TW202016315A

TW202016315A - 用於治療黏多醣症 iv a 型之腺相關病毒載體

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Publication number: TW202016315A
Application number: TW108118667A
Authority: TW
Inventors: 圖伯瑪麗亞法蒂瑪波斯奇; 查爾斯維特聖歇; 聖歇亞柏特里柏拉; 維吉尼亞阿瑞芭霍里戈特
Original assignee: 西班牙商艾斯提夫製藥股份有限公司; 巴塞隆納歐都諾瑪大學
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-05-01
Also published as: US20210214695A1; SG11202011777PA; PH12020552041A1; CA3101659A1; CO2020015942A2; JP2021526023A; EP3802803A1; AR115449A1; WO2019228950A1; CN113474453A; CN113474453B; IL279054A; BR112020024377A2; AU2019275969A1; KR20210027266A; JP7369403B2; MA52737A; MX2020012911A

Abstract

本發明提供新穎多核苷酸序列、包含其之腺相關病毒衍生之載體及醫藥組合物以用於治療溶酶體儲積症，及特別地，用於治療黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群。

Description

用於治療黏多醣症　IV　A　型之腺相關病毒載體

本發明係關於可用於表現所關注蛋白質之多核苷酸序列及載體及其在基因療法中之使用。本發明亦關於有助於治療黏多醣症(MPS)之載體及核酸序列，及特定言之用於治療黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群之載體及核酸序列。

溶酶體係在動物細胞之細胞質中發現的細胞器，其包含超過50種水解酶，其在廢棄的細胞組分之再循環期間或在病毒及細菌之吞噬之後分解生物分子。該細胞器包含幾種類型的水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶、磷酸酶及硫酸酶。所有酶均係酸性水解酶。

溶酶體儲積病(LSD)由遺傳缺陷引起，其影響一或多種溶酶體酶。此等遺傳性疾病通常由存在於溶酶體中之特定酶活性之缺乏引起。在較小程度上，此等疾病可能係由於溶酶體生物發生中涉及的蛋白質之缺陷。

LSD係個體罕見的，儘管此等疾病作為一組在一般人群中相對常見。LSD之總患病率為約1例/5,000活產。然而，一般人群中的一些群體特別受到LSD高發的折磨。例如，來自中歐及東歐猶太人(德系猶太人)個體之後代之高歇氏(Gaucher)病及泰薩二氏症(Tay-Sachs disease)之患病率分別為1例/600個出生及1例/3,900個出生。

黏多醣症(MPS)係一組七種LSD疾病，其特徵在於參與葡糖胺聚糖(GAG)之代謝之特定溶酶體酶之不存在或缺乏。所有MPS均具有常染色體隱性遺傳模式，其中MPSII (亨特氏病(Hunter disease))除外，其具有X染色體連鎖遺傳。

在7種MPS中，黏多醣症IV型(MPSIV或Morquio氏症候群)具有兩種亞型A及B。Morquio氏A及B均係常染色體隱性遺傳病，其等對男性及女性的影響相同。Morquio氏A或MPSIVA係一種罕見疾病及現有的患病率數據很少且多變。報告估計範圍從北愛爾蘭的1/76,320至西澳大利亞的1/641,178。MPSIVA係由參與GAG硫酸角質素(KS)及6-硫酸軟骨素(C6S)降解之酵素中之一者之缺乏引起的。已鑑定編碼該酶之基因並已報導各種突變。

MPSIVA係由酵素半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶(GALNS，EC 3.1.6.4)之活性缺乏引起的。GALNS係一種溶酶體酵素，其水解在6-硫酸軟骨素(C6S)之非還原端處之N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸之硫酸酯基及在硫酸角質素(KS)之非還原端處之半乳糖-6-硫酸之硫酸酯基。作為非降解C6S及KS之持續積聚之結果，發生進行性細胞損傷，從而導致多系統疾病。目前，已在人GALNS 基因中鑑定出約180種不同的突變，其導致GALNS酵素之活性之缺乏。

大多數KS及C6S由軟骨細胞產生，及因此，未降解的受質主要積聚在細胞及軟骨之細胞外基質中。此對軟骨及骨骼發育具有直接影響，導致系統性骨骼發育不良。在罹患Morquio氏A之患者中，軟骨細胞經液泡化，及此導致異常的軟骨形成及/或軟骨內骨化。罹患MPSIVA之大多數患者出生時表現健康及症狀逐漸發展。初始症狀在1至3歲之間確認及診斷時的平均年齡為約4.7歲。主要骨骼特徵包括：驚人射擊軀幹侏儒症、齒狀突發育不全、雞胸、脊柱後凸、脊柱側凸、膝外翻、髖外翻、下肋擴張、關節運動過度及步態異常伴跌倒傾向。其他潛在的併發症包括肺部功能不全、心臟瓣膜病、聽力喪失、肝腫大、細角膜混濁、粗糙面部特徵及牙齒間隔寬伴隨牙釉質異常薄及頻繁齲齒。MPSIVA患者保持智力。疾病進展速率及存在的表型特徵在患者間係不同的。若最終身高低於120 cm，則MPSIVA表型定義為嚴重，若最終身高高於120 cm且低於140 cm，則定義為中度，及若最終身高在整個年齡超過140 cm，則定義為輕度。報告的預期壽命之範圍係從生命的第二個十年到70歲。此種可變性可能與多種因素有關，諸如突變之性質、種族或患者接受的健康護理的差異。

直到最近，尚沒有針對MPSIVA症候群之疾病特異性批准療法。可用之治療係症狀性，且基於多種非特異性藥物之投與，以預防及管理疾病併發症。然而，在過去幾年中，MPSIVA患者可得兩種主要治療選項：酵素替代療法(ERT)及造血幹細胞移植(HSCT)。兩種治療策略之設計依賴於交叉校正之可能性，這是基於以下之事實：正常細胞分泌大量甘露糖-6-磷酸(M6P)標記之可溶性溶酶體酵素(諸如GALNS)，其可隨後經其他細胞經由質膜上的M6P受體從細胞外區室攝取並靶向溶酶體。此外，存在殘留酵素活性之極限值，通常非常低，高於該極限值，細胞能夠積極應對受質流入，並且該疾病不會影響個體，表明正常活動的恢復不係改變臨床過程之必要條件。

對於MPSIVA，已在疾病之兩種不同小鼠模型中測試ERT (Tomatsu等人，2008，2010a，2015)。在該研究中，每週對0.5及12週齡MPSIVA小鼠靜脈內或腹膜內投與250 U/g重組鼠GALNS (rGALNS)之劑量。在最後一次給藥後一週，MPSIVA小鼠顯示內臟器官，骨髓、心臟瓣膜、韌帶及結締組織中之竇內襯細胞中之GAG儲存顯著減少及血液KS水平顯著降低，證明藉由輸注rGALNS之體細胞校正。

在2014年，重組人GALNS商品化為Elosulfase alfa，VIMIZIM^® (BioMarin Pharmaceutical Inc)，被食品及藥物管理局(FDA)及歐洲藥品管理局(EMA)批准用於治療MPSIVA。每週藉由靜脈內輸注以2 mg/kg之劑量投與治療，平均輸注時間段為3.5-4.5小時。入選患者的年齡範圍為5至57歲。在基線時，所有入選的患者可在6分鐘步行測試(6MWT)中行走30至325 m (Sanford及Lo，2014)。主要終點被確定為在治療開始後第24週在6MWT中行走的距離從基線的變化。次要終點包括第24週三分鐘內爬樓梯速率(3MSCT)及尿液KS水平從基線的變化。患者分為兩個治療組：彼等以每週劑量2 mg/kg接受VIMIZIM^® 之患者及彼等每隔一週一次接受2 mg/kg之患者。對於每週接受VIMIZIM^® 2 mg/kg之患者，開始治療後24週，6MWT的行走距離與安慰劑組相比增加達22,5 m。然而，接受VIMIZIM^® 之患者之爬樓梯速率沒有差異。此外，就治療的前24週而言，沒有觀察到行走能力的進一步改善。另一方面，與安慰劑組相比，每隔一週一次接受VIMIZIM^® 2 mg/kg之患者之6MWT及3MSCT沒有差異。在所有VIMIZIM^® 治療組中，尿KS水平從基線之降低(藥效動力學效應之量度)更大(2014)。最初納入安慰劑對照試驗之患者後來有資格在開放標籤擴展試驗(MOR-005)中開始用VIMIZIN^® 治療。

由於對VIMIZIM^® 之可能過敏性，因此在產品投與期間可提供醫療支持。在試驗期間，所描述的最嚴重的不良事件係過敏性及超敏性反應，其可在VIMIZIM^® 輸注期間或產品投與後長達3小時內隨時出現。罹患急性呼吸道疾病之患者可能會增加風險及需要另外監測。可能危害患者生命之此等過敏性反應包括咳嗽、皮疹、喉發緊、蕁麻疹、潮紅、膚色變化、低血壓、呼吸短促、胸痛及胃腸道症狀，諸如噁心、腹痛、乾嘔及嘔吐(http://vimizim.com)。ERT之其他缺點包括：1)在兒科患者中進行3.5-4.5小時長的靜脈內輸注之難度，2)每週一次用VIMIZIM^® 2 mg/kg治療之患者中100%在4週後發展出抗藥物抗體之事實，3)測試的所有患者在試驗期間至少一次發展出能夠抑制藥物結合至甘露糖-6-磷酸受體之中和抗體，及4)療法之高成本，其亦包括家庭護理之成本(2014)。

使用骨髓衍生之幹細胞之造血幹細胞移植(HSCT) (骨髓移植，BMT)已被證明在治療罹患其他MPS之患者之體細胞及神經病理學方面係有效的。藉由HSC表型校正之主要缺點係治療對MPSIVA患者生長之影響微乎其微(Chinen等人，2014；Wang等人，2016；Yabe等人，2016)。

鑑於目前MPSIVA治療性選項之局限性，需要替代方法。

活體內基因療法提供對MPSIVA及其他遺傳性疾病進行一次性治療的可能性，具有終身有益效果之前景。

Morquio氏A疾病之基因療法臨床前研究主要基於γ-逆轉錄病毒-、慢病毒-及腺相關-衍生之載體之投與。

用編碼人GALNS基因之γ-逆轉錄病毒衍生之載體活體外轉導MPSIVA人類淋巴母細胞B細胞、人角質細胞、鼠成肌細胞及兔滑膜細胞導致GALNS酵素活性增加，因而導致細胞內GAG儲存減少(Toietta等人，2001)。

