JP7090548B2 - Aav系条件的発現系 - Google Patents
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Description
例示的なレプリコンベクター
AAVレプリコン系の特徴を試験するために、本発明者らは、マーカー遺伝子としてルシフェラーゼORFを保有するAAVレプリコンベクターを構築した。これは、種々の実験設定においてAAVレプリコンの誘導可能性を試験することを可能にした。本発明者らは、AAV配列の供給源としてpAV1プラスミド(ATCC #VR37215)を使用した。本発明者らは、XhoIおよびApaIについての単一の認識部位の間のAAVを、pTRE-Hyg (Invitrogen)に由来するマルチクローニングサイト(multiple cloning site)およびハイグロマイシン耐性カセットを含む合成オリゴヌクレオチド配列と入れ替えた。XhoI部位は、AAV VP1 ORFの最初にあるp40転写開始部位の380 nt下流に位置し、ApaI部位は、capコード配列の最後にある右の(right)ITRの前(486 nt上流)に位置する。この中間体に、本発明者らは、pGLuc (NEB)由来のPCR増幅したルシフェラーゼORFを挿入した。この構築物を、pAV1-GLuc-Hygと命名した(図1Aおよび1Cならびに配列番号:1)。対照の理由(control reason)のために、本発明者らは、緑蛍光タンパク質(GFP)のORFも、pEGFP-N1 (Clontech)に存在するORFを増幅する同じ位置に挿入した。この対照構築物を、pAV1-GFP-Hygと命名した。
AAVベースのレプリコン系による標的細胞の提供:一過性および安定なトランスフェクタント
本発明者らは、2つの異なるトランスフェクションプロトコルを使用するAAVレプリコンベクターの誘導性発現を試験した。まず、本発明者らは、レポーター遺伝子を保有するAAVレプリコンベクターで種々の細胞型を一過的にトランスフェクトした。本アプローチは、種々の細胞株において本発明者らの系を試験することを可能にした。種々の細胞において一過性トランスフェクションプロトコルを使用することの利点は、AAVレプリコン技術の、特定の細胞株中で複製するヘルパーウイルスへの適用可能性である。本方法の欠点は、トランスフェクションプロトコルがアッセイ時間を長くし、実験間でトランスフェクション効率が異なるために、さらなるハウスキーピングマーカーによる遺伝子発現データの標準化が必要であることである。従って、本発明者らは、また、AAVレプリコンの完全な(integrated)コピーを保有する293A細胞に基づく安定な細胞株を生成した。安定な細胞株を生成するために、ヒト293A細胞(Invitrogen)を、pAV1-GLuc-Hygでトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性について選択した。安定なクローンを、ハイグロマイシンの連続的な存在における限界希釈法により単離した。得られたクローンのセットを試験した後、本発明者らは、レプリコン陰性(LE2A2)およびレプリコン陽性の安定クローン(LE2D8)を選択し、連続継代を用いてそれらを増殖させた。次いで、これらの293Aベースの細胞株を、安定トランスフェクションの背景においてAAVレプリコン技術を試験する以下の実験において使用した。本アプローチは、より短い試験時間および再現性をアッセイするためのアッセイを提供した。本技術の欠点は、遺伝子発現レベルが一過性の系を使用して得られたものより低いと予想されることである。
種々のウイルスを使用するレプリコン系の誘導
3.1 アデノウイルス誘導
AAVレプリコンベクターがその最も一般的に使用されるヘルパーウイルスに応答するかどうかを試験するために、本発明者らは、まず、アデノウイルス(Ad)感染に対するレプリコン応答を試験した。この目的のために、本発明者らは、SuperFectトランスフェクション試薬(Qiagen)のトランスフェクションプロトコルに従って、U2OSおよび293A細胞を、プレースホルダー(placeholder)DNAとして1μgのLitmus28で、ハウスキーピングマーカーとしてmCherryを構成的に発現する0.5μgのpO6-CMVmCheで、および0.5μgの特定の構築物でトランスフェクトした。該特定の構築物は、ルシフェラーゼ発現AAVレプリコン(pAV-GLuc-Hyg)およびGFP発現カセットを保有する対照レプリコンベクター(pAV-GFP-Hyg)であった。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクトした細胞を、3.3×104/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。次いで、本発明者らは、常に技術的な三連のものを使用して、該細胞を、mCherryを発現する組換えアデノウイルス5型(ADChe)で100のMOI(感染多重度)で感染させた。このmCherryマーカーを発現するE1およびE3除去第1世代AD5ベクターを、相補(complementation)依存性アデノウイルスのモデルとして使用した。293A細胞は、この欠損ウイルス中に存在しないE1遺伝子をトランス相補し得るので、これらの細胞は、かかるAdの生産的ウイルスサイクルを支持する。しかし、U2OS細胞は、第1世代Adベクターの遺伝的欠損を相補し得ない。従って、これらの細胞においては、ウイルス侵入およびいくつかの初期遺伝的の発現のみが生じるが、DNA複製および生産的感染は進行し得ない。
