV9/AGA. Camundongos com seis meses de idade foram tratados (IV ou IT) e aos 18 meses de idade foram cole- tadas amostras de tecido e fluido corporal. As amostras foram ensaia- das para quantificar o substrato. Os dados são apresentados como mé- dia + sem. Os grupos AGU +/- e -/- não tratados foram comparados pelo teste de Mann-Whitney. Os grupos AGU -/- não tratados e tratados fo- ram comparados com um teste de comparação múltipla de Dunnett com Kruskal-Wallis (***p<0,005; **p<0,01; *p<0,05). Painel inferior esquerdo: Os camundongos com 6 meses de idade foram tratados com 2x10** vg de AAV9/AGA IV. Os níveis de substrato na urina voltaram ao normal quatro semanas após a injeção e são mantidos em níveis mais baixos (semana 8).

[0021] A Figura 6 mostra o acúmulo de substrato no tecido cerebral. Os camundongos receberam uma dose única aos 6 meses. A análise do cérebro por MRS foi realizada quando os camundongos tinham 16 meses de idade. Os dados são apresentados como média + sem. Os grupos AGU +/- e -/- não tratados foram comparados usando o teste de Mann-Whitney. Os grupos AGU -/- não tratados e tratados foram com- parados por um teste de comparação múltipla de Dunnett com Kruskal- Wallis (***p<0,005; **p<0,01; *p<0,05).

[0022] A Figura 7 mostra que tratamentos com alta dose com AAV9/AGA resgata a mobilidade. Os camundongos receberam uma dose única aos 6 meses e o teste foi administrado aos 14 meses de idade. Os camundongos foram autorizados a inspecionar um campo aberto. A distância percorrida nos primeiros 5 minutos (painel superior), o tempo gasto em movimento (mobilidade, abaixo à esquerda) e o tempo gasto parado (imobilidade, abaixo à direita) foram registrados e quantificados pelo sistema de rastreamento de vídeo Noldus automati- zado. Os dados são apresentados como média + sem. O teste de Mann- Whitney comparou o grupo AGU +/- com -/- não tratados. Os grupos AGU -/- não tratados e tratados foram comparados por ANOVA de uma via, seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunn (***p<0,005; **p <0,01; *p <0,05).

[0023] A Figura 8 mostra que a terapia com gene preserva as po- pulações de células de Purkinje. Os camundongos com AGU KO rece- beram uma dose única de AAV9/AGA aos 6 meses e o cérebro dos ca- mundongos foi coletado aos 18 meses de idade. O tecido cerebral fixado seccionado com 5 yu de espessura foi corado com hematoxilina e eosina (painel superior). As células de Purkinje (seta) são identificadas em fi- guras representativas de cada coorte. As células de Purkinje foram quantificadas para cada coorte (painel inferior). Os dados são apresen- tados como média + sem. O teste de Mann-Whitney comparou o grupo AGU +/- com -/- não tratados. Os grupos AGU -/- não tratados e tratados foram comparados por ANOVA de uma via, seguida pelo teste de com- paração múltipla de Dunn (**p <0,01; *p <0,05).

[0024] As Figuras 9A-9H mostram uma comparação do processa- mento e atividade de variantes de AGA naturais e otimizadas. As vari- antes SNP149-AGA foram expressas transitoriamente em células (A) HEK293T ou (B) HeLa. O plasmídeo pcDNA3 vazio serviu como con- trole. Western blot com anticorpo anti-AGA mostra o processamento correto de todas os construtos, com um nível de expressão mais alto dos construtos otimizados por códon. (C, D). Os sinais de Western blot foram quantificados e normalizados para a atividade da renila luciferase para corrigir a eficiência da transfecção. A atividade de AGA (E, F) foi medida nos mesmos lisados celulares utilizados para o Western blot. À atividade de AGA foi normalizada para a atividade de renila luciferase. A atividade de AGA (G, H) foi normalizada para a quantidade de prote- ína AGA. N = 5, mostrado como média + SD. Análise estatística por One-Way Anova.

Descrição Detalhada da Invenção

[0025] A presente invenção é explicada em mais detalhes abaixo. Esta descrição não pretende ser um catálogo detalhado de todas as di- ferentes maneiras pelas quais a invenção pode ser implementada ou de todas as funcionalidades que podem ser adicionados à presente inven- ção. Por exemplo, as funcionalidades ilustradas em relação a uma mo- dalidade podem ser incorporadas em outras modalidades e as funcio- nalidades ilustradas em relação a uma modalidade particular podem ser excluídas dessa modalidade. Além disso, numerosas variações e adi- ções às várias modalidades sugeridas aqui ficarão evidentes para aque- les versados na técnica à luz da presente descrição que não se afastam da presente invenção. Portanto, o seguinte pedido pretende ilustrar al- gumas modalidades particulares da invenção e não especificar exausti- vamente todas as permutações, combinações e variações das mesmas.

[0026] A menos que o contexto indique de outra maneira, é preten- dido especificamente que as várias características da invenção aqui descritas possam ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a presente invenção também contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui estabelecidas podem ser excluídas ou omitidas. Para ilustrar, se o pedido estabelecer que um complexo compreende os componentes A, BecC, é pretendido especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma combinação dos mesmos, possa ser omitido e rejeitado singular- mente ou em qualquer combinação

[0027] A menos que definido de outra maneira, todos os termos téc- nicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comu- mente entendido por aquele versado na técnica ao qual esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui apresen- tada tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares e não é pretendida ser limitante da invenção.

[0028] As sequências de nucleotídeos são aqui apresentadas ape- nas pela fita simples, na direção 5' para 3', da esquerda para a direita, a menos que seja especificamente indicado de outra forma. Os nucleo- tídeos e aminoácidos são aqui representados da maneira recomendada pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission ou (para ami- noácidos) pelo código de uma letra ou pelo código de três letras, ambos de acordo com 37 C.F.R. 81.822 e uso estabelecido.

[0029] Exceto quando indicado de outra maneira, os métodos pa- dronizados conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser uti- lizados para a produção de polipeptídeos recombinantes e sintéticos, anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno, manipulação de sequências de ácidos nucleicos, produção de células transformadas, construção de construtos de rAAV , proteínas do capsídeo modificadas, vetores de empacotamento que expressam as sequências rep e/ou cap de AAV e células de empacotamento estavelmente e transitoriamente transfectadas. Tais técnicas são conhecidas por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, SAMBROOK et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F.

M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOL- OGY (Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., Nova York).

[0030] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, se- quências de nucleotídeos, sequências de aminoácidos e outras referên- cias aqui mencionadas estão incorporadas por referência na sua totali- dade.

Definições

[0031] Como usado na descrição da invenção e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "o/a", "um/uma" também pretendem in- cluir as formas no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0032] Como usado aqui, "e/ou" se refere a e abrange toda e qual- quer combinação possível de um ou mais dos itens associados listados, assim como a falta de combinações quando interpretadas em alternativa ("ou").

[0033] Além disso, a presente invenção também contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer funcionalidade ou combi- nação de funcionalidades estabelecidas aqui podem ser excluídas ou omitidas.

[0034] Além disso, a expressão "cerca de", como usada aqui, quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade de um composto ou agente desta invenção, dose, tempo, temperatura e semelhantes, pretende abranger variações de +10%, +5%, + 1%, +0,5% ou até + 0,1% da quantidade especificada.

[0035] Como usada aqui, a frase de transição "que consiste essen- cialmente em” deve ser interpretada como abrangendo os materiais ou etapas citados e aqueles que não afetam materialmente as característi- cas básicas e novas da invenção reivindicada. Assim, a expressão "que consiste essencialmente em” como usada aqui não deve ser interpre- tada como equivalente a "que compreende”.

[0036] A expressão "consiste essencialmente em (e variantes gra- maticais), conforme aplicada a uma sequência de polinucleotídeos ou de polipeptídeo desta invenção, significa um polinucleotídeo ou polipep- tídeo que consiste na sequência citada (por exemplo, SEQ ID NO) e um total de dez ou menos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) nu- cleotídeos ou aminoácidos adicionais nas extremidades 5' e/ou 3' ou N- terminal e/ou C-terminal da sequência citada ou entre as duas extremi- dades (por exemplo, entre domínios), de modo que a função do polinu- cleotídeo ou polipeptídeo não seja materialmente alterada. O total de dez ou menos nucleotídeos ou aminoácidos adicionais inclui o número total de nucleotídeos ou aminoácidos adicionais adicionados juntos. À expressão "materialmente alterado", como aplicada aos polinucleotí- deos da invenção, se refere a um aumento ou diminuição na capacidade de expressar o polipeptídeo codificado de pelo menos cerca de 50% ou mais em comparação com o nível de expressão de um polinucleotídeo que consiste na sequência citada. A expressão "materialmente alte- rado", como aplicada aos polipeptídeos da invenção, se refere a um au- mento ou diminuição da atividade biológica de pelo menos cerca de 50% ou mais em comparação com a atividade de um polipeptídeo que con- siste na sequência citada.

[0037] A expressão "parvovírus", como usada aqui, abrange a famí- lia Parvoviridae, que inclui parvovírus de replicação autônoma e depen- dovírus. Os parvovírus autônomos incluem membros dos gêneros Par- vovirus, Eritrovírus, Densovirus, Iteravirus e Contravirus. Parvovírus au- tônomos exemplificadores incluem, mas não estão limitados a, vírus mi- nuto de camundongo, parvovírus bovino, parvovírus canino, parvovírus de galinha, vírus de panleucopenia felina, parvovírus felino, parvovírus de ganso, parvovírus H1, parvovírus de pato de moscóvia, parvovírus de cobra e vírus B19. Outros parvovírus autônomos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, FIELDS et al., VIROL- OGY, volume 2, capítulo 69 (4º ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0038] O gênero Dependovirus contém os vírus adeno-associados (AAV), incluindo mas não limitados a AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluindo tipos 3A e 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV tipo 12, AAV tipo 13, AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV de cabra, AAV de cobra, AAV equino e AAV de ovino. Ver, por exemplo, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, capítulo 69 (4º ed., Lippincott-Raven Publishers); e Tabela 1.

[0039] A expressão "vírus adeno-associado" (AAV) no contexto da presente invenção inclui sem limitação AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluindo os tipos 3A e 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino e AAV ovino e qualquer outro AAV conhecido agora ou descoberto mais tarde. Veja, por exemplo, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, capítulo 69 (4º ed., Lippincott-Raven Publishers). Um número adicional de sorotipos e cla- dos adicionais de AAV foi identificado (veja, por exemplo, Gao et al. (2004) J Virol. 78: 6381-6388 e Tabela 1), que também são englobados pela expressão "AAV".

[0040] As partículas e genomas de parvovírus da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a AAV. As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV e os parvovírus autônomos, assim como as sequências das ITRs nativas, proteínas Rep e subunidades do capsídeo são conhecidas na técnica. Tais sequências podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos, como o GenBank. Veja, por exemplo, Números de Acesso ao GenBank NC 002077, NC 001401, NC 001729, NC 001863, NC 001829, NC 001862, NC 000883, NC 001701, NC 001510, NC 006152, NC 006261, AFO63497, U89790, AFO43303, AFO28705, AFO28704, JO2275, JO1901, JO2275, X01457, AF288015, AHOO9962, AYO28226, AYO28223, AYG631966, AX753250, EU285562, NC 001358, NC 001540, AF513851, AF513852 e AY530579; cujas descrições são incorporadas por referên- cia aqui para ensinar sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de parvovírus e AAV. Veja também, por exemplo, Bantel-Schaal et al., (1999) Ju. Virol. 73: 939; Chiorini et al., (1997) J. Virol. 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al., (2004) Virol. 33-:375-383; Mori et a/., (2004) Virol. 330:375; Muramatsu et a/l., (1996) Virol. 221:208; Ruffing et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:3385; Rutledge et a/l., (1998) J. Virol. 72:309; Schmidt et a/., (2008) J. Virol. 82:8911; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Srivastava et al., (1983) J. Virol. 45:555; Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994; publicações de patentes internacionais WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; e Patente U.S. No. 6.156.303; cujas des- crições estão incorporadas aqui por referência aqui para ensinar se- quências de ácidos nucleicos e aminoácidos de parvovírus e AAV. Veja também a Tabela 1. Uma descrição inicial das sequências de ITR de AAV1, AAV2 e AAV3 é fornecida por Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associado vírus (AAV) DNA replication and integration ", Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (aqui incorporada na sua totalidade).

[0041] Uma sequência codificadora “quimérica” do capsídeo do ácido nucleico de AAV ou proteína do capsídeo de AAV é aquela que combina porções de duas ou mais sequências do capsídeo. Um vírion ou partícula de AAV "quimérico" compreende uma proteína do capsídeo de AAV quimérico.