將編碼人GALNS cDNA之慢病毒衍生之載體投與Morquio氏A皮膚纖維母細胞顯示酵素活性水平比未轉導之MPSIVA纖維母細胞之彼等高7.5倍，儘管低於人健康纖維母細胞之酵素活性水平。慢病毒載體之使用亦導致β-己醣胺酶及β-半乳糖苷酶活性之正常化，據報導其等係Morquio氏A之二級生物標誌物(Almeciga等人，2013；Salazar等人，2016)。

特定言之，腺相關病毒(AAV)載體介導之基因轉移作為許多活體內基因療法應用之選擇方法迅速出現，此歸因於此等載體之高轉導效率及病原性的缺乏。AAV載體可轉導有絲分裂後細胞及若干臨床前及臨床研究已證實AAV載體介導之基因轉移之潛力，以有效地驅動多種疾病之治療性轉殖基因之持續表現。

AAV載體之使用允許評估GALNS及硫酸酶修飾因子1 (SUMF1)之共同表現對酵素活性之影響。此種共同表現導致細胞培養物中酵素活性增加多達4倍(Alméciga-Díaz等人，2010)。活體內，在Morquio氏A小鼠模型中投與AAV-GALNS載體顯示，在單次靜脈內投與後12週，血漿中之酵素活性恢復至野生型水平的8.5%，而用AAV-SUMF1載體之共同投與導致GALNS活性增加至野生型水平的19%。GALNS酵素活性在心臟及骨骼中亦分別增加至野生型的30%及33% (Alméciga Javier、Montaño Adriana、Shunji Tomatsu，2012)。

為改善GALNS酵素之骨遞送，開發經修飾之AAV載體，其在病毒衣殼內攜帶短酸性胺基酸肽以賦予病毒對骨羥基磷灰石之親和力。該經修飾之編碼GALNS之AAV載體顯著增加MPSIVA小鼠模型之骨中的載體基因組副本及轉殖基因表現並導致GALNS活性水平為野生型的42% (Alméciga Javier、Montaño Adriana、Shunji Tomatsu，2012；Tomatsu等人，2010b)。

上述方法均未完全恢復半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性，達成完全根除細胞質內內含物，或校正MPSIVA之所有臨床徵兆。因此，需要具有更佳功效及安全性譜之MPSIVA治療的新穎方法。

本發明提供用於治療黏多醣症(特定言之黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群)之新穎的多核苷酸序列及載體。

在第一態樣中，本發明提供新穎的分離的多核苷酸序列，其與以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有75%至90%的同一性，其中該序列編碼功能性人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶。

在另一個態樣中，本發明係關於包含本發明之多核苷酸序列之表現載體。

本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明之多核苷酸序列或載體。

此外，本發明之另一態樣係關於本文所述的多核苷酸序列或載體、或醫藥組合物，其用作藥物，特定言之用於治療黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群。

本發明亦提供一種用於產生根據本發明之腺相關病毒載體之方法。

微生物之寄存

質體pAAV-CAG-hGALNS (SEQ ID NO: 2)、pAAV-CAG-ohGALNS-v1 (SEQ ID NO: 4)、pAAV-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 6)及pAAV-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 8)於2018年4月19日分別以寄存編號DSM 32791、DSM 32792、DSM 32793及DSM 32794寄存在DSMZ——德國微生物及細胞培養技術有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany處。定義

術語「核苷酸序列」或「分離的核苷酸序列」或「多核苷酸序列」或「多核苷酸」或「分離的多核苷酸序列」在本文中可互換使用並分別係指包含脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之核酸分子DNA或RNA。核酸可係雙股的，單股的，或包含雙股或單股序列之部分。

術語「序列同一性%」、「同一性%」或「序列同源性%」係指在比對序列以達成最大序列同一性%後，候選序列之核苷酸或胺基酸與參考序列中之核苷酸或胺基酸相同之百分比。在一個較佳實施例中，基於兩個給定的SEQ ID NO的全長或其部分計算序列同一性。序列同一性%可藉由本技術確立的任何方法或算法(諸如ALIGN、BLAST及BLAST 2.0算法)確定。參見Altschul S等人，Nuc Acids Res. 1977；25:3389-3402及Altschul S等人，J Mol Biol. 1990；215:403-410。

本文中，「序列同一性%」、「同一性%」或「序列同源性%」藉由將參考序列與候選序列比對後相同的核苷酸或胺基酸的數量除以參考序列中的核苷酸或胺基酸的總數並將結果乘以100來計算。

視情況，在確定胺基酸相似性程度時，熟習此項技術者亦可考慮到所謂的「保守性」胺基酸取代，正如熟習此項技術者所明瞭。保守性胺基酸取代係基於具有相似側鏈之殘基之可互換性。例如，具有脂族側鏈之胺基酸群組包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；具有脂族-羥基側鏈之胺基酸群組包括絲胺酸及蘇胺酸；具有含醯胺側鏈之胺基酸群組包括天冬醯胺酸及麩醯胺酸；具有芳族側鏈之胺基酸群組包括苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；具有鹼性側鏈之胺基酸群組包括離胺酸、精胺酸及組胺酸；具有含硫側鏈之胺基酸群組包括半胱胺酸及甲硫胺酸。本文揭示的胺基酸序列之取代變異體係其中已移除所揭示序列中之至少一個殘基並在其位置插入不同殘基之彼等變異體。較佳地，胺基酸變化係保守的。每種天然存在之胺基酸之較佳保守性取代如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln至Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met、Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；及Val至Ile或Leu。

術語「編碼(codify)」或「編碼(coding)」係指確定核苷酸序列如何轉譯成多肽或蛋白質之遺傳密碼。序列中核苷酸之順序決定沿多肽或蛋白質之胺基酸順序。

術語「蛋白質」係指由胺基酸或多肽之一或多個直鏈組成之大分子。蛋白質可能遭受轉譯後修飾，例如半胱胺酸殘基轉化為3-側氧基丙胺酸、糖基化或金屬結合。蛋白質之糖基化係新增共價連接至胺基酸鏈之不同碳水化合物。

如本文所用，術語「轉錄調節區」係指能夠調節一或多個基因之表現之核酸片段。本發明之多核苷酸之調節區可包括用於結合轉錄因子以幫助RNA聚合酶結合並促進表現之啟動子、正向反應元件、活化子及增強子序列，及阻遏蛋白所結合的以阻斷RNA聚合酶附接或防止表現之操縱子或沉默子序列。

術語「啟動子」必須理解為用於控制一或多種多核苷酸之轉錄之核酸片段，例如，編碼序列，其位於多核苷酸序列的5'上游，及其係藉由以下之存在而在結構上鑑定：DNA依賴性RNA聚合酶之結合位點、轉錄起始位點及(但不限於)轉錄因子、阻遏子及本技術中已知可直接或間接地起作用以調節來自啟動子之轉錄量之任何其他核苷酸序列之結合位點。

當使用適宜分析法，諸如RT-qPCR或北方墨點法(檢測轉錄)，啟動子可在使用包含可以操作方式連接至所關注核苷酸序列之該啟動子之基因構築體的表現系統中起始該核苷酸序列之轉錄時，該啟動子被稱為係活性的或被稱為驅動可以操作方式連接至其之核苷酸序列之表現。亦可使用針對經編碼之蛋白質之適宜分析法(諸如西方墨點法或ELISA)在蛋白質水平評估該啟動子之活性。若可檢測到轉錄或若發現與使用僅因不含該啟動子而不同的構築體之轉錄相比轉錄或蛋白質水平增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、500%、1000%、1500%或2000%，則該啟動子被認為能夠起始轉錄。

術語「組成型」啟動子係指在大多數生理及發育條件下具有活性之啟動子。「誘導型」啟動子為較佳根據生理或發育條件調節之啟動子。誘導型啟動子在藥物遞送或光暴露後可能係具有活性的。因此，「組成型」啟動子在「誘導型」啟動子意義上非調節。「組織特異性」啟動子較佳在特定類型之細胞/組織中具有活性。普遍存在的啟動子可定義為在許多或任何不同組織中具有活性之啟動子。通常，在此上下文中之「許多」意指超過5種或至少6種、10種、15種、20種或在5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種不同的組織中。

術語「CAG」啟動子係指包含雞β-肌動蛋白啟動子及巨大細胞病毒增強子之啟動子(Alexopoulou A.等人 BMC Cell Biology 2008；9(2): 1-11)。更確切而言，該CAG啟動子包含(i)巨大細胞病毒(CMV)早期增強子元件，(ii)雞β-肌動蛋白啟動子，(iii)雞β-肌動蛋白基因之第一內含子，及(iv)兔β-球蛋白基因之內含子2/外顯子3。

術語「hAAT」啟動子係指包含人α1-抗胰蛋白酶啟動子及來自載脂蛋白E之肝細胞控制區(HCR)增強子之三個副本之雜合啟動子。

術語「可以操作方式連接」係指啟動子序列就所關注基因而言之功能關係及位置(例如，若啟動子或增強子實現序列之轉錄，則其可以操作方式連接至編碼序列)。通常，可以操作方式連接的啟動子與所關注序列鄰接。然而，增強子不必與所關注序列鄰接以控制其表現。

如本文所用，術語「轉錄後調節區」係指促進盒或所得基因產物中所包含的序列之表現、穩定化或定位之任何多核苷酸。

如本文所用，術語「載體」係指能夠將一或多種所關注多核苷酸遞送及視需要表現至宿主細胞中之構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞(諸如生產細胞)。載體可係穩定的並可自我複製的。關於可使用的載體之類型沒有限制。載體可係選殖載體，其適於繁殖及獲得併入若干異源生物體中之多核苷酸、基因構築體或表現載體。

在一個特定實施例中，該載體係表現載體。如本文所用的術語「表現載體」係指設計用於細胞中基因表現之載體，亦即該載體用於將特定基因引入靶細胞中以產生由該基因編碼之蛋白質。

根據本發明之載體可包含調節序列，其充當增強子及/或啟動子區並導致表現載體上攜帶的基因之有效轉錄。適宜之載體包括原核表現載體(例如，pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物)、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌體及穿梭載體(例如pSA3及pAT28)、及基於病毒載體之真核表現載體(例如，腺病毒、腺相關病毒以及逆轉錄病毒及慢病毒)、以及非病毒載體，諸如pSilencer 4.1-CMV (Ambion®，Life Technologies Corp.，Carslbad, CA, US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL及pKSV-10、pBPV-l、pML2d及pTDTl。