AAVは、ヘルペスウイルス共感染によっても復活され得るので、本発明者らは、AAVレプリコンベクターのHSV-1感染に対する応答を試験した。この目的のために、293A細胞を、上記(2.1)するようにpAV1-GLuc-Hygでトランスフェクトし、トランスフェクションの3日後に(3 day after transfection)(dpt)、HSV1で0.2、0.5および2のMOIで感染させた。本実験において使用したHSV1株は、BAC由来単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)実験室株であった(Nagel et al. J Virol., 82:3109-3124 (2008))。上清のルシフェラーゼ活性を、感染の24および48時間後(24 and 48 h after infection)(hpi)に測定し、mock感染細胞と比較した(図3A)。
次いで、本発明者らは、生産性(productive)ヘルペスウイルス複製が、最適なAAVレプリコン応答に必要であるかどうかを試験することを望んだ。この目的のために、293AおよびU2OS細胞を、トランスフェクション試薬としてSuperFectを使用して、1.25μgのLitmus28、0.5μgの特定のDNA (pAV-GLuc-Hyg)および0.25μgのハウスキーピングマーカーを使用してトランスフェクトした。上記最後のプラスミドは、ホタルルシフェラーゼのための発現ベクターである。本発明者らは、ルミノメトリー(luminometry)を使用する実験間での定量的標準化を可能にするために、トランスフェクション対照として(上記実験で使用したmCherry発現プラスミドの代わりに)該発現ベクターをアッセイに導入した。細胞を、3dptにADCheベクターおよび野生型(wt)Ad 5型(AD5-WT)で1、10および100のMOIで感染させた。上清を、48時間後に回収し、ルシフェラーゼ活性を上記したように測定した。全実験を3回繰り返し、ADChe誘導を6回繰り返した。
コピー数/HG/=2(CTh-CTl)
(式中、HGはハウスキーピング遺伝子であり、CThはハウスキーピング遺伝子についてのCT値であり、CTlはGLuc増幅についてのCT値である。)
に従って倍加が線形相(linear phase)(CT)に達した点で決定した。GLuc特異的増幅についての基本的なコピー数(primary copy number)を、各増幅曲線のCT値を使用して計算し、GAPDHのコピー数に対して標準化した。これは、両方の日についてGLucコピー数の相対的定量を可能にした(図4B)。
AAVベースのレプリコン技術は臨床ウイルス単離物の薬物感受性を試験するために使用され得る
レプリコン陽性細胞株LE2D8がHSV1複製に応答するという事実を考慮して、本発明者らは、薬物感受性臨床単離物と薬物耐性臨床単離物を区別するためのアッセイを確立した。アシクロビル(ACV)は、ヒトHSV1感染の治療のために使用される最も著名な薬物である。アシクロビルは、グアノシンアナログであり、ウイルスDNAポリメラーゼを阻害し、結果として、ACVは、HSV1複製を阻害する。AAVレプリコン応答がHSV1複製に依存性である場合、系は、ACVの存在下で、ACV感受性HSV1株(これはこの条件において複製できない)での感染と、ACV耐性株(これはこの条件において複製し得る)での感染に対して異なる応答をする筈である。
ヒトアデノウイルスを含むマストアデノウイルスは、その遺伝的および生物学的特徴に従って、6つの種(A~F種)に分類される。AAVレプリコン系は、組換えおよび野生型ヒトアデノウイルス5型(Ad5)、C種のアデノウイルスにより良好に誘導されることが証明された。臨床実施において、アデノウイルス単離物は、C以外の種(主に、B種およびD種)からしばしば見出されるので、本発明者らは、他の種を示す種々のヒトアデノウイルスが、本発明者らがAd5について観察したものと同等のレプリコン応答を誘導し得るかどうかを試験した。この目的のために、293A細胞を、FuGene HDトランスフェクション試薬(Promega)のトランスフェクションプロトコルに従ってpAV1-GLuc-Hygでトランスフェクトし、感染を、トランスフェクションの3日後に続けた。細胞を、3.3x104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、以下のヒトアデノウイルス血清型で1のMOIで感染させた:Ad12 (A種)、Ad3およびAd11 (B種)、Ad9およびAd17 (D種)、Ad4 (E種)。対照として、組換えアデノウイルス5型(ADChe)感染を、1のMOIで使用した。上清のルシフェラーゼ活性を、感染の48時間後(hpi)に測定し、対応するmock感染細胞と比較した(図7)。AAVレプリコン由来ルシフェラーゼ発現の誘導は、全てのアデノウイルス血清型での感染の際に観察され得、ADCheでの誘導(20倍)に対して同等の16~58倍の誘導値を生じた。これらのデータは、AAVレプリコン応答が、種々の種由来のヒトアデノウイルスの野生の範囲で良好に誘導され得ることを示す。
凍結したトランスフェクト細胞を使用した感染によるAAVレプリコンの誘導
