BR112020024377A2 - vetores de vírus adeno-associados para o tratamento de mucopolissacaridose tipo iv a - Google Patents

Abstract

VETORES DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS PARA O TRATAMENTO DE MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IV A. A presente invenção fornece novas sequências de polinucleotídeo, vetores derivados de vírus adenoassociados e composições farmacêuticas contendo os mesmos para o tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomal e especialmente, para o tratamento de mucopolissacaridose do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

Description

VETORES DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS PARA O TRATAMENTO DE MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IV A CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a sequências de polinucleotídeo e vetores úteis para a expressão de proteínas de interesse e sua utilização na terapia gênica. A presente invenção também se refere a vetores e sequências de ácido nucleico úteis para o tratamento de mucopolissacaridoses (MPS), e em particular, para o tratamento de mucopolissacaridoses do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O lisossomo é uma organela encontrada no citoplasma de células animais as quais contém mais de 50 hidrolases que quebram biomoléculas durante a reciclagem de componentes celulares desgastados ou após o engolfamento de vírus e bactérias. Esta organela contém diversos tipos de enzimas hidrolíticas, incluindo proteases, nucleases, glicosidases, lipases, fosfolipases, fosfatases e sulfatases. Todas as enzimas são hidrolases ácidas.

[003] Doenças de armazenamento lisossomal (LSDs) são causadas por defeitos genéticos que afetam uma ou mais enzimas lisossomais. Essas doenças genéticas geralmente resultam de uma deficiência na atividade de uma enzima específica presente no lisossomo. Em menor extensão, essas doenças podem ser devidas a deficiências de proteínas envolvidas na biogênese lisossomal.

[004] As LSDs são individualmente raras, embora, como um grupo, essas disfunções sejam relativamente comuns na população em geral. A prevalência combinada de LSDs é de aproximadamente 1 por 5000 nascidos vivos. No entanto, alguns grupos dentro da população em geral são particularmente afetados por uma alta ocorrência de LSDs. Por exemplo, a prevalência das doenças de Gaucher e Tay-Sachs em descendentes de indivíduos judeus da Europa Central e Oriental (Ashkenazi) é de 1 para 600 e 1 para 3900 nascimentos, respectivamente.

[005] As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de sete doenças LSD caracterizadas pela ausência ou deficiência de uma enzima lisossomal específica envolvida no metabolismo das glicosaminoglicanas (GAGs). Todas as MPS apresentam um padrão de herança autossômica recessiva, com exceção da MPSII (doença de Hunter) a qual apresenta uma herança ligada ao cromossomo X.

[006] Das sete MPS, as mucopolissacaridoses do tipo IV (MPSIV ou síndrome de Morquio) apresentam dois subtipos, A e B. Morquio A e B são ambas condições hereditárias autossômicas recessivas, as quais afetam igualmente homens e mulheres. Morquio A ou MPSIVA é uma condição rara e os dados existentes acerca da prevalência são escassos e variáveis. As estimativas reportadas variam de 1 para 76320 na Irlanda do Norte a 1 para 641178 na Austrália Ocidental. A MPSIVA é causada pela deficiência de uma das enzimas envolvidas na degradação da GAG queratan sulfato (KS) e condroitina 6-sulfato (C68S). O gene que codifica esta enzima foi identificado e várias mutações foram reportadas.

[007] A MPSIVA é causada pela deficiência na atividade da enzima galactosamina (N-acetil) -6-sulfatase (GALNS, EC 3.1.6.4). A GALNS é uma enzima lisossomal que hidrolisa o grupo éster de sulfato da N-acetilgalactosamina- 6-sulfato na extremidade não redutora da condroitina-6-

sulfato (C6S) e a de galactose-6-sulfato na extremidade não redutora da queratan sulfato (KS). Como uma consequência do acúmulo sustentado de C6S e KS não degradados, ocorre dano celular progressivo, resultando em doença multissistêmica. Atualmente, cerca de 180 mutações diferentes foram identificadas no gene GALNS humano levando à deficiência da atividade da enzima GALNS.

[008] A maioria das KS e C6S são produzidas por condrócitos e, portanto, os substratos não degradados se acumulam principalmente nas células e na matriz extracelular da cartilagem. Isso apresenta impacto direto no desenvolvimento da cartilagem e do osso, levando à displasia esquelética sistêmica. Em pacientes com Morquio A, as células da cartilagem estão vacuoladas, e isso resulta em condrogênese anormal e / ou ossificação endocondral. A maioria dos pacientes com MPSIVA nasce aparentemente saudável e os sintomas evoluem progressivamente. Os sintomas iniciais são reconhecidos entre 1 e 3 anos de idade e a idade média ao diagnóstico é de cerca de 4,7 anos. As principais características esqueléticas incluem: nanismo de tronco curto impressionante, hipoplasia odontoide, pectus carinatum, cifose, escoliose, genu valgo, coxa valga, alargamento das costelas inferiores, articulações hipermóveis e marcha anormal com tendência a cair. Outras complicações potenciais incluem comprometimento pulmonar, doença cardio vascular, perda auditiva, hepatomegalia, turvação fina da córnea, características faciais ásperas e dentes amplamente espaçados com esmalte anormalmente fino e cáries frequentes. Os pacientes com MPSIVA preservam a inteligência. A taxa de progressão da doença e as características fenotípicas presentes variam entre os pacientes. Os fenótipos de MPSIVA são definidos como graves se a altura final for menor do que 120 cm, como intermediários se a altura final for maior do que 120 cm e menor do que 140 cm, e como leve se a altura final for maior do que 140 cm ao longo das idades. A expectativa de vida reportada variam da segunda década de vida a 70 anos de idade. Essa variabilidade pode estar relacionada a diversos fatores, tal como a natureza da mutação, etnia ou diferenças nos cuidados de saúde que o paciente recebe.

[009] Até recentemente, não existiam terapias aprovadas específicas para doenças para à síndrome da MPSIVA. Os tratamentos disponíveis eram sintomáticos e baseados na administração de uma ampla faixa de fármacos inespecíficos para a prevenção e gestão das complicações da doença. Entretanto, duas opções terapêuticas principais se tornaram disponíveis para pacientes com MPSIVA nos últimos anos: terapia de reposição enzimática (TRE) e transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). O projeto de ambas as estratégias terapêuticas baseia-se na possibilidade de correção cruzada, com base no fato de que as células normais secretam quantidades significativas de enzimas lisossomais solúveis marcadas com manose-6-fosfato (M6P), como GALNS, as quais podem ser subsequentemente recaptadas do compartimento extracelular por outras células por meio de receptores M6P na membrana plasmática e direcionados aos lisossomos. Em adição, existe um limiar de atividade enzimática residual, geralmente muito baixo, acima do qual a célula é capaz de lidar com o influxo de substrato e a doença não afeta os indivíduos, sugerindo que a restauração da atividade normal não é um requisito para modificar o curso clínico.

[0010] Para a MPSIVA, ERT tem sido testada em dois diferentes modelos de camundongo murino da doença (Tomatsu et al., 2008, 2010a, 2015). Neste estudo, uma dose de 250 U / q de GALNS murina recombinante (rGALNS) foi semanalmente administrada por via intravenosa ou por via intraperitoneal a camundongos com MPSIVA de 0,5 e 12 semanas de idade. Uma semana após a última dosagem, os camundongos com MPSIVA mostraram uma redução acentuada no armazenamento da GAG em órgãos viscerais, células do revestimento sinusal na medula óssea, válvulas cardíacas, ligamentos e tecidos conjuntivos e redução acentuada dos níveis de KS no sangue, evidenciando correção somática pela infusão de rGALNS.

[0011] Em 2014, GALNS humana recombinante comercializada com elosulfase alfa, VIMIZIMº (BioMarin Pharmaceutical Inc.) foi aprovada pela Administração de Alimentos e Fármacos (do inglês Food e Drug Administration — FDA) e Agência Europeia de Medicamentos (do inglês European Medicines Agency - EMA) para o tratamento da MPSIVA. O tratamento foi administrado semanalmente em uma dose de 2 mg / kg por infusão intravenosa, com um período médio de infusão de 3,5 - 4,5 horas. A idade dos pacientes inscritos variou de 5 a 57 anos. No início do estudo, todos os pacientes inscritos podiam caminhar entre 30 e 325 m no teste de caminhada de 6 minutos (TC6) (Sanford e Lo, 2014). O ponto final primário foi estabelecido como a mudança da linha de base na distância percorrida no TC6 na semana 24 após o início do tratamento. Os pontos finais secundários incluíram mudanças da linha de base na taxa de subida de escadas em três minutos (3MSCT) e nos níveis de KS na urina na semana

24, Os pacientes foram divididos em dois grupos de tratamento: aqueles que receberam VIMIZIME em uma dose semanal de 2 mg / kg e aqueles com 2 mg / kg uma vez a cada duas semanas. Em pacientes que receberam VIMIZIMO 2 mg / kg semanalmente, a distância percorrida no TC6 foi aumentada para 22,5 m em comparação com à coorte de placebo 24 semanas após o início do tratamento. No entanto, não houve diferença na taxa de subida de escadas em pacientes que receberam VIMIZIMO. Além disso, nenhuma melhora adicional foi observada na capacidade de locomoção em relação às primeiras 24 semanas de tratamento. Por outro lado, não houve diferenças no TC6 e no 3MSCT em pacientes que receberam VIMIZIMO 2 mg / kg uma vez a cada duas semanas, em comparação ao grupo placebo. A redução nos níveis de KS urinário desde o início, uma medida do efeito farmacodinâmico, foi maior em todos os grupos de tratamento com VIMIZIMO (2014). Os pacientes que inicialmente foram incluídos no estudo controlado por placebo foram posteriormente elegíveis para iniciar o tratamento com VIMIZINGO em um estudo de extensão aberto (MOR-005).

[0012] Devido a uma possível hipersensibilidade ao VIMIZIMO, suporte médico está disponível durante a administração do produto. Durante o ensaio, os eventos adversos mais graves descritos foram reações anafiláticas e de hipersensibilidade, os quais podem surgir a qualquer momento durante a infusão de VIMIZIMO ou até 3 horas após a administração do produto. os pacientes com doença respiratória aguda podem apresentar risco aumentado e requerem monitoramento adicional. Essas reações anafiláticas, as quais podem comprometer a vida do paciente,

incluem tosse, erupção cutânea, aperto na garganta, urticária, rubor, alterações na cor da pele, pressão arterial baixa, falta de ar, dor no peito e sintomas gastrointestinais, como náusea, dor abdominal, enjoos e vômitos (http://vimizim.com). Outras desvantagens da ERT incluem: 1) a dificuldade de realizar infusões intravenosas de 3,5 - 4,5 horas de duração em pacientes pediátricos, 2) o fato de que 100 % dos pacientes tratados com VIMIZIMGO 2 mg / kg uma vez por semana desenvolveram anticorpos anti- fármacos após 4 semanas, 3) todos os pacientes testados desenvolveram anticorpos neutralizantes capazes de inibir a ligação do fármaco ao receptor de manose-6-fosfato pelo menos uma vez durante o ensaio, e 4) o alto custo da terapia, que inclui também os custos dos cuidados em domicílio (2014).

[0013] o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) usando células-tronco derivadas da medula óssea (transplante de medula óssea, TMO) tem se mostrado eficiente no tratamento de patologias somáticas e neurológicas em pacientes com outras MPSs. A principal desvantagem da correção do fenótipo pelo TCTH é o impacto mínimo que o tratamento apresenta no crescimento dos pacientes com MPSIVA (Chinen et al., 2014; Wang et al., 2016; Yabe et al., 2016).

[0014] Dadas as limitações das opções terapêuticas atuais para MPSIVA, abordagens alternativas são necessárias.

[0015] A terapia gênica in vivo oferece a possibilidade de um tratamento único para MPSIVA e outras doenças hereditárias, com o prospecto de efeitos benéficos ao longo da vida.

[0016] Os estudos pré-clínicos de terapia gênica para a doença de Morquio A foram baseados principalmente na administração de vetores derivados de adenoassociados y- retrovírus e lentivírus.

[0017] A transdução in vitro de células B humanas de linfoblastóides de MPSIVA, queratinócitos humanos, mioblastos murinos e sinoviócitos de coelho com vetores derivados de y-retrovírus que codificam para o gene GALNS humano resultou em um aumento na atividade enzimática de GALNS que levou a uma redução do armazenamento da GAG intracelular (Toietta et al., 2001).

[0018] A administração de vetores derivados de lentivírus que codificam para o cDNA de GALNS humano para fibroblastos da pele de Morquio A mostrou níveis de atividade enzimática 7,5 vezes mais alto do que aqueles de fibroblastos de MPSIVA não transduzidos, embora menores do que àqueles de fibroblastos humanos saudáveis. O uso de vetores lentivirais também levou à normalização das atividades de B- hexosaminidase e B-galactosidase, os quais foram relatados como biomarcadores secundários para Morquio A (Almeciga et al., 2013; Salazar et al., 2016).