術語「重組質體」或「質體」係指藉由基因工程化技術獲得的小的、環狀、雙股、自我複製之DNA分子，其能夠將所關注遺傳物質轉移至細胞，此導致產生由靶細胞中之該遺傳物質編碼之產物(例如，蛋白質多肽、肽或功能性RNA)。此外，術語「重組質體」或「質體」亦指在製造作為重組載體基因組之載體之病毒載體期間使用的藉由基因工程化技術獲得的小的、環狀、雙股、自我複製之DNA分子。

術語「重組病毒載體」或「病毒載體」係指藉由基因工程化技術從天然存在之病毒獲得的物劑，其能夠將所關注遺傳物質(例如DNA或RNA)轉移至細胞，此導致產生由靶細胞中之該遺傳物質編碼之產物(例如，蛋白質多肽、肽或功能性RNA)。

術語「腺相關病毒」、「AAV病毒」、「AAV病毒體」、「AAV病毒粒子」及「AAV粒子」在本文中用作同義詞，係指由AAV之至少一種衣殼蛋白(較佳由特定AAV血清型之所有衣殼蛋白組成)及對應於AAV基因組之經包封之多核苷酸組成之病毒粒子。野生型AAV係指屬於伴隨病毒(Dependovirus)屬細小病毒(Parvoviridae)科之病毒。野生型AAV基因組之長度為約4.7 Kb及由單股脫氧核糖核酸(ssDNA)組成，其可係陽性或陰性意義的。野生型基因組包括在DNA股兩端處之反向末端重複序列(ITR)、及三個開放閱讀框(ORF)。ORF rep編碼AAV生命週期所必需的四種Rep蛋白。ORF cap包含編碼衣殼蛋白之核苷酸序列：VP1、VP2及VP3，其相互作用形成二十面體對稱之衣殼。最後，與Cap ORF重疊的AAP ORF編碼似乎促進衣殼組裝之AAP蛋白。若粒子包含異源多核苷酸(亦即不同於野生型AAV基因組之多核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)，其側接AAV ITR，則其通常稱為「AAV載體粒子」或「AAV病毒載體」或「AAV載體」。本發明亦包括雙股AAV(亦稱為dsAAV或scAAV)之用途。

如本文所用，術語「腺相關病毒ITR」或「AAV ITR」係指存在於AAV之基因組之DNA鏈兩端處之反向末端重複序列。ITR序列係AAV基因組有效增殖所必需的。此等序列之另一個性質係其形成髮夾之能力。該特徵有助於其自我啟動，此允許第二DNA股之引子酶獨立性合成。ITR亦被證明係將野生型AAV DNA整合至宿主細胞基因組中(例如人第19染色體中，針對血清型2 AAV)並從中營救，以及將AAV DNA有效衣殼化為完全組裝之脫氧核糖核酸酶抗性AAV粒子所必需的。ITR序列之長度為約145 bp。較佳地，ITR之整個序列用於AAV病毒載體之基因組中，儘管此等序列之某種程度之微小修飾係允許的。野生型ITR序列可藉由插入、缺失或截短來改變，只要ITR介導所需的功能，例如複製、切口、病毒包裝、整合及/或前病毒營救即可。修飾此等ITR序列之程序係本技術中熟知的。ITR可來自任何野生型AAV，包括(但不限於)血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或已知或以後發現的任何其他AAV。AAV包括兩個ITR，其等可相同或不同。此外，此兩個AAV ITR可來自與AAV衣殼相同之AAV血清型，或可係不同的。在一個較佳實施例中，5'及3' AAV ITR衍生自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8及/或AAV9。較佳地，ITR來自AAV2、AAV8及/或AAV9，AAV2係最佳的。在一個實施例中，選擇AAV2 ITR以產生假型化之AAV (亦即具有衍生自不同血清型之衣殼及ITR之AAV)。

如本文所用，表述「重組病毒基因組」係指AAV基因組，其中至少一種外來多核苷酸插入至天然存在之AAV基因組中。根據本發明之AAV之基因組通常包含順式作用之5'及3'反向末端重複序列(ITR)及表現盒。

術語「基因療法」係指將所關注遺傳物質(例如DNA或RNA)轉移至細胞中以治療或預防遺傳或獲得性疾病或病情。所關注遺傳物質編碼產物(例如蛋白質多肽、肽或功能性RNA)，其產生係活體內所需的。例如，所關注遺傳物質可編碼具有治療價值之酵素、激素、受體或多肽。

如本文所用，術語「轉導」係指一種過程，藉此經由病毒載體將外源核苷酸序列引入至細胞中。

如本文所用，術語「轉染」係指藉由非病毒方法有意將經純化之核酸引入至真核細胞中之過程。

如本文所用，術語「治療」係指投與本發明之化合物或組合物以控制疾病之進展。控制疾病進展應理解為達成有益或期望之臨床結果，包括(但不限於)症狀之減輕、疾病持續時間之減少、病理狀態之穩定(特別係避免額外的惡化)、疾病進展之延遲、病理狀態之改善、及緩解(部分及全部)。控制疾病進展亦涉及與若不應用治療之預期存活期相比，存活期之延長。

術語「有效量」係指足以達成預期目的之物質的量。例如，用於增加半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶(GALNS)活性之AAV載體之有效量係足以減少醣胺聚醣累積的量。用於治療疾病或病症之表現載體之「治療有效量」係足以減少或根除疾病或病症之信號及症狀之表現載體的量。給定物質之有效量將隨各種因素(諸如物質之性質、給藥途徑、接受該物質之動物的尺寸及種類及提供該物質之目的)而變化。每個個體情況下之有效量可由熟習此項技術者根據本技術中已確立的方法憑經驗確定。

術語「個體」係指哺乳動物，較佳係人或非人哺乳動物，更佳係小鼠、大鼠、其他囓齒動物、兔、狗、貓、豬、牛、馬或靈長類動物，又更佳係人。

本發明提供用於治療黏多醣症，特定言之黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群之新穎多核苷酸序列及載體。

因此，在第一態樣中，本發明係關於與如以SEQ ID NO: 1描述之核苷酸序列具有75%至90%的同一性之分離的多核苷酸序列(下文稱為「本發明之多核苷酸」)，其中該序列編碼功能性人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶。

如上所述，MPSIVA係由酵素半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶(GALNS)之活性之缺乏引起的。GALNS係一種溶酶體酵素，其水解在軟骨素-6-硫酸(C6S)之非還原端處之N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸之硫酸酯基及在硫酸角質素(KS)之非還原端處之半乳糖-6-硫酸之硫酸酯基。作為非降解C6S及KS之持續積聚之結果，發生進行性細胞損傷，從而導致多系統疾病。

本發明人已證明活體內投與包含不同形式之人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶(GALNS)表現盒之載體，其中該GALNS編碼序列與野生型編碼GALNS核苷酸序列具有75%至90%的同一性，導致GALNS活性顯著增加超過在MPSIVA動物中測得的水平。實際上，用包含與野生型具有75%至90%的同一性之序列之表現載體達成的人GALNS活性水平高於由包含野生型序列之載體介導之彼等水平。

本發明亦考慮與編碼如以SEQ ID NO:1描述的野生型GALNS之核苷酸序列具有75%至90%的同一性之多核苷酸序列，其中該等序列編碼本技術中已知的功能性人GALNS變異體及片段。因此，本發明應被解釋為包括編碼GALNS之功能上等效變異體之DNA。

如本文所用，術語「功能上等效變異體」係關於與由GALNS之多肽序列編碼之酵素實質上同源並保留GALNS之生物活性之任何酵素。此等功能上等效變異體之序列可從GALNS之序列藉由插入、取代或缺失一或多個胺基酸獲得且其實質上保留GALNS之生物活性。用於確定變異體是否保留天然GALNS之生物活性之方法係熟習此項技術者公知的並包括本申請案之實驗部分中使用的任何分析法。特定言之，本發明包括的GALNS之功能上等效變異體具有GALNS之功能中之至少一者，諸如例如，標準化或降低醣胺聚醣(GAG)水平，特定言之C6S及KS水平。在本發明之實例部分中，詳細描述適用於測定功能性GALNS酵素降低或標準化該GAG水平之能力之方法。

如本發明所附的實例中所示，本發明之多核苷酸序列編碼功能性GALNS酵素。與WT相比，該等酵素顯示增強之活性。結果顯示投與載體後GALNS活性恢復，此導致半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性顯著增加超過在MPSIVA動物中測得的水平。如在本發明所附的實例中所示，GALNS活性水平為在肝臟中1500%至2600%之WT水平的範圍內。

在一個較佳實施例中，若多肽在如上所提及的功能中顯示能力，特定言之，若其能夠以GALNS野生型多肽之能力之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，較佳以GALNS野生型多肽之能力之至少50%、60%、70%、80%、90%或100%降解醣胺聚醣硫酸角質素(KS)及角質素-6-硫酸(C6S)，則其被認為係GALNS酵素之功能上等效變異體。

GALNS之功能上等效變異體為與天然GALNS實質上同源之多肽。表述「實質上同源」係關於當蛋白質序列相對於GALNS野生型序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度時之該蛋白質序列。使用熟習此項技術者公知的電腦算法及方法確定兩個多肽之間的同一性程度。兩個胺基酸序列之間的同一性較佳藉由使用BLASTP算法[BLAST Manual，Altschul, S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md. 20894，Altschul, S.等人，J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]來確定，儘管亦可使用其他類似的算法。

GALNS之功能上等效變異體可藉由置換其編碼多核苷酸內的核苷酸來獲得，從而負責用於產生GALNS之宿主細胞中的密碼子偏好。

GALNS之功能上等效變異體可藉由進行保守性胺基酸改變並在上述功能分析法或本技術中已知的其他功能分析法中中之一者測試所得變異體來產生。保守性胺基酸取代係指具有相似側鏈之殘基之可互換性。例如，具有脂族側鏈之胺基酸群組為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；具有脂族-羥基側鏈之胺基酸群組為絲胺酸及蘇胺酸；具有含醯胺側鏈之胺基酸群組為天冬醯胺酸及麩醯胺酸；具有芳族側鏈之胺基酸群組為苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；具有鹼性側鏈之胺基酸群組為離胺酸、精胺酸及組胺酸；具有含硫側鏈之胺基酸群組為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守性胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。

在本發明之一個特定實施例中，編碼本發明多核苷酸中包含的GALNS蛋白或其功能上等效變異體之核苷酸序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有75%至90%的同一性。在一個更特定實施例中，該核苷酸序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有80%至85%的同一性。在一個更佳實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7組成之群。