[0042] A expressão "tropismo", como usada aqui, se refere à en- trada preferencial do vírus em certos tipos de células ou tecidos e/ou interação preferencial com a superfície celular que facilita a entrada em certos tipos de células ou tecidos, opcional e preferencialmente seguido pela expressão (por exemplo, transcrição e, opcionalmente, tradução) de sequências transportadas pelo genoma viral na célula, por exemplo, para um vírus recombinante, expressão da(s) sequência(s) de nucleotí- deos heteróloga(s). Aqueles versados na técnica apreciarão que a transcrição de uma sequência de ácido nucleico heteróloga do genoma viral não pode ser iniciada na ausência de fatores trans-atuantes, por exemplo, para um promotor induzível ou sequência de ácido nucleico regulada de outra maneira. No caso de um genoma de rAAV, a expres- são do gene do genoma viral pode ser a partir de um pró-vírus integrado estavelmente e/ou a partir de um epissoma não integrado, assim como de qualquer outra forma que o ácido nucleico do vírus possa assumir dentro da célula.

[0043] A expressão "perfil de tropismo" refere-se ao padrão de transdução de uma ou mais células, tecidos e/ou órgãos alvo. Exemplos representativos de capsídeos quiméricos de AAV têm um perfil de tro- pismo caracterizado pela transdução eficiente de células do SNC com apenas baixa transdução de órgãos periféricos. Tabela 1

Tora de AGO, Woero de Ressso Gui Genomas Completos — | Número de Acesso GenBank GenBank Bank [ue | eme | [em | es | [De | we] [essa |O es emo | es | O er [asas TO ER TT e e [Tras | E TT e a [ms | E | Rr e | a [eme [e e O mes | [omareemenen | | | e | mes [| | e | es | AAVATCC VR6S Avíário no Avsa0620 arassoo2 NC 004828 o ese e ar | a O see LES as ss os ss LE am is e as se LT SS joe | es [| | nes | ”” ssos1s Assossa no ssos2s - ssossa nos vssoses Ps ssosss nos — Rs7 Avssoseo LE To je | eee [| e | | nos Avssosss Ro —— Secos xd ELLE cn Dc O mg mm | nm | 505 jo LD A O e e en | ELLE a Re ee ee LD A e e a ie | ELLE o e o ses ELLE Ao Rs e o Ro se Foo dl Cn de e ee E ELE es e as | esse eso a vasos ao | Nesta | ELLE o e a es E sso Rs avaos es ar | o” o eee e am | EF o 0044 A ão "distúrbi iado à ão ab d [ ] expressão "distúrbio associado à expressão aberrante de um gene de AGA", conforme usada aqui, se refere a uma doença, dis- túrbio, síndrome ou condição causada por ou um sintoma de expressão diminuída ou alterada do gene de AGA em um indivíduo em relação ao nível de expressão em um indivíduo normal ou em uma população.

[0045] A expressão "distúrbio associado com a atividade aberrante de um produto do gene de AGA", como usada aqui, se refere a uma doença, distúrbio, síndrome ou condição causada por ou um sintoma de atividade diminuída ou alterada do produto do gene AGA em um indiví- duo em relação à atividade em um indivíduo normal ou em uma popula- ção.

[0046] Como usado aqui, "transdução" de uma célula por um vetor de vírus (por exemplo, um vetor de AAV) significa entrada do vetor na célula e transferência de material genético para a célula pela incorpora- ção de ácido nucleico no vetor de vírus e subsequente transferência na célula através do vetor de vírus.

[0047] A menos que indicado de outra maneira, "transdução efici- ente" ou "tropismo eficiente" ou expressões semelhantes podem ser de- terminados pela referência a um controle positivo ou negativo adequado (por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 85% , 90%, 95% ou mais da transdução ou tropismo, respectivamente, de um con- trole positivo ou pelo menos cerca de 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500%, 500%, 1000% ou mais da transdução ou tropismo, respectiva- mente, de um controle negativo).

[0048] Similarmente, pode ser determinado se um vírus "não trans- duz com eficiência" ou "não possui tropismo eficiente" para um tecido alvo, ou expressões semelhantes, pela referência a um controle ade- quado. Em modalidades particulares, o vetor de vírus não transduz efi- cientemente (isto é, não possui tropismo eficiente para) tecidos fora do SNC, por exemplo, fígado, rim, gônadas e/ou células germinativas. Em modalidades particulares, a transdução indesejável de tecidos (por exemplo, fígado) é de 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 1% ou menos, 0,1% ou menos do nível de transdução dos tecidos alvo desejados (por exemplo, células do SNC).

[0049] As expressões "porção 5' e "porção 3' são expressões rela- tivas para definir uma relação espacial entre dois ou mais elementos. Assim, por exemplo, uma "porção 3' de um polinucleotídeo indica um segmento do polinucleotídeo que está a jusante de outro segmento. À expressão "porção 3' não pretende indicar que o segmento está neces- sariamente na extremidade 3' do polinucleotídeo ou mesmo que ele es- teja necessariamente na metade 3' do polinucleotídeo, embora possa estar. Da mesma forma, uma "porção 5' de um polinucleotídeo indica um segmento do polinucleotídeo que está a montante de outro seg- mento. A expressão "porção 5' não pretende indicar que o segmento esteja necessariamente na extremidade 5' do polinucleotídeo, ou mesmo que ele esteja necessariamente na metade 5' do polinucleotí- deo, embora possa estar.

[0050] Como usada aqui, a expressão "polipeptídeo" abrange pep- tídeos e proteínas, a menos que indicado de outra maneira.

[0051] Um "polinucleotídeo", "ácido nucleico" ou "sequência de nu- cleotídeos" é uma sequência de bases de nucleotídeos e podem ser sequências híbridas de RNA, DNA ou DNA-RNA (incluindo nucleotídeos que ocorrem naturalmente e não naturalmente), mas é preferivelmente uma sequência de DNA de fita simples ou dupla.

[0052] A expressão "quadro de leitura aberto (ORF)", como usada aqui, refere-se à porção de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que codifica um polipeptídeo.

[0053] A expressão "otimizado por códon", como usado aqui, refere- se a uma sequência codificadora de gene que foi otimizada para au- mentar a expressão pela substituição de um ou mais códons normal- mente presentes em uma sequência codificadora (por exemplo, em uma sequência do tipo selvagem, incluindo, por exemplo, uma sequência co- dificadora para AGA) com um códon para o mesmo aminoácido (sinô- nimo). Dessa maneira, a proteína codificada pelo gene é idêntica, mas a sequência de nucleobases subjacente do gene ou o mMRNA corres- pondente são diferentes. Em algumas modalidades, a otimização subs- titui um ou mais códons raros (isto é, códons para tRNA que ocorrem relativamente com pouca frequência nas células de uma espécie espe- cífica) por códons sinônimos que ocorrem com mais frequência para melhorar a eficiência da tradução. Por exemplo, na otimização de códon humano, um ou mais códons em uma sequência codificadora são subs- tituídos por códons que ocorrem com mais frequência nas células hu- manas para o mesmo aminoácido. A otimização do códon também pode aumentar a expressão do gene por meio de outros mecanismos que podem melhorar a eficiência da transcrição e/ou tradução. As estraté- gias incluem, sem limitação, aumentar o conteúdo total de GC (ou seja, o percentual de guaninas e citosinas em toda a sequência codificadora), diminuir o conteúdo de CpG (ou seja, o número de dinucleotídeos CG ou GC na sequência codificadora), remover os sítios doadores ou acep- tores de splice crípticos e/ou adicionar ou remover sítios de entrada ri- bossômica, tais como sequências de Kozak. Desejavelmente, um gene otimizado por códon exibe uma expressão de proteína melhorada, por exemplo, a proteína codificada dessa maneira é expressa em um nível detectavelmente maior em uma célula em comparação com o nível de expressão da proteína fornecida pelo gene de tipo selvagem em uma célula semelhante de outra maneira.

[0054] A expressão "identidade de sequência", como usada aqui, tem o significado padronizado na técnica. Como é conhecido na técnica, vários programas diferentes podem ser utilizados para identificar se um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem identidade ou similaridade com uma sequência conhecida. A identidade ou similaridade de sequência pode ser determinada usando técnicas padronizadas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando ao algoritmo de identidade de sequência local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algo- ritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de pesquisa de simi- laridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444

(1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WD, o programa de sequência Best Fit descrito por Devereux et al/., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984), preferivelmente usando as configurações pa- dronizadas ou pela inspeção.

[0055] Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP. PILEUP cria um alinhamento múltiplo de sequências a partir de um grupo de sequên- cias relacionadas, usando alinhamentos progressivos pareados. Tam- bém pode ser traçada uma árvore que mostre os relacionamentos de cluster usados para criar o alinhamento. PILEUP utiliza uma simplifica- ção do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J Mol. Evol. 35:351 (1987); o método é semelhante àquele descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151 (1989).

[0056] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) e Karlin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 5873 (1993). Um programa BLAST par- ticularmente útil é o programa WU-BLAST-2, que foi obtido de Altschul et al, Meth. Enzymol, 266:460 (1996); blast.wustl/edu/blast/RE- ADME html. WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, que são preferencialmente configurados com os valores padronizados. Os parâ- metros são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio pro- grama, dependendo da composição da sequência particular e da com- posição do banco de dados particular contra o qual a sequência de in- teresse está sendo pesquisada; no entanto, os valores podem ser ajus- tados para aumentar a sensibilidade.

[0057] Um algoritmo útil adicional é o gapped BLAST, como rela- tado por Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997).

[0058] Um valor percentual de identidade da sequência de aminoá-

cidos é determinado pelo número de resíduos idênticos corresponden- tes dividido pelo número total de resíduos da sequência "mais longa" na região alinhada. A sequência "mais longa" é aquela que possui os resí- duos mais reais na região alinhada (as lacunas introduzidas pelo WU- Blast-2 para maximizar o escore do alinhamento são ignoradas).

[0059] De maneira semelhante, o percentual de identidade da se- quência de ácido nucleico é definido como o percentual de resíduos de nucleotídeo na sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos no polinucleotídeo especificamente descrito aqui.

[0060] O alinhamento pode incluir a introdução de lacunas nas se- quências a serem alinhadas. Além disso, para as sequências que con- têm mais ou menos nucleotídeos do que os polinucleotídeos aqui des- critos especificamente, é entendido que em uma modalidade, o percen- tual de identidade de sequência será determinado com base no número de nucleotídeos idênticos em relação ao número total de nucleotídeos. Assim, por exemplo, a identidade de sequência de sequências mais cur- tas do que uma sequência aqui descrita especificamente, será determi- nada utilizando o número de nucleotídeos na sequência mais curta, em uma modalidade. Nos cálculos do percentual de identidade, o peso re- lativo não é atribuído a várias manifestações de variação de sequência, como inserções, deleções, substituições, etc.

[0061] Em uma modalidade, apenas as identidades são pontuadas positivamente (+1) e todas as formas de variação de sequência, inclu- indo gaps, recebem um valor de "0", o que evita a necessidade de uma escala ponderada ou parâmetros como descritos abaixo para cálculos de similaridade de sequência. O percentual de identidade da sequência pode ser calculado, por exemplo, pela divisão do número de resíduos idênticos correspondentes pelo número total de resíduos da sequência "mais curta" na região alinhada e multiplicando por 100. A sequência

"mais longa" é aquela que possui os resíduos mais reais na região ali- nhada.

[0062] Como usado aqui, um ácido nucleico ou sequência de nucle- otídeos “isolados” (por exemplo, um "DNA isolado" ou um "RNA iso- lado") significa um ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos sepa- rados ou substancialmente livres de pelo menos alguns dos outros com- ponentes que ocorrem naturalmente no organismo ou vírus, por exem- plo, os componentes estruturais celulares ou virais ou outros polipeptí- deos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados ao ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos.

[0063] Da mesma forma, um polipeptídeo "isolado" significa um po- lipeptídeo que é separado ou substancialmente livre de pelo menos al- guns dos outros componentes do organismo ou vírus que ocorre natu- ralmente, por exemplo, os componentes estruturais celulares ou virais ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados com o polipeptídeo.

[0064] Como usada aqui, a expressão "modificado", aplicada a uma sequência de polinucleotídeos ou de polipeptídeos, se refere a uma se- quência que difere de uma sequência do tipo selvagem devido a uma ou mais deleções, adições, substituições ou qualquer combinação das mesmas.

[0065] Como usada aqui, "isolar" ou "purificar" (ou equivalentes gra- maticais) um vetor de vírus, significa que o vetor de vírus é pelo menos parcialmente separado de pelo menos alguns dos outros componentes no material de partida.