[0019] A transferência de genes mediada por vetores de vírus adenoassociado (AAV), em particular, está emergindo rapidamente à medida que a abordagem de escolha para muitas aplicações de terapia gênica in vivo, devido à alta eficiência de transdução e à falta de patogenicidade desses vetores. Os vetores de AAV podem transduzir células pós- mitóticas e vários estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram o potencial da transferência de genes mediada por vetores de AAV para conduzir com eficiência a expressão sustentada de transgenes terapêuticos para uma variedade de doenças.

[0020] O uso de vetores de AAV permitiu a avaliação do efeito de co-expressão de GALNS e fator de modificação da sulfatase 1 (SUMFI) na atividade enzimática. Esta co- expressão resultou em um aumento de até 4 vezes na atividade enzimática em culturas celulares (Alméciga-Diaz et al., 2010). In vivo, a administração de vetores de AAV-GALNS em um modelo de camundongo com Morquio A mostrou que a atividade enzimática em plasma foi restaurada em até 8,5 % dos níveis do tipo selvagem 12 semanas após uma única administração intravenosa, enquanto a coadministração com o vetor AAV- SUMF1 resultou em um aumento da atividade da GALNS de até 19 % dos níveis do tipo selvagem. A atividade enzimática da GALNS foi também aumentada até 30 % e 33 % do tipo selvagem no coração Ee ossos, respectivamente (Alméciga Javier, MontaÃo Adriana, Shunji Tomatsu, 2012).

[0021] Para melhorar a distribuição óssea da enzima GALNS, um vetor de AAV modificado carregando um peptídeo de aminoácido ácido curto dentro do capsídeo viral para conferir afinidade ao vírus para a hidroxiapatita óssea foi desenvolvido. Este vetor de AAV que codifica GALNS modificado aumentou significativamente as cópias do genoma do vetor e a expressão do transgene no osso do modelo de camundongo com MPSIVA e levou a níveis de atividade de GALNS de 42 % do tipo selvagem (Alméciga Javier, Montaho Adriana, Shunji Tomatsu, 2012; Tomatsu et al., 2010b).

[0022] Nenhuma das abordagens acima mencionadas restaurou totalmente a atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase, alcançou a erradicação total das inclusões intracitoplasmáticas ou corrigiu todos os sinais clínicos da

MPSIVA. Assim, existe uma necessidade de novas abordagens para o tratamento da MPSIVA que apresentem melhores perfis de eficácia e segurança.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0023] A presente invenção fornece novas sequências de polinucleotídeo e vetores para o tratamento de mucopolissacaridoses, em particular mucopolissacaridoses do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

[0024] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma nova sequência de polinucleotídeo isolada apresentando 75 % a 90 % de identidade com sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1 em que a referida sequência codifica uma (N-acetil) 6-sulfatase galactosamina humana funcional.

[0025] Em outro aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo a sequência de polinucleotídeo da invenção.

[0026] Um aspecto adicional da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz das sequências de polinucleotídeo ou do vetor da invenção.

[0027] Ainda, um aspecto adicional da invenção se refere a uma sequência de polinucleotídeo ou um vetor, ou uma composição farmacêutica aqui descrita para uso como um medicamento, em particular para o tratamento de mucopolissacaridoses do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

[0028] A presente invenção também fornece um método para a produção dos vetores virais adenoassociados de acordo com a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] Figura 1. Geração de pAAV-CAG-hGALNS e AAV9- CAG-hGALNS. (A) Representação esquemática do plasmídeo pAAV- CAG-hGALNS e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de hGALNS.

[0030] Figura 2. Geração de pAAV-CAG-ohGALNS-vl e AAVO9-CAG-OhGALNS-vl. (A) Representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-vl e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de ohGALNS-vl1.

[0031] Figura 3. Geração de pAAV-CAG-ohGALNS-v2 e AAVO9-CAG-OhGALNS-v2. (A) Representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-v2 e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de oOhGALNS-v2.

[0032] Figura 4. Geração de pAAV-CAG-ohGALNS-v3 e AAVO9-CAG-OhGALNS-v3. (A) Representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-v3i e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de ohGALNS-v3.

[0033] Figura 5. Geração de pAAV-CAG-omGalns, AAV9- CAG-omGalns e AAVB-CAG-omGalns. (A) Representação esquemática do plasmídeo PAAV-CAG-omGalns e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de omGalns.

[0034] Figura 6. Geração de pAAV-hAAT-omGalns e

AAVB-hAAT-omGalns. (A) Representação . esquemática do plasmídeo —pAAV-hAAT-omGalns e seus componentes. (B) Representação esquemática do genoma de um vetor adenoassociado contendo a sequência de codificação de omGalns.

[0035] Figura 7. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 que codificam para diferentes versões de Galns humanas (AAV9-CAG-hGalns, AAV9-CAG-ohGalns-vl, AAV9-CAG- ohGalns-v2 e AAV9-CAG-ohGalns-v3) para camundongos machos. Atividade de GALNS em (A) fígado e (B) soro de camundongos do tipo selvagem (WT) (saudável), camundongos Galns -/- não tratados e Camundongos Galns -/- administrados sistemicamente, por meio de injeção intravenosa (IV), com 5 x 10!º vg de cada vetor em 2 meses de idade. A atividade de GALNS WT foi estabelecida para 100 %. Os valores são médias + SEM de 4 - 5 camundongos por grupo.

[0036] Figura 8. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 que codificam para Galns murinas otimizadas (AAV9- CAG-omGalns) para camundongos machos. A atividade de GALNS no (A) fígado, (B) fêmur, (C) tecido adiposo de camundongos do tipo selvagem (WT) (saudável), camundongos Galns -/- não tratados e camundongos Galns -/- administrados sistemicamente, por meio de injeção intravenosa (IV), com 1 x 10? vg de AAV9-CAGomGalns em 1 mês de idade. (D) a atividade de GALNS no soro em diferentes pontos após a injeção na mesma coorte de animais. A atividade de GALNS WT foi estabelecida para 100 %. Os valores são médias t SEM de 4 - 5 camundongos por grupo. * P < 0,05, **** P < 0,0001, vs. camundongos Galns -/- não tratados.

[0037] Figura 9. Distribuição intravenosa de vetores de AAVB que codificam para Galns murinos otimizados (AAV8- CAG-omGalns) para camundongos machos. A atividade de GALNS no (A) fígado, (B) fêmur, (C) tecido adiposo de camundongos do tipo selvagem (WT) (saudável), camundongos Galns -/- não tratados e camundongos Galns -/- administrados sistemicamente, por meio de injeção intravenosa (IV), com 1 x 10º? vg de AAVB-CAGomGalns em 1 mês de idade. (D) A atividade de GALNS no soro em diferentes pontos após a injeção na mesma coorte de animais. A atividade de GALNS WT foi estabelecida para 100 %. Os valores são médias t+ SEM de 4 - 5 camundongos por grupo. * P < 0,05, **** P < 0,0001, vs. camundongos Galns -/- não tratados.

[0038] Figura 10. Distribuição intravenosa de vetores de AAV8 que codificam para Galns murinos otimizados (AAVB8-hAAT-omGalns) para camundongos machos. A atividade de GALNS no (A) fígado, (B) fêmur, (C) tecido adiposo de camundongos do tipo selvagem (WT) (saudável), camundongos Galns -/- não tratados e camundongos Galns -/- administrados sistemicamente, por meio de injeção intravenosa (IV), com 1 x 10! vg de AAVB-hAAT-omGalns em 1 mês de idade. (D) A atividade de GALNS no soro em diferentes pontos após a injeção na mesma coorte de animais. A atividade de GALNS WT foi estabelecida para 100 %. Os valores são médias t SEM de 4 - 5 camundongos por grupo. * P < 0,05, **** P < 0,0001, vs. camundongos Galns -/- não tratados.

[0039] Figura 11. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 e AAV8 que codificam para Galns murinos otimizados (AAV9-CAG-omGalns, AAVB-CAG-omGalns e AAVB8- hAATomGalns) para camundongos machos. A quantificação de queratan sulfato (KS) no (A) fígado e (B) soro por análise

LC-MS / MS. **** P < 0,0001, vs. camundongos machos Galns - /- não tratados.

[0040] Figura 12. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 e AAVB que codificam para Galns murinos otimizados (AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns e AAVB8- hAaATomGalns) para camundongos machos. Histopatologia da placa de crescimento epifisário da tíbia em cortes corados com azul de toluidina. Ampliação original de 100x.

[0041] Figura 13. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 e AAVB que codificam para Galns murinos otimizados (AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns e AAVB8- hAATomGalns) para camundongos machos Galns -/-. (A) Quantificação da intensidade de coloração obtida no epitélio da córnea após a coloração de Mowry para glicosaminoglicanas. (B) Histopatologia da glândula lacrimal em cortes corados com azul de toluidina em camundongo do tipo selvagem (WT) (saudável), camundongos Galns -/- não tratados e Camundongos Galns -/- administrados sistemicamente, por meio de injeção intravenosa (IV). Ampliação original de 40x. *** P < 0.001, ***t* P < 0,000l vs. camundongos machos Galns -/- não tratados.

[0042] Figura 14. Distribuição intravenosa de vetores de AAV9 que codificam para Galns murinos otimizados (AAV9-CAG-omGalns) para camundongos machos. A análise por microscopia eletrônica de transmissão da ultraestrutura do giro dentado e amígdala colhidos de machos WT e Galns - / - saudáveis de 6 meses de idade administrados sistemicamente com 1 x 10!? vg de vetores que codificam para Galns murinos otimizados —(AAV9-CAG-omGALNS). Lisossomos aumentados em macrófagos perivasculares (giro dentado), células gliais perineuronais e células endoteliais (amígdala) são indicados por pontas de seta.

DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS

[0043] Os plasmídeos pAAV-CAG-hGALNS (SEQ ID NO: 2), PAAV-CAG-ohGALNS-vl (SEQ ID NO: 4), pAAV-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 6) e pAAV-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 8) foram depositados em 19 de abril de 2018 sob os números de acesso DSM 32791, DSM 32792, DSM 32793 e DSM 32794 respectivamente no DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zzellkulturen, Inhoffenstrabe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federativa da Alemanha.

DEFINIÇÕES

[0044] Os termos “sequência de nucleotídeo” ou “sequência de nucleotídeo isolada” ou “sequência de polinucleotídeo” ou “polinucleotídeo” ou “sequência de polinucleotídeo isolada” são aqui utilizados de forma intercambiável e se referem a uma molécula de ácido nucleico, tanto DNA ou RNA, contendo desoxi ribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, respectivamente. O ácido nucleico pode ser de dupla fita, fita simples ou conter ambas porções com sequências de dupla fita ou fita simples.

[0045] Os termos “% identidade de sequência”, “% de identidade” ou “% homologia de sequência” se refere à porcentagem de nucleotídeos ou aminoácidos de uma sequência candidata os quais são idênticos aos nucleotídeos ou aminoácidos na sequência de referência, após o alinhamento das sequências para alcançar o máximo de % identidade de sequência. Em uma modalidade preferida, a identidade de sequência é calculada com base no comprimento completo das duas SEQ ID NO dadas ou em parte das mesmas. A % de identidade de sequência pode ser determinada por quaisquer métodos ou algoritmos estabelecidos na técnica, tal como os algoritmos ALIGN, BLAST e BLAST 2.0. Vide Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977; 25: 3389 - 3402 e Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990; 215: 403 - 410.

[0046] Aqui, a “% de identidade de sequência”, “% de identidade” ou “% de homologia de sequência” é calculada dividindo o número de nucleotídeos ou aminoácidos os quais são idênticos após o alinhamento da sequência de referência e a sequência candidata, pelo número total de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência de referência e multiplicação do resultado por 100.

[0047] Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade do aminoácido, o técnico no assunto pode também considerar as substituições de aminoácido denominadas “conservativas”, como ficaria claro para um técnico no assunto. substituições de aminoácido conservativas estão baseadas na intercambialidade de resíduos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais alifáticas inclui glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais hidroxil alifáticas inclui serina e treonina; o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais contendo amido inclui asparagina e glutamina; o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais aromáticas inclui fenilalanina, tirosina e triptofano; o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais básicas inclui lisina, arginina, e histidina; e o grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais contendo enxofre inclui cisteína e metionina. As variantes de substituição da sequência de aminoácido aqui divulgada são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências divulgadas foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Preferencialmente, a mudança do aminoácido é conservativa. Substituições conservativas preferidas para cada um dos aminoácidos de ocorrência natural são como segue: Ala para Ser; Arg para Lys; Asn para Gln ou His; Asp para Glu; Cys para Ser ou Ala; Gln para Asn; Glu para Asp; Gly para Pro; His para Asn ou Gln; Ile para Leu ou Val; Leu para Ile ou Val; Lys para Arg; Gln para Glu; Met para Leu ou Ile; Phe para Met, Leu ou Tyr; Ser para Thr; Thr para Ser; Trp para Tyr; Tyr para Trp ou Phe; e, Val para Ile ou Leu.