在本發明之另一個實施例中，由本發明之多核苷酸編碼之GALNS蛋白係選自由人GALNS (hGALNS)及小鼠GALNS (mGALNS)組成之群，較佳係人GALNS (hGALNS)。

本發明之多核苷酸可進一步包含表現控制序列，包括(但不限於)適宜之轉錄調節序列(亦即，起始、終止、啟動子及增強子)、有效之RNA加工信號(例如剪接及多腺苷酸化(polyA)信號)、穩定細胞質mRNA之序列、增強轉譯效率之序列(亦即Kozak一致序列)、增強蛋白質穩定性之序列，及需要時，增強經編碼之產物分泌之序列。許多表現控制序列係本技術中已知的並可根據本發明使用。

因此，根據本發明，在一個特定實施例中，本發明之多核苷酸具有可以操作方式連接至編碼GALNS之核苷酸序列之轉錄調節區。在本發明之一個特定實施例中，該轉錄調節區包含啟動子。在本發明之另一個特定實施例中，本發明之多核苷酸之轉錄調節區進一步包含可以操作方式連接至啟動子之增強子。

可將本發明之多核苷酸併入至載體中。在一個特定實施例中，該載體為表現載體。因此，在另一個態樣中，本發明係關於包含本發明之多核苷酸之表現載體，本文稱為「本發明之載體」。在一個特定實施例中，該載體為質體。在另一個特定實施例中，該載體為AAV載體，該AAV載體含有包含根據本發明之多核苷酸之重組病毒基因組。

揭示於本發明之多核苷酸之上下文中之所有實施例亦適用於本發明之載體。

在另一個實施例中，本發明之多核苷酸序列側接AAV ITR。在一個更特定實施例中，該AAV ITR為AAV2 ITR。

在另一個實施例中，本發明之多核苷酸進一步包含轉錄後調節區。如本文所用，術語「轉錄後調節區」係指促進盒或所得基因產物中包含的序列之表現、穩定化或定位之任何多核苷酸。轉錄後調節區可係(但不限於)土撥鼠肝炎病毒轉錄後區(WPRE)。如本文所用，術語「土撥鼠B型肝炎病毒調節後元件」或「WPRE」係指DNA序列，其在轉錄時產生能夠增強基因表現之三級結構。

在另一個實施例中，本發明之多核苷酸序列進一步包含多腺苷酸化信號。

如本文所用，術語「多腺苷酸化信號」係關於介導多腺嘌呤尾部附接至mRNA的3'端之核酸序列。適宜之多腺苷酸化信號包括(但不限於) SV40早期多腺苷酸化信號、SV40晚期多腺苷酸化信號、HSV胸苷激酶多腺苷酸化信號、魚精蛋白基因多腺苷酸化信號、腺病毒5 Elb多腺苷酸化信號、牛生長激素多腺苷酸化信號、人變異體生長激素多腺苷酸化信號、兔β-球蛋白poly A信號及類似。在一個特定實施例中，多腺苷酸化信號係兔β-球蛋白poly A信號或其功能變異體及片段。

如上所述，在本發明之一個特定實施例中，將本發明之多核苷酸併入載體中。在一個特定實施例中，該載體係表現載體。在一個特定實施例中，該表現載體包含可以操作方式連接至該多核苷酸序列之啟動子序列。該啟動子可係組成型啟動子或組織特異性啟動子。在一個特定實施例中，該啟動子係選自CAG啟動子、hAAT啟動子或CMV啟動子。在本發明之一個較佳實施例中，該啟動子係CAG啟動子。在另一個特定實施例中，該啟動子係hAAT啟動子。

本發明之多核苷酸包含編碼GALNS之核苷酸序列或其功能上等效變異體。在一個實施例中，該核苷酸序列係編碼人GALNS之核苷酸序列，其對應於NCBI資料庫寄存編號為NM_000512.4之序列，更佳地，其為SEQ ID NO: 1。在一個較佳實施例中，核苷酸序列係編碼人GALNS之核苷酸序列之變異體。更特定言之，該序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有75至90%的同一性。更特定言之，該序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有80至85%的同一性。較佳地，該序列為選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7組成之群之序列。

在一個更特定實施例中，根據本發明之表現載體係選自由質體pAAV-CAG-ohGALNS-v1(寄存編號DSM 32792，如以SEQ ID NO: 4描述)、質體pAAV-CAG-ohGALNS-v2(寄存編號DSM 32793，如以SEQ ID NO: 6描述)、pAAV-CAG-ohGALNS-v3(寄存編號DSM 32794，如以SEQ ID NO: 8描述)。

在另一個特定實施例中，本發明係指表現載體。更特定言之，係腺相關病毒載體或AAV載體，該AAV載體包含重組病毒基因組，其中該重組病毒基因組包含多核苷酸，該多核苷酸包含可以操作方式連接至編碼GALNS之核苷酸序列或其功能上等效變異體之轉錄調節區。

根據本發明之AAV包括AAV已知血清型之任何血清型。通常，AAV之不同血清型具有顯著同源性之基因組序列，提供相同系列之遺傳功能，產生在物理及功能方面基本等效之病毒粒子，並經由實務上相同的機制複製及組裝。特定言之，本發明之AAV可屬於AAV之血清型1 (AAV1)、AAV2、AAV3(包括3A型及3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV及任何其他AAV。不同AAV血清型之基因組之序列之實例可在文獻中或在公共資料庫(諸如GenBank)中找到。參見GenBank寄存編號AF028704.1 (AAV6)、NC006260 (AAV7)、NC006261 (AAV8)及AX753250.1 (AAV9)。在一個較佳實施例中，本發明之AAV載體係屬於選自由AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAVrh10血清型組成之群之血清型。在一個較佳實施例中，本發明之該AAV載體係屬於血清型9 (AAV9)或血清型8 (AAV8)。

在一個特定實施例中，該AAV載體包含人或鼠GALNS序列。在一個實施例中，該載體包含編碼人GALNS之核苷酸序列，其對應於NCBI資料庫寄存編號為NM_000512.4之序列，更佳地，其為SEQ ID NO: 1。在一個較佳實施例中，該載體包含核苷酸序列，其係編碼人GALNS之核苷酸序列之變異體。更特定言之，該序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有75至90%的同一性。更特定言之，該序列與如以SEQ ID NO:1描述之核苷酸序列具有80至85%的同一性。較佳地，該序列係選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7組成之群之序列。

在本發明之另一個特定實施例中，AAV載體為AAV9-CAG-hGALNS，SEQ ID NO: 12，其包含連接至CAG啟動子之核苷酸序列SEQ ID NO: 1。在另一個實施例中，AAV載體為AAV9-CAG-ohGALNS-v1，SEQ ID NO：13，其包含連接至CAG啟動子之核苷酸序列SEQ ID NO: 3。在另一個實施例中，AAV為AAV9-CAG-ohGALNS-v2，SEQ ID NO: 14，其包含連接至CAG啟動子之核苷酸序列SEQ ID NO: 5。在另一個實施例中，AAV載體為AAV9-CAG-ohGALNS-v3，SEQ ID NO: 15，其包含連接至CAG啟動子之核苷酸序列SEQ ID NO: 7。

在一個較佳實施例中，本發明之AAV包含重組病毒基因組，其包含沿5'至3'方向包含的多核苷酸序列，(i) 5' AAV2 ITR，(ii) CMV即刻早期增強子，(iii)雞β-肌動蛋白啟動子，(iv)雞β-肌動蛋白基因之第一內含子，(v)來自兔β-球蛋白基因之內含子2/外顯子3，(vi) GALNS cDNA或其功能上等效變異體，(vii) poly A信號，諸如兔β-球蛋白poly A信號，及(viii) 3' AAV2 ITR。熟習此項技術者當明瞭，載體基因組可包含其他序列(例如上文具體描述之序列之間的介入序列)。組分(i)至(v)具有熟習此項技術者通常理解的含義。

在一個較佳實施例中，重組病毒基因組包含核苷酸序列SEQ ID NO: 12。具體而言，5' AAV2 ITR包含SEQ ID NO:12之核苷酸1-131，CAG啟動子包含核苷酸185-1707，人GALNS cDNA包含核苷酸1918-3494，兔β-球蛋白poly A信號包含核苷酸3520-4048，及3' AAV2 ITR包含核苷酸4107-4215。

在另一個較佳實施例中，該重組病毒基因組包含核苷酸序列SEQ ID NO: 13。具體而言，5' AAV2 ITR包含SEQ ID NO:13之核苷酸1-131，CAG啟動子包含核苷酸185-1707，人GALNS cDNA包含核苷酸1918-3494，兔β-球蛋白poly A信號包含核苷酸3520-4048，及3' AAV2 ITR包含核苷酸4107-4215。

在另一個較佳實施例中，該重組病毒基因組包含核苷酸序列SEQ ID NO: 14。具體而言，5' AAV2 ITR包含SEQ ID NO: 14之核苷酸1-120，CMV增強子包含核苷酸194-557，β-肌動蛋白啟動子包含核苷酸558-839，雞β-肌動蛋白基因之第一內含子包含核苷酸840-1804，來自兔β-球蛋白基因之內含子2/外顯子3包含核苷酸1805-1906，人GALNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信號包含核苷酸3619-4147，及3' AAV2 ITR包含核苷酸4206-4313。

在另一個較佳實施例中，該重組病毒基因組包含核苷酸序列SEQ ID NO: 15。具體而言，5' AAV2 ITR包含SEQ ID NO: 15之核苷酸1-120，CMV增強子包含核苷酸194-557，β-肌動蛋白啟動子包含核苷酸558-839，雞β-肌動蛋白基因之第一內含子包含核苷酸840-1804，來自兔β-球蛋白基因之內含子2/外顯子3包含核苷酸1805-1906，人GALNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信號包含核苷酸3619-4147，及3' AAV2 ITR包含核苷酸4206-4313。

經修飾之AAV序列亦可用於本發明之上下文中。此等經修飾之序列(例如)包括與任何已知血清型之AAV ITR或VP具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多核苷酸及/或胺基酸序列同一性並其維持該組分之功能之序列(例如，具有約75-99%核苷酸或胺基酸序列同一性之序列)。用於確定AAV ITR或VP之功能之分析法係本技術中已知的。可使用該等經修飾之序列代替野生型AAV ITR或VP序列。