AAVレプリコンは、一過性トランスフェクションにより導入され得るか、または安定細胞株が使用され得る。アッセイは、一過性トランスフェクションを適用した場合、細胞をトランスフェクションの後回復させるためにトランスフェクションと感染の間待機する必要があるので、3日長く費やし得る。一過性トランスフェクションにおいてこの72時間のアッセイ時間を省くために、本発明者らは、製造業者のプロトコルに従ってFuGeneを使用して、6ウェル中の2E+05 293A細胞を、0.6μg pAV1-GLuc-Hygおよび5μg Litmus 28 stuffer DNAでトランスフェクトした。24および48時間後、細胞を、凍結媒体(Dulbecco’s改変イーグル培地(DMEM)、20%ウシ胎仔血清(FBS)および10%ジメチルスルホキシド(DMSO))中に再懸濁し、3x104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した:プレートをシールし、次いで、-80℃で迅速に凍結した。プレートの融解のために、150μlの増殖培地を、各ウェルに直接添加し、細胞を、通常の細胞培養条件下で2時間インキュベートした。次いで、上清を、除去し、100μlの増殖培地を各ウェルに添加した。融解の4、6、20および26時間後、前もってトランスフェクトした293A細胞を、HSV-1実験室株で0.01、0.1および1のMOIを使用して感染させた。48 hpi後、ルシフェラーゼ活性を、以前の実験のように、20μlの上清中で測定した。ルシフェラーゼ活性の誘導を、HSV-1感染後の値とmock感染細胞を比較することにより計算した(図8)。
AAVレプリコン遺伝子を含む組換えAAV2ベクターの誘導
本発明者らは、特定の細胞株における低いトランスフェクション効率に基づく限界を克服することに興味があるので、本発明者らは、潜在的なレプリコンベクター形質導入系として、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)を調査した。このために、本発明者らは、製造業者のプロトコルに従って、PEI (Polyscience, PEI "Max", MW 40,000)を使用して、AAV産生のためにプラスミドpDP2rs (Grimm, D., M. A. Kay and J. A. Kleinschmidt (2003). "Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6." Molecular Therapy 7(6): 839-850)で、pAV1-GLuc-Hygと命名した本発明の構築物で、2,30E+08 HEK 293TN細胞をトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトした細胞を、3回の凍結融解により溶解した。放出されたrAAVレプリコン粒子を、精製し、イオジキサノール(iodixanol)密度遠心分離により濃縮した(Zolotukhin, S., B. J. Byrne, E. Mason, I. Zolotukhin, M. Potter, K. Chesnut, C. Summerford, R. J. Samulski and N. Muzyczka (1999). "Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield." Gene Therapy 6(6): 973-985)。
本発明の態様として以下のものが挙げられる。
[1]5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) 1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に1つまたは複数のヘルパーポ リヌクレオチドにより活性化され得る少なくとも1つのプロモーター、好ましくはAAVプロ モーターp5およびAAVプロモーターp19;
(iii) (ii)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列 ;
(iv) 該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に該1つまたは複数のヘルパ ーポリヌクレオチドにより活性化され得るプロモーター、好ましくはAAVプロモーターp40 ;
(v) (iv)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;
(vi) ポリアデニル化部位;ならびに
(vii) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
を含む核酸を含むビリオンであって、該ビリオンは、AAV cap遺伝子を含まない、および /または任意のAAV cap遺伝子産物を発現し得ない、ビリオン。
[2]該ビリオンは、AAVキャプシドタンパク質を含み、好ましくは、該ビリオンは、[ 1]に規定される核酸および該キャプシドタンパク質からなる、[1]記載のビリオン。 [3](aa) 5’~3’方向に、
(i) 少なくとも1つのアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) 1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に1つまたは複数のヘルパーポ リヌクレオチドにより活性化され得るプロモーター;および
(iii) (aa)(ii)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列を含む核 酸;ならびに
(ab) 5’~3’方向に、
(i) 該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に該1つまたは複数のヘルパー ポリヌクレオチドにより活性化され得るプロモーター;および
(ii) (ab)(i)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配 列