[0048] Os termos “codificar” ou “codificação” se refere ao código genético que determina como uma sequência de nucleotídeo é traduzida dentro de um polipeptídeo ou uma proteína. A ordem dos nucleotídeos em uma sequência determina a ordem dos aminoácidos ao longo de um polipeptídeo ou uma proteína.

[0049] O termo “proteíin”" se refere a uma macromolécula composta de uma ou mais cadeias lineares de aminoácidos ou polipeptídeos. As proteínas podem sofrer modificações pós-translacionais, como a conversão de um resíduo de cisteína para 3-oxoalanina, glicosilação ou ligação de metal. A glicosilação de uma proteína é a adição de diferentes carboidratos os quais estão ligados covalentemente para a cadeia de aminoácido.

[0050] O termo “região reguladora da transcrição”, tal como aqui utilizado, se refere a um fragmento de ácido nucleico capaz de regular a expressão de um ou mais genes. As regiões regulatórias dos polinucleotídeos da invenção podem incluir um promotor, mais elementos de resposta, sequências ativadoras e intensificadoras para a ligação de fatores de transcrição para ajudar a ligação da RNA polimerase e promover a expressão, e sequências operadoras ou silenciadoras para as quais proteínas repressoras se ligam para bloquear a ligação à RNA polimerase e evitar a expressão.

[0051] O termo “promotor” deve ser entendido como um fragmento de ácido nucleico que atua para controlar a transcrição de um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, as sequências de codificação, as quais são posicionadas 5' à montante da sequência de polinucleotídeo(s), e as quais são estruturalmente identificadas pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de início da transcrição e, porém não limitado a, sítios de ligação para os fatores de transcrição, repressores, e qualquer outra sequência de nucleotídeos conhecida no estado da técnica para atuar diretamente ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição a partir do promotor.

[0052] Diz-se que um promotor é ativo ou aciona a expressão de uma sequência de nucleotídeo operacionalmente ligada a ele quando ele pode iniciar a transcrição da referida sequência de nucleotídeo em um sistema de expressão que utiliza um constructo genético compreendendo o referido promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse utilizando um ensaio adequados tal como RT-qPCR ou Northern blotting (detecção do transcripto). A atividade do referido promotor pode também ser avaliada ao nível de proteína utilizando um ensaio adequado para a proteína codificada tal como Western blotting ou um ELISA.

Diz-se que um promotor é capaz de iniciar a transcrição se um transcripto puder ser detectado ou se um aumento no nível do transcripto ou da proteína mostra-se de pelo menos 5 &%, %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1000 %, 1500 % ou 2000 % quando comparado à transcrição utilizando um constructo o qual difere apenas no fato de ser livre do referido promotor.

[0053] O termo promotor “constitutivo” se refere a um promotor que é ativo sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor “induzível” é um promotor o qual é preferencialmente regulado dependendo das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor induzível pode estar ativo após a distribuição do fármaco ou exposição à luz. Um promotor “constitutivo”, dessa forma, não é regulado no sentido de um promotor “induzível”. Um promotor “específico para o tecido” é preferencialmente ativo em tipos específicos de células / tecidos. Um promotor ubíquo pode ser definido como um promotor que é ativo em muitos ou em quaisquer tecidos diferentes. Usualmente, “muitos” neste contexto significa mais do que 5 ou pelo menos 6, 10, 15, 20 ou em 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 diferentes tecidos.

[0054] O termo promotor “CAG” se refere a um promotor compreendendo o promotor Bractina de galinha e intensificador do citomegalovírus (Alexopoulou A. et al. BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1 - 11). Mais precisamente, o referido promotor CAG compreende (1) o elemento intensificador precoce do citomegalovírus (CMV), (ii) o promotor beta-actina da galinha, (iii) o primeiro íntron do gene beta-actina da galinha, e (iv) o íntron 2 / éxon 3 do beta-globina de coelho.

[0055] O termo promotor “hAAT” se refere a um promotor híbrido compreendendo o promotor al-antitripsina humano e três cópias do intensificador da região de controle do hepatócito (HCR) a partir da apolipoproteína E.

[0056] O termo “operacionalmente ligado” se refere à relação funcional e a localização da sequência de promotor em relação ao gene de interesse (por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência). Em geral, um promotor operacionalmente ligado é contíguo para a sequência de interesse. No entanto, um intensificador não precisa ser contíguo para a sequência de interesse para controlar sua expressão.

[0057] o termo “região reguladora após a transcrição", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer polinucleotídeo que facilita a expressão, estabilização, ou localização das sequências contidas no cassete ou no produto de gene resultante.

[0058] O termo “vetor”, tal como aqui utilizado, se refere a um constructo capaz de distribuir, e opcionalmente expressar, um ou mais polinucleotídeos de interesse dentro de uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA nu ou RNA, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão do DNA ou RNA encapsulados em lipossomas e determinadas células eucarióticas, tal como células produtoras. Os vetores podem ser estáveis e podem ser auto replicáveis. Não existe limitações com relação ao tipo de vetor que pode ser utilizado. O vetor pode ser um vetor de clonagem, adequado para a propagação e para a obtenção de polinucleotídeos, constructos genéticos ou vetores de expressão incorporados para diversos organismos heterólogos.

[0059] Em uma modalidade particular, o referido vetor é um vetor de expressão. O termo “vetor de expressão” tal como aqui utilizado se refere a um vetor projetado para a expressão gênica em células, isto é, o vetor é usado para introduzir um gene específico dentro de uma célula alvo para produzir a proteína codificada pelo gene.

[0060] O vetor de acordo com a presente invenção pode conter sequências regulatórias as quais atuam como regiões intensificadoras e / ou promotoras e levam à transcrição eficiente do gene realizada no vetor de expressão. Vetores adequados incluem vetores de expressão procarióticos (por exemplo, pUCl18, pUCl19, Blue script e seus derivados), mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, fagos e vetores de troca (por exemplo, pSA3 e pAT28) e vetores de expressão eucarióticos baseados em vetores virais (por exemplo, adenovírus, vírus adenoassociados, bem como retrovírus e lentivírus), bem como vetores não virais tais como pSilencer 4,1-CMV (AmbionG, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US), PCDNA3, PpcDNA3.1/hyg PpHCMV/Zeo, PpCR3.1, pEFl/His, PIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, PVAX1, pzeoSV2, pCl, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDT1.

[0061] o termo “plasmídeo recombinante” ou “plasmídeo” se refere a uma molécula DNA pequena, circular, com dupla fita, auto replicável obtida através de técnicas de engenharia genética capazes de transferir material genético de interesse para uma célula, a qual resulta na produção do produto codificado por aquele referido material genético (por exemplo, uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou RNA funcional) na célula alvo. Além disso, o termo “plasmídeo recombinante” ou “plasmídeo” também se refere a uma molécula de DNA pequena, circular, com dupla fita, auto replicável obtida através de técnicas de engenharia genética utilizada durante a fabricação de vetores virais como carreadores do genoma do vetor recombinante.

[0062] O termo “vetor viral recombinante” ou “vetor viral” se refere a um agente obtido a partir de um vírus de ocorrência natural através de técnicas de engenharia genética capazes de transferir material genético (por exemplo, DNA ou RNA) de interesse para uma célula, a qual resulta na produção do produto codificado pelo referido material genético (por exemplo, uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou RNA funcional) na célula alvo.

[0063] Os termos “vírus adenoassociados”, “vírus de AAV”, “vírion de AAV”, “partícula viral de AAV” e “partícula de AAV”, aqui utilizado como sinônimos, se referem a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV (preferencialmente compostas de todas as proteínas do capsídeo de um sorotipo de AAV específico) e um polinucleotídeo encapsulado que corresponde ao genoma do AAV. O AAV do tipo selvagem se refere a um vírus que pertence ao gênero Dependovirus, família Parvoviridae. O genoma do AAV do tipo selvagem tem aproximadamente 4,7 Kb em comprimento e consiste em um ácido desoxi ribonucleico de fita simples (ssDNA) o qual pode ser de sentido positivo ou negativo. O genoma do tipo selvagem inclui repetições terminais invertidas (ITR) em ambas as extremidades da fita de DNA, e três quadros de leitura abertos (ORFs). O ORF rep codifica para quatro proteínas Rep necessárias para o ciclo de vida do AAV. O ORF cap contém sequências de nucleotídeo que codificam proteínas do capsídeo: VPl, VP2 e VP3, as quais interagem para formar um capsídeo de simetria icosaédrica. Por fim, o ORF AAP, o qual sobrepõe com o ORF Cap, codifica para a proteína AAP que aparece para promover o conjunto do capsídeo. Se a partícula compreende um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo diferente de um genoma do AAV do tipo selvagem, tal como um transgene para ser distribuído para uma célula de mamífero) flanqueado por ITRs de AAV, então, é tipicamente conhecido como “partícula do vetor de AAV” ou “vetor viral de AAV” ou “vetor de AAV”. A invenção também abrange o uso de AAV com dupla fita também denominado dsAAV ou scCAAV.

[0064] O termo “ITRs de vírus adenoassociado” ou “ITRs de AAV”, tal como aqui utilizado, se refere às repetições terminais invertidas presentes em ambas as extremidades da fita de DNA do genoma de um AAV. As sequências de ITR são requeridas para a multiplicação eficiente do genoma do AAV. Outra propriedade destas sequências é a sua capacidade para formar um grampo. Esta característica contribui para a sua autopreparação, a qual permite a síntese independente de primase da segunda fita de DNA. As ITRs também mostraram ser necessárias para a integração do DNA do AAV do tipo selvagem no genoma da célula hospedeira (por exemplo, no 19tº cromossomo humano para o AAV de sorotipo 2) e resgate a partir da mesma, bem como para a eficiente encapsidação do DNA do AAV dentro de uma partícula de AAV resistente a desoxi ribonuclease completamente montada. As sequências de ITR apresentam cerca de 145 bp em comprimento. Preferencialmente, as sequências completas das ITRs são utilizadas no genoma do vetor viral de AAV, embora algum grau de modificação menor dessas sequências seja permitido. Uma sequência de ITR do tipo selvagem pode ser alterada pela inserção, deleção ou truncamento, desde que as ITR medeiem as funções desejadas, por exemplo, replicação, corte, empacotamento do vírus, integração, e / ou resgate do pró vírus. Os procedimentos para a modificação destas sequências de ITR são bem conhecidos no estado da técnica. As ITR podem ser de qualquer AAV do tipo selvagem, incluindo, porém não limitado aos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou qualquer outro AAV conhecido ou posteriormente descoberto. O AAV compreende duas ITRsS, as quais podem ser iguais ou diferentes. Ainda, as duas ITRs de AAV podem ser do mesmo sorotipo de AAV que o capsídeo do AAV, ou podem ser diferentes. Em uma modalidade preferida, as ITRs 5' e 3' de AAV derivam de AAV1, AAV2, AAV4, AAVS5, AAV7, AAVB e / ou AAV9. Preferencialmente, as ITRs são de AAV2, AAVB e / ou AAV9 sendo AAV2 a mais preferida. Em uma modalidade, as ITRs de AAV2 são selecionada para gerar um AAV pseudo-tipado (isto é, um AAV apresentando capsídeo e ITRs derivadas de diferentes sorotipos).

[0065] A expressão “genoma viral recombinante”, tal como aqui utilizado, se refere a um genoma de AAV no qual pelo menos um polinucleotídeo externo é inserido dentro do genoma do AAV de ocorrência natural. O genoma do AAV de acordo com a invenção tipicamente compreende as sequências 5' e 3' de repetição terminal invertidas (ITRS) que atuam como cis e um cassete de expressão.

[0066] O termo “terapia gênica” se refere à transferência de material genético (por exemplo, DNA ou RNA) de interesse dentro de uma célula para tratar ou prevenir uma doença ou condição genética ou adquirida. O material genético de interesse codifica um produto (por exemplo, uma proteína, polipeptídeo, peptídeo ou RNA funcional) cuja produção in vivo é desejada. Por exemplo, o material genético de interesse pode codificar uma enzima, hormônio, receptor ou polipeptídeo de valor terapêutico.

[0067] O termo “transduzir” ou “transdução”, tal como aqui utilizado, se refere ao processo em que uma sequência de nucleotídeo externa é introduzida dentro de uma célula por meio de um vetor viral.

[0068] o termo “transfecção”, tal como aqui utilizado, se refere ao processo de introdução deliberada de ácidos nucleicos purificados por métodos não virais dentro de células eucarióticas.