本發明之AAV載體包含來自任何血清型之衣殼。通常，不同的AAV血清型具有在胺基酸及核酸水平上具有實質同源性之基因組序列，提供相同的遺傳功能集，產生在物理及功能方面基本等效之病毒粒子，並經由實務上相同的機制複製及組裝。特定言之，本發明之AAV可屬於AAV之血清型1 (AAV1)、AAV2、AAV3(包括3A型及3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV及任何其他AAV。不同AAV血清型之基因組之序列之實例可在文獻中或在公共資料庫(諸如GenBank)中找到。參見GenBank寄存編號AF028704.1 (AAV6)、NC006260 (AAV7)、NC006261 (AAV8)及AX753250.1 (AAV9)。在一個較佳實施例中，本發明之腺相關病毒載體係屬於選自由AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAVrh10血清型組成之群之血清型。在一個更佳實施例中，該AAV為AAV血清型9 (AAV9)或AAV血清型8 (AAV8)。

本發明之AAV載體之基因組缺少rep及cap開放閱讀框。此等AAV載體僅可被複製並包裝至宿主細胞中的感染性病毒粒子中，該等宿主細胞已用編碼及表現rep及cap基因產物(亦即，AAV Rep及Cap蛋白)之載體轉染，且其中該等宿主細胞已被編碼及表現來自腺病毒之蛋白質之載體轉染。本發明之醫藥組合物

本發明之多核苷酸或表現載體可藉由習知方法投與人體或動物體，此需要其在醫藥組合物中進行調配。因此，在第二態樣中，本發明係關於醫藥組合物(下文稱為「本發明之醫藥組合物」)，其包含治療有效量之本發明之多核苷酸或本發明之載體。醫藥組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑。

揭示於本發明之多核苷酸或本發明之載體之上下文中之所有實施例亦適用於本發明之醫藥組合物。

術語「治療有效量」係指計算產生所需效果之本發明之多核苷酸、載體或AAV載體的量及通常由本發明之多核苷酸、載體或AAV載體之自身特徵及欲獲得的治療效果等其他原因確定。因此，可有效治療疾病的該量可藉由本文所述的標準臨床技術或本技術中以其他方法已知的來確定。用於調配物中的精確劑量取決於投藥途徑。可使用申請專利當時之技術水平中熟知的技術從活體內數據(例如動物模型)估計初始劑量。在申請專利當時之技術水平中具有正常經驗的人可基於動物中的資料容易地最佳化對人的投與。

在一個特定實施例中，調配物之劑量可作為病毒粒子或作為基因組副本(「GC」)/病毒基因組(「vg」)測量或計算。

本技術中已知的任何方法可用於確定每毫升本發明病毒組合物的基因組副本(GC)數。一種進行AAV GC數滴定之方法如下：首先用DNA酶處理經純化之AAV載體樣品，以從生產過程消除未衣殼化之AAV基因組DNA或污染質體DNA。然後對DNA酶抗性粒子進行熱處理以從衣殼釋放基因組。然後使用靶向病毒基因組之特定區域之引子/探針組藉由實時PCR定量所釋放的基因組。

本文可互換使用的術語「醫藥上可接受之載劑」、「醫藥上可接受之稀釋劑」、「醫藥上可接受之賦形劑」或「醫藥上可接受之媒劑」係指無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或任何習知類型之調配助劑。醫藥上可接受之載劑在使用的劑量及濃度下對接受者基本上無毒並與調配物之其他成分相容。醫藥上可接受之載劑的數量及性質取決於所需的投藥形式。醫藥上可接受之載劑係已知的並可藉由本技術中熟知的方法製備。

醫藥組合物可按照例行方法調配成適合於靜脈內、皮下、肌肉內、腦脊髓內液(CSF)(例如腦池內或腦室內)投與給人類之醫藥組合物。在一個較佳實施例中，醫藥組合物係用於靜脈內或腦脊髓內液(CSF)投與。更佳地，醫藥組合物係用於靜脈內投與。

可調配AAV載體用於藉由注射(例如藉由推注或連續輸注)進行非經腸投與。用於注射之調配物可以單位劑型(例如在安瓿中或在單劑量或多劑量容器中)與添加的防腐劑一起提供。病毒組合物可採取諸如含在油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之此類形式，並可包含調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑或分散劑。AAV調配物之液體製劑可藉由習知方法用醫藥上可接受之添加劑(諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸))製備。製劑亦可包含緩衝鹽。或者，組合物可呈粉末形式，用於在使用前用適宜媒劑(例如無菌無熱原水)建構。必要時，該組合物亦可包含局部麻醉劑，諸如利多卡因(lidocaine)，以減輕注射部位的疼痛。當組合物將藉由滲透投與時，可用包含醫藥品質的水或鹽水溶液之滲透瓶進行分配。當藉由注射投與組合物時，可提供用於注射或無菌鹽水溶液之水瓶，使得可在投與前混合該等成分。較佳地，醫藥上可接受之載劑為鹽水溶液及洗滌劑，諸如聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，Pluronic F68®。

本發明之組合物可調配成用於遞送至之動物用於獸用目的 (例如家畜(牛、豬、其他))及其他非人哺乳動物個體以及人個體。本發明之醫藥組合物可用生理上可接受之載劑調配，用於基因轉移及基因療法應用。

亦包括佐劑與本發明之多核苷酸、載體或AAV載體組合使用或與其混合使用。預期的佐劑包括(但不限於)無機鹽佐劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微粒佐劑、黏膜佐劑。

佐劑可作為與本發明之多核苷酸、載體或AAV載體之混合物投與給個體，或組合使用。

本發明之醫藥組合物可以局部或全身投與。在一個實施例中，醫藥組合物在其細胞將被轉導的組織或器官附近投與。在一個特定實施例中，本發明之醫藥組合物係全身性投與。

如本文所用，術語「全身性投與」及「全身投與」係指本發明之多核苷酸、載體、AAV載體或組合物可以非局部方式投與個體。全身投與可到達個體體內的幾個器官或組織或可到達個體的特定器官或組織。例如，靜脈內投與可導致個體中一種以上組織或器官之轉導。本發明之醫藥組合物可以單劑量投與，或在本發明之特定實施例中，可使用多劑量(例如，兩次、三次、四次或更多次投與)來達成治療效果。在本發明之一個較佳實施例中，本發明之醫藥組合物係以單劑量投與，亦即其係一生中投與一次。

因此，在另一個態樣中，本發明係關於根據本發明之多核苷酸或載體或根據本發明之醫藥組合物，其係用於藥物中。

在另一個態樣中，本發明係關於根據本發明之多核苷酸或載體或根據本發明之醫藥組合物，其係用於治療黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群。

如本發明所附的實例所示，包含不同形式之人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶表現盒之AAV載體藉由尾靜脈注射靜脈內遞送至2個月大的受MPSIVA影響之小鼠。GALNS活性分析顯示，用所有的包含半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之載體轉導導致半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性顯著增加超過在MPSIVA動物中測得的水平。

因此，在另一個態樣中，本發明係關於根據本發明之多核苷酸或載體或根據本發明之醫藥組合物，其係用於增加半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性。

在另一個態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防有此需要的個體之黏多醣症IVA型之方法，該方法包括對該個體投與根據本發明之多核苷酸或根據本發明之載體或根據本發明之醫藥組合物。

如本文所用，術語「預防」係指抑制個體中的疾病之開始或減少其發生。預防可係完全的(例如，個體中完全沒有病理細胞)或部分的。預防亦指對臨床病情之易感性降低。如本文所用，術語「治療」係指投與本發明之多核苷酸、或載體或AAV載體或本發明之醫藥組合物以在其臨床徵兆出現後控制疾病進展。控制疾病進展應理解為意指達成有益或期望之臨床結果，包括(不限於)症狀之減輕、疾病持續時間之減少、病理狀態之穩定(特別係避免額外的惡化)、疾病進展之延遲、病理狀態之改善、及緩解(部分及全部)。控制疾病進展亦涉及與若不進行治療之預期存活期相比，存活期之延長。

如本文所用，術語「個體」係指個體或動物，諸如人類、非人類靈長類動物(例如黑猩猩及其他猿及猴子物種)、農場動物(例如鳥類、魚類、牛、綿羊、豬、山羊及馬)、家養哺乳動物(例如狗及貓)、或實驗室動物(例如囓齒動物，諸如小鼠、大鼠及天竺鼠)。該術語包括任何年齡或性別之個體。在一個較佳實施例中，該個體為哺乳動物，較佳係人。獲得本發明之 AAV 之方法

本發明亦關於用於獲得本發明之AAV載體之方法。該等AAV載體可藉由將本發明之多核苷酸引入至組成型表現Rep及Cap蛋白之細胞中來獲得或其中該等Rep及Cap編碼序列以質體或載體方式提供。

因此，在另一個態樣中，本發明係關於一種用於獲得AAV載體之方法，該方法包括以下步驟： (i) 提供包含本發明之多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋白及視需要可選之AAV複製所依賴的病毒蛋白之細胞， (ii) 將細胞維持在對於AAV之組裝合適之條件下，及 (iii) 純化由該細胞產生的腺相關病毒載體。

能夠產生AAV載體之任何細胞均可用於本發明。

先前已描述用於該方法中之本發明之多核苷酸。揭示於本發明之多核苷酸之上下文中之任何實施例適用於用於獲得本發明之AAV之方法之上下文中。

如本文所用，術語「cap蛋白」係指具有天然AAV cap蛋白(例如VP1、VP2及VP3)之至少一種功能活性之多肽。cap蛋白之功能活性之實例包括誘導衣殼形成，促進單股DNA累積，促進AAV DNA包裝成衣殼(亦即衣殼化)，結合至細胞受體，及促進病毒粒子進入至宿主細胞中之能力。原則上，任何cap蛋白均可用於本發明之上下文中。

在一個較佳實施例中，cap蛋白衍生自AAV8或AAV9。

如本文所用，術語「衣殼」係指包裝病毒基因組之結構。衣殼由由蛋白質組成之幾種寡聚結構亞單元組成。例如，AAV具有藉由三種衣殼蛋白：VP1、VP2及VP3相互作用形成之二十面體衣殼。

如本文所用，術語「rep蛋白」係指具有天然AAV rep蛋白之至少一種功能活性之多肽。rep蛋白之「功能活性」係與蛋白質之生理功能相關之任何活性，包括藉由識別，DNA複製的AAV起點之結合及切口以及DNA解旋酶活性促進DNA之複製。其他功能包括調節AAV(或其他異源)啟動子之轉錄及AAV DNA至宿主染色體中之定點整合。在一個特定實施例中，AAV rep基因衍生自血清型AAV2。