[0066] Com a expressão "tratar", "tratando" ou "tratamento (ou ex- pressões gramaticalmente equivalentes), é entendido que a gravidade da condição do indivíduo é reduzida ou pelo menos parcialmente recu- perada ou melhorada e/ou que algum alívio, mitigação ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico é alcançado e/ou há um retardo na progressão da condição e/ou prevenção ou retardo no aparecimento de uma doença ou distúrbio.

[0067] Como usada aqui, a expressão "prevenir", "previne" ou "pre- venção" (e seus equivalentes gramaticais) se refere a um retardo no início de uma doença ou distúrbio ou a diminuição dos sintomas após o início da doença ou distúrbio. As expressões não pretendem implicar a abolição completa da doença e abrangem qualquer tipo de tratamento profilático que reduza a incidência da doença ou retarde o início e/ou a progressão da doença.

[0068] Uma quantidade "eficaz para o tratamento", como usada aqui, é uma quantidade que é suficiente para fornecer alguma melhora ou benefício ao indivíduo. Alternativamente, uma quantidade "eficaz para o tratamento" é uma quantidade que proporcionará algum alívio, mitigação, diminuição ou estabilização de pelo menos um sintoma clí- nico no indivíduo. Aqueles versados na técnica compreenderão que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, desde que seja fornecido algum benefício ao indivíduo.

[0069] Uma quantidade "eficaz para a prevenção", como usada aqui, é uma quantidade que é suficiente para prevenir e/ou retardar o aparecimento de uma doença, distúrbio e/ou sintomas clínicos em um indivíduo e/ou reduzir e/ou retardar a gravidade do início de uma do- ença, distúrbio e/ou sintomas clínicos em um indivíduo em relação ao que ocorreria na ausência dos métodos da invenção. Aqueles versados na técnica compreenderão que o nível de prevenção não precisa ser completo, desde que seja fornecido algum benefício ao indivíduo.

[0070] Uma "sequência de nucleotídeos heteróloga" ou "ácido nu- cleico heterólogo" é uma sequência que não ocorre naturalmente no ví- rus. Geralmente, o ácido nucleico heterólogo ou a sequência de nucle- otídeos compreende um quadro de leitura aberto que codifica um poli- peptídeo e/ou um RNA não traduzido.

[0071] Como usada aqui, a expressão "vetor", "vetor de vírus", "ve- tor de liberação" (e expressões semelhantes) geralmente se referem a uma partícula de vírus que funciona como um veículo de liberação de ácido nucleico e que compreende o ácido nucleico viral (ou seja, o ge- noma de vetor) empacotado dentro do vírion. Os vetores de vírus de acordo com a presente invenção compreendem um capsídeo quimérico de AAV de acordo com a invenção e podem empacotar um genoma de AAV ou rAAV ou qualquer outro ácido nucleico incluindo ácidos nuclei- cos virais. Alternativamente, em alguns contextos, a expressão "vetor", "vetor de vírus", "vetor de liberação" (e expressões semelhantes) pode ser usada para se referir ao genoma do vetor (por exemplo, vDNA) na ausência do vírion e/ou de um capsídeo viral que atue como um trans- portador para liberar moléculas ligadas ao capsídeo ou empacotadas dentro do capsídeo.

[0072] Os vetores de vírus da invenção podem ainda ser partículas duplas de parvovírus, conforme descrito na publicação de patente inter- nacional WO 01/92551 (cuja divulgação é aqui incorporada por referên- cia na sua totalidade). Assim, em algumas modalidades, genomas de fita dupla (dúplex) podem ser empacotados.

[0073] Um "genoma do vetor de AAV recombinante" ou "genoma de rAAV" é um genoma de AAV (isto é, VONA) que compreende pelo me- nos uma repetição terminal invertida (por exemplo, uma, duas ou três repetições terminais invertidas) e uma ou mais sequências de nucleotí- deos heterólogas. Os vetores de rAAV geralmente retêm as repetições terminais (TR) de 145 bases em cis para gerar o vírus; entretanto, TRs de AAV modificadas e TRs de não AAV, incluindo sequências parcial- mente ou completamente sintéticas, também podem servir a esse pro- pósito. Todas as outras sequências virais são dispensáveis e podem ser fornecidas em trans (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). O vetor de rAAV opcionalmente compreende duas TRs (por exemplo, TRs de AAV), que geralmente estarão nas extremidades 5' e 3' das sequências de nucleotídeos heterólogas, mas não precisam ser contíguas a elas. As TRs podem ser iguais ou diferentes uma da outra. O genoma do vetor também pode conter uma única ITR na extremidade 3'ou5,.

[0074] A expressão "repetição terminal" ou "TR" inclui qualquer re- petição terminal viral ou sequência sintética que forme uma estrutura em grampo e funcione como uma repetição terminal invertida (isto é, medeia as funções desejadas, tais como a replicação, empacotamento de vírus, integração e/ou resgate de pró-vírus e semelhantes). A TR pode ser uma TR de AAV ou uma TR não AAV TR. Por exemplo, uma sequência de TR não AAV, tal como aquelas de outros parvovírus (por exemplo, parvovírus canino (CPV), parvovírus de camundongo (MVM), parvovírus humano B-19) ou o hairpin de SV40 que serve como origem da replicação do SV40, pode ser usada como TR, que pode ser modifi- cado osteriormente por truncamento, substituição, exclusão, inserção e/ou adição. Além disso, a TR pode ser parcial ou completamente sin- tética, tal como a "sequência D dupla" como descrito na Patente U.S. No. 5.478.745 de Samulski et al.

[0075] Os genomas de parvovírus têm sequências palindrômicas nas extremidades 5' e 3'. A natureza palindrômica das sequências leva à formação de uma estrutura em grampo que é estabilizada pela forma- ção de ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares. Acredita-se que esta estrutura em forma de grampo adote uma forma de "Y" ou "T". Veja, por exemplo, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, capítulos 69 e 70 (4º ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0076] Uma "repetição terminal de AAV" ou "TR de AAV" pode ser de qualquer AAV incluindo, mas não limitada aos sorotipos 1,2,3,4,5, 6,7,8,9, 10 ou 1 1 ou qualquer outro AAV já conhecido ou descoberto mais tarde (veja, por exemplo, a Tabela 1). Uma repetição terminal de

AAV não precisa ter a sequência de repetição terminal nativa (por exem- plo, uma sequência de TR de AAV nativa pode ser alterada por inserção, deleção, truncamento e/ou mutações missense), desde que a repetição terminal medeie as funções desejadas, por exemplo, replicação, empa- cotamento vírus, integração e/ou resgate de pró-viírus e semelhantes.

[0077] As expressões "partícula de rAAV" e "vírion de rAAV" são usadas alternativamente aqui. Uma "partícula de rAAV" ou "vírion de rAAV" compreende um genoma de vetor de rAAV empacotado dentro de um capsídeo de AAV.

[0078] Os vetores de vírus da invenção podem ainda ser vetores de vírus "direcionados" (por exemplo, ter um tropismo direcionado) e/ou um parvovírus "híbrido" (isto é, no qual as ITRs virais e o capsídeo viral são de parvovírus diferentes) como descrito na publicação de patente inter- nacional WO 00/28004 e Chao et al, (2000) Mol. Therapy 2:619.

[0079] Além disso, o capsídeo viral ou os elementos genômicos po- dem conter outras modificações, incluindo inserções, deleções e/ou substituições.

[0080] Como usada aqui, a expressão "aminoácido" abrange quais- quer aminoácidos que ocorrem naturalmente, suas formas modificadas e aminoácidos sintéticos.

[0081] Os aminoácidos levorotatórios (L-) que ocorrem natural- mente são mostrados na Tabela 2.

Abreviação Resíduo de Aminoácido Letras Letra Alanina Ala

EX E [RAR AR RO Ácido Aspártico (Aspartato) Asp | ph | Cisteina Cys FERE IR e

Glicina Gly Histidina His so E Leucina Leu Lisina Lys Fenilalanina Phe reina Treonina Thr Tirosina Tyr

[0082] Alternativamente, o aminoácido pode ser um resíduo de ami- noácido modificado (exemplos não limitantes são mostrados na Tabela 3) ou pode ser um aminoácido que é modificado por modificação pós- traducional (por exemplo, acetilação, amidação, formilação, hidroxila- ção, metilação, fosforilação ou sulfatação). Tabela 3: Derivados de Resíduo de Aminoácido Ácido 2-Aminoadípico Aad Ácido 3-Aminoadípico bAad beta-Alanina, Ácido beta-Aminopropiônico bAla Ácido 2-Aminobutírico Abu Ácido 4-Aminobutírico, Ácido Piperidínico 4Abu Ácido 6-Aminocaproico Acp Ácido 2-Amino-heptanoico Ahe Ácido 2-Aminoisobutírico Aib Ácido 3-Aminoisobutírico bAib Ácido 2-Aminopimélico Apm t-butilalanina t-BuA

Citrulina Cit Ciclo-hexilalanina Cha Ácido 2,4-Diaminobutírico Dbu Desmosina Des Ácido 2,2'-Diaminopimélico Dpm Ácido 2,3-Diaminopropiônico Dpr N-Etilglicina EtGly N-Etilasparagina EtAsn Homoarginina hArg Homocisteína hCys Homosserina hSer Hidroxilisina Hyl Alo-Hidroxilisina aHyl 3-Hidroxiprolina 3Hyp 4-Hidroxiprolina 4Hyp Isodesmosina Ide alo-Isoleucina alle Sulfóxido de Metionina MSO N-Metilglicina, sarcosina MeGly N-Metilisoleucina Melle 6-N-Metilisina MeLys N-Metilvalina MevVal 2-Naftilalanina 2-Nal Norvalina Nva Norleucina Nle Ornitina Orn 4-Clorofenilalanina Phe(4-Cl) 2-Fluorofenilalanina Phe(2-F) 3-Fluorofenilalanina Phe(3-F) 4-Fluorofenilalanina Phe(4-F)

Fenilglicina Phg

[0083] Além disso, o aminoácido que não ocorre naturalmente pode ser um aminoácido "não natural", como descrito por Wang et al, (2006) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:225- 49. Estes aminoácidos não naturais podem ser utilizados com vantagem para ligar quimicamente moléculas de interesse à proteína do capsídeo de AAV.

[0084] A expressão "modelo" ou "substrato" é aqui utilizado para se referir a uma sequência de polinucleotídeos que pode ser replicada para produzir o DNA viral do parvovírus. Para fins de produção de vetores, o modelo será tipicamente incorporado dentro de uma sequência ou cons- truto de nucleotídeos maior incluindo, mas não limitados a um plasmí- deo, vetor de DNA nu, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromos- somo artificial de levedura (YAC) ou um vetor viral (por exemplo, vetores adenovírus, herpesvírus, vírus Epstein-Barr, AAV, baculoviral, vetores retrovirais e semelhantes). Alternativamente, o modelo pode ser esta- velmente incorporado no cromossomo de uma célula de empacota- mento.

[0085] Como usadas aqui, as "sequências que codificam Rep" de parvovírus ou AAV indicam as sequências de ácidos nucleicos que co- dificam as proteínas não estruturais parvovirais ou e AAV que medeiam a replicação viral e a produção de novas partículas virais. Os genes e proteínas de replicação de parvovírus e AAV foram descritos, por exem- plo, FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, capítulos 69 e 70 (4º ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0086] As "sequências que codificam Rep" não precisam codificar todas as proteínas Rep parvovirais ou de AAV. Por exemplo, com rela- ção ao AAV, as sequências que codificam Rep não precisam codificar todas as quatro proteínas Rep de AAV (Rep78, Rep 68, Rep52 e Rep40); de fato, acredita-se que AAV5 expresse apenas as proteínas

Rep68 e Rep40 unidas. Em modalidades representativas, as sequên- cias que codificam Rep codificam pelo menos aquelas proteínas de re- plicação que são necessárias para replicação do genoma viral e empa- cotamento em novos virions. As sequências que codificam Rep geral- mente codificam pelo menos uma proteína Rep grande (isto é, Rep78/68) e uma proteína Rep pequena (isto é, Rep52/40). Em moda- lidades particulares, as sequências que codificam Rep codificam a pro- teína Rep78 de AAV e as proteínas Rep52 e/ou Rep40 de AAV. Em outras modalidades, as sequências que codificam Rep codificam as pro- teínas Rep68 e Rep52 e/ou Rep40. Ainda uma modalidade adicional, as sequências que codificam Rep codificam as proteínas Rep68 e Rep52, proteínas Rep68 e Rep40, proteínas Rep78 e Rep52 ou proteínas Rep78 e Rep40.