[0069] O termo “tratar” ou “tratamento”, tal como aqui utilizado, se refere à administração de um composto ou composição da invenção para controlar a progressão de uma doença. O controle da progressão da doença é entendido como a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados que incluem, mas não estão limitados a, redução dos sintomas, redução da duração da doença, estabilização de estados patológicos (especificamente para evitar deterioração adicional), retardo da progressão da doença, melhora do estado patológico e remissão (parcial e total). O controle da progressão da doença também envolve uma extensão da sobrevida, em comparação com a sobrevida esperada caso o tratamento não seja aplicado.

[0070] O termo “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade de uma substância suficiente para alcançar o propósito pretendido. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um vetor de AAV para aumentar a atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase (GALNS) é uma quantidade suficiente para reduzir o acúmulo de glicosaminoglicanas. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um vetor de expressão para tratar uma doença ou disfunção é uma quantidade do vetor de expressão suficiente para reduzir ou erradicar os sinais e sintomas da doença ou disfunção. A quantidade eficaz de uma determinada substância irá variar com fatores tais como a natureza da substância, a via de administração, o tamanho e as espécies do animal a receber a substância e a finalidade de fornecer a substância. A quantidade eficaz em cada caso específico pode ser determinada empiricamente por um técnico no assunto de acordo com métodos estabelecidos no estado da técnica.

[0071] O termo “indivíduo” se refere a um mamífero, preferencialmente humano ou mamífero não humano, mais preferencialmente camundongo, rato, outros roedores, coelho, cachorro, gato, porco, vaca, cavalo ou primata, ainda mais preferencialmente humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0072] A presente invenção fornece novas sequências de polinucleotídeo e vetores para o tratamento de mucopolissacaridoses, em particular mucopolissacaridoses do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

[0073] Então, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma sequência de polinucleotídeo isolada

(aqui em seguida referida como “polinucleotídeo da invenção”) apresentando entre 75 % a 90 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1 em que a referida sequência codifica um (N-acetil) 6- sulfatase galactosamina humana funcional.

[0074] Tal como mencionado acima, a MPSIVA é causada pela deficiência na atividade da enzima galactosamina (N- acetil) 6-sulfatase (GALNS). A GALNS é uma enzima lisossomal que hidrolisa o grupo éster de sulfato da Nº acetilgalactosamina-6-sulfato na extremidade não redutora da condroitina-6-sulfato (C6S) e aquela da galactose-6-sulfato na extremidade não redutora de queratan sulfato (KS). Como uma consequência do acúmulo sustentado de C6S e KS não degradados, ocorre dano celular progressivo, resultando em doença multissistêmica.

[0075] Os inventores mostraram que a administração in vivo dos vetores contendo diferentes versões da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase (GALNS) humana as quais expressam cassete, em que as referidas sequências de codificação de GALNS apresentam entre 75 % a 90 % de identidade com a sequência de nucleotídeo que codifica GALNS do tipo selvagem, resultou em um aumento substancial na atividade de GALNS em relação aos níveis medidos em animais com MPSIVA. De fato, os níveis da atividade de GALNS humana alcançado com os vetores de expressão contendo as sequências apresentando entre 75 % a 90 % de identidade com o tipo selvagem foram maiores do que aquelas mediadas pelo vetor contendo a sequência do tipo selvagem.

[0076] A invenção também contempla sequências de polinucleotídeo apresentando entre 75 % a 90 % de identidade com a sequência de nucleotídeo que codifica a GALNS do tipo selvagem tal como definida na SEQ ID NO: 1 em que as referidas sequências codificam variantes e fragmentos de GALNS humana funcional conhecidas no estado da técnica. Então, a invenção deve ser interpretada para incluir o DNA que codifica variantes funcionalmente equivalentes de GALNS.

[0077] o termo “variante funcionalmente equivalente”, tal como aqui utilizado, se refere a qualquer enzima substancialmente homóloga para a enzima codificada pela sequência de polipeptídeo de GALNS e a qual preserva a atividade biológica da GALNS. A sequência das referidas variantes equivalentes funcionais pode ser obtida a partir da sequência de GALNS por meio da inserção, substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos e os quais substancialmente preserva a atividade biológica das GALNS. Métodos para determinar se uma variante preserva a atividade biológica da GALNS nativa são amplamente conhecidos para o técnico no assunto e inclui quaisquer dos ensaios utilizados na parte experimental do presente pedido. Particularmente, as variantes funcionalmente equivalentes das GALNS abrangidas pela presente invenção apresentam pelo menos uma das funções das GALNS tal como, por exemplo, normalizar ou reduzir os níveis de glicosaminoglicanas (GAG), em particular, níveis de C6S e KS. Na seção dos Exemplos da presente invenção, é detalhado um método adequado para determinar a capacidade de uma enzima GALNS funcional para reduzir ou normalizar os referidos níveis de GAG.

[0078] Tal como mostrados nos Exemplos que acompanham a presente invenção, as sequências de polinucleotídeo da presente invenção codificam enzimas GALNS funcionais. As referidas enzimas mostram atividade intensificada quando comparadas com as WT. Os resultados mostram uma restauração da atividade de GALNS após a administração do vetor, o qual levou a um aumento substancial na atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase em relação aos níveis medidos em animais com MPSIVA. Como é mostrados nos Exemplos que acompanham a presente invenção, a atividade dos níveis de GALNS variou de 1500 % a 2600 % dos níveis de WT no fígado.

[0079] Em uma modalidade preferida, um polipeptídeo é considerado uma variante funcionalmente equivalente da enzima GALNS se ele mostra capacidade em funções tais como mencionadas acima. Particularmente, se ele é capaz de degradar a glicosaminoglicanas queratan sulfato (KS) e condroitina-6-sulfato (C6S) com pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da capacidade do polipeptídeo da GALNS do tipo selvagem, preferencialmente com pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da capacidade do polipeptídeo da GALNS do tipo selvagem.

[0080] As variantes funcionalmente equivalentes da GALNS são polipeptídeos substancialmente homólogos para a GALNS nativa. A expressão “substancialmente homóloga”, se refere a uma sequência de proteína quando a referida sequência de proteína apresenta um grau de identidade em relação à sequência da GALNS do tipo selvagem de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 &%.

O grau de identidade entre dois polipeptídeos é determinado usando algoritmos de computador e métodos os quais são amplamente conhecidos para um técnico no assunto. A identidade entre duas sequências de aminoácido é preferencialmente determinada pelo uso do algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) ]|, embora outros algoritmos similares possam também ser utilizados.

[0081] As variantes funcionalmente equivalentes da GALNS podem ser obtidas pela substituição de nucleotídeos dentro do seu polinucleotídeo codificador, responsável pela preferência de códon na célula hospedeira o qual é para ser utilizado para produzir o GALNS.

[0082] As variantes funcionalmente equivalentes da GALNS podem ser geradas fazendo alterações conservativas de aminoácido e testando a variante resultante em um dos ensaios funcionais descritos acima ou em outros ensaios funcionais conhecidos no estado da técnica. As substituições de aminoácido conservativas referem-se à intercambialidade de resíduos que apresentam cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais com hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais aromáticas são fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que apresentam cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

[0083] Em uma modalidade particular da invenção, a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína GALNS ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma contida no polinucleotídeo da invenção apresenta entre 75 % a 90 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade particular, a referida sequência de nucleotídeo apresenta entre 80 % a 85 % de identidade com sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade mais preferida, a referida sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 7.

[0084] Em outra modalidade da invenção, a proteína GALNS codificada pelo polinucleotídeo da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em GALNS humana (NGALNS) e GALNS de camundongo (mGALNS), preferencialmente GALNS humana (hGALNS).

[0085] O polinucleotídeo da invenção pode ainda compreender sequências de controle de expressão que incluem, porém não limitado a, sequências reguladoras de transcrição adequadas (isto é, iniciadora, terminadora, promotora e intensificadora), sinais de processamento do RNA eficientes (por exemplo, sinais de encaixe e de poliadenilação (polyA)), sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático, sequências que intensificam a eficiência de translação (isto é, sequência consensus Kozak), sequências que intensificam a estabilidade da proteína, e quando desejado, sequências que intensificam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências de controle de expressão é conhecido no estado da técnica e pode ser utilizado de acordo com a presente invenção.

[0086] Então, de acordo com a invenção, em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção apresenta uma região reguladora da transcrição operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeo que codifica GALNS. Em uma modalidade particular da invenção, a referida região reguladora da transcrição compreende um promotor. Em outra modalidade particular da invenção, a região reguladora da transcrição do polinucleotídeo da invenção ainda compreende um intensificador operacionalmente ligado ao promotor.

[0087] O polinucleotídeo da invenção pode ser incorporado dentro de um vetor. Em uma modalidade particular, o referido vetor é um vetor de expressão. Então, em outro aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão, aqui referido como “vetor da invenção”, contendo o polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade particular, o referido vetor é um plasmídeo. Em outra modalidade particular o referido vetor é um vetor de AAV, o referido vetor de AAV contendo um genoma viral recombinante compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

[0088] Todas as modalidades divulgadas no contexto do polinucleotídeo da invenção são também aplicáveis para o vetor da invenção.

[0089] Em outra modalidade, a sequência de polinucleotídeo da invenção está flanqueada por ITRs de AAV.

Em uma modalidade particular, as referidas ITRs de AAV são ITRs de AAV2.

[0090] Em outra modalidade, o polinucleotídeo da invenção ainda compreende uma região reguladora após a transcrição. O termo “região reguladora após a transcrição”, tal como aqui utilizado, se refere a qualquer polinucleotídeo que facilita a expressão, estabilização ou localização das sequências contidas no cassete ou o produto genético resultante. A região reguladora após a transcrição pode ser, sem limitação, a região após a transcrição do vírus Woodchuck da hepatite (WPRE). O termo “elemento pós regulador do vírus Woodchuck da hepatite B” ou “WPRE”, tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de DNA que, quando transcrita, cria uma estrutura terciária capaz de intensificar a expressão de um gene.

[0091] Em outra modalidade, a sequência de polinucleotídeo da invenção ainda compreende um sinal de poliadenilação.

[0092] O termo “sinal de poliadenilação”, tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de ácido nucleico que medeia a ligação de uma cauda de poli adenina ao terminal 3' do mRNA. Sinais de poliadenilação adequados incluem, sem limitação, o sinal de poliadenilação precoce SV40, o sinal de poliadenilação tardio SV40, o sinal de poliadenilação da timidina quinase HSV, o sinal de poliadenilação do gene protamina, o sinal de poliadenilação do adenovírus 5 Elb, o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento da variante humana, o sinal da beta-globina poli A de coelho e similares. Em uma modalidade particular, o sinal de poliadenilação é o sinal da beta-globina poli A de coelho ou variantes e fragmentos funcionais da mesma.

[0093] Tal como mencionado acima, em uma modalidade particular da invenção, o polinucleotídeo da invenção está incorporado em um vetor. Em uma modalidade particular, o referido vetor é um vetor de expressão. Em uma modalidade particular, o referido vetor de expressão compreende uma sequência de promotor operacionalmente ligada a referida sequência de polinucleotídeo. O referido promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor específico para tecido. Em uma modalidade particular, o referido promotor é selecionado a partir de um promotor CAG, um promotor hAAT ou um promotor CMV. Em uma modalidade preferida da invenção, o referido promotor é o promotor CAG. Em outra modalidade particular, o referido promotor é um promotor hAAT.

[0094] O polinucleotídeo da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica GALNS ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma. Em uma modalidade, a referida sequência de nucleotiídeo é a sequência de nucleotídeo que codifica GALNS humana, a qual corresponde à sequência do banco de dados NCBI com número de acesso NM 000512.4, mais particularmente, é a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeo é uma variante da sequência de nucleotídeo que codifica a GALNS humana. Mais particularmente, a referida sequência apresenta entre 75 % a 90 % de identidade com sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: l. Mais particularmente, a referida sequência apresenta entre 80 % a 85 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a referida sequência é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7.

[0095] Em uma modalidade particular, o vetor de expressão de acordo com à invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-vl, com número de acesso DSM 32792, tal como definido na SEQ ID NO: 4, plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-v2 com número de acesso DSM 32793, tal como definido na SEQ ID NO: 6, pAAV-CAG-ohGALNS- v3 com número de acesso DSM 32794, tal como definido na SEQ ID NO: 8.

[0096] Em outra modalidade particular, a invenção se refere a um vetor de expressão. Mais particularmente, um vetor viral adenoassociado ou vetor de AAV, o referido vetor de AAV contendo um genoma viral recombinante em que o referido genoma viral recombinante compreende um polinucleotídeo compreendendo uma região reguladora da transcrição operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeo que codifica GALNS ou uma variante funcional equivalente da mesma.