如本文所用，詞語「AAV複製所依賴的病毒蛋白」係指執行AAV複製所依賴的功能之多肽(亦即「輔助功能」)。輔助功能包括(但不限於)活化AAV基因轉錄、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、cap蛋白之合成、及AAV衣殼組裝所需的其等功能。基於病毒之輔助功能可衍生自任何已知的輔助病毒，諸如腺病毒、皰疹病毒(除了單純皰疹病毒型1之外)及牛痘病毒。輔助功能包括(但不限於)腺病毒E1、E2a、VA及E4或皰疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29、及皰疹病毒聚合酶。

可藉由將該等基因併入至載體(諸如(例如)質體)中並將該載體引入至細胞中，將本發明之多核苷酸、或基因AAV rep、AAV cap及提供輔助功能之基因引入至細胞中。基因可併入至相同的質體或不同的質體中。在一個較佳實施例中，將本發明之多核苷酸併入至一個質體中，將AAV rep及cap基因併入至另一個質體中及將提供輔助功能之基因併入至另一個質體中。

可藉由使用本技術中熟知的任何適宜方法將包含本發明之多核苷酸及/或AAV rep及cap基因或提供輔助功能之基因之質體引入至細胞中。轉染方法之實例包括(但不限於)與磷酸鈣之共沉澱、DEAE-葡聚糖、聚凝胺、電穿孔、顯微注射、脂質體介導之融合、脂質轉染、逆轉錄病毒感染及基因槍轉染。在一個特定實施例中，藉由與磷酸鈣共沉澱進行轉染。當細胞缺乏AAV rep及cap基因及提供腺病毒輔助功能之基因中之任何一者之表現時，可將該等基因與本發明之多核苷酸同時引入至細胞中。或者，可在引入本發明之多核苷酸之前或之後將該等基因引入細胞中。

在一個特定實施例中，用三種質體同時轉染細胞，i)包含本發明之多核苷酸之質體，ii)包含AAV rep及cap基因之質體及iii)包含提供輔助功能之基因之質體。

本發明方法之步驟(ii)包括將細胞保持在針對AAV之組裝合適的條件下。

培養細胞之方法及促進AAV載體粒子釋放(諸如細胞之裂解)之示例性條件可如本文實例中所述進行。使生產細胞生長一段適宜的時間，以促進AAV之組裝及病毒載體於培養基中之釋放。通常，從病毒產生的角度測量培養時間。例如，在AAV之情況下，病毒產生通常在如本文所述的適宜生產細胞中提供輔助病毒功能時開始。

本發明方法之步驟(iii)包括純化由細胞產生之AAV載體。

從該等細胞或該培養基中純化AAV之任何方法均可用於獲得本發明之AAV。在一個特定實施例中，本發明之AAV係在基於聚乙二醇沉澱步驟及兩個連續氯化銫(CsCl)梯度之最佳化方法之後純化的。

各種天然存在之AAV及工程化之AAV、其編碼核酸、AAV cap及rep蛋白、以及適用於產生AAV之用於分離或產生、繁殖及純化此種AAV(及特定言之其衣殼)之方法係本技術中已知的。

本發明進一步提供分離的細胞，其包含編碼GALNS蛋白之本發明之多核苷酸序列或其功能上等效變異體。

揭示於本發明之多核苷酸、載體或AAV載體及本發明之醫藥組合物之上下文中之所有實施例均適用於本發明之治療性方法。一般程序1. 重組 AAV 載體

本文所述的AAV載體藉由三重轉染獲得。製備載體所需的材料係：HEK293細胞(表現腺病毒E1基因)、提供腺病毒功能之輔助質體、提供來自血清型2的AAV rep基因之質體及來自血清型8或9 (AAV8或AAV9)的cap基因及最後的具有AAV2 ITR及所關注結構之骨架質體。

為產生表現半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之AAV載體，在普遍存在的雜合CAG啟動子或肝臟特異性hAAT啟動子之控制下，將人或鼠半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之最佳化或非最佳化編碼序列選殖至AAV骨架質體中。使用EndoFree Plasmid Megaprep套組(Qiagen)進行大規模質體生產。

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY, US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側懸血清型2AAV之病毒ITR(如上所述)；2)攜帶AAV rep2及cap8或cap9基因之質體；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。

本發明之載體係根據本技術中熟知的分子生物學技術構築。2. 體外轉染研究

使用Lipofectamine® 2000 (Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，CA, USA)，遵循製造商的說明書，用4 μg pAAV-CAG-omGALNS、pAAV-hAAT-omGALNS、pAAV-CAG-hGALNS、pAAV-CAG-ohGALNS-v1、pAAV-CAG-ohGALNS-v2或pAAV-CAG-ohGALNS-v3轉染HEK293細胞。48小時後，收穫細胞及培養基並加工用於蛋白質提取。

藉由在250 μl Mili-Q水中超音波處理細胞獲得蛋白質提取物並使用Bradford蛋白質分析(Bio-Rad，Hercules，CA，US)定量蛋白質含量。在1 μg細胞蛋白質提取物及5 μl培養基中測定半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性並使用4-甲基傘形酮衍生之螢光受質(Toronto Rerearch Chemicals Inc，Ontario, Canada)分別藉由蛋白質總量及體積進行標準化，如前所述(van Diggelen等人，1990)。3. 動物

獲得C57BL/6N-A/a胚胎幹細胞，其在Galns基因中攜帶報導子(LacZ )基因標記插入，可藉由國際小鼠表型分析聯盟(International Mouse Phenotyping Consortium，IMPC，www.mousephenotype.org)獲得。將選殖體顯微注射於巴塞羅那自治大學(Universitat Autònoma de Barcelona)(UAB)的動物生物技術及基因療法中心(Center of Animal Biotechnology and Gene Therapy，CBATEG)的轉殖基因動物單元中的C57BL/6JOlaHsd囊胚中，並將所得的雄性嵌合體與C57Bl/6NTac雌性體一起繁殖以產生Galns 敲除後代(MPSIVA或Galns^-/- 小鼠)。藉由PCR分析確定來自尾部剪切樣品之基因組DNA之基因型，該PCR分析擴增包含靶向突變之序列。各種正義及反義引子之序列為：正義引子：5’ CCA GGG AAT GTC CCA CCT ATT T 3’ (SEQ ID NO: 20)；反義引子：5’ GTC AGG TTG ACA CGA AGC TG 3’ (SEQ ID NO: 21)；及反義引子KO：5’ GGA ACT TCG GTT CCG GCG 3’ (SEQ ID NO: 22)。正義及反義引子允許對WT小鼠進行基因分型。正義及反義引子KO允許對Galns^-/- 小鼠進行基因分型。

用標準飲食(Harlan，Tekland)隨意餵養小鼠並在12小時的光暗循環下維持(在上午9:00照明)。

由於缺乏GALNS活性，此等動物早在1個月大時就顯示MPSIVA疾病之幾種病理特徵，包括醣胺聚醣(GAG)之累積及股骨及脛骨骺板之不同區域中溶酶體區室之擴大。此外，當動物變老時，許多此等病理發現會加劇，表明老年動物之病狀惡化。同樣地，隨著動物變老，亦觀察到GAG在周邊器官(諸如肝臟、心臟及脾臟)中累積。然而，在Galns^-/- 及WT同窩仔之間的壽命中沒有觀察到顯著差異。4. 對 小鼠之載體投與

對於AAV8-hAAT-omGALNS載體之靜脈內載體遞送，藉由3-4週齡的Galns^-/- 動物的尾靜脈以總體積200 μl對小鼠注射總劑量1x10¹¹ vg。用1 x 10¹¹ vg對照非編碼(AAV8-hAAT-null)載體注射類似的動物群。

為對小鼠靜脈內載體遞送AAV8-CAG-omGALNS載體，藉由3-4週齡的Galns^-/- 動物的尾靜脈以總體積200 μl對小鼠注射總劑量1 x 10¹² vg。用1 x 10¹² vg對照非編碼(AAV8-CAG-null)載體注射類似的動物群。

為對小鼠靜脈內載體遞送AAV9-CAG-omGALNS載體，藉由3-4週齡的Galns^-/- 動物的尾靜脈以總體積200 μl對小鼠注射總劑量1 x 10¹² vg。用1 x 10¹² vg對照非編碼(AAV9-CAG-null)載體注射類似的動物群。

在載體給藥後6個月，7個月大時，處死小鼠並收穫組織。

對於靜脈內載體遞送，藉由2個月大的Galns^-/- 動物之尾靜脈注射以總體積200 μl對小鼠遞送具有不同形式之人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶編碼序列之AAV9載體之5 x 10¹⁰ 個載體基因組。WT及未經處理之Galns^-/- 動物用作對照。

2.5個月大時，在載體投與後15天，處死小鼠並收穫組織。5. 樣品收集

在處死時，將動物深度麻醉及然後用50 ml PBS經心臟灌注以完全清除組織中的血液。收集整個大腦及多個體細胞組織(包括肝臟、脾臟、腎臟、肺、心臟、脂肪組織、眼睛、淚腺及骨骼)且在液氮中冷凍並儲存在-80℃或浸入福爾馬林中以進行隨後的組織學分析。6. 半乳糖胺 (N- 乙醯基 )-6- 硫酸酶活性及醣胺聚醣定量

將肝臟及脂肪組織樣品在Mili-Q水中超音波處理並將股骨樣品在由25 mmol/l Tris-HCl (pH 7.2)及1 mmol/l苯甲基磺醯氟組成的均質化緩衝液中均質化。用4-甲基傘形酮衍生之螢光受質(Toronto Rerearch Chemicals Inc，Ontario, Canada)測定半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性，如前所述(van Diggelen等人，1990)。將肝臟、脂肪組織及股骨GALNS活性水平相對於蛋白質的總量標準化，使用Bradford蛋白質分析(Bio-Rad，Hercules，CA, US)定量。

對於GAG定量，對組織樣品稱重及然後用蛋白酶K消化並藉由離心及過濾澄清提取物。藉由液相層析-質譜(LC-MS/MS)測定組織提取物及血清中之GAG水平。將GAG水平標準化為濕組織重量或消化的樣品之總體積。7. 組織學分析

將組織在福爾馬林中固定12-24小時，包埋在石蠟中並切片。

對於角膜上皮中儲存GAG之檢測，對石蠟切片進行Mowry膠體染色，其以藍色顯示GAG。對於淚腺及脛骨骺生長板中儲存GAG之檢測，對樹脂切片進行甲苯胺藍染色，其以白色顯示GAG之儲存。