[0087] Como usada aqui, a expressão "proteína Rep grande" se re- fere a Rep68 e/ou Rep78. As proteínas Rep grandes da invenção rei- vindicada podem ser do tipo selvagem ou sintéticas. Uma proteína Rep grande do tipo selvagem pode ser de qualquer parvovírus ou de AAV, incluindo mas não limitado aos sorotipos 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11 ou 13, ou qualquer outro AAV já conhecido ou descoberto mais tarde (consulte, por exemplo, Tabela 1). Uma proteína Rep grande sintética pode ser alterada por inserção, deleção, truncamento e/ou mutações missense.

[0088] Aqueles versados na técnica compreenderão ainda que não é necessário que as proteínas de replicação sejam codificadas pelo mesmo polinucleotídeo. Por exemplo, para MVM, as proteínas NS-1 e NS-2 (que são variantes de splice) podem ser expressas independente- mente uma do outro. Da mesma forma, para o AAV, o promotor p19 pode ser inativado e a(s) proteína(s) Rep grande(s) expressa(s) a partir de um polinucleotídeo e a(s) proteína(s) Rep pequena(s) expressa(s) a partir de um polinucleotídeo diferente. Tipicamente, no entanto, será mais conveniente expressar as proteínas de replicação a partir de um único construto. Em alguns sistemas, os promotores virais (por exemplo, promotor p19 de AAV) podem não ser reconhecidos pela célula e, por- tanto, é necessário expressar as proteínas Rep grandes e pequenas a partir de cassetes de expressão separados. Em outros casos, pode ser desejável expressar as proteínas Rep grande e Rep pequena separa- damente, isto é, sob o controle de elementos de controle transcricionais e/ou traducionais separados. Por exemplo, pode ser desejável controlar a expressão das proteínas Rep grandes, de modo a diminuir a propor- ção de proteínas Rep grandes para pequenas. No caso de células de insetos, pode ser vantajoso regular a expressão das proteínas Rep grandes (por exemplo, Rep78/68) para evitar a toxicidade para as célu- las (veja, por exemplo, Urabe et |, (2002) Human Gene Therapy 13: 1935).

[0089] Como usado aqui, as "sequências que codificam cap" do par- vovírus ou de AAV codificam as proteínas estruturais que formam um parvovírus funcional ou o capsídeo de AAV (isto é, podem empacotar o DNA e infectar as células alvo). Tipicamente, as sequências que codifi- cam cap codificarão todas as subunidades do capsídeo do parvovírus ou de AAV, mas menos do que todas as subunidades do capsídeo po- dem ser codificadas desde que um capsídeo funcional seja produzido. Tipicamente, mas não necessariamente, as sequências que codificam cap estarão presentes em uma única molécula de ácido nucleico.

[0090] A estrutura do capsídeo dos parvovírus autônomos e de AAV está descrita em mais detalhes em BERNARD N. FIELDS et al., VIRO- LOGY, volume 2, capítulos 69 e 70 (4ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0091] Por "reter substancialmente" uma propriedade, é entendido que pelo menos cerca de 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% da propriedade (por exemplo, atividade ou outra característica mensurável) são retidos.

Cassetes de Expressão e Vetores de AGA

[0092] A presente invenção se refere ao projeto de um cassete de expressão AGA para fornecer expressão máxima de aspartilglicosami- nidase (AGA), a enzima codificada pelo gene AGA e o uso do cassete de expressão para atingir níveis terapêuticos de AGA em um indivíduo.

[0093] Assim, um aspecto da invenção se refere a um polinucleotí- deo que compreende uma quadro de leitura aberto de AGA humano (ORF), em que a sequência de nucleotídeos tenha sido otimizada por códon para expressão em células humanas. O quadro de leitura aberto é a porção do gene de AGA que codifica AGA. Como usada aqui, uma ORF de AGA humano se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica AGA humano. A otimização de códon é uma técnica bem co- nhecida e códons ótimos para expressão em humanos são conhecidos. O uso de uma sequência de AGA otimizada por códon permite distinguir a expressão da sequência transduzida da expressão da sequência de AGA endógena em um indivíduo.

[0094] Em algumas modalidades, o quadro de leitura aberto de AGA otimizado por códon codifica uma enzima AGA que é modificada a partir da sequência do tipo selvagem, por exemplo, compreende, consiste es- sencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos na qual 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos foram substituídos, adicionados e/ou dele- tados em comparação com a sequência de aminoácidos do tipo selva- gem.

[0095] Em algumas modalidades, o quadro de leitura aberto de AGA otimizado por códon compreende, consiste essencialmente em, ou con- siste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela.

[0096] Outro aspecto da invenção refere-se a um cassete de ex- pressão que compreende um polinucleotídeo que compreende um qua- dro de leitura aberto de AGA humano. Em certas modalidades, o poli- nucleotídeo é uma sequência humana otimizada por códon, por exem- plo, um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica a ela.

[0097] O polinucleotídeo de AGA no cassete de expressão pode es- tar operativamente ligado a um ou mais elementos de expressão que podem intensificar a expressão de AGA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor, por exemplo, um promotor de beta-actina de galinha, por exemplo, um promotor que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste na se- quência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência pelo me- nos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. Em algumas modalidades, o promotor compreende ainda o éxon 1 e o íntron 1 de beta-actina de frango, por exemplo, que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ |D NO: 3 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. Esse promotor híbrido de beta- actina de frango fornece vantajosamente uma expressão robusta a longo prazo nas células dos sistemas nervoso central e periférico e é preferido sobre o promotor de citomegalovírus comumente usado, que demonstrou silenciar a expressão do gene ao longo do tempo (veja Gray et al., Human Gene Ther. 22: 1143 (201 1), incorporado por referência aqui na sua totalidade).

[0098] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operativa- mente ligado a um intensificador, por exemplo, um intensificador de ci- tomegalovírus, por exemplo, um intensificador que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste na sequência de nucleotí- deos da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idêntica a ela.

[0099] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operativa- mente ligado a um íntron, por exemplo, um íntron de MVM híbrido/mo- dificado, por exemplo, um íntron que compreende, que consiste essen- cialmente em ou que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela. O íntron, pode estar localizado em qual- quer parte do cassete de expressão onde seu efeito seja de intensificar a expressão, por exemplo, precedendo a ORF, dentro da ORF ou entre a ORF e o sítio de poliadenilação.

[00100] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operativa- mente ligado a um sinal de poliadenilação, por exemplo, um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, por exemplo, um si- nal de poliadenilação que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela.

[00101] Aqueles versados na técnica apreciarão ainda que uma va- riedade de elementos promotores/intensificadores podem ser utilizados dependendo do nível e da expressão específica para o tecido desejada. O promotor/intensificador pode ser constitutivo ou induzível, depen- dendo do padrão de expressão desejado. O promotor/intensificador pode ser nativo ou estranho e pode ser uma sequência natural ou sin- tética. Por estranho, é pretendido que a região de iniciação da transcri- ção não seja encontrada no hospedeiro do tipo selvagem no qual a re- gião de iniciação da transcrição é introduzida.

[00102] Os elementos promotores/intensificadores podem ser nati- vos da célula alvo ou do indivíduo a ser tratado e/ou nativos da sequên- cia heteróloga de ácidos nucleicos. O elemento promotor/intensificador é geralmente escolhido de modo a funcionar na(s) célula(s) alvo de in- teresse. Em modalidades representativas, o elemento promotor/intensi- ficador é um elemento promotor/intensificador de mamífero. O elemento promotor/intensificador pode ser constitutivo ou induzível.

[00103] Os elementos induzíveis de controle da expressão são ge- ralmente utilizados naquelas aplicações em que é desejável fornecer regulação sobre a expressão da(s) sequência(s) de ácido nucleico he- teróloga(s). Os elementos promotores/intensificadores induzíveis para a liberação de genes podem ser elementos específicos para o tecido ou elementos promotores/intensificadores preferidos para o tecido e in- cluem elementos promotores/intensificadores específicos ou preferidos para o músculo (incluindo músculo cardíaco, esquelético e/ou liso), es- pecíficos ou preferidos para os tecidos neurais (incluindo específico para o cérebro), olhos (incluindo específico para a retina e específico para a córnea), específico ou preferido para o fígado, específico ou pre- ferido para a medula óssea, específico ou preferido para o pâncreas, específico ou preferido para o baço específico ou específico ou preferido para o pulmão. Outros elementos promotores/intensificadores induzí- veis incluem elementos induzíveis por hormônios e induzíveis por me- tais. Elementos promotores/intensificadores induzíveis exemplificado- res incluem, mas não estão limitados a um elemento Tet on/off, um pro- motor induzível por RU486, um promotor induzível por ecdisona, um promotor induzível por rapamicina e um promotor de metalotioneína.

[00104] Nas modalidades em que a ORF de AGA é transcrita e de- pois traduzida nas células alvo, geralmente são utilizados sinais de ini- ciação específicos para tradução eficiente de sequências codificadoras de proteínas inseridas. Estas sequências de controle de tradução exó- genas, que podem incluir o códon de iniciação ATG e sequências adja- centes, podem ter várias origens, naturais e sintéticas.

[00105] Em certas modalidades, o cassete de expressão compre- ende ainda pelo menos uma repetição terminal invertida (ITR) de vírus adeno-associado (AAV), por exemplo, duas ITRs de AAV. As duas ITRs podem ter a mesma sequência de nucleotídeos ou sequências de nu- cleotídeos diferentes. As ITRs de AAV podem ser de qualquer sorotipo de AAV, por exemplo, AAV2. Cada ITR independentemente pode ser a sequência do tipo selvagem ou uma sequência modificada. Em algumas modalidades, o cassete de expressão é um genoma de AAV, por exem- plo, um genoma de AAV autocomplementar.

[00106] Em certas modalidades, o cassete de expressão compre- ende um intensificador, um promotor, um íntron, um quadro de leitura aberto de AGA humano e um sítio de poliadenilação, opcionalmente na ordem citada. Em certas modalidades, o cassete de expressão compre- ende uma ITR de AAV, um intensificador, um promotor, um íÍntron, um quadro de leitura aberto de AGA humano, um sítio de poliadenilação e uma ITR de AAV, opcionalmente na ordem citada. Em certas modalida- des, o cassete de expressão compreende um intensificador de CMV, um promotor de beta-actina de frango, um íntron de MVM híbrido/modi- ficado, um quadro de leitura aberto de AGA humano e um sítio de poli- adenilação do hormônio de crescimento bovino, opcionalmente na or- dem citada. Em certas modalidades, o cassete de expressão compre- ende uma ITR de AAV mutante, um intensificador de CMV, um promotor de beta-actina de frango, um íntron de MVM híbrido/modificado, um qua- dro de leitura aberto de AGA humano, um sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino e uma ITR de AAV de tipo selvagem, opcionalmente na ordem citada.

[00107] Em algumas modalidades, o cassete de expressão compre- ende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de nucle- otídeos da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência pelo menos cerca de 70% idêntica a ela, por exemplo, pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica a ela.

[00108] “Um outro aspecto da invenção se refere a um vetor que com- preende o polinucleotídeo ou a cassete de expressão da invenção. Os vetores adequados incluem, mas não estão limitados a um plasmídeo, fago, vetor viral (por exemplo, vetor de AAV, um vetor de adenovírus, um vetor de herpesvírus, um alfavírus ou um vetor de baculovírus), cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial de leve- dura (YAC). Por exemplo, o ácido nucleico pode compreender, consistir em ou consistir essencialmente em um vetor AAV que compreende uma repetição terminal 5' e/ou 3' (por exemplo, repetição terminal 5' e/ou 3' de AAV). Em algumas modalidades, o vetor é um veículo de liberação, tal como uma partícula (por exemplo, uma micropartícula ou nanopartí- cula) ou um lipossoma ao qual o cassete de expressão está ligado ou no qual o cassete de expressão está incorporado. O vetor pode ser qual- quer veículo de liberação adequado para transportar o cassete de ex- pressão para dentro de uma célula.

[00109] Emalgumas modalidades, o vetor é um vetor viral, por exem- plo, um vetor de AAV. O vetor AAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV, por exemplo, AAV9. Em algumas modalidades, o vetor AAV pode compreender proteínas do capsídeo do tipo selvagem. Em outras mo- dalidades, o vetor de AAV pode compreender uma proteína do capsídeo modificada com tropismo alterado em comparação com uma proteína do capsídeo do tipo selvagem, por exemplo, uma proteína do capsídeo modificada não direcionada ao fígado ou que possui tropismo intensifi- cado para células específicas.