を含む核酸を含む細胞であって、該細胞は、AAV cap遺伝子を含まない、および/または 任意のAAV cap遺伝子産物を発現し得ない、細胞。
[4](a)(aa) 5’~3’方向に、
(i) 少なくとも1つのアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) (b)の1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に1つまたは複数のヘルパ ーポリヌクレオチドにより活性化され得るプロモーター;
(iii) (aa)(ii)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列
を含む核酸;
(ab) 5’~3’方向に、
(i) (b)の該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび任意に1つまたは複数のヘル パーポリヌクレオチドにより活性化され得るプロモーター;
(ii) (ab)(i)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配 列
を含む核酸;ならびに任意に
(b) 発現可能な形態で該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドをコードし、かつ任意に 該1つまたは複数のヘルパーポリヌクレオチドを提供する1つ以上の核酸
を含むキットであって、該キットは、AAV cap遺伝子も任意のAAV cap遺伝子産物を発現す る手段も含まない、キット。
[5](aa)および(ab)の該核酸は、細胞中に含まれ、該細胞は、AAV cap遺伝子を含まな い、および/または任意のAAV cap遺伝子産物を発現し得ない、[2]記載のキット。
[6](i) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の環状核酸に含まれ、好ましくは、(ab) の核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)( ii)の前に位置する;
(ii) (aa)および(ab)の核酸の配列は、各々別個の環状核酸に含まれる;
(iii) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の直鎖状核酸に含まれ、好ましくは、(ab)の 核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)(ii )の前に位置する;または
(iv) (aa)および(ab)の核酸の配列は、各々別個の直鎖状核酸に含まれる、
[1]もしくは[2]記載のビリオン、[3]記載の細胞、または[4]もしくは[5] 記載のキット。
[7](i) (aa)および(ab)の両方の核酸の配列は、該細胞のゲノムDNAに含まれる、また は
(ii) (ab)の核酸の配列は、該細胞のゲノムDNAに含まれる、
[3]もしくは[6]記載の細胞または[5]もしくは[6]記載のキット。
[8](i) (aa)(ii)のプロモーターは、AAVプロモーターp40、p5、p19および該1つまた は複数のヘルパーポリペプチドを天然にコードするウイルス由来の後期プロモーターから なる群より選択され、好ましくはAAV p40プロモーターである;および/または
(ii) (ab)(i)のプロモーターは、プロモーターp5、p19およびp40から選択され、好ましく はp5またはp19であり、さらにより好ましくはp5およびp19プロモーターの組み合わせであ る、
前記いずれか記載の細胞、キット、またはビリオン。
[9](ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep78および/また はAAV Rep68ポリペプチドをコードし、好ましくは、(ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep 遺伝子コード配列は、AAV Rep52および/またはAAV Rep40ポリペプチドをさらにコードす る、前記いずれか記載の細胞、キット、またはビリオン。
[10](b)の核酸は、存在する限り、
(i)ヘルパーウイルス中に含まれる;または
(ii)該細胞は、(b)の該核酸をさらに含む、
前記いずれか記載の細胞またはキット。
[11](aa)の核酸配列は、2つのAAV逆方向末端反復配列を含み、第2の逆方向末端反 復配列は、(aa)(iii)のトランスジェニック配列の後に逆方向において位置する、前記い ずれか記載の細胞、キット、またはビリオン。
[12](b)の該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび、存在する限り、1つま たは複数のヘルパーポリヌクレオチドは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科か ら選択されるウイルスから生じる、前記いずれか記載の細胞またはキット。
[13][5]を引用する限りにおいて、
(a)該細胞は容器(vessel)中に提供される;
(b)該細胞は、複数の場合において、マルチウェルプレートのウェル中に提供される;お よび/または
(c)該キットは、指示、好ましくは、[14]~[17]いずれか記載の方法を実施する ための指示を含む使用説明書を含む、
[5]~[10]いずれか記載のキット。