使用NIS Elements Advanced Research 2.20軟體，使用所有動物的相同信號極限值設置，對每隻動物每隻眼睛的15-20個圖像(原始放大倍數，×40)中的GAG+面積%進行定量。然後，計算正面積的百分比，亦即，以像素為單位的面積，在圖像中所關注區域中的總組織區域上具有正信號。8. 透射電子顯微鏡法分析

藉由過量異氟烷(Isoflo，Labs. Esteve，Barcelona, ES)處死小鼠並藉由下腔靜脈灌注1 ml 2.5%戊二醛及2%多聚甲醛。將齒狀迴及杏仁體之一小部分(約1 mm³ )切片並在4℃下在相同的固定劑中培養2小時。在冷的二甲胂酸鹽緩衝液中洗滌後，將樣品後固定在1%四氧化鋨中，在乙酸雙氧鈾水溶液中染色，及然後藉由梯度乙醇系列脫水並包埋在環氧樹脂中。使用檸檬酸鉛對來自樹脂塊之超薄切片(600–800 Å)進行染色並在透射電子顯微鏡(H-7000；Hitachi，Tokyo, JP)中檢查。9. 統計分析

所有結果表示為平均值±SEM。使用單因子ANOVA進行統計學比較。使用鄧恩事後檢驗在對照組及治療組之間進行多重比較，並使用塔基事後檢驗在所有組之間進行多重比較。若P ＜ 0.05，則視為統計顯著性。實例實例 1 ： pAAV-CAG-hGALNS 之構築

人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS(NCBI參考序列：NM_000512.4)用作起始物料並為此目的進行化學合成(GeneArt；Life Technologies)。CDS SEQ ID NO: 1在分別在5’及3’處側接MluI及EcoRI限制位點之質體pMK-RQ (KanR)內部接受選殖。

從pMK-RQ質體切下MluI/EcoRI人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶CDS片段及於隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI及EcoRI限制位點之間。所得的質體命名為pAAV-CAG-hGALNS(寄存編號DSM 32791)。參見圖1A及SEQ ID NO: 2。

本文使用的AAV骨架質體pAAV-CAG先前已生成並包含來自AAV2基因組之ITR、CAG啟動子及來自兔β-球蛋白之polyA信號、以及用於選殖所關注CDS之多選殖位點。CAG啟動子係由CMV早期/中間增強子及雞β-肌動蛋白啟動子組成之雜合啟動子。該啟動子能夠普遍地驅動強效表現。實例 2 ： pAAV-CAG-ohGALNS-v1 之構築

設計並獲得包括半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶cDNA序列(ohGALNS)之最佳化形式之表現盒。藉由消除隱蔽的剪接位點及RNA去穩定序列元件以增加RNA穩定性，新增RNA穩定化序列元件，密碼子最佳化及G/C含量適應，避免穩定的RNA二級結構等變化，進行序列最佳化以最大化人體中半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶蛋白產生之效率。人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS (NCBI參考序列：NM_000512.4)用作序列最佳化之起始點。

最佳化的CDS SEQ ID NO: 3 (GeneArt；Life Technologies)在分別在5’及3’處側接MluI及EcoRI限制位點之質體pMK-RQ (KanR)內部接受選殖。

從pMK-RQ質體切下MluI/EcoRI最佳化人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶CDS片段及於隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI及EcoRI限制位點之間。所得的質體命名為pAAV-CAG-ohGALNS-v1(寄存編號DSM 32792)。參見圖2A及SEQ ID NO: 4。實例 3 ： pAAV-CAG-ohGALNS-v2 之構築

使人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS (NCBI參考序列：NM_000512.4)經歷序列最佳化(GenSript, Inc)。最佳化的CDS SEQ ID NO: 5在分別在5’及3’處側接MluI及EcoRI限制位點之質體pUC57 (AmpR)內部接受選殖。

從pUC57質體切下MluI/EcoRI最佳化人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶CDS片段及於隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI及EcoRI限制位點之間。所得的質體命名為pAAV-CAG-ohGALNS-v2(寄存編號DSM 32793)。參見圖3A及SEQ ID NO: 6。實例 4 ： pAAV-CAG-ohGALNS-v3 之構築

使人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS (NCBI參考序列：NM_000512.4)經歷序列最佳化(DNA 2.0 Inc)。最佳化的CDS SEQ ID NO: 7在分別在5’及3’處側接MluI及EcoRI限制位點之質體pj201 (KanR)內部接受選殖。

從pj201質體切下MluI/EcoRI最佳化人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶CDS片段及於隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI及EcoRI限制位點之間。所得的質體命名為pAAV-CAG-ohGALNS-v3(寄存編號DSM 32794)。參見圖4A及SEQ ID NO: 8。實例 5 ： pAAV-CAG-omGALNS 之構築

使鼠半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS(NCBI參考序列：NM_016722.4)經歷序列最佳化(GeneArt；Life Technologies)。最佳化的CDS SEQ ID NO: 9在分別在5’及3’處側接MluI及EcoRI限制位點之質體pMA-RQ-Bb (AmpR)內部接受選殖。

從pMA-RQ-Bb質體切下MluI/EcoRI最佳化鼠半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶CDS片段及於隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI及EcoRI限制位點之間。所得的質體命名為pAAV-CAG-omGALNS。參見圖5A及SEQ ID NO: 10。實例 6 ： pAAV-hAAT-omGALNS 之構築

使鼠半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之CDS (NCBI參考序列：NM_016722.4)經歷序列最佳化(GeneArt；Life Technologies) SEQ ID NO: 9。

hAAT啟動子(SEQ ID NO: 19)分別在5’及3’處側接BglII及MluI限制位點之質體pGG2-hAAT (AmpR)內部接受選殖。

從pAAV-CAG-omGALNS質體切下CAG啟動子(SEQ ID NO: 18)並於隨後藉由hAAT啟動子置換。所得的質體命名為pAAV-hAAT-omGALNS。參見圖6A及SEQ ID NO: 11。

hAAT啟動子係由人α1-抗胰蛋白酶啟動子及來自載脂蛋白E之肝細胞控制區(HCR)增強子之三個副本組成之雜合啟動子。該啟動子能夠驅動強效表現肝臟特異性。實例 7 ： AAV9-CAG-hGALNS 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV9-CAG-hGALNS (SEQ ID NO:12) (Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-hGALNS；SEQ ID NO: 2)；2)攜帶AAV2rep 及AAV9cap 基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖1B。實例 8 ： AAV9-CAG-ohGALNS-v1 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV9-CAG-ohGALNS-v1 (SEQ ID NO: 13)。(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-ohGALNS-v1；SEQ ID NO: 4)；2)攜帶AAV2rep 及AAV9cap 基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖2B。實例 9 ： AAV9-CAG-ohGALNS-v2 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV9-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 14)。(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-ohGALNS-v2；SEQ ID NO: 6)；2)攜帶AAV2rep 及AAV9cap 基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖3B。實例 10 ： AAV9-CAG-ohGALNS-v3 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV9-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 15)。(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-ohGALNS-v3；SEQ ID NO: 7)；2)攜帶AAV2rep 及AAV9cap 基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖4B。實例 11 ： AAV9-CAG-omGALNS 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV9-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16)。參見(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-omGALNS；SEQ ID NO: 10)；2)攜帶AAV2rep 及AAV9cap 基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖5B及SEQ ID NO: 16。實例 12 ： AAV8-CAG-omGALNS 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV8-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16)。參見(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-CAG-omGALNS；SEQ ID NO: 10)；2)攜帶AAV2rep 及AAV8cap 基因之質體(pREP2CAP8)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖5B及SEQ ID NO: 16。實例 13 ： AAV8-hAAT-omGALNS 之產生

使用具有修飾之三種質體藉由無輔助病毒轉染HEK293細胞產生載體AAV8-hAAT-omGALNS (SEQ ID NO: 17)。參見(Matsushita等人，1998；Wright等人，2005)。將細胞在轉瓶(RB) (Corning，Corning，NY，US)中在補充有10% FBS之DMEM中培養至70%匯合率及然後與如下共轉染：1)攜帶表現盒之質體，其側接AAV2 ITR (pAAV-hAAT-omGALNS；SEQ ID NO: 11)；2)攜帶AAV2rep 及AAV8cap 基因之質體(pREP2CAP8)；及3)攜帶腺病毒輔助功能之質體。使用如前所述的最佳化方案，藉由兩個連續的氯化銫梯度純化載體(Ayuso等人，2010)。將載體對PBS + 0.001% Pluronic® F68透析，過濾，藉由qPCR滴定並儲存在-80℃直至使用。參見圖6B及SEQ ID NO: 17。實例 14 ：對 MPSIVA 小鼠靜脈內注射 AAV9-CAG-hGALNS 、 AAV9-CAG-ohGALNS-v1 、 AAV9-CAG-ohGALNS-v2 或 AAV9-CAG-ohGALNS-v3

包含人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶表現盒之不同形式之AAV9-CAG-hGALNS、AAV9-CAG-ohGALNS-v1、AAV9-CAG-ohGALNS-v2或AAV9-CAG-ohGALNS-v3之總劑量5x10¹⁰ 個載體基因組經由尾靜脈注射經靜脈內遞送至2月齡的受MPSIVA影響之小鼠。

在載體遞送後2週進行GALNS活性分析。用所有四種包含半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之載體轉導會導致半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性顯著增加超過MPSIVA動物中測得的水平。半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶活性水平範圍為肝臟中WT水平之1500%至2600%及血清中WT之55%至99%。參見圖7A及7B。在肝臟中，利用包含人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之2型及3型之表現盒達到的活性水平高於彼等由包含野生型序列之載體所介導者。參見圖7A。在血清中，人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶之型2及型3均導致酵素活性比野生型及型1更高的增加。參見圖7B。實例 15 ：對 MPSIVA 小鼠靜脈內遞送 AAV9-CAG-omGALNS 、 AAV8-CAG-omGALNS 或 AAV8-hAAT-omGALNS

經由3-4週齡大MPSIVA動物的尾靜脈以總體積200 μl注射總劑量AAV9-CAG-omGALNS載體之1 x 10¹² 個載體基因組、AAV8-CAG-omGALNS載體之1 x 10¹² 個載體基因組或AAV8-hAAT-omGALNS載體之1 x 10¹¹ 個載體基因組。載體投與後4個月及6個月，處死動物並收集樣品以用於進一步分析。