[0097] O AAV de acordo com a presente invenção inclui qualquer sorotipo dos sorotipos de AAV conhecidos. Em geral, os diferentes sorotipos de AAV apresentam sequências genômicas com uma homologia significativa, fornecendo séries idênticas de funções genéticas, produzem vírions os quais são essencialmente equivalentes em termos físicos e funcionais, e replicam e montam através de mecanismos praticamente idênticos. Em particular, o AAV da presente invenção pode pertencer ao sorotipo 1 de AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (incluindo os tipos 3A e 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAVT, AAV8, AAV9, AAVIO, AAVIl, AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino e qualquer outro AAV. Exemplos das sequências do genoma dos diferentes sorotipos de AAV podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos tais como GenBank. Vide os números de acesso GenBank AFO28704.1 (AAV6), NCOON6260 (AAVT7), NCOO6261 (AAVB), e AXT53250.1 (AAV9). Em uma modalidade preferida, o vetor de AAV da invenção é de um sorotipo selecionada a partir do grupo que consiste nos sorotipos AAV2, AAV5, AAVT7T, AAV8, AAV9, AAVIO e AAVrhlO0. Em uma modalidade preferida, o referido vetor de AAV da invenção é do sorotipo 9, AAV9 ou sorotipo 8, AAV8.

[0098] Em uma modalidade particular, o referido vetor de AAV contém uma sequência GALNS humana ou murina. Em uma modalidade, o referido vetor contém uma sequência de nucleotídeo que codifica a GALNS humana, a qual corresponde à sequência do banco de dados da NCBI com número de acesso NM 000512.4, mais particularmente é a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, o referido vetor contém uma sequência de nucleotídeo a qual é uma variante da sequência de nucleotídeo que codifica para a GALNS humana. Mais particularmente, a referida sequência apresenta entre 75 &% a 90 % de identidade com sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1. Mais particularmente, a referida sequência apresenta entre 80 % a 85 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a referida sequência é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7.

[0099] Em outra modalidade particular da invenção, o vetor de AAV é o AAV9-CAG-hGALNS, SEQ ID NO: 12, o qual contém a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ligada ao promotor CAG. Em outra modalidade, o vetor de AAV é o AAV9- CAG-ohGALNS-vl, SEQ ID NO: 13 contendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3 ligada ao promotor CAG. Em outra modalidade, o AAV é o AAV9-CAG-oOhGALNS-v2, SEQ ID NO: 14 contendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ligada ao promotor CAG. Em outra modalidade, o vetor de AAV é o AAV9-CAG-ohGALNS-v3, SEQ ID NO: 15 contendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7 ligada ao promotor CAG.

[00100] Em uma modalidade preferida, o AAV da invenção contém um genoma viral recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo compreendendo na direção 5' para 3', (i) um ITR de AAV2 5', (ii) um intensificador precoce imediato de CMV, (iii) um promotor da beta-actina de galinha, (iv) o primeiro íntron do gene da beta-actina de galinha, (v) o íntron 2 / éxon 3 do gene da beta-globina de coelho, (vi) um cDNA da GALNS ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma, (vii) um sinal poli A, tal como o sinal da beta-globina poli A de coelho, e (viii) um ITR de AAV2 3'. Os versados na técnica apreciarão que o genoma do vetor pode compreender outras sequências (por exemplo, sequências intervenientes entre as sequências especificamente descritas acima). Os componentes (i) a (v) têm o significado tipicamente compreendido pelo especialista na técnica.

[00101] Em uma modalidade preferida, o genoma viral recombinante compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 12. Especificamente, a ITR DE AAV2 5' compreende os nucleotídeos 1 - 131, o promotor CAG compreende os nucleotídeos 185 - 1707, o cDNA da GALNS humana compreende os nucleotídeos 1918 - 3494, o sinal da beta-globina poli A de coelho compreende os nucleotídeos 3520 - 4048, e a ITR DE AAV2 3' compreende os nucleotídeos 4107 - 4215 da SEQ ID NO:

12.

[00102] Em outra modalidade preferida, o genoma viral recombinante compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 13. Especificamente, a ITR DE AAV2 5' compreende os nucleotídeos 1 - 131, o promotor CAG compreende os nucleotídeos 185 - 1707, o cDNA da GALNS humana compreende os nucleotídeos 1918 - 3494, o sinal da beta-globina poli A de coelho compreende os nucleotídeos 3520 - 4048, e a ITR DE AAV2 3' compreende os nucleotídeos 4107 - 4215 da SEQ ID NO:

13.

[00103] Em outra modalidade preferida, o genoma viral recombinante compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 14. Especificamente, a ITR DE AAV2 5" compreende os nucleotídeos 1 - 120, o intensificador CMV compreende os nucleotídeos 194 - 557, o promotor da beta-actina compreende os nucleotídeos 558 - 839, o primeiro íntron do gene da beta- actina de galinha compreende os nucleotídeos 840 - 1804, o íntron 2 / éxon 3 do gene da beta-globina de coelho compreende os nucleotídeos 1805 - 1906, o cDNA da GALNS humana compreende os nucleotídeos 1934-3592, o sinal da beta- globina poli A de coelho compreende os nucleotídeos 3619 - 4147, e a ITR DE AAV2 3' compreende os nucleotídeos 4206 - 4313 da SEQ ID NO: 14.

[00104] Em outra modalidade preferida, o genoma viral recombinante compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 15. Especificamente, a ITR DE AAV2 5' compreende os nucleotídeos 1 - 120, o intensificador CMV compreende os nucleotídeos 194 - 557, o promotor da beta-actina compreende os nucleotídeos 558 —- 839, o primeiro íntron do gene da beta- actina de galinha compreende os nucleotídeos 840 - 1804, o íntron 2 / éxon 3 do gene da beta-globina de coelho compreende os nucleotídeos 1805 - 1906, o cDNA da GALNS humana compreende os nucleotídeos 1934 - 3592, o sinal da beta-globina poli A de coelho compreende os nucleotídeos 3619 - 4147, e a ITR DE AAV2 3' compreende os nucleotídeos 4206 - 4313 da SEQ ID NO: 15.

[00105] As sequências de AAV modificadas podem também ser usadas no contexto da presente invenção. As referidas sequências modificadas, por exemplo, incluem sequências que apresentam pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou mais de identidade de sequência de nucleotídeos e / ou aminoácidos (por exemplo, uma sequência apresentando cerca de 75 - 99 % de identidade de sequência de nucleotídeo ou aminoácido) para uma ITR ou VP de AAV de qualquer um dos sorotipos conhecidos e que mantém a função dos referidos componentes. Os ensaios para determinar a função da ITR ou VP de AAV são conhecidos no estado da técnica. As referidas sequências modificadas podem ser utilizadas no lugar das sequências de ITR ou VP de AAV do tipo selvagem.

[00106] O vetor de AAV da invenção compreende um capsídeo de qualquer sorotipo. Em geral, os diferentes sorotipos de AAV apresentam sequências genômicas de homologia significativa para os níveis de aminoácido e ácido nucleico, fornecendo um conjunto idêntico de funções genéticas, produzir vírions que são essencialmente equivalentes em termos físicos e funcionais, e replicar e montar através de mecanismos praticamente idênticos. Em particular, o AAV da presente invenção pode pertencer ao sorotipo 1 de AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (incluindo os tipos 3 A e 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAVT, AAVB, AAV9, AAVIO, AAVI11, AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino e qualquer outro AAV. Exemplos das sequências do genoma de diferentes sorotipos de AAV podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos tal como GenBank. Vide os números de acesso do GenBank AFO28704.1 (AAV6), NCOO06260 (AAV7), NCOO06261 (AAVB) e AX753250.1 (AAV9). Em uma modalidade preferida, o vetor viral adenoassociado da invenção é de um sorotipo selecionado a partir do grupo que consiste nos sorotipos AAV2, AAV5, AAV7, AAVB, AAV9, AAVIO e AAVrhl10. Em uma modalidade mais preferida, o referido AAV é AAV do sorotipo 9, AAV9 ou AAV sorotipo 8, AAV8.

[00107] O genoma do vetor de AAV da invenção não possui os quadros de leitura abertos rep e cap. Os vetores de AAV podem apenas ser replicados e empacotados dentro de partículas virais infecciosas em células hospedeiras as quais foram transfectadas com um vetor que codifica e expressa os produtos genéticos rep e cap (isto é, proteínas de AAV Rep e Cap), e em que as células hospedeiras foram transfectadas com um vetor o qual codifica e expressa proteínas a partir de adenovírus.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA INVENÇÃO

[00108] O polinucleotídeo do vetor de expressão da invenção pode ser administrado para o corpo humano ou animal por métodos convencionais, os quais requerem sua formulação em uma composição farmacêutica. Então, em um segundo aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica (aqui em seguida referida como “composição farmacêutica da invenção”) compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo da invenção ou do vetor da invenção. A composição farmacêutica pode ainda incluir um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00109] Todas as modalidades divulgadas no contexto do polinucleotídeo da invenção ou do vetor da invenção são também aplicáveis para as composições farmacêuticas da invenção.

[00110] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade do polinucleotídeo, vetor ou vetor de AAV da invenção calculada para produzir o efeito desejado e será geralmente determinada, entre outros motivos, pelas próprias características do polinucleotídeo, vetor ou vetor de AAV da invenção e o efeito terapêutico a ser obtido. Então, a referida quantidade que será eficaz no tratamento de uma doença pode ser determinada por técnicas clínicas padrão aqui descritas ou de outra forma conhecidas no estado da técnica. A dose precisa usada na formulação dependerá da via de administração. As doses iniciais podem ser estimadas a partir de dados in vivo (por exemplo, modelos animais) usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Uma pessoa com experiência normal no estado da técnica pode facilmente otimizar a administração a humanos com base nos dados em animais.

[00111] Em uma modalidade particular, a dosagem da formulação pode ser medida ou calculada como partículas virais ou como cópias do genoma (“GC”) / genomas virais (Cvg”).

[00112] Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser usado para determinar o número de cópias do genoma (GC) por mililitro das composições virais da invenção. Um método para realizar a titulação do número de GC de AAV é como segue: as amostras de vetor de AAV purificadas são primeiro tratadas com DNase para eliminar o DNA do genoma de AAV não encapsidado ou o DNA de plasmídeo contaminante a partir do processo de produção. As partículas resistentes à DNase são então submetidas a tratamento térmico para liberação do genoma do capsídeo. Os genomas liberados são então quantificados por PCR em tempo real usando conjuntos de iniciador / sonda direcionados a uma região específica do genoma viral.

[00113] os termos “carreador farmaceuticamente aceitável”, “diluente farmaceuticamente aceitável”, “excipiente farmaceuticamente aceitável”, ou “veículo farmaceuticamente aceitável”, aqui usados de forma intercambiável, se refere a um sólido, semissólido ou preenchedor líquido, diluente, material de encapsulamento ou auxiliar de formulação de qualquer tipo convencional não tóxico. Um carreador farmaceuticamente aceitável é essencialmente atóxico para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas e é compatível com os demais ingredientes da formulação. O número e a natureza dos carreadores farmaceuticamente aceitáveis dependem da forma de administração desejada. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos e podem ser preparados por métodos bem conhecidos no estado da técnica.

[00114] A composição farmacêutica pode ser formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa,

subcutânea, intramuscular, fluido intra cérebro espinhal (CSF), por exemplo, intracisternal ou intra cérebro ventricular, em seres humanos. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica é para administração intravenosa ou fluido intra cérebro espinhal (CSF). Mais preferencialmente, a composição farmacêutica é para administração intravenosa.

[00115] O vetor de AAV pode ser formulado para administração parenteral por injeção (por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua). As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas ou em recipientes mono ou multidose) com um conservante adicionado. As composições virais podem assumir a forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, podendo conter agentes de formulação como agentes de suspensão, estabilização Ou dispersão. As preparações líquidas das formulações de AAV podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis), agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou acácia), veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados), e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais tamponantes. Alternativamente, as composições podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado (por exemplo, água estéril apirogênica) antes do uso. Quando necessário, uma composição também pode incluir um anestésico local, como a lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Quando uma composição se destina a ser administrada por infiltração, pode dispensar-se um frasco de infiltração que contenha água ou solução salina de qualidade farmacêutica. Quando uma composição é administrada por injeção, um frasco de água pode ser fornecido para injeção ou solução salina estéril, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. Preferencialmente, o carreador farmaceuticamente aceitável é solução salina e um detergente como o copolímero em bloco de polietileno-polioxipropileno, Pluronic F680.

[00116] As composições da invenção podem ser formuladas para a distribuição em animais para fins veterinários (por exemplo, pecuária (gado, porcos, outros)), e outros indivíduos mamíferos não humanos, bem como em indivíduos humanos. A composição farmacêutica da invenção pode ser formulada com um carreador fisiologicamente aceitável para uso em aplicações de transferência gênica e terapia gênica.