[00110] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV auto- complementar ou duplicado (scAAV). Os vetores scAAV são descritos na publicação de patente internacional WO 01/92551 (cuja descrição está aqui incorporada por referência na sua totalidade). O uso de scAAV para expressar a ORF de AGA pode fornecer um aumento no número de células transduzidas, no número de cópias por célula transduzida ou em ambas.

[00111] Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma célula transformada que compreende o polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor da invenção. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor são incorporados estavelmente no ge- noma celular. A célula pode ser uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo.

[00112] Outro aspecto da invenção se refere a um animal transgê- nico que compreende o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou a célula transformada da invenção. Em algumas modalidades, o animal é um animal de laboratório, por exemplo, um camundongo, rato, coelho, cachorro, macaco ou primata não humano.

[00113] Um aspecto adicional da invenção se refere a uma formula- ção farmacêutica que compreende o polinucleotídeo, cassete de ex- pressão, vetor e/ou célula transformada da invenção em um veículo far- maceuticamente aceitável. Métodos de Produção de Vetores de Vírus

[00114] Apresente invenção fornece ainda métodos de produção de vetores de vírus. Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método para produzir uma partícula de AAV recombinante, que compreende fornecer a uma célula permissiva para replicação de AAV: (a) um modelo de AAV recombinante que compreende (i) o poli- nucleotídeo ou cassete de expressão da invenção, e (ii) uma ITR; (b)

um polinucleotídeo que compreenda as sequências codificadoras Rep e sequências codificadoras Cap; sob condições suficientes para a repli- cação e embalagem do modelo de AAV recombinante; pelo que partí- culas de AAV recombinantes são produzidas na célula. As condições suficientes para a replicação e empacotamento do modelo de AAV re- combinante podem ser, por exemplo, a presença de sequências de AAV suficientes para replicação do modelo de AAV e encapsidação em cap- sídeos de AAV (por exemplo, sequências de rep de AAV e sequências de cap de AAV) e sequências auxiliares de adenovírus e/ou herpesvírus. Em modalidades particulares, o modelo de AAV compreende duas se- quências de ITR de AAV, que estão localizadas a 5' e 3' no polinucleo- tídeo da invenção, embora não precisem ser diretamente contíguas a elas.

[00115] Em algumas modalidades, o modelo de AAV recombinante compreende uma ITR que não é resolvida por Rep para produzir vetores de AAV duplicados como descrito na publicação de patente internacio- nal WO 01/92551.

[00116] Omodelode AAV e as sequências de rep e cap de AAV são fornecidos sob condições tais que o vetor de vírus que compreende o modelo de AAV empacotado no capsídeo de AAV é produzido na célula. O método pode ainda compreender a etapa de coleta do vetor de vírus da célula. O vetor de vírus pode ser coletado do meio e/ou pela lise das células.

[00117] A célula pode ser uma célula que seja permissiva para repli- cação viral de AAV. Qualquer célula adequada conhecida na técnica pode ser empregada. Em modalidades particulares, a célula é uma cé- lula de mamífero (por exemplo, uma célula de primata ou humana). Como outra opção, a célula pode ser uma linhagem celular de empaco- tamento trans-complementares que fornece as funções deletadas de um vírus auxiliar com defeito de replicação, por exemplo, células 293 ou outras células E1a trans-complementares.

[00118] A replicação de AAV e as sequências do capsídeo podem ser fornecidas por qualquer método conhecido na técnica. Os protocolos atuais tipicamente expressam os genes rep/cap de AAV em um único plasmídeo. A replicação de AAV e as sequências de empacotamento não precisam ser fornecidas juntas, embora possa ser conveniente fazê- lo. As sequências de rep e/ou cap de AAV podem ser fornecidas por qualquer vetor viral ou não viral. Por exemplo, as sequências de rep/cap podem ser fornecidas por um vetor híbrido de adenovírus ou herpesví- rus (por exemplo, inserido nas regiões E1a ou E3 de um vetor de ade- novírus deletado). Os vetores EBV também podem ser empregados para expressar os genes cap e rep de AAV. Uma vantagem desse mé- todo é que os vetores de EBV são epissomais, mas manterão um nú- mero alto de cópias em sucessivas divisões celulares (isto é, são inte- gradas de maneira estável à célula como elementos extra-cromossômi- cos, designados como "epissoma nuclear baseado em EBV", veja Mar- golski. (1 92) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67).

[00119] Como uma alternativa adicional, as sequências de rep/cap podem ser incorporadas de maneira estável em uma célula.

[00120] Tipicamente, as sequências de rep/cap de AAV não serão flanqueadas pelas TRs, para evitar o resgate e/ou o empacotamento dessas sequências.

[00121] O modelo de AAV pode ser fornecido à célula usando qual- quer método conhecido na técnica. Por exemplo, o modelo pode ser fornecido por um vetor não viral (por exemplo, plasmídeo) ou viral. Em modalidades particulares, o modelo de AAV é fornecido por um vetor de herpesvírus ou adenovírus (por exemplo, inserido nas regiões Ela ou E3 de um adenovírus deletado). Como outra ilustração, Palombo et al., (1998) J Virology 72:5025, descrevem um vetor de baculovírus que car- rega um gene repórter flanqueado pelas TRs de AAV. Os vetores de

EBV também podem ser empregados para liberar o modelo, como des- crito acima em relação aos genes rep/cap.

[00122] Em outra modalidade representativa, o modelo de AAV é for- necido por um vírus rAAV replicante. Ainda em outras modalidades, um pro-vírus de AAV que compreende o modelo de AAV é integrado esta- velmente no cromossomo da célula.

[00123] Para melhorar os títulos de vírus, funções de vírus auxiliares (por exemplo, adenovírus ou herpesvírus) que promovem uma infecção produtiva por AAV podem ser fornecidas à célula. As sequências do ví- rus auxiliar necessárias para a replicação de AAV são conhecidas na técnica. Tipicamente, estas sequências serão fornecidas por um vetor auxiliar de adenovírus ou herpesvírus. Alternativamente, as sequências de adenovírus ou herpesvírus podem ser fornecidas por outro vetor não viral ou viral, por exemplo, como um mini-plasmídeo de adenovírus não infeccioso que transporta todos os genes auxiliares que promovem a produção eficiente de AAV, conforme descrito por Ferrari et al. (1997) Nature Med. 3:1295 e as Patentes U.S. Nos. 6.040.183 e 6.093.570.

[00124] Além disso, as funções do vírus auxiliar podem ser forneci- das por uma célula de empacotamento com as sequências auxiliares incorporadas no cromossomo ou mantidas como um elemento extra- cromossômico estável. Geralmente, as sequências de vírus auxiliares não podem ser empacotadas em virions de AAV, por exemplo, não são flanqueadas por ITRs.

[00125] Será compreendido por aqueles versados na técnica que pode ser vantajoso fornecer as sequências de replicação e o capsídeo de AAV e as sequências do vírus auxiliar (por exemplo, sequências de adenovírus) em um único construto auxiliar. Este construto auxiliar pode ser um construto não viral ou viral. Como uma ilustração não limitante, um construto auxiliar pode ser um adenovírus híbrido ou herpesvírus híbrido que compreendem os genes rep/cap de AAV.

[00126] Emuma modalidade particular, as sequências de rep/cap de AAV e as sequências auxiliares de adenovírus são fornecidas por um único vetor auxiliar de adenovírus. Este vetor pode ainda compreender o modelo de AAV. As sequências de rep/cap de AAV e/ou o modelo de AAV podem ser inseridos em uma região deletada (por exemplo, as re- giões E1a ou E3) do adenovírus.

[00127] Em uma modalidade adicional, as sequências de rep/cap de AAV e as sequências auxiliares de adenovírus são fornecidas por um único vetor auxiliar de adenovírus. De acordo com esta modalidade, o modelo de AAV pode ser fornecido como um modelo de plasmídeo.

[00128] Em outra modalidade ilustrativa, as sequências de rep/cap de AAV e sequências auxiliares de adenovírus são fornecidas por um único vetor auxiliar de adenovírus e o modelo AAV é integrado à célula como um pró-vírus. Alternativamente, o modelo de AAV é fornecido por um vetor de EBV que é mantido dentro da célula como um elemento extra-cromossômico (por exemplo, como um epissoma nuclear baseado em EBV).

[00129] Em uma modalidade exemplificadora adicional, as sequên- cias de rep/cap de AAV e sequências auxiliares de adenovírus são for- necidas por um único adenovírus auxiliar. O modelo de AAV pode ser fornecido como um vetor viral de replicação separado. Por exemplo, o modelo de AAV pode ser fornecido por uma partícula de AAV ou uma segunda partícula de adenovírus recombinante.

[00130] De acordo com os métodos anteriores, o vetor híbrido de adenovírus compreende tipicamente as sequências 5' e 3' cis de ade- novírus suficientes para replicação e empacotamento de adenovírus (isto é, as repetições terminais de adenovírus e a sequência PAC). As sequências rep/cap de AAV e, se presente, o modelo de AAV são incor- porados no arcabouço do adenovírus e são flanqueados pelas sequên-

cias cis 5' e 3', de modo que essas sequências possam ser empacota- das em capsídeos de adenovírus. Como descrito acima, as sequências auxiliares de adenovírus e as sequências rep/cap de AAV geralmente não são flanqueadas por ITRs, de modo que essas sequências não são empacotadas nos virions de AAV.

[00131] Zhang et al. ((2001) Gene Ther. 18:704-12) descrevem um auxiliar quimérico que compreende o adenovírus e os genes rep e cap de AAV.

[00132] O herpesvírus também pode ser usado como vírus auxiliar nos métodos de empacotamento de AAV. Os herpesvírus híbridos que codificam a(s) proteína(s) Rep de AAV podem facilitar vantajosamente os esquemas de produção escalonável de vetores AAV. Um vetor hí- brido do vírus herpes simplex tipo | (HSV-1) que expressa os genes rep e cap de AAV-2 foi descrito (Conway et a/., (1999) Gene Ther. 6:986 e WO 00/17377.

[00133] “Como alternativa adicional, os vetores de vírus da invenção podem ser produzidos em células de inseto usando vetores de baculo- vírus para fornecer os genes rep/cap e o modelo de AAV, como descrito, por exemplo, por Urabe et al., (2002) Human Gene Ther. 13:1935-43.

[00134] Os estoques de vetores de AAV livres de vírus auxiliares con- taminantes podem ser obtidos por qualquer método conhecido na téc- nica. Por exemplo, o AAV e o vírus auxiliar podem ser facilmente dife- renciados com base no tamanho. O AAV também pode ser separado do vírus auxiliar com base na afinidade por um substrato de heparina (Zolo- tukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973). Os vírus auxiliares com defeito de replicação deletados podem ser usados tal que qualquer vírus auxi- liar contaminante não seja competente para replicação. Como alterna- tiva adicional, um auxiliar de adenovírus que não possui expressão tar- dia de genes pode ser empregado, pois apenas a expressão precoce de adenovírus é necessária para mediar o empacotamento de AAV. Os mutantes de adenovírus defeituosos para expressão tardia de genes são conhecidos na técnica (por exemplo, mutantes de adenovírus ts100K e ts 149). Métodos de Uso dos Vetores de AGA

[00135] A presente invenção também se refere a métodos para a li- beração de uma ORF de AGA em uma célula ou para um indivíduo para aumentar a produção de AGA, por exemplo, para fins terapêuticos ou de pesquisa in vitro, ex vivo ou in vivo. Assim, um aspecto da invenção se refere a um método de expressar um quadro de leitura aberto de AGA em uma célula, que compreende o contato da célula com o polinucleo- tídeo, o cassete de expressão e/ou o vetor da invenção, expressando assim o quadro de leitura aberto de AGA na célula. Em algumas moda- lidades, a célula é uma célula in vitro, uma célula ex vivo ou uma célula in vivo.

[00136] Outro aspecto da invenção se refere a um método para ex- pressar um quadro de leitura aberto de AGA em um indivíduo, que com- preende liberar para o indivíduo o polinucleotídeo, cassete de expres- são, vetor e/ou célula transformada da invenção, expressando assim o quadro de leitura aberto de AGA no indivíduo. Em algumas modalida- des, o indivíduo é um modelo animal de um distúrbio associado à ex- pressão aberrante do gene de AGA.

[00137] Um aspecto adicional da invenção se refere a um método de tratamento de um distúrbio associado à expressão aberrante de um gene de AGA ou atividade aberrante de um produto do gene de AGA em um indivíduo necessitado, que compreende liberar para o indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada da invenção, tratando desse modo o distúrbio associado à expressão aberrante do gene de AGA no indivíduo. Em algumas modalidades, o distúrbio associado com a ex- pressão do gene de AGA é aspartilglicosaminária.