在AAV處理後6個月，GALNS在經MPSIVA處理的動物之肝臟、股骨、脂肪組織及血清中之酵素活性係經標準化，達到與在健康動物中所觀察到之彼等相似或甚至更高的值。參見圖8、9及10。GALNS活性之恢復導致在肝臟及血清中疾病之受質累積特徵之完全標準化，如在野生型對照及經處理之Galns^-/- 小鼠中相似濃度之硫酸角質素所示。參見圖11。

靜脈內投與不同載體至血流主要轉導肝臟等其他組織及器官(Ruzo等人，2012)。因此，用不同載體處理的MPSIVA雄性小鼠肝臟中之GALNS活性比在健康動物中所觀察到的高約25倍。參見圖8A、9A及10A。

當在肝臟中過度表現時，可溶性溶酶體蛋白被有效地分泌至血流，使此器官成為循環酵素之來源(Ruzo等人，2012)。在經處理之MPSIVA小鼠之血清中，GALNS活性在注射後3個月左右達到峰值且之後長期穩定，其值在比野生型同窩小鼠高20至50倍之範圍內。參見圖8D、9D及10D。當藉由定量血清及肝臟中之GAG含量來評估療法之體細胞功效時，觀察到循環及肝臟KS水平之全面標準化。參見圖11。

在AAV遞送後4個月，來自經MPSIVA處理的小鼠之脛骨骨骺生長板顯示細胞內GAG累積明顯減少，這由存在多個細胞內GAG儲積指示。參見圖12。

經AAV處理的動物亦顯示淚腺中GAG累積之完全標準化，這由不存在細胞內GAG儲積指示。參見圖13B。同樣地，利用Mowry氏膠體染色染色的角膜上皮切片中GAG陽性區域之信號強度之量化顯示經AAV9-CAG-omGALNS或AAV8-hAAT-omGALNS處理之Galns ^-/- 小鼠中角膜上皮表面上GAG沉積之百分比降低超過GALNS缺陷小鼠中記錄的值。參見圖13A。

藉由透射電子顯微鏡法對7月齡雄性小鼠之齒狀迴及杏仁體進行超微結構分析，顯示在未經處理之GALNS缺陷小鼠之細胞之細胞質中存在包含電致發光物質之大液泡。此等細胞被鑑定為齒狀迴中之血管周圍巨噬細胞或杏仁體中之神經周圍神經膠質細胞及內皮細胞。此等囊泡(似乎為填充有儲存材料的溶酶體)在健康野生型或經AAV9-CAG-omGALNS處理之Galns^- /^- 動物之樣品中完全不存在，這證實基因轉移後之溶酶體區室恢復正常大小。參見圖14。

圖 1. pAAV-CAG-hGALNS及AAV9-CAG-hGALNS之產生。(A)質體pAAV-CAG-hGALNS及其組分的概視圖。(B)包含hGALNS編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 2. pAAV-CAG-ohGALNS-v1及AAV9-CAG-ohGALNS-v1之產生。(A)質體pAAV-CAG-ohGALNS-v1及其組分的概視圖。(B)包含ohGALNS-v1編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 3. pAAV-CAG-ohGALNS-v2及AAV9-CAG-ohGALNS-v2之產生。(A)質體pAAV-CAG-ohGALNS-v2及其組分的概視圖。(B)包含ohGALNS-v2編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 4. pAAV-CAG-ohGALNS-v3及AAV9-CAG-ohGALNS-v3之產生。(A)質體pAAV-CAG-ohGALNS-v3及其組分的概視圖。(B)包含ohGALNS-v3編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 5. pAAV-CAG-omGalns、AAV9-CAG-omGalns及AAV8-CAG-omGalns之產生。(A)質體pAAV-CAG-omGalns及其組分的概視圖。(B)包含omGalns編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 6. pAAV-hAAT-omGalns及AAV8-hAAT-omGalns之產生。(A)質體pAAV-hAAT-omGalns及其組分的概視圖。(B)包含omGalns編碼序列之腺相關載體之基因組的概視圖。

圖 7. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼不同人Galns 形式之AAV9載體(AAV9-CAG-hGalns、AAV9-CAG-ohGalns-v1、AAV9-CAG-ohGalns-v2及AAV9-CAG-ohGalns-v3)。在2個月大時，在用5x10¹⁰ vg各載體經由靜脈內(IV)注射全身投與之野生型(健康)小鼠(WT)、未經處理之Galns-/-小鼠及Galns-/-小鼠的(A)肝臟及(B)血清中之GALNS活性。WT GALNS活性設定為100%。值係每組4-5隻小鼠之平均值±SEM。

圖 8. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV9載體(AAV9-CAG-omGalns)。在1個月大時，在用1 x 10¹² vg AAV9-CAGomGalns經由靜脈內(IV)注射全身投與之野生型(健康)小鼠(WT)、未經處理之Galns-/-小鼠及Galns-/-小鼠的(A)肝臟、(B)股骨、(C)脂肪組織中之GALNS活性。(D)在同一組動物中不同注射後時間點血清中之GALNS活性。WT GALNS活性設定為100%。值係每組4-5隻小鼠之平均值±SEM。* P＜0.05，**** P＜0.0001，相對於Galns-/-未經處理之小鼠。

圖 9. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV8載體(AAV8-CAG-omGalns)。在1個月大時，在用1 x 10¹² vg AAV8-CAGomGalns經由靜脈內(IV)注射全身投與之野生型(健康)小鼠(WT)、未經處理之Galns-/-小鼠及Galns-/-小鼠的(A)肝臟、(B)股骨、(C)脂肪組織中之GALNS活性。(D)在同一組動物中不同注射後時間點血清中之GALNS活性。WT GALNS活性設定為100%。值係每組4-5隻小鼠之平均值±SEM。* P＜0.05，**** P＜0.0001，相對於Galns-/-未經處理之小鼠。

圖 10. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV8載體(AAV8-hAAT-omGalns)。在1個月大時，在用1 x 10¹¹ vg AAV8- hAAT-omGalns經由靜脈內(IV)注射全身投與之野生型(健康)小鼠(WT)、未經處理之Galns-/-小鼠及Galns-/-小鼠的(A)肝臟、(B)股骨、(C)脂肪組織中之GALNS活性。(D)在同一組動物中不同注射後時間點血清中之GALNS活性。WT GALNS活性設定為100%。值係每組4-5隻小鼠之平均值±SEM。* P＜0.05，**** P＜0.0001，相對於Galns-/-未經處理之小鼠。

圖 11. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV9及AAV8載體(AAV9-CAG-omGalns、AAV8-CAG-omGalns及AAV8-hAATomGalns)。藉由LC-MS/MS分析定量(A)肝臟及(B)血清中之硫酸角質素(KS)。**** P＜0.0001，相對於Galns-/-未經處理之雄性小鼠。

圖 12. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV9及AAV8載體(AAV9-CAG-omGalns、AAV8-CAG-omGalns及AAV8-hAATomGalns)。經甲苯胺藍染色之切片中脛骨骺生長板之組織病理學。原始放大倍數100x。

圖 13. 對雄性Galns-/-小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠Galns 之AAV9及AAV8載體(AAV9-CAG-omGalns、AAV8-CAG-omGalns及AAV8-hAATomGalns)。(A)在Mowry氏染色醣胺聚醣後，在角膜上皮中獲得的染色強度之定量。(B)在藉由靜脈內(IV)注射全身投與的野生型(健康)小鼠(WT)、未經處理之Galns-/-小鼠及Galns-/-小鼠中經甲苯胺藍染色之切片中之淚腺之組織病理學。原始放大倍數40x。*** P＜0.001，**** P＜0.0001，相對於Galns-/-未經處理之雄性小鼠。

圖 14. 對雄性小鼠靜脈內遞送編碼最佳化鼠GALNS之AAV9載體(AAV9-CAG-omGalns)。藉由透射電子顯微鏡法分析自全身性投與1 x 10¹² vg編碼最佳化鼠Galns 之載體(AAV9-CAG-omGALNS)的6個月大的健康WT及Galns-/-雄性收獲的齒狀迴及杏仁體之超微結構。箭頭指示血管周圍巨噬細胞(齒狀迴)、神經周圍膠質細胞及內皮細胞(杏仁體)中放大的溶酶體。

Claims

一種分離的多核苷酸序列，其與如SEQ ID NO:1所闡述之核苷酸序列具有介於75%至90%的同一性，其中該序列編碼功能性人半乳糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酶。
如請求項1之分離的多核苷酸序列，其中該序列與如SEQ ID NO:1所闡述之核苷酸序列具有介於80%至85%的同一性。
如請求項1或2之分離的多核苷酸序列，其中該序列係選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7組成之群。
一種表現載體，其包含如請求項1至3中任一項之多核苷酸序列。
如請求項4之表現載體，其中該載體包含以操作方式連接至該多核苷酸序列之啟動子序列，該啟動子係選自CAG啟動子、hAAT啟動子或CMV啟動子。
如請求項5之表現載體，其中該啟動子係CAG啟動子。
如請求項4至6中任一項之表現載體，其中該載體係重組AAV載體。
如請求項7之表現載體，其中該重組AAV載體係選自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAVrh10。
如請求項4至6中任一項之載體，其中該載體係選自由如SEQ ID NO:4所闡述之質體pAAV-CAG-ohGALNS-型1、如SEQ ID NO:6所闡述之質體pAAV-CAG-ohGALNS-型2及如SEQ ID NO: 8所闡述之質體pAAV-CAG-ohGALNS-型3組成之群。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至3中任一項之多核苷酸或如請求項4至9中任一項之載體。
如請求項10之醫藥組合物，其中該組合物係經靜脈內投與的。
如請求項10或11之醫藥組合物，其中其係一生中投與一次。
一種如請求項1至3中任一項之多核苷酸、如請求項4至9中任一項之載體或如請求項10至12中任一項之醫藥組合物於製造用於治療黏多醣症IV A型或Morquio氏A症候群的藥物中之用途。
如請求項13之用途，其中該藥物係用於靜脈內投與。
如請求項13或14之用途，其中該藥物係一生中投與一次。
一種用於獲得如請求項7或8之載體之方法，該方法包括如下步驟： (i) 提供包含本發明之多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋白及視需要可選之AAV複製所依賴的病毒蛋白之細胞， (ii) 將細胞維持在對於AAV之組裝合適之條件下；及 (iii) 純化由該細胞產生的腺相關病毒載體。