[00117] Está também abrangido o uso de adjuvantes em combinação com ou em mistura com o polinucleotídeo, vetor ou vetor de AAV da invenção. Adjuvantes contemplados incluem, porém não estão limitados a adjuvantes de sal mineral ou adjuvantes de gel de sal mineral, adjuvantes particulados, adjuvantes micro particulados, adjuvantes mucosais.

[00118] Adjuvantes podem ser administrados a indivíduos como uma mistura com o polinucleotídeo, vetor ou vetor de AAV da invenção, ou usados em combinação.

[00119] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada localmente ou sistemicamente. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada próxima do tecido ou órgão cujas células são para ser transduzidas. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da invenção é administrada sistemicamente.

[00120] O termo “administrada sistemicamente” e “administração sistêmica”, tal como aqui utilizado, significa que o polinucleotídeo, vetores, vetores de AAV ou composições da invenção podem ser administrados a um indivíduo de maneira não localizada. A administração sistêmica pode atingir diversos órgãos ou tecidos por todo o corpo do indivíduo ou pode atingir órgãos ou tecidos específicos do indivíduo. Por exemplo, a administração intravenosa pode resultar na transdução de mais de um tecido ou órgão em um indivíduo. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em uma dose única ou, em modalidades particulares da invenção, podem ser empregadas doses múltiplas (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) para alcançar um efeito terapêutico. Em uma modalidade preferida da invenção, a composição farmacêutica da invenção é administrada em dose única, isto é, é administrada uma vez na vida.

[00121] Então, em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo ou um vetor de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso na medicina.

[00122] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um polinucleotídeo ou um vetor de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de mucopolissacaridose do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

[00123] Tal como mostrado nos Exemplos que acompanham a presente invenção, os vetores de AAV contendo diferentes versões da galactosamina humana (N-acetil) 6-sulfatase que expressa o cassete foram distribuídos por via intravenosa para camundongos de 2 meses de idade afligidos com MPSIVA por meio de injeção venosa caudal. A análise da atividade da GALNS mostrou que a transdução com todos os vetores contendo galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase resultou em um aumento substancial na atividade da galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase ao longo dos níveis medidos em animais com MPSIVA.

[00124] Então, em outro aspecto, a invenção se refere a um polinucleotídeo ou um vetor de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para aumentar a atividade da galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase.

[00125] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento e / ou prevenção de uma mucopolissacaridose do tipo IVA em um indivíduo em necessidade do mesmo o qual compreende a administração ao referido indivíduo de um polinucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção.

[00126] os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção”, tal como aqui utilizado, se refere a inibir a início ou diminuição da ocorrência de uma doença em um indivíduo. A prevenção pode ser completa (por exemplo, a ausência total de células patológicas em um indivíduo) ou parcial. A prevenção também se refere a uma susceptibilidade reduzida para uma condição clínica. O termo “tratar” ou “tratamento”, tal como aqui utilizado, se refere à administração de um polinucleotídeo, ou vetor ou vetor de AAV ou uma composição farmacêutica da invenção para controlar a progressão de uma doença após o aparecimento de seus sinais clínicos. O controle da progressão da doença é entendido como a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados os quais incluem, porém não estão limitados a, redução dos sintomas, redução da duração da doença, estabilização dos estados patológicos (especificamente para evitar a deterioração adicional ), retardo na progressão da doença, melhora do estado patológico e remissão (parcial e total). O controle da progressão da doença envolve também uma extensão da sobrevida, comparada com a sobrevida esperada caso o tratamento não seja aplicado.

[00127] O termo “indivíduo”, tal como aqui utilizado, se refere a um indivíduo ou animal, tal como um ser humano, um primata não humano (por exemplo, chimpanzés e outras espécies de símios e macacos), um animal de fazenda (por exemplo, pássaros, peixes, gado, ovelhas, porcos, cabras, e cavalos), um mamífero doméstico (por exemplo, cães e gatos), ou um animal de laboratório (por exemplo, roedores, como camundongos, ratos e cobaias). O termo inclui um indivíduo de qualquer idade ou sexo. Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um mamífero, preferencialmente um ser humano.

MÉTODOS PARA A OBTENÇÃO DOS AAVs DA INVENÇÃO

[00128] A invenção também se refere a um método para a obtenção dos vetores de AAV da invenção. Os referidos vetores de AAV podem ser obtidos pela introdução dos polinucleotídeos da invenção dentro de células que expressam as proteínas Rep e Cap constitutivamente ou em que as sequências de codificação para Rep e Cap são fornecidas em plasmídeos ou vetores.

[00129] Então, em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a obtenção de um vetor de AAV compreendendo as etapas de: (i) fornecer uma célula compreendendo um polinucleotídeo da invenção, proteínas cap de AAV, proteínas rep de AAV e, opcionalmente, proteínas virais das quais o AAV é dependente para replicação, (ii) manter a célula em condições adequadas para a montagem do AAV e (iii) purificar o vetor viral adenoassociado produzido pela célula.

[00130] Qualquer célula capaz de produzir vetores de AAV podem ser utilizadas na presente invenção.

[00131] O polinucleotídeo da invenção utilizado neste método foi previamente descrito. Qualquer uma das modalidades divulgadas no contexto dos polinucleotídeos da invenção é aplicável no contexto dos métodos para a obtenção do AAV da invenção.

[00132] O termo “proteína cap”, tal como aqui utilizado, se refere a um polipeptídeo que apresenta pelo menos uma atividade funcional de uma proteína cap de AAV nativa (por exemplo, VPl, VP2 e VP3). Exemplos de atividades funcionais das proteínas cap incluem a capacidade de induzir a formação de um capsídeo, facilitar o acúmulo de DNA de fita simples, facilitar o empacotamento do DNA de AAV em capsídeos (isto é, encapsidação), se ligar a receptores celulares, e facilitar a entrada do vírion nas células hospedeiras. Em princípio, qualquer proteína pode ser usada no contexto da presente invenção.

[00133] Em uma modalidade preferida, as proteínas cap são derivadas de AAV8 ou AAV9.

[00134] O termo “capsídeo”, tal como aqui utilizado, se refere à estrutura na qual o genoma viral é empacotado. Um capsídeo consiste de diversas subunidades estruturais oligoméricas feitas de proteínas. Por exemplo, o AAV apresenta um capsídeo icosaédrico formado pela interação de três proteínas do capsídeo: VPl, VP2 e VP3.

[00135] O termo “proteína rep”, tal como aqui utilizado, se refere a um polipeptídeo que apresenta pelo menos uma atividade funcional de uma proteína rep de AAV nativa. Uma “atividade funcional” de uma proteína rep é qualquer atividade associada à função fisiológica da proteína, incluindo a facilitação da replicação do DNA através do reconhecimento, ligação e corte da replicação do DNA de origem do AAV bem como a atividade da DNA helicase. as funções adicionais incluem modulação da transcrição dos promotores de AAV (ou outros heterólogos) e integração específica para o sítio do DNA de AAV em um cromossomo hospedeiro. Em uma modalidade particular, os genes da rep de AAV derivam do sorotipo AAV2.

[00136] A expressão “proteínas virais das quais o AAV é dependente para replicação”, tal como aqui utilizado, se refere polipeptídeos os quais realizam funções das quais o AAV é dependente para replicação (isto é, “funções auxiliares”). As funções auxiliares incluem, sem limitação, aquelas funções requeridas para a ativação da transcrição do gene do AAV, encaixe do mRNA de AAV específico para o estágio, replicação do DNA de AAV , síntese de proteínas cap, e montagem do capsídeo do AAV. As funções auxiliares a base de vírus podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos, tal como adenovírus, herpes vírus (exceto vírus do herpes simplex tipo 1), e vírus vaccinia. As funções auxiliares incluem, sem limitação, adenovírus El, E2a, VA e E4 ou herpes vírus UL5, UL8, UL52, e UL29, e herpes vírus polimerase.

[00137] O polinucleotídeo da invenção, ou os genes rep de AAV, cap de AAV e genes que fornecem funções auxiliares podem ser introduzidos dentro da célula pela incorporação dos referidos genes dentro de um vetor tal como, por exemplo, um plasmídeo, e introdução do referido vetor dentro da célula. Os genes podem ser incorporados dentro do mesmo plasmídeo ou dentro de diferentes plasmídeos. Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo da invenção é incorporado em um plasmídeo, os genes rep e cap de AAV são incorporados dentro de outro plasmídeo e os genes que fornecem funções auxiliares são incorporados dentro de outro plasmídeo.

[00138] Os plasmídeos contendo o polinucleotídeo da invenção e ou os genes rep e cap de AAV ou genes que fornecem funções auxiliares podem ser introduzidos dentro da célula pelo uso de qualquer método adequado bem conhecido no estado da técnica. Exemplos de métodos de transfecção incluem, porém não estão limitados a co-precipitação com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, polibreno, eletroporação, micro injeção, fusão mediada por lipossoma, lipofecção, infecção por retrovírus e transfecção biolística. Em uma modalidade particular, a transfecção é realizada por meio da co- precipitação com fosfato de cálcio. Quando a célula não possui a expressão de qualquer um dos genes rep e cap de AAV e genes que fornecem funções auxiliares adenovirais, os referidos genes podem ser introduzidos dentro da célula simultaneamente com o polinucleotídeo da invenção. Alternativamente, os referidos genes podem ser introduzidos na célula antes ou após a introdução do polinucleotídeo da invenção.

[00139] Em uma modalidade particular, as células são transfectadas simultaneamente com três plasmídeos, i) um plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo da invenção, ii) um plasmídeo compreendendo os genes rep e cap do AAV e iii) um plasmídeo compreendendo os genes que fornecem as funções auxiliares.

[00140] A etapa (ii) do método da invenção envolve a manutenção da célula sob condições adequadas para montagem do AAV.

[00141] Os métodos de cultura de células e exemplos de condições as quais promovem a liberação de vetores de partículas de AAV, tais como a lise das células, podem ser realizadas tal como aqui descrito em exemplos. As células produtoras são cultivadas por um período de tempo adequado para promover a montagem do AAV e a liberação de vetores virais no meio. Geralmente, o tempo de cultura é medido a partir do ponto de produção viral. Por exemplo, no caso de AAV, a produção viral geralmente começa após o fornecimento da função do vírus auxiliar em uma célula produtora apropriada, tal como aqui descrito.

[00142] A etapa (iii) do método da invenção envolve a purificação do vetor de AAV produzido pela célula.

[00143] Qualquer método para a purificação do AAV das referidas células ou do referido meio de cultura pode ser utilizado para a obtenção do AAV da invenção. Em uma modalidade particular, os AAV da invenção são purificados seguindo um método otimizado baseado em uma etapa de precipitação de polietilenoglicol e dois gradientes consecutivos de cloreto de césio (CsCl).

[00144] Diversos AAV de ocorrência natural e projetados, os ácido nucleicos que os codificam, proteínas cap e rep de AAV, bem como os métodos para o isolamento ou geração, propagação e purificação dos referidos AAV, e em particular, seus capsídeos, adequados para uso na produção do AAV são conhecidos no estado da técnica.

[00145] A presente invenção ainda fornece uma célula isolada compreendendo a sequência de polinucleotídeo da invenção que codifica a proteína GALNS ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma.

[00146] Todas as modalidades divulgadas no contexto dos polinucleotídeos, vetores ou vetores de AAV da invenção e as composições farmacêuticas da invenção são aplicáveis para os métodos terapêuticos da invenção.

PROCEDIMENTOS GERAIS Vetores de AAV recombinantes

[00147] Os vetores de AAV aqui descritos foram obtidos por transfecção tripla. Os materiais requeridos para fazer os vetores foram: células HEK293 (que expressam genes adenovirais El), plasmídeo auxiliar que fornece funções de adenovírus, plasmídeo que fornece genes rep de AAV do sorotipo 2 e genes cap dos sorotipos 8 ou 9 (AAVB ou AAV9) e, por fim, o plasmídeo estrutural com ITRs DE AAV2 e o construto de interesse.

[00148] Para gerar vetores de AAV que expressam galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase, as sequências de codificação otimizada ou não otimizada da galactosamina (N- acetil) 6-sulfatase humana ou murina foram clonadas em um plasmídeo estrutural de AAV sob o controle do promotor CAG híbrido ubíquo ou um promotor hAAT específico para o fígado. A produção em larga escala dos plasmídeos foi realizada usando um kit de mega preparação de plasmídeo EndoFree (Qiagen).

[00149] Os vetores foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co- transfectado com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado pelos ITRs virais do AAV de sorotipo 2 (descrito acima); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep2 e cap8 ou cap? de AAV; e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por aPCR e armazenados a -80 ºC até o uso.