[14]ウイルス、好ましくは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択さ れるものが、抗ウイルス剤により阻害されるかどうかを決定する方法であって、該方法は 、[4]~[13]いずれか記載のキットまたは[1]、[2]、[6]、[8]、[9 ]もしくは[11]いずれか記載のビリオンを、該ウイルスを含む試料と接触させる工程 を含み、該接触は、(i)該抗ウイルス剤の存在下および(ii)その非存在下でもたらされ、 ケース(ii)において、該キットまたはビリオンのそれぞれに従って画定されるトランスジ ェニックコード配列の産物の量がより多いことは、該ウイルスが該剤により阻害されたこ とを示す、方法。
[15][3]、[6]~[9]、[11]または[12]いずれか1項に規定される細 胞に、[11]および[12]が[3]または[6]~[9]を引用する限りにおいて、 1つ以上のヘルパーポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を導入する工程、および、 任意に、前述のいずれかにおいて規定される1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドを提供 する工程を含み、それにより、該トランスジェニックコード配列によりコードされる産物 を発現する、条件的遺伝子発現のための方法。
[16]感染性ウイルスを検出および/または定量する方法であって、該ウイルスは、好 ましくは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択され、該方法は、[3] 、[6]~[9]、[11]または[12]いずれか1項に規定される細胞を、[11] および[12]が[3]または[6]~[9]を引用する限りにおいて、該感染性ウイル スを含むまたは含むと疑われる試料と接触させる工程を含み、該細胞に従って画定される トランスジェニックコード配列の産物の存在および/または量は、該感染性ウイルスの存 在および/または量を示す、方法。
[17]ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する化合物を同定するための方法であって 、該ウイルスは、好ましくは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択され 、該方法は、
(a) 前記のいずれかに規定される細胞の集団の細胞に、1つ以上のヘルパーポリペプチド をコードする1つまたは複数の核酸を導入する工程、および、任意に、前記のいずれかに 規定される1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドを提供する工程;
(b) 該導入の後に、工程(a)の細胞集団により発現される(aa)(iii)の該トランスジェニッ クコード配列によりコードされる産物の量を決定する工程;
(c) 前記のいずれかに規定される細胞の集団と、試験されるべき化合物を接触させる工程 ;
(d) 工程(c)の細胞集団の細胞に、工程(a)に規定される該1つまたは複数の核酸を導入す る工程;
(e) 該導入の後に、工程(d)の細胞集団により発現される該トランスジェニックコード配 列によりコードされる産物の量を決定する工程;
(f) 工程(b)で決定された該産物の量と工程(e)で決定された該産物の量を比較する工程
を含み、工程(b)で決定された産物に比べて工程(e)で決定された産物が少ないことは、試 験された化合物が抗ウイルス活性を有することを示す、方法。
Claims (21)
- 5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) AAVp5プロモーターまたはAAVp5プロモーターとAAVp19プロモーターの組み合わせから選択されるプロモーター;
(iii) (ii)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列;
(iv) AAV2ゲノムの1700位から2287位まで伸長するAAV p40プロモーター;
(v) (iv)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;
(vi) ポリアデニル化部位;ならびに
(vii) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
を含む核酸を含むビリオンであって、該ビリオンは、AAV cap遺伝子を含まない、ビリオン。 - 該ビリオンは、AAVキャプシドタンパク質を含み、好ましくは、該ビリオンは、請求項1に規定される核酸および該キャプシドタンパク質からなる、請求項1記載のビリオン。
- (aa) 5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) AAV2ゲノムの1700位から2287位まで伸長するAAV p40プロモーター;
(iii) (aa)(ii)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;および
(iv) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列
を含む核酸;ならびに
(ab) 5’~3’方向に、
(i) AAVp5プロモーターまたはAAVp5プロモーターとAAVp19プロモーターの組み合わせから選択されるプロモーター;および
(ii) (ab)(i)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列
を含む核酸を含む細胞であって、該細胞は、AAV cap遺伝子を含まず、