[00138] Em certas modalidades, o polinucleotídeo, cassete de ex- pressão, vetor e/ou célula transformada são liberados para o indivíduo, por exemplo, sistemicamente (por exemplo, por via intravenosa) ou di- retamente no sistema nervoso central (por exemplo, no líquido cefalor- raquidiano por injeção intratecal ou intraventricular) do indivíduo. Em al- gumas modalidades, o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada são liberados por via intravenosa. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada são liberados por via intratecal (IT). A administração da dose IT é vantajosa pelos seguintes motivos. Primeiro, a dose IT neces- sária para alcançar a eficácia em experimentos pré-clínicos foi aproxi- madamente 10 vezes menor em comparação com a administração |V. Segundo, a liberação IT atinge a concentração máxima na dosagem no LCR e consequentemente máxima transdução possível do SNC, o sis- tema orgânico mais atingido pela AGU. Terceiro, a liberação IT minimiza a exposição do sistema imunológico ao vetor de AAV9, limitando o vírus principalmente ao espaço do SNC. Quarto, é a capacidade do vetor va- zado de transduzir órgãos periféricos e expressar a enzima AGA para atingir o tecido não-neuronal deficiente por meio de circulação sistêmica nos níveis terapêuticos. A incapacidade da proteína AGA da circulação sistêmica de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) e entrar no LCR é uma limitação do direcionamento de órgãos periféricos sem o direcionamento adequado para o SNC. A liberação IT pode ser obtida com uma injeção ou infusão usando uma bomba, por exemplo, em uma taxa de cerca de 1 mL por minuto.

[00139] Os vetores de vírus recombinantes de acordo com a pre- sente invenção encontram uso em aplicações veterinárias e médicas. Indivíduos adequados incluem aves e mamíferos. A expressão "aves", como usada aqui inclui, mas não está limitada a galinhas, patos, gansos, codornas, perus, faisão, papagaios, periquitos. A expressão "mamífero",

como usada aqui inclui, mas não está limitada a humanos, primatas, primatas não humanos (por exemplo, macacos e babuínos), gado, ove- lhas, cabras, porcos, cavalos, gatos, cães, coelhos, roedores (por exem- plo, ratos, camundongos, hamsters e semelhantes) etc. Os indivíduos humanos incluem recém-nascidos, crianças, jovens e adultos. Opcio- nalmente, o indivíduo " necessita” dos métodos da presente invenção, por exemplo, porque o indivíduo tem ou é considerado estar em risco de ter um distúrbio que inclui aqueles aqui descritos ou se beneficiará da liberação de um polinucleotídeo que inclui aqueles aqui descritos. Como uma opção adicional, o indivíduo pode ser um animal de labora- tório e/ou um modelo animal de doença.

[00140] Em certas modalidades, o polinucleotídeo da invenção é ad- ministrado a um indivíduo necessitado o mais cedo possível na vida do indivíduo, por exemplo, assim que o indivíduo é diagnosticado com ex- pressão ou atividade aberrante de AGA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é administrado a um paciente recém-nascido, por exem- plo, depois do rastreamento do recém-nascido ter identificado a expres- são ou atividade aberrante de AGA. Em algumas modalidades, o poli- nucleotídeo é administrado a um feto no útero, por exemplo, após o ras- treamento pré-natal ter identificado a expressão ou atividade aberrante de AGA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é administrado a um indivíduo assim que o indivíduo desenvolve sintomas associados à expressão ou atividade aberrante de AGA ou é suspeito ou diagnosti- cado como tendo expressão ou atividade aberrante de AGA. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo é administrado a um indivíduo an- tes que o indivíduo desenvolva sintomas associados à expressão ou atividade aberrante de AGA, por exemplo, um indivíduo que seja sus- peito ou diagnosticado como tendo expressão ou atividade aberrante de AGA, mas que ainda não começou a exibir sintomas.

[00141] Em modalidades particulares, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada da invenção em um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, outros agen- tes medicinais, agentes farmacêuticos, agentes estabilizadores, tam- pões, veículos, adjuvantes, diluentes, etc. Para injeção, o veículo será tipicamente um líquido. Um veículo exemplificador para injeção seria so- lução salina, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, opci- onalmente com excipientes adicionais, por exemplo, D-sorbitol 5%. Para outros métodos de administração, o veículo pode ser sólido ou líquido. Para administração por inalação, o veículo será respirável e preferivel- mente estará na forma de partículas sólidas ou líquidas.

[00142] Por "farmaceuticamente aceitável" é entendido um material que não é tóxico ou indesejável de outra maneira, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indese- jáveis.

[00143] Um aspecto da presente invenção é um método de transfe- rência de uma ORF de AGA para uma célula in vitro. O polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor da invenção podem ser introduzidos nas células na quantidade apropriada. O vetor de vírus pode ser intro- duzido nas células na multiplicidade de infecção apropriada de acordo com métodos de transdução padronizados apropriados para as células alvo em particular. Os títulos do vetor ou capsídeo de vírus a serem administrados podem variar, dependendo do tipo e número de células alvo e do vetor ou capsídeo de vírus específico, e podem ser determi- nados por aqueles versados na técnica sem experimentação indevida. Em modalidades particulares, pelo menos cerca de 10º unidades infec- ciosas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10º unidades infecci- osas são introduzidas na célula.

[00144] —A(s)célula(s) na(s) qual(is) o polinucleotídeo, cassete de ex- pressão e/ou vetor da invenção, por exemplo, vetor de vírus, podem ser introduzidos pode(m) ser de qualquer tipo, incluindo mas não limitada(s) a células neurais (incluindo células do sistema nervoso periférico e cen- tral, em particular, células cerebrais tais como neurônios, oligodendróci- tos, células gliais, astrócitos), células pulmonares, células do olho (in- cluindo células da retina, epitélio pigmentar da retina e células da cór- nea), células epiteliais (por exemplo, células do epitélio intestinal e res- piratório) células musculares esqueléticas (incluindo mioblastos, miotu- bos e miofibras), células musculares do diafragma, células dendríticas, células pancreáticas (incluindo células das ilhotas), células hepáticas, uma célula do trato gastrointestinal (incluindo células musculares lisas, células epiteliais), células do coração (incluindo cardiomiócitos), células ósseas (por exemplo, células-tronco da medula óssea), células-tronco hematopoiéticas, células do baço, queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, células da próstata, células articulares (incluindo, por exem- plo, cartilagem, menisco, sinóvia e medula óssea), células germinativas e semelhantes. Alternativamente, a célula pode ser qualquer célula pro- genitora. Como alternativa adicional, a célula pode ser uma célula- tronco (por exemplo, célula-tronco neural, célula-tronco hepática). Ainda como alternativa adicional, a célula pode ser uma célula de câncer ou de tumor. Além disso, as células podem ser de qualquer espécie de ori- gem, como indicado acima.

[00145] O polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor da inven- ção, por exemplo, vetor de vírus, podem ser introduzidos nas células in vitro com o objetivo de administrar a célula modificada a um indivíduo. Em modalidades particulares, as células foram removidas de um indiví- duo, o polinucleotídeo, o cassete de expressão e/ou o vetor da inven- ção, por exemplo, vetor de vírus, são introduzidos no mesmo e as célu- las são então recolocadas de volta no indivíduo. Os métodos de remo- ção de células do indivíduo para tratamento ex vivo, seguidos de intro-

dução no indivíduo, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, pa- tente U.S. No. 5.399.346). Alternativamente, o polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor da invenção, por exemplo, vetor de vírus, são introduzidos em células de outro indivíduo, em células cultivadas ou em células de qualquer outra fonte adequada e as células são administra- das a um indivíduo necessitado.

[00146] As células adequadas para terapia com gene ex vivo são as descritas acima. As dosagens das células a serem administradas a um indivíduo variarão com a idade, condição e espécie do indivíduo, o tipo de célula, o ácido nucleico a ser expresso pela célula, o modo de admi- nistração e semelhantes. Tipicamente, pelo menos cerca de 10? a cerca de 10º ou cerca de 10º a cerca de 10º células serão administradas por dose em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades par- ticulares, as células transduzidas com o vetor de vírus são administra- das ao indivíduo em uma quantidade eficaz em combinação com um veículo farmacêutico.

[00147] Um outro aspecto da invenção é um método de administra- ção do polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor da invenção, por exemplo, vetor de vírus da invenção a um indivíduo. Em modalida- des particulares, o método compreende um método de liberação de uma ORF de AGA a um indivíduo animal, o método compreendendo: admi- nistração de uma quantidade eficaz de um vetor de vírus de acordo com a invenção a um indivíduo animal. A administração dos vetores de vírus da presente invenção a um indivíduo humano ou a um animal necessi- tados pode ser por qualquer meio conhecido na técnica. Opcionalmente, o vetor de vírus é liberado em uma dose eficaz em um veículo farma- ceuticamente aceitável.

[00148] As dosagens dos vetores de vírus a serem administradas a um indivíduo dependerão do modo de administração, da doença ou con-

dição a ser tratada, da condição do indivíduo, do vetor de vírus especí- fico e do ácido nucleico a ser liberado, e podem ser determinadas de maneira rotineira. Doses exemplificadoras para alcançar efeitos tera- pêuticos são títulos de vírus de pelo menos cerca de 105, 106, 107, 108, 10º, 10º, 10, 1072, 1073, 107%, 105, 106, 1077 ou 10ºº unidades de transdução ou genomas de vetor ou mais, por exemplo, cerca de 107, 108, 10º, 10º, 1071, 1072, 1073, 101%, 1075, 10º unidades de transdução ou genomas vetoriais, ainda mais preferivelmente cerca de 10** ou 10'* unidades de transdução ou genomas de vetor.

[00149] Em modalidades particulares, mais de uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) podem ser empregadas para atingir o nível desejado de expressão de gene durante um período de vários intervalos, por exemplo, diariamente, semanal- mente, mensalmente, anualmente etc.

[00150] Exemplos de modos de administração incluem a administra- ção oral, retal, através da mucosa, tópica, intranasal, inalação (por exemplo, via aerossol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intrate- cal, intraocular, transdérmica, no útero (ou in ovo), parenteral (por exem- plo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular [incluindo ad- ministração ao músculo esquelético, diafragma e/ou músculo cardíaco], intradérmica, intrapleural, intracerebral e intra-articular), tópica (por exemplo, tanto na pele como nas superfícies das mucosas, incluindo superfícies das vias aéreas e administração transdérmica), intralinfática e semelhantes, assim como injeção direta de tecido ou órgão (por exem- plo, fígado, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma ou cérebro). A administração também pode ser em um tumor (por exem- plo, no ou próximo a um tumor ou linfonodo). A via mais adequada em qualquer caso dependerá da natureza e gravidade da condição a ser tratada e da natureza do vetor específico que está sendo usado.

[00151] Em algumas modalidades, o vetor viral é administrado ao

SNC, ao sistema nervoso periférico ou a ambos,

[00152] Em algumas modalidades, o vetor viral é administrado dire- tamente ao SNC, por exemplo, o cérebro ou a medula espinhal. A ad- ministração direta pode resultar em alta especificidade de transdução de células do SNC, por exemplo, em que pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou mais das células transduzidas são células do SNC. Qualquer método conhecido na técnica para administrar vetores diretamente no SNC pode ser usado. O vetor pode ser introduzido na medula espinhal, tronco cerebral (medula oblongata, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tá- lamo, epitálamo, glândula pituitária, substância negra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo os lobos occipi- tal, temporal, parietal e frontal, córtex, gânglios basais, hipocampo e amígdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro e colí- culo inferior. O vetor também pode ser administrado em diferentes regi- ões do olho, tal como na retina, córnea ou nervo óptico. O vetor pode ser liberado no líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lom- bar) para administração mais dispersa do vetor.

[00153] O vetorde liberação pode ser administrado às regiões dese- jadas do SNC por qualquer via conhecida na técnica incluindo, mas não limitada a liberação intratecal, intracerebral, intraventricular, intranasal, intra-aural, intra-ocular (por exemplo, intra-vítrea, sub-retiniana, na câ- mara anterior) e periocular (por exemplo, região sub-Tenon) ou qualquer combinação das mesmas.

[00154] O vetor de liberação pode ser administrado de uma maneira que produza uma transdução mais disseminada, difusa de tecidos, in- cluindo o SNC, o sistema nervoso periférico e/ou outros tecidos.