[00150] Os vetores da presente invenção foram construídos de acordo com técnicas de biologia molecular bem conhecidas no estado da técnica.

Estudos de transfecção in vitro

[00151] As células HEK293 foram transfectadas com 4 ug de pAAV-CAG-omGALNS, pAAV-hAAT-omGALNS, pAAV-CAG-hGALNS,

PAAV-CAG-oOhGALNS-vl, . pAAV-CAG-oOhGALNS-v2 ou pAAV-CAG- ohGALNS-v3 usando Lipofectamine8& 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) seguindo as instruções do fabricante. Após 48 horas, as células e os meios de cultura foram colhidos e processados para extração da proteína.

[00152] Os extratos da proteína foram obtidos por sonicação das células em 250 1ul de água Mili-Q e o teor de proteína foi quantificado usando ensaio da proteína Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, US). A atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase foi determinada em 1 ug de extrato da proteína celular e 5 ul de meio de cultura e normalizado pela quantidade total e volume da proteína, respectivamente, com um substrato fluorogênico derivado de 4-metilumbeliferona (Toronto Research Chemicals Inc, Ontario, Canadá), tal como previamente descrito (van Diggelen et al., 1990).

Animais

[00153] Células-tronco embrionárias C57BL / 6N-A / a que carregam um gene repórter (LacZ) marcando a inserção no gene Galns disponível por meio do Consórcio Internacional de Fenotipagem de Camundongos (em inglês International Mouse Phenotyping Consortium - IMPC, www.mousephenotype.org) foram obtidas. Os clones foram micro injetados em blastocistos C57BL / 6JO0OlaHsd na Unidade de Animais Transgênicos do Centro de Biotecnologia e Terapia gênica de Animais (CBATEG) na Universidade Autônoma de Barcelona (UAB), e as quimeras masculinas resultantes foram cruzadas com fêmeas C57Bl / 6NTac para gerar descendentes nocaute para Galns (camundongos com MPSIVA ou Galns - / -). O genótipo foi determinado no DNA genômico a partir de amostras cortadas na cauda com uma análise de PCR que amplifica uma sequência abrangendo a mutação alvo. As sequências dos respectivos iniciadores sense e antisense foram: iniciador sense: 5" CCA GGG AAT GTC CCA CCT ATT T 3” (SEQ ID NO: 20); iniciador antisense: 5' GTC AGG TTG ACA CGA AGC TG 3' (SEQ ID NO: 21); e iniciador antisense KO: 5" GGA ACT TCG GTT CCG GCG 3' (SEQ ID NO: 22). Os iniciadores sense e antisense permitem a genotipagem de camundongos WT. Os iniciadores sense e antisense KO permitem a genotipagem de camundongos Galns - /-.

[00154] Os camundongos foram alimentados ad libitum com uma dieta padrão (Harlan, Tekland) e mantidos sob um ciclo claro - escuro de 12 h (luzes acesas às 9h da manhã).

[00155] Devido à ausência da atividade de GALNS esses animais apresentam, desde um mês de idade, várias características “patológicas características da doença MPSIVA, incluindo acúmulo de glicosaminoglicanas (GAGs) e alargamento do compartimento lisossomal em diferentes regiões da placa epifisária do fêmur e da tíbia. Além disso, muitos desses achados patológicos são exacerbados quando os animais ficam mais velhos, sugerindo a piora da patologia à medida que os animais envelhecem. Da mesma forma, conforme os animais envelhecem, o acúmulo de GAG em órgãos periféricos como o fígado, o coração e o baço também é observado. No entanto, nenhuma diferença significativa é observada na expectativa de vida entre os irmãos Galns - / - e WT.

Administração do vetor aos camundongos

[00156] Para a distribuição de vetores intravenosa de vetores AAV8-hAAT-omGALNS, uma dose total de 1 x 10** vg foi injetada em camundongos em um volume total de 200 ul através da veia caudal de animais Galns -/- de 3 - 4 semanas de idade. Uma coorte similar de animais foi injetada com 1 x 10!?* vg de vetor controle não codificante (AAV8-hAAT-null).

[00157] Para a distribuição de vetores intravenosa de vetores AAVB-CAG-omGALNS em camundongos, uma dose total de 1 x 10? vg foi injetada em camundongos em um volume total de 200 ul através da veia caudal de animais Galns -/- de 3 —- 4 semanas de idade. Uma coorte similar de animais foi injetada com 1 x 10!? vg de vetor controle não codificante (AAVB-CAG-null).

[00158] Para a distribuição de vetores intravenosa de vetores AAV9-CAG-omGALNS em camundongos, uma dose total de 1 x 10"? vg foi injetada em camundongos em um volume total de 200 ul através da veia caudal de animais Galns -/- de 3 — 4 semanas de idade. Uma coorte similar de animais foi injetada com 1 x 10"? vg de vetor controle não codificante (AAV9-CAG-null).

[00159] Aos 7 meses de idade, 6 meses após a administração do vetor, os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram coletados.

[00160] Para a distribuição intravenosa do vetor, 5 x 101º genomas do vetor de vetores de AAV9 que apresentam diferentes versões da sequência de codificação da glicosamina humana (N-acetil) 6-sulfatase foram distribuídas em camundongos em um volume total de 200 ul por meio de injeção venosa caudal de animais Galns -/- de 2 semanas de idade. Animais WTI e Galns -/- não tratados foram usados como controle.

[00161] Aos 2,5 meses de idade, 15 dias após a administração do vetor, os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram coletados.

Coleta da amostra

[00162] No sacrifício, os animais foram profundamente anestesiados e, em seguida, perfundidos transcardialmente com 50 ml de PBS para limpar completamente o sangue dos tecidos. O cérebro inteiro e múltiplos tecidos somáticos (incluindo fígado, baço, rim, pulmão, coração, tecido adiposo, olho, glândula lacrimal e ossos) foram coletados e congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ºC ou imersos em formalina para análises histológicas subsequentes.

Atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase e quantificação das glicosaminoglicanas

[00163] Amostras de fígado e tecido adiposo foram sonicadas em água Mili-Q e amostras de fêmur foram homogeneizadas em tampão de homogeneização que consiste em mmol / 1 de Tris-HCl, pH 7.2 e 1 mmol / 1 de fluoreto de fenil metil sulfonil. A atividade da galactosamina (N- acetil) 6-sulfatase foi determinada com um substrato fluorogênico derivado de 4-metilumbeliferona (Toronto Research Chemicals Inc, Ontario, Canadá), tal como previamente descrito (van Diggelen et al., 1990). Os níveis da atividade de GALNS no fígado, tecido adiposo e fêmur foram normalizadas contra a quantidade total de proteína, quantificada usando ensaio da proteína Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, US).

[00164] Para a quantificação da GAG, as amostras de tecido foram pesadas e, em seguida, digeridas com proteinase K e os extratos foram clarificados por centrifugação e filtração. Os níveis de GAG foram determinados por cromatografia líquida - espectrometria de massas (LC-MS /

MS) em extratos de tecido e soro. Os níveis de GAG foram normalizados para o peso do tecido úmido ou para o volume total das amostras digeridas.

Análise histológica

[00165] Os tecidos foram fixados por 12 - 24 h em formalina, embebidos em parafina e seccionados.

[00166] Para a detecção de armazenamento de GAG no epitélio da córnea, seções de parafina foram submetidas à coloração coloidal de Mowry, a qual revela as GAGs na cor azul. Para a detecção de armazenamento de GAG na glândula lacrimal e na placa de crescimento epifisário tibial, seções de resina foram submetidas à coloração com azul de toluidina, a qual revela o armazenamento de GAG na cor branca.

[00167] O software NIS Elements Advanced Research

2.20 foi usado para quantificar a % da área da GAG + em 15 — 20 imagens de cada olho (ampliação original de x40) por animal, usando as mesmas configurações do limiar de sinal para todos os animais. Em seguida, foi calculada a porcentagem de área positiva, isto é, a área, em pixels, com sinal positivo em relação à área total do tecido na região de interesse da imagem.

Análise da microscopia eletrônica de transmissão

[00168] Os camundongos foram sacrificados por meio de uma overdose de isoflurano (Isoflo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) e perfundidos por meio da veia cava inferior com 1 ml de glutaraldeído a 2,5 % e aformaldeído a 2 %. Uma pequena porção (aproximadamente 1 mm?º) do giro dentado e amígdala foi seccionada e incubada por 2 horas a 4 “*C no mesmo fixador. Após lavagem em tampão cacodilato frio, os corpos-de-prova foram pós-fixados em tetra óxido de ósmio a 1 %, corados em acetato de uranila aquoso, e posteriormente desidratados em etanol de série graduada e embebidos em resina epóxi. Os cortes ultrafinos (600 - 800 À) dos blocos de resina foram corados com citrato de chumbo e examinados em microscópio eletrônico de transmissão (H-7000; Hitachi, Tóquio, JP).

Análise estatística

[00169] Todos os resultados são expressos como média t+ SEM. As comparações estatísticas foram feitas usando ANOVA de uma via. Comparações múltiplas entre os grupos de controle e tratamento foram feitas pelo pós-teste de Dunnett, e entre todos os grupos pelo pós-teste de Tukey. A significância estatística foi considerada se P < 0,05.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção do pAAV-CAG-hGALNS

[00170] A CDS para a galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase humana (sequência de referência NCBI: NM 000512.4) foi usada como material de partida e foi quimicamente sintetizada para esta finalidade (GeneArt; Life Technologies). A CDS da SEQ ID NO: 1 foi recebida clonada dentro do plasmídeo pMK-RQ (KanR) flanqueada por sítios de restrição Mlul e EcoRI em 5' e 3', respectivamente.

[00171] Os fragmentos Mlul / EcoRI da CDS da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana foi excisada do plasmídeo pMK-RQ e subsequentemente clonada entre os sítios de restrições Mlul e EcoRI do plasmídeo estrutural de AAV PAAV-CAG. O plasmídeo resultante foi nomeado pAAV-CAG-hGALNS (número de acesso DSM 32791). Vide a Figura 1A e SEQ ID NO:

2.

[00172] O plasmídeo estrutural de AAV pAAV-CAG aqui utilizado foi previamente gerado e contido em ITRs do genoma de AAV2, o promotor CAG, e o sinal poli A de fB-globina de coelho, bem como um sítio de multiclonagem para a clonagem das CDSs de interesse. O promotor CAG é um promotor híbrido composto pelo intensificador precoce / intermediário de CMV e o promotor B-actina de galinha. Este promotor é capaz de conduzir uma potente expressão ubíqua.

Exemplo 2: Construção do pAAV-CAG-ohGALNS-vl

[00173] Os cassetes de expressão que incluem uma versão otimizada da sequência de cDNA da galactosamina (N- acetil) 6-sulfatase (oOhGALNS) foram projetados e obtidos. A otimização da sequência foi realizada para maximizar a eficiência da produção de proteína galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase em seres humanos por meio da eliminação de sítios de encaixe crípticos e de elementos de sequência de desestabilização do RNA para maior estabilidade do RNA, adição de elementos de sequência de estabilização de RNA, otimização de códons e adaptação do teor de G / C, prevenção de estruturas secundárias de RNA estáveis, dentre outras mudanças. A CDS para a galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana (sequência de referência NCBI: NM 000512.4) foi usada como ponto de partida para a otimização da sequência.

[00174] As CDS otimizada da SEQ ID NO: 3 (GeneArt; Life Technologies) foram recebidas clonadas dentro do plasmídeo pMK-RQ (KanR) flanqueadas por sítios de restrição MluI e EcoRI em 5' e 3', respectivamente.

[00175] Os fragmentos MluIl / EcoRI otimizados da CDS da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana foram excisados do plasmídeo pMK-RQ e subsequentemente clonados entre os sítios de restrições MluIl e EcoRI do plasmídeo estrutural de AAV pAAV-CAG. O plasmídeo resultante foi nomeado pAAV-CAG-oOhGALNS-vl (número de acesso DSM 32792). Vide a Figura 2A e SEQ ID NO: 4.

Exemplo 3: Construção do pAAV-CAG-ohGALNS-v2

[00176] A CDS para a galactosamina humana (N-acetil) 6-sulfatase (sequência de referência NCBI: NM 000512.4) foi submetida à otimização de sequência (GenSript, Inc). As CDS otimizadas da SEQ ID NO: 5 foram recebidas clonadas dentro do plasmídeo pUC57 (AmMpR) flanqueadas por sítios de restrição MluIl e EcoRI em 5' e 3', respectivamente.

[00177] Os fragmentos Mlul / EcoRI da CDS da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana foram excisados do plasmídeo pUC57 e subsequentemente clonados entre os sítios de restrições MluIl e EcoRI do plasmídeo estrutural de AAV pAAV-CAG. O plasmídeo resultante foi nomeado pAAV-CAG- ohGALNS-v2 (número de acesso DSM 32793). Vide a Figura 3A e SEQ ID NO: 6.