(i) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の環状核酸に含まれ、(ab)の核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)(ii)の前に位置する;または
(ii) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の直鎖状核酸に含まれ、(ab)の核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)(ii)の前に位置する、細胞。 - (a)(aa) 5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) AAV2ゲノムの1700位から2287位まで伸長するAAV p40プロモーター;
(iii) (aa)(ii)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;および
(iv) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列
を含む核酸;
(ab) 5’~3’方向に、
(i) AAVp5プロモーターまたはAAVp5プロモーターとAAVp19プロモーターの組み合わせから選択されるプロモーター;および
(ii) (ab)(i)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列
を含む核酸;ならびに任意に
(b) 発現可能な形態で該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドをコードし、かつ任意に該1つまたは複数のヘルパーポリヌクレオチドを提供する1つ以上の核酸、ここで、該1つまたは複数のヘルパーポリペプチドおよび1つまたは複数のヘルパーポリヌクレオチドは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択されるウイルスから生じる、
を含むキットであって、該キットは、AAV cap遺伝子を含まず、
(i) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の環状核酸に含まれ、(ab)の核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)(ii)の前に位置する;または
(ii) (aa)および(ab)の核酸の配列は、単一の直鎖状核酸に含まれ、(ab)の核酸の配列は、5’~3’方向において、(aa)の核酸の配列内の(aa)(i)の後かつ(aa)(ii)の前に位置する、キット。 - (aa)および(ab)の該核酸は、細胞中に含まれ、該細胞は、AAV cap遺伝子を含まない、請求項4記載のキット。
- (i) (aa)および(ab)の両方の核酸の配列は、該細胞のゲノムDNAに含まれる、請求項3記載の細胞。
- 5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) AAVp5プロモーターまたはAAVp5プロモーターとAAVp19プロモーターの組み合わせから選択されるプロモーター;
(iii) (ii)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列;
(iv) AAV2ゲノムの1700位から2287位まで伸長するAAVp40プロモーター;
(v) (iv)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;ならびに
(vi) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列
を含む核酸を含む、
請求項3および6いずれか記載の細胞。 - (ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep78および/またはAAV Rep68ポリペプチドをコードし、好ましくは、(ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep52および/またはAAV Rep40ポリペプチドをさらにコードする、請求項3および6~7いずれか1項記載の細胞。
- AAVp40プロモーターが、AP1 -40、SP1 -50、GGT -70、およびMLTF -100部位を含む、請求項3および6~8いずれか1項記載の細胞。
- (i) (aa)および(ab)の両方の核酸の配列は、該細胞のゲノムDNAに含まれる、請求項4または5記載のキット。
- 5’~3’方向に、
(i) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列;
(ii) AAVp5プロモーターまたはAAVp5プロモーターとAAVp19プロモーターの組み合わせから選択されるプロモーター;
(iii) (ii)の該プロモーターの制御下にある少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列;
(iv) AAV2ゲノムの1700位から2287位まで伸長するAAVp40プロモーター;
(v) (iv)の該プロモーターの制御下にあるトランスジェニックコード配列;ならびに
(vi) アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)配列
を含む核酸を含む、