[00155] Tipicamente, o vetor viral será administrado em uma formu- lação líquida por injeção direta (por exemplo, injeção estereotáxica) na região ou compartimento desejado no SNC e/ou outros tecidos. Em al-

gumas modalidades, o vetor pode ser liberado através de um reserva- tório e/ou bomba. Em outras modalidades, o vetor pode ser fornecido por aplicação tópica na região desejada ou por administração intranasal de uma formulação em aerossol. A administração no olho ou no ouvido pode ser por aplicação tópica de gotículas de líquido. Como alternativa adicional, o vetor pode ser administrado como uma formulação sólida de liberação lenta. A liberação controlada de vetores de parvovírus e AAV é descrita pela publicação de patente internacional WO 01/91803.

[00156] Os injetáveis podem ser preparados em formas convencio- nais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emul- sões. Alternativamente, o vetor de vírus pode ser administrado de ma- neira local ao invés de sistêmica, por exemplo, em uma formulação de depósito ou de liberação sustentada. Além disso, o vetor de vírus pode ser liberado seco a uma matriz implantável cirurgicamente, tal como um substituto de enxerto ósseo, uma sutura, um stent e semelhantes (por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. 7.201.898).

[00157] As composições farmacêuticas adequadas para administra- ção oral podem ser apresentadas em unidades discretas, tais como cáp- sulas, pílulas, pastilhas ou comprimidos, cada uma contendo uma quan- tidade predeterminada da composição desta invenção; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão de óleo em água ou água em óleo. A administração oral pode ser realizada complexando um vetor de vírus da presente invenção a um veículo capaz de suportar a degrada- ção por enzimas digestivas no intestino de um animal. Exemplos de tais veículos incluem cápsulas ou comprimidos de plástico, como conhecido na técnica. Tais formulações são preparadas por qualquer método ade- quado de farmácia, que inclui a etapa de associar a composição e um veículo adequado (que pode conter um ou mais ingredientes acessórios,

como observado acima). Em geral, a composição farmacêutica de acordo com as modalidades da presente invenção é preparada pela mistura uniforme e íntima da composição com um veículo líquido ou só- lido finamente dividido, ou ambos, e então, se necessário, modelando a mistura resultante. Por exemplo, um comprimido pode ser preparado comprimindo ou moldando um pó ou grânulos que contêm a composi- ção, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os com- primidos são preparados pela compressão, em uma máquina ade- quada, a composição em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, di- luente inerte e/ou agentes ativos na superfície/dispersantes. Os compri- midos moldados são feitos pela moldagem, em uma máquina adequada, o composto em pó umedecido com um aglutinante líquido inerte.

[00158] “Composições farmacêuticas adequadas para administração bucal (sublingual) incluem pastilhas que compreendem a composição desta invenção em uma base aromatizada, usualmente sacarose e acá- cia ou tragacanto; e pastilhas que compreendem a composição em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

[00159] As composições farmacêuticas adequadas para administra- ção parenteral podem compreender soluções aquosas e não aquosas estéreis para injeção da composição desta invenção, cujas preparações são opcionalmente isotônicas com o sangue do receptor pretendido. Es- tas preparações podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos, que tornam a composição isotônica com o sangue do receptor pretendido. As suspensões, soluções e emulsões estéreis aquosas e não aquosas podem incluir agentes de suspensão e espessantes. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenogli- col, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções al- coólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, Ringer dextrose, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de líquidos e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na Ringer dextrose) e semelhantes. Conservantes e outros aditivos tam- bém podem estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.

[00160] As composições podem ser apresentadas em recipientes de unidade/dose ou múltiplas doses, por exemplo, em ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por conge- lamento (liofilizada) que requer apenas a adição do veículo líquido es- téril, por exemplo, solução salina ou água para injeção imediatamente antes do uso.

[00161] Soluções e suspensões extemporâneas para injeção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente. Por exemplo, uma composição estéril injetável, estável desta invenção em uma forma de dosagem unitária em um reci- piente fechado pode ser fornecida. A composição pode ser fornecida na forma de um liofilizado, que pode ser reconstituído com um veículo far- maceuticamente aceitável adequado para formar uma composição lí- quida adequada para injeção em um indivíduo. A forma de dosagem unitária pode ser de cerca de 1 ug a cerca de 10 gramas da composição desta invenção. Quando a composição é substancialmente insolúvel em água, uma quantidade suficiente de um agente emulsificante, que seja fisiologicamente aceitável, pode ser incluída em uma quantidade sufici- ente para emulsionar a composição em um veículo aquoso. Um desses agentes emulsionantes úteis é a fosfatidilcolina.

[00162] As composições farmacêuticas adequadas para administra- ção retal podem ser apresentadas como supositórios de dose unitária. Estes podem ser preparados pela mistura da composição com um ou mais veículos sólidos convencionais tal como, por exemplo, manteiga de cacau e moldando a mistura resultante.

[00163] As composições farmacêuticas desta invenção adequadas para aplicação tópica na pele podem assumir a forma de uma pomada, creme, loção, pasta, gel, spray, aerossol ou óleo. Os veículos que po- dem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a vaselina, lanolina, polietileno glicóis, álcoois, intensificadores transdérmicos e combina- ções de dois ou mais dos mesmos. Em algumas modalidades, por exemplo, a administração tópica pode ser realizada misturando uma composição farmacêutica da presente invenção com um reagente lipo- fílico (por exemplo, DMSO) que é capaz de passar pela pele.

[00164] As composições farmacêuticas adequadas para administra- ção transdérmica podem estar na forma de adesivos discretos adapta- dos para permanecer em contato íntimo com a epiderme do indivíduo por um período prolongado de tempo. As composições adequadas para administração transdérmica também podem ser liberadas por iontofo- rese (veja, por exemplo, Pharm. Res. 3:318 (1986)) e tipicamente assu- mem a forma de uma solução aquosa opcionalmente tamponada da composição desta invenção. As formulações adequadas podem com- preender citrato ou tampão bisttris (pH 6) ou etanol/água e podem conter de 0,1 a 0,2M de ingrediente ativo.

[00165] Os vetores de vírus aqui descritos podem ser administrados aos pulmões de um indivíduo por qualquer meio adequado, por exem- plo, através da administração de uma suspensão de aerossol de partí- culas respiráveis compreendidas pelos vetores de vírus, que o indivíduo inala. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. Aerossóis de partículas líquidas que compreendem os vetores de vírus podem ser produzidos por qualquer meio adequado, tais como com um nebulizador de aerossol acionado por pressão ou um nebulizador ultrassônico, como é conhecido por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Pa- tente U.S. No. 4.501.729. Aerossóis de partículas sólidas que compre- endem os vetores de vírus também podem ser produzidos com qualquer gerador de aerossóis de medicamentos em partículas sólidas, por téc- nicas conhecidas na técnica farmacêutica.

[00166] Tendo descrito a presente invenção, a mesma será expli- cada em mais detalhes nos exemplos a seguir, que estão incluídos aqui apenas para fins ilustrativos e que não se destinam a limitar a invenção. EXEMPLO 1 Vetores de AAV que compreendem AGA Otimizada

[00167] Um cassete do genoma do vetor de AAV foi desenvolvido para expressar a ORF de AGA (FIG. 1). Este cassete foi projetado para fornecer a expressão máxima de um genoma de AAV autocomplemen- tar que seria empacotado dentro de vários capsídeos de AAV. O cassete consiste em, na ordem: ITR de AAV2 mutante, intensificador de CMV, promotor de beta-actina de frango, íntron de MVM híbrido/modificado, ORF de AGA humano otimizada por códon, sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino e ITR de AAV?2 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 7). O transgene de AGA humano foi otimizado por códon para conferir um aumento significativo nos níveis de expressão. O promotor CBh e BGH poliA são utilizados por sua capacidade de conduzir uma expressão forte dentro dos limites de tamanho de um vetor de scAAV. Os vetores de scAAV são 10-100 vezes mais eficientes na transdução em comparação com os vetores tradicionais de AAV.

[00168] Antes de testar o vetor de AGA, um estudo intratecal com alta dose de AAV9 foi realizado em camundongos do tipo selvagem, usando um vetor repórter AAV9/CBh-GFP autocomplementar para es- tudar a biodistribuição do vetor. Este construto de vetor é idêntico ao AAV9/AGA, exceto que o gene de GFP é inserido no lugar do gene de

AGA. A dose é 1,8 vezes maior que a alta dose IT de AAV9/AGA tes- tada. O projeto do estudo é apresentado na Tabela 4 e os resultados são fornecidos na FIG. 2.

[00169] O estudo indicou uma biodistribuição ampla do transgene li- berado através dos vetores de AAV9 no SNC e nos tecidos periféricos. O estudo, enquanto utilizava um gene diferente de AAV9/AGA, quantifi- cou a biodistribuição de AAV9 em doses semelhantes às da alta dose.

[00170] O cassete de expressão de AGA foi empacotado dentro de um capsídeo de AAV9 para injeções intratecais e os vetores resultantes foram utilizados para tratar camundongos knockout para AGA.

[00171] Um camundongo knock-out para AGA (KO) foi gerado e des- crito em 1996 por Kaartinen et al. (Nat. Med. 2(12):1375 (1996)). Os camundongos têm uma inserção de cassete de neomicina direcionada no éxon 3, o que leva à terminação prematura do polipeptídeo no resí- duo de aminoácido 103. Aos 5 meses de idade, alterações morfológicas extensas e vacuolização são aparentes no cérebro e no fígado. O com- prometimento motor (rotarod) foi estatisticamente significativo com 20 semanas de idade (n=7). Uma análise adicional dos camundongos com AGU indica a patologia generalizada no cérebro em 5-6 meses, com extensa perda de neurônios de Purkinje cerebelares evidente com 10 meses. O tempo médio de vida foi relatado ser de cerca de 19 meses. Camundongos com doença terminal mostram extensa gliose no cére- bro, juntamente com alterações patológicas no fígado e nos rins. Em camundongos com AGU com 6 meses de idade, os resultados da RNM foram concordantes com os dados da RNM humana, mostrando pouca diferenciação entre a substância cinzenta e a branca e dilatação ventri- cular conforme confirmado em camundongos com idades entre 6 e 16 meses. O modelo de camundongo KO não possui atividade AGA detec- tável e recapitula os aspectos mais importantes da doença humana.

[00172] A colônia mantida pelos inventores exibia uma doença que ainda era aparente e consistente com o fenótipo humano, mas a pro- gressão da doença foi mais lenta e menos grave do que a relatada por Kaartinen et al. Déficits comportamentais sutis surgiram após 1 ano, ne- nhuma alteração estrutural foi visível pela RNM aos 18 meses e ataxia severa estava ausente. No entanto, por volta dos 20 a 21 meses, uma alta incidência de retenção urinária extrema emergiu como um fenótipo consistente, que criou um ponto final predefinido do estudo de 18 a 19 meses para nossos camundongos com AGU por razões humanitárias. Pela histologia, a perda severa de células de Purkinje foi evidente no cerebelo com 18 a 19 meses de idade.

[00173] Estudos de eficácia foram projetados para testar as interven- ções em camundongos AGA KO antes e após o surgimento de patologia significativa no SNC (2 vs 6 meses de idade, respectivamente). As vias IT e IV foram investigadas em paralelo quanto à eficácia e segurança do AAV9/AGA. De acordo com os estudos descritos abaixo, a via IT foi escolhida para avançar com o estudo, em parte devido a restrições prá- ticas de tradução, ou seja, a eficácia poderia ser alcançada com uma dose vetorial global "por indivíduo" mais baixa.

[00174] O desenho do estudo para o teste de eficácia é apresentado na Tabela 5, assim como na FIG. 3. Os camundongos foram randomi- zados em coortes de tratamento e o estudo usou número aproximada- mente igual de machos e fêmeas. Os camundongos foram pesados e avaliados mensalmente quanto a condição corporal geral. Sempre que possível (na maioria dos casos, incluindo todas as avaliações de bio- marcadores), o pessoal do estudo não estava ciente do genótipo e do tratamento dos camundongos e os camundongos eram identificados apenas como números de identificação genéricos. Todos os camundon- gos que atingiram o ponto final planejado de 18 a 19 meses tiveram amostras coletadas, com todos os principais tecidos congelados ou fi-

xados em formalina.

Soro, urina e LCR foram coletados de todos os ca- mundongos na necropsia.

Durante a vida, o soro e a urina foram cole- tados antes da injeção e, depois, 0,25, 1, 3, 6, 9 meses após a injeção.

As medições de GIcNAc-Asn foram realizadas de maneira cega.

Um subconjunto de amostras foi avaliado nos estudos piloto abaixo, mas a maioria foi arquivada sem teste.

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[00175] Os estudos pré-clínicos com camundongos demonstraram um resgate responsivo à dose de biomarcadores específicos para a do- ença. Um sumário dos achados de eficácia é mostrado na Tabela 6.