Exemplo 4: Construção do pAAV-CAG-ohGALNS-v3

[00178] A CDS para a galactosamina humana (N-acetil) 6-sulfatase (sequência de referência NCBI: NM 000512.4) foi submetida à otimização de sequência (DNA 2.0 Inc). As CDS otimizadas da SEQ ID NO: 7 foram recebidas clonadas dentro do plasmídeo pj201 (KanR) flanqueadas por sítios de restrição MluI e EcoRI em 5' e 3', respectivamente.

[00179] Os fragmentos Mlul / EcoRI da CDS da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana foram excisados do plasmídeo pj201 e subsequentemente clonados entre os sítios de restrições MluIl e EcoRI do plasmídeo estrutural de AAV pAAV-CAG. O plasmídeo resultante foi nomeado pAAV-CAG- oOhGALNS-v3 (número de acesso DSM 32794). Vide a Figura 4A e SEQ ID NO: 8.

Exemplo 5: Construção do pAAV-CAG-omGALNS

[00180] As CDS para galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase murina (sequência de referência NCBI: NM 016722.4) foi submetida à otimização de sequência (GeneArt; Life Technologies). As CDS otimizadas da SEQ ID NO: 9 foram recebidas clonadas dentro do plasmídeo EPMA-RO-Bb (AmPpR) flanqueadas por sítios de restrição MluI e EcoRI em 5' e 3', respectivamente.

[00181] Os fragmentos Mlul / EcoRI da CDS da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase murina otimizada foram excisados do plasmídeo pMA-RQO-Bb e subsequentemente clonados entre os sítios de restrições Mlul e EcoRI do plasmídeo estrutural de AAV pAAV-CAG. O plasmídeo resultante foi nomeado pAAV-CAG-omGALNS. Vide a Figura 5A e SEQ ID NO: 10.

Exemplo 6: Construção do pAAV-hAAT-omGALNS

[00182] As CDS para a galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase murina (sequência de referência NCBI: NM 016722.4) foram submetidas à otimização de sequência (GeneArt; Life Technologies) SEQ ID NO: 9.

[00183] O promotor hAAT (SEQ ID NO: 19) foi recebido clonado dentro do plasmídeo pGG2-hAAT (AmMpR) flanqueado por sítios de restrição BglII e MluI em 5' e 3', respectivamente.

[00184] O promotor CAG (SEQ ID NO: 18) foi excisado do plasmídeo pAAV-CAG-omGALNS e subsequentemente substituído por um promotor hAAT. O plasmídeo resultante foi nomeado PAAV-hAAT-omGALNS. Vide a Figura 6A e SEQ ID NO: 11.

[00185] O promotor hAAT é um promotor híbrido composto pelo promotor da antitripsina al humana e três cópias do intensificador da região de controle de hepatócitos (HCR) da apolipoproteína E. Este promotor é capaz de conduzir uma potente expressão específica para o fígado.

Exemplo 7: Produção do AAV9-CAG-hGALNS

[00186] Vetores de AAV 9-CAG-hGALNS (SEQ ID NO: 12) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-hGALNS; SEQ ID NO: 2); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 1B.

Exemplo 8: Produção do AAV9-CAG-ohGALNS-v1

[00187] Os vetores de AAV 9-CAG-ohGALNS-vl (SEQ ID NO: 13) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-oOhGALNS-vl; SEQ ID NO: 4); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9);

e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 2B.

Exemplo 9: Produção do AAV9-CAG-ohGALNS-v2

[00188] Os vetores de AAV 9-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 14) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-ohGALNS-v2; SEQ ID NO: 6); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 3B.

Exemplo 10: Produção do AAV9-CAG-ohGALNS-v3

[00189] Os vetores de AAV 9-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 15) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-ohGALNS-v3; SEQ ID NO: 7); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 4B.

Exemplo 11: Produção do AAV9-CAG-omGALNS

[00190] Os vetores de AAV 9-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. Vide (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 5B e SEQ ID NO: 16.

Exemplo 12: Produção do AAV8-CAG-omGALNS

[00191] Os vetores de AAV 8-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. Vide (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV8 (pREP2CAP8); e 3) um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 5B e SEQ ID NO: 16.

Exemplo 13: Produção do AAV8-hAAT-omGALNS

[00192] Os vetores de AAV 8-hAAT-omGALNS (SEQ ID NO: 17) foram gerados por transfecção livre de vírus auxiliar de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. Vide (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). As células foram cultivadas a 70 % de confluência em frascos do tipo roller (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementado com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo que carrega o cassete de expressão flanqueado por ITRs DE AAV2 (pAAV-hAAT-omGALNS; SEQ ID NO: 11); 2) um plasmídeo que carrega os genes rep de AAV2 e cap de AAV8 (pREP2CAP8); e 3)

um plasmídeo que carrega as funções auxiliares de adenovírus. os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado tal como previamente descrito (Ayuso et al., 2010). Os vetores foram dialisados contra PBS + 0.001 % de PluronicO F68, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80 ºC até o uso. Vide a Figura 6B e SEQ ID NO: 17.

Exemplo 14: Injeção intravenosa de AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-OhGALNS-v1, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 ou AAV9-CAG- ohGALNS-v3 em camundongos com MPSIVA

[00193] Uma dose total de 5 x 10º de genomas do vetor AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-ohGALNS-vl, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 ou AAV9-CAG-oOhGALNS-v3 contendo diferentes versões de cassetes que expressam a galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase humana foram distribuídos por via intravenosa para camundongos de 2 meses de idade afligidos com MPSIVA por meio de injeção venosa caudal.

[00194] A análise da atividade da GALNS foi realizada 2 semanas após a distribuição do vetor. A transdução com todos os quatro vetores contendo galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase resultou em um aumento substancial na atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase em relação aos níveis medidos em animais com MPSIVA. Os níveis da atividade da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase variou de 1500 % a 2600 % dos níveis de WT no fígado e 55 % a 99 % de WT no soro. Vide a Figuras 7A e 7B. No fígado, os níveis da atividade alcançada com o cassete de expressão contendo ambas a versão 2 e versão 3 da galactosamina (N-acetil) 6-sulfatase humana foram mais altos do que aqueles mediados pelo vetor contendo a sequência do tipo selvagem. Vide a Figura 7A. No soro,

ambas a versão 2 e a versão 3 da galactosamina (N-acetil) 6- sulfatase humana levou a aumentos maiores na atividade enzimática do que o tipo selvagem e a versão 1. Vide a Figura 7B.

Exemplo 15: Distribuição intravenosa de AAV9-CAG- omGALNS AAV8B-CAG-omGALNS ou AAV8-hAAT-omGALNS em camundongos com MPSIVA

[00195] Uma dose total de 1 x 10!? de genomas do vetor AAV9-CAG-omGALNS, 1 x 10)? de genomas do vetor AAVB8-CAG- OomGALNS ou 1 x 10! de genomas do vetor AAVB-hAAT-omGALNS foram injetadas através da veia caudal de animais de 3 - 4 semanas de idade com MPSIVA em um volume total de 200 ul. Quatro e seis meses após a administração do vetor, os animais foram sacrificados e as amostras foram coletadas para mais análises.

[00196] Seis meses após o tratamento com AAV, a atividade enzimática da GALNS no fígado, fêmur, tecido adiposo e soro de animais com MPSIVA tratados foi normalizada, atingindo valores similares ou até mesmo superiores àqueles observados em animais saudáveis. Vide as Figuras 8, 9 e 10. A restauração da atividade da GALNS levou a uma normalização completa do acúmulo de substrato característico da doença no fígado e no soro, tal como indicado por concentrações similares de queratan sulfato em camundongos controle do tipo selvagem e Galns -/-tratados. Vide a Figura 11.

[00197] As administrações intravenosas dos diferentes vetores para a corrente sanguínea transduz principalmente o fígado entre outros tecidos e órgãos (Ruzo et al., 2012). De acordo, a atividade da GALNS no fígado de camundongos machos com MPSIVA tratados com os diferentes vetores foi aproximadamente 25 vezes maior do que a observada em animais saudáveis. Vide as Figuras 8A, 9A e 10A.

[00198] Quando superexpressas no fígado, as proteínas lisossomais solúveis são secretadas de forma eficiente para a corrente sanguínea, transformando este órgão em uma fonte de enzima circulante (Ruzo et al., 2012). No soro dos camundongos com MPSIVA tratados, a atividade da GALNS atingiu um pico por volta do mês 3 após a injeção e posteriormente foi estabilizada a longo prazo com valores que variam de 20 a 50 vezes maiores do que nos irmãos do tipo selvagem. Vide as Figuras 8D, 9D e 10D. Quando a eficácia somática da terapia foi avaliada através da quantificação do teor de GAG no soro e fígado, uma normalização completa dos níveis circulantes e hepático de KS foi observada. Vide a Figura

11.

[00199] Quatro meses após a distribuição do AAV, as placas de crescimento epifisário tibial de camundongos com MPSIVA tratados mostraram uma redução distinta do acúmulo de GAG intracelular indicada pela presença de múltiplos depósitos de GAG intracelulares. Vide a Figura 12.

[00200] Os animais tratados com AAV também mostraram uma normalização completa do acúmulo de GAG nas glândulas lacrimais, indicada pela ausência de depósitos intracelulares de GAG. Vide a Figura 13B. Da mesma forma, a quantificação da intensidade do sinal da área positiva para GAG em seções do epitélio da córnea coradas com a coloração coloidal de Mowry, revelou uma redução na % da deposição de GAG sobre a superfície do epitélio da córnea em camundongos Galns - / - tratados com AAV9-CAG-omGALNS ou AAV8-hAAT-

OomGALNS em relação aos valores documentados em camundongos deficientes para GALNS. Vide a Figura 13A.

[00201] A análise ultra estrutural por microscopia eletrônica de transmissão do giro dentado e da amígdala de camundongos machos de 7 meses de idade revelou a presença de grandes —“vacúolos contendo substância eletrolucente no citoplasma das células de camundongos deficientes para GALNS não tratados. Essas células foram identificadas como macrófagos perivasculares no giro denteado ou células gliais perineuronais e células endoteliais na amígdala. Essas vesículas, as quais aparentavam ser lisossomos preenchidos com material de armazenamento, estavam completamente ausentes nas amostras de animais sadios do tipo selvagem ou Galns - / - tratados com AAV9-CAG-omGALNS, confirmando a restauração do tamanho normal do compartimento lisossomal após a transferência gênica. Vide a Figura 14.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de polinucleotídeo isolada CARACTERIZADA pelo fato de apresentar entre 75 % a 90 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1 em que a referida sequência codifica uma (N-acetil) 6- sulfatase galactosamina humana funcional.

2. Sequência de polinucleotídeo isolada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de a referida sequência apresentar entre 80 a 85 % de identidade com a sequência de nucleotídeo tal como definida na SEQ ID NO: 1.

3. Sequência de polinucleotídeo isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de a referida sequência ser selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7.

4. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma sequência de polinucleotídeo conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o referido vetor compreender uma sequência de promotor operacionalmente ligada a referida sequência de polinucleotídeo, o referido promotor sendo selecionado a partir de um promotor CAG, um promotor hAAT ou um promotor CMV.

6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de o referido promotor ser um promotor CAG.

7. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de o referido vetor ser um vetor de AAV recombinante.

8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 7,

CARACTERIZADO pelo fato de o referido vetor de AAV recombinante ser selecionado a partir de AAV2, AAV5, AAVT, AAV8, AAV9, AAVIO e AAVrh10.

9. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de o referido vetor ser selecionado a partir do grupo que consiste em o plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS-versãol, com número de acesso DSM 32792, tal como definido na SEQ ID NO: 4, o plasmídeo pAAV-CAG- ohGALNS-versão2 com número de acesso DSM 32793, tal como definido na SEQ ID NO: 6, e o plasmídeo pAAV-CAG-ohGALNS- versão3 com número de acesso DSM 32794, tal como definido na SEQ ID NO: 8.

10. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 9.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de a composição ser administrada por via intravenosa.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADA pelo fato de ser administrada uma vez na vida.

13. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 9, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 12 CARACTERIZADOS pelo fato de ser para uso na medicina.

14. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 9, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 12, CARACTERIZADOS pelo fato de ser para uso no tratamento de mucopolissacaridose do tipo IVA ou síndrome de Morquio A.

15. Método para a obtenção do vetor, conforme definido na reivindicação 7 ou 8 CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (i) fornecer uma célula compreendendo um polinucleotídeo da invenção, proteínas cap de AAV, proteínas rep de AAV e, opcionalmente, proteínas virais das quais o AAV é dependente para replicação, (ii) manter a célula em condições adequadas para a montagem do AAV; e (iii) purificar o vetor viral adenoassociado produzido pela célula.