請求項4、5および10いずれか記載のキット。 - (ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep78および/またはAAV Rep68ポリペプチドをコードし、好ましくは、(ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep52および/またはAAV Rep40ポリペプチドをさらにコードする、請求項4、5および10~11いずれか1項記載のキット。
- (b)の核酸は、
(i)ヘルパーウイルス中に含まれる;または
(ii)該細胞は、(b)の該核酸をさらに含む、
請求項5および10いずれか1項記載のキット。 - (aa)および(ab)の該核酸は、細胞中に含まれ、該細胞は、AAV cap遺伝子を含まず、ここで、
(a)該細胞は容器(vessel)中に提供される;
(b)該細胞は、複数の場合において、マルチウェルプレートのウェル中に提供される;および/または
(c)該キットは、指示を含む使用説明書を含む、
請求項4、5および10~13いずれか1項記載のキット。 - AAVp40プロモーターが、AP1 -40、SP1 -50、GGT -70、およびMLTF -100部位を含む、請求項4、5および10~14いずれか1項記載のキット。
- (ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep78および/またはAAV Rep68ポリペプチドをコードし、好ましくは、(ab)(ii)の少なくとも1つのAAV rep遺伝子コード配列は、AAV Rep52および/またはAAV Rep40ポリペプチドをさらにコードする、請求項1および2いずれか記載のビリオン。
- AAVp40プロモーターが、AP1 -40、SP1 -50、GGT -70、およびMLTF -100部位を含む、請求項1、2および16いずれか1項記載のビリオン。
- アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択されるウイルスが、抗ウイルス剤により阻害されるかどうかを決定するインビトロ方法であって、該方法は、請求項4、5および10~15いずれか1項記載のキットまたは請求項1、2および16~17いずれか1項記載のビリオンを、該ウイルスを含む試料と接触させる工程を含み、該接触は、細胞内で(i)該抗ウイルス剤の存在下および(ii)その非存在下でもたらされ、ケース(i)に比べてケース(ii)において、該キットまたはビリオンのそれぞれに従って画定されるトランスジェニックコード配列の産物の量がより多いことは、該ウイルスが該剤により阻害されたことを示す、インビトロ方法。
- 請求項3および6~9いずれか1項に規定される細胞に、1つ以上のヘルパーポリペプチドをコードする、および、任意に、1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドを提供する1つ以上の核酸を導入する工程を含み、それにより、該トランスジェニックコード配列によりコードされる産物を発現し、該1つ以上のヘルパーポリペプチドおよび1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択されるウイルスから生じる、条件的遺伝子発現のためのインビトロ方法。
- 感染性ウイルスを検出および/または定量するインビトロ方法であって、該ウイルスは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択され、該方法は、請求項3および6~9いずれか1項に規定される細胞を、該感染性ウイルスを含むまたは含むと疑われる試料と接触させる工程を含み、該細胞に従って画定されるトランスジェニックコード配列の産物の存在および/または量は、該感染性ウイルスの存在および/または量を示す、インビトロ方法。
- ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する化合物を同定するためのインビトロ方法であって、該ウイルスは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択され、該方法は、
(a) 請求項3および6~9のいずれか1項に規定される細胞の集団の細胞に、1つ以上のヘルパーポリペプチドをコードする、および、任意に、1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドを提供する1つまたは複数の核酸を導入する工程、ここで、該1つ以上のヘルパーポリペプチドおよび1つ以上のヘルパーポリヌクレオチドは、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科から選択されるウイルスから生じる;
(b) 該導入の後に、工程(a)の細胞集団により発現される(aa)(iii)の該トランスジェニックコード配列によりコードされる産物の量を決定する工程;
(c) 請求項3および6~9のいずれか1項に規定される細胞の集団と、試験されるべき化合物を接触させる工程;
(d) 工程(c)の細胞集団の細胞に、工程(a)に規定される該1つまたは複数の核酸を導入する工程;
(e) 該導入の後に、工程(d)の細胞集団により発現される該トランスジェニックコード配列によりコードされる産物の量を決定する工程;
(f) 工程(b)で決定された該産物の量と工程(e)で決定された該産物の量を比較する工程
を含み、工程(b)で決定された産物に比べて工程(e)で決定された産物が少ないことは、試験された化合物が抗ウイルス活性を有することを示す、インビトロ方法。
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