Tabela 6 Via da dose Nível da dose (x10*º Conclusões vo) Intratecal 2 Atividade enzimática aumentada, acúmulo de substrato reduzido, mas não completamente eficaz na melhora do fenótipo comporta- mental Intratecal 10 Atividade enzimática aumentada, acúmulo de substrato reduzido e fenótipo comportamental normalizado. Note que a dose IT é 10 ve- zes menor em comparação com a dose IV elevada, mas o res- gate foi comparável.

“intravenosa — — 20 . Atividadeenzimáticaaumentada, acúmulo de substratoreduzido, mas não completamente eficaz na melhora do fenótipo comporta- mental Intravenosa 100 Atividade enzimática aumentada, acúmulo de substrato reduzido e fenótipo comportamental normalizado

[00176] Melhoraem Biomarcadores. Após o tratamento, várias linhas de evidências bioquímicas demonstraram a eficácia do AAV9/AGA no modelo de camundongo AGU. Níveis sustentados de enzimas AGA pró- ximos ou superiores aos níveis de WT foram observados no sangue, fígado, medula espinhal e cérebro (dados do sangue mostrados na FIG.

4). Mais importante, a normalização responsiva à dose de GICNAc-Asn (substrato AGA) foi observada na urina, soro, LCR, cérebro e fígado (FIG. 5). Para explorar os biomarcadores de neuroimagem, um estudo piloto de ressonância nuclear magnética lisados de cérebro de camun- dongo AGA KO e de camundongo normal identificou um pico de subs- trato específico da doença em 5 ppm. MRS foi então explorada para quantificar esse pico em camundongos vivos, onde era mensurável a 5,1 ppm. FIG. 6 mostra a quantificação desse pico e sua redução em resposta ao tratamento.

[00177] Melhora comportamental em camundongos KO. A melhora nos níveis da enzima AGA e redução do substrato de AGA em KO foram atingidas após a administração de AAV9/AGA. Com base na fisiopato-

logia da doença, é esperado que a correção do insulto subjacente (acú- mulo de substrato) interrompa ou diminua a neurodegeneração, resul- tando em um resgate fenotípico. Para testar isso diretamente, os ca- mundongos tratados foram avaliados aos 14 meses de idade, uma idade em que os camundongos com AGU mostram mobilidade reduzida em um teste de campo aberto.

[00178] —Pacientescom AGU tendem a se afastar, se acalmarem, não têm entusiasmo e ficam quietos por horas à medida que a doença pro- gride. O teste de exploração em campo aberto em camundongos é uma ferramenta para avaliar a nova exploração do ambiente, o comporta- mento relacionado à ansiedade e a atividade locomotora geral. A ativi- dade locomotora exploratória nos primeiros 5 minutos da sessão de teste captura suficientemente os aspectos críticos do comportamento relacionado à ansiedade. Neste projeto experimental, ninhadas de ca- mundongos heterozigotos (normais) foram testados em paralelo como controles de referência. Aos 6 meses de idade, os camundongos AGA KO foram randomizados em um dos 5 grupos: 1) não tratados, 2) alta dose IV, 3) baixa dose |V, 4) alta dose IT e 5) baixa dose IT. Esta idade é significativa, uma vez que a neuropatologia está presente nos camun- dongos nessa idade. Aproximadamente 8 meses após a injeção (14 me- ses), todos os camundongos foram testados quanto à sua mobilidade com o teste de campo aberto. A distância percorrida, o alto tempo de mobilidade e o tempo de imobilidade foram quantificados por um sis- tema automatizado de rastreamento de vídeo Noldus. Esses testes re- fletem a atividade e a ansiedade nos camundongos KO tratados e não tratados.

[00179] No total, houve um alto grau de variabilidade em todos os grupos, o que pode ser explicado pelo histórico genético misto dos ca- mundongos e pela idade avançada de teste. Os camundongos hetero-

zigotos eram altamente móveis, inspecionando o ambiente novo/desco- nhecido, e passavam menos tempo imóveis/estacionários exibindo ní- veis mais altos de ansiedade e atividade (FIG. 7). Os camundongos KO não tratados apresentaram comportamento exploratório e mobilidade menores em relação aos heterozigotos. Os camundongos KO tratados mostraram melhora em sua mobilidade em comparação com as coortes não tratadas. As coortes tratadas com níveis de dose mais altos gasta- ram significativamente mais tempo em movimento, embora as distân- cias percorridas durante esse período não tenham sido significativa- mente diferentes dos camundongos não tratados. Deve-se notar que o tratamento foi iniciado em camundongos com 6 meses de idade, idade em que uma patologia e degeneração cerebral significativa está pre- sente. Estudos em camundongos tratados com 2 meses de idade estão em andamento. Interpretamos esses resultados como mostrando uma normalização comportamental significativa de camundongos tratados após o início da patologia da doença, pela administração IV ou IT de AAV9/AGA, em altas doses. Este é um resultado crucial, pois demonstra um claro benefício fenotípico para os camundongos com AGU e define uma dose minimamente eficaz, uma vez que a dose baixa foi incapaz de resgatar completamente o fenótipo da doença.

[00180] Histopatologia de AGU. A hipertrofia lisossômica, como evi- denciada por vacuolização celular, nos órgãos viscerais dos camundon- gos KO, assemelha-se à histopatologia da AGU humana. As células neuronais, gliais e endoteliais do córtex frontal, cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal dos camundongos com AGU são vacuolizadas por volta dos 6 meses e pioram progressivamente. Em camundongos KO com idade superior a 18 meses, 70-80% das células de Purkinje relata- das no córtex cerebelar são perdidas em comparação com os controles pareados pela idade. Em nossos estudos, camundongos com AGU não tratados apresentaram perda menos grave, mas ainda significativa, de células de Purkinje em comparação com os controles (FIG. 8). As célu- las de Purkinje estavam preservadas em número significativamente maior em doses mais altas em camundongos com AGU sintomáticos tratados aos 6 meses de idade.

[00181] Estudos piloto de segurança sem GPL indicam uma mar- gem de segurança favorável para o AAV9/AGA. Comparados aos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem, os AGU KO tiveram baixa sobrevivência, com apenas 8 dos 20 ultrapassando a marca de meses. Vimos um tempo de vida praticamente normal de camundon- gos com AGU não tratados por até 20 meses e não estamos usando a sobrevivência como uma medida de resultado de eficácia. Iniciamos uma coorte adicional (em andamento 11 meses após a injeção, n = 27), em que os camundongos com AGU receberam uma "dose 10x" maior (IT, 1x10? vg) acima da dose minimamente eficaz de 1x10*' vg). Até agora, não foram observados sinais de morbidade em comparação com camundongos com AGU normais ou não tratados. Enquanto observa- mos uma morte inexplicada em um camundongo AGU tratado, houve três mortes inexplicáveis em uma coorte paralela de camundongos com AGU tratados em veículo. Efeitos tóxicos sutis não são descartados, mas nossos dados sugerem um perfil de segurança favorável a longo prazo de AAV9/AGA. EXEMPLO 2 Processamento e Atividade Aperfeiçoados de AGA Otimizada

[00182] Parausaro AGA para terapia com gene, é importante obter um alto nível de atividade ácida da expressão enzimática nos tecidos- alvo. Para esse fim, o gene de AGA humano foi otimizado para o uso do códon. A sequência otimizada que codifica Ser 149 ou Thrl49 (duas va- riantes humanas de ocorrência natural) foi clonada no vetor de expres- são pcDNAS3. A expressão e a atividade das variantes otimizadas foram comparadas com construtos que exibem a sequência normal de cDNA humano. Uma expressão de proteínas significativamente mais alta foi obtida nas células HEK e HeLa das variantes otimizadas por códon, em comparação com as respectivas não otimizadas (FIGS 9A-9D). Consis- tentemente, as atividades enzimáticas normalizadas foram significativa- mente mais altas com as variantes de AGA otimizadas (FIGS 9E-9F). AGA Thrl49 otimizada mostrou uma tendência a maior de expressão e atividade do que contraparte Ser149, mas essa diferença não foi signi- ficativa. As atividades específicas relativas de AGA Ser149 e Thrl49 não foram significativamente diferentes entre si (FIGS 9G-9H).

[00183] O precedente é ilustrativo da presente invenção e não deve ser interpretado como limitante da mesma. A invenção é definida pelas reivindicações a seguir, com os equivalentes das reivindicações a serem incluídas nela.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo que compreende um quadro de leitura aberto de AGA humano, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos foi otimizada por códon para expressão em células huma- nas.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo compreende a sequên- cia de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos cerca de 90% idêntica à mesma.

3.Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de compre- ender um polinucleotídeo que compreende um quadro de leitura aberto de AGA humano.

4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

5. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está operativa- mente ligado a um promotor.

6. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de beta-actina de frango.

7. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um intensificador.

8. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o intensificador é um intensificador de citomegalovírus (CMV).

9. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um íntron.

10. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o íntron é um íntron de MVM híbrido/mo- dificado.

11. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um sinal de poliadenilação.

12. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.

13. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma repetição terminal invertida (ITR) de vírus adeno-asso- ciado (AAV).

14. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende duas ITRs de AAV.

15. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as duas ITRs de AAV têm a mesma sequência de nucleotídeos.

16. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as duas ITRs de AAV têm sequências de nucleotídeos diferentes.

17. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV2.

18. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 17, caracterizado pelo fato de que o cassete de ex- pressão é um genoma de AAV autocomplementar.

19. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 18, caracterizado pelo fato de que o cassete de ex- pressão compreende um intensificador, um promotor, um íntron, um quadro de leitura aberto de AGA humano e um sítio de poliadenilação.

20. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende uma ITR de AAV, um intensificador, um promotor, um íntron, um quadro de leitura aberto de AGA humano, um sítio de poliadenilação e uma ITR de AAV.

21. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 18, caracterizado pelo fato de que o cassete de ex- pressão compreende um intensificador de CMV, um promotor de beta- actina de frango, um íntron de MVM híbrido/modificado, um quadro de leitura aberto de AGA humano e um sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.

22. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende uma ITR mutante de AAV, um intensificador de CMV, um promotor de beta-actina de frango, um íntron de MVM híibrido/modificado, um quadro de leitura aberto de AGA humano, um sítio de poliadenilação do hormô- nio de crescimento bovino e uma ITR de AAV de tipo selvagem.

23. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de nucleotí- deos da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência pelo menos cerca de 90% idêntica a ela.

24. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o polinu- cleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o cassete de ex- pressão como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 16.

25. Vetor, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

26. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV.

27. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é um vetor de AAVO9.

28. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV compreende as proteínas do capsídeo do tipo selvagem.

29. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV compreende uma proteína do capsídeo modificada com tropismo alterado em comparação com uma proteína do capsídeo do tipo selvagem.

30. Vetor, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo modificada não é direcionada ao fígado.

31. Célula transformada, caracterizada pelo fato de compre- ender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, o cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 23, e/ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 30.

32. Célula transformada, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo, cassete de expressão e/ou vetor são incorporados estavelmente no genoma da célula.

33. Animal transgênico, caracterizado pelo fato de compre- ender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, o cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 23, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 30, e/ou a célula transformada como definida na reivindicação 31 ou 32.

34. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2,0 cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindica- ções 3 a 23, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações

24 a 30, e/ou a célula transformada como definida na reivindicação 31 ou 32, em um veículo farmaceuticamente aceitável.

35. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitá- vel é solução salina tamponada com fosfato com D-sorbitol a 5%.

36. Método para expressar um quadro de leitura aberto de AGA em uma célula, caracterizado pelo fato de compreender o contato da célula com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, O cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindica- ções 3 a 23, e/ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindi- cações 24 a 30, expressando assim o quadro de leitura aberto de AGA na célula.

37. Método para expressar um quadro de leitura aberto de AGA em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender liberar ao indivíduo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, o cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindica- ções 3 a 23, ou o vetor como definido ema qualquer uma das reivindi- cações 24 a 30, e/ou a célula transformada, como definida na reivindi- cação 31 ou 32, expressando assim o quadro de leitura aberto de AGA no indivíduo.

38. Método para tratar um distúrbio associado com a expres- são aberrante de um gene de AGA ou atividade aberrante de um pro- duto de gene de AGA em um indivíduo necessitado da mesma, carac- terizado pelo fato de compreender liberar para o indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo como definido na rei- vindicação 1 ou 2, o cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 23, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 30, e/ou a célula transformada como definida na reivindicação 31 ou 32, tratando desse modo o distúrbio associado à expressão aberrante do gene de AGA no indivíduo ou atividade aber- rante do produto do gene de AGA.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado à expressão aberrante do gene de AGA ou atividade aberrante do produto do gene AGA é aspartilglico- saminúria.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada são liberados por via intrave- Nnosa.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor e/ou célula transformada são liberados por via intrate- cal.