CN115873987A - 检测腺相关病毒载体感染滴度的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明为检测腺相关病毒载体感染滴度的方法和试剂盒,涉及重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的检测方法,所述方法的特征在于:将重组腺相关病毒载体样品和携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒作为辅助病毒与对HSV1病毒及AAV病毒均敏感的细胞接触,培养细胞,通过针对重组腺相关病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列设计探针和引物实施定量PCR检测细胞中重组腺相关病毒载体样品经复制和增殖产生的AAV基因组DNA拷贝数,由此计算重组腺相关病毒载体样品的感染滴度。本发明还涉及用于实施本发明的重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的检测方法的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及病毒载体滴度的检测领域。具体而言,本发明涉及腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体的感染滴度的检测方法和试剂盒。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体无致病性,免疫原性低,安全性好,能转导种类众多的组织细胞,并能长期稳定地表达其携带的基因,这些特性使其十分适合于作为体内基因转移的工具。重组腺相关病毒载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗中得到了较为广泛的应用。
近年来,腺相关病毒载体用于体内基因转移的临床试验数量稳步增加,对AAV载体基因药物进行AAV载体的含量测定是质量控制的一个指标。AAV载体基因药物的含量测定以滴度为检测指标,通常分为物理滴度和感染滴度。
物理滴度是对病毒载体基因组(vector genomes,vg)进行定量获得的值。大多数AAV载体制品中除完整的病毒颗粒外,还包含空衣壳、有缺陷的干扰突变体和其他无感染活性的颗粒,这部分无效的病毒颗粒在物理滴度检测中很难区分,因此测定物理滴度无法准确地获得AAV载体基因药物具有感染活性的病毒量。感染滴度的检测是AAV载体基因药物的一个重要检测指标。
由于AAV载体为复制缺陷型病毒载体,在细胞内的复制需要辅助病毒或者提供辅助功能的多个辅助因子的存在,所述辅助病毒如腺病毒(Adenovirus)、疱疹病毒(HSV)等。AAV载体对某些体外细胞的敏感性很差,不同血清型的AAV载体对不同细胞的敏感性有很大差异,且用AAV载体感染细胞后不形成噬斑和其他病变形态,无法用噬斑法测定AAV载体的感染滴度,因此常规的病毒滴度测定方法无法应用于AAV载体感染滴度的检测。
现有技术中公开的AAV载体感染滴度测定方法包括“感染中心测定法(Infectiouscenter assay,ICA)(McLaughlin SK等人,(1988).Adeno-associated virus generaltransduction vectors:Analysis of proviral structures.J.Virol.62,1963-1973)。在该方法中,将梯度稀释的AAV载体和野生型腺病毒共同感染携带AAV的rep-cap基因的重组HeLa细胞株,培养一定时间后,将细胞转移到膜上,用32P标记的载体基因组探针进行原位杂交,通过对杂交阳性细胞的计数得到AAV病毒载体的感染滴度。感染中心测定法的主要缺点是,需要对单个杂交阳性细胞逐一计数,这会产生较大的误差,另外,细胞转膜杂交技术的稳定性较差。
现有技术中还有基于在辅助病毒共感染细胞的情况下,用AAV病毒载体的连续稀释液感染96孔板中的细胞检测AAV病毒载体感染滴度的方法。例如,将HeLa衍生的AAV2Rep/Cap表达细胞系D7-4接种于96孔板中,并在Ad5(5型腺病毒)存在下用AAV2病毒载体的10倍系列稀释液感染所述D7-4细胞。感染后48小时,通过定量PCR(qPCR)确定载体基因组的复制,并通过方法计算感染滴度(ZHU ZHEN等人,Infectious Titer AssayforAdeno-Associated Virus Vectors with Sensitivity Sufficient to Detect SingleInfectious Events,HUMAN GENE THERAPY15:709-715(July2004))。由于不同血清型AAV病毒载体对细胞敏感性不同,因此对于HeLa细胞不敏感的AAV血清型,需要重新构建表达Rep/Cap的敏感细胞系才能够使用该方法。
曹晖等(CN101386891A)以携带AAV2的Rep/Cap基因的重组人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type1,HSV1)作为辅助病毒,将该辅助病毒和待测滴度的AAV2载体样品共同感染BHK-21细胞,通过对AAV2载体样品进行梯度稀释,并通过核酸探针杂交显色,得到AAV2载体样品的感染滴度。该方法以携带AAV的Rep/Cap基因的重组人HSV1(在本文中也将该辅助病毒简称为“HSV1-rc”)替代ZHU ZHEN等人的Ad5,但遗憾的是斑点印迹杂交不够灵敏,且需要阳性对照作为参照,仅能对AAV病毒载体的感染滴度进行相对定量。该检测方法不够准确和灵敏,无法检测出AAV载体的单个感染事件,只能通过与AAV载体标准品比较,获得待测样品的相对感染滴度。
本领域仍需开发一种可以准确、灵敏地测定不同血清型AAV病毒载体制品中感染性AAV颗粒浓度的方法。
发明概述
本发明人通过研究,开发了一种确定重组腺相关病毒(AAV)感染滴度的高灵敏度检测方法。该方法能够通过qPCR检测AAV病毒的单个感染事件,利用法计算TCID50值从而对AAV病毒进行绝对定量,而不是仅仅对AAV病毒进行相对的感染性度量。
因此,在第一方面,本发明提供了一种重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的检测方法,包括如下步骤:
(1)对重组腺相关病毒载体样品进行倍比系列稀释,例如,进行10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍系列稀释;
(2)将步骤(1)的经倍比系列稀释的各浓度重组腺相关病毒载体样品和辅助病毒(例如,所述辅助病毒是携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒)与对辅助病毒及AAV载体均敏感的细胞接触,所述细胞例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞,对每个AAV病毒载体样品浓度设置多个细胞复孔,例如设置6-12个,例如10个复孔并培养,例如培养48~72h;设置不含AAV病毒载体样品的稀释液作为阴性对照;
(3)培养结束后,每孔加入细胞裂解液裂解细胞,制备DNA模板;
(4)针对AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列,例如,针对各血清型AAV共有的AAV ITR序列或针对特定的目的基因序列(例如,用于疾病治疗的目的基因序列),设计探针和引物实施定量PCR(qPCR),检测细胞中AAV病毒载体样品经复制和增殖产生的AAV基因组拷贝数;
在一个实施方案中,本发明方法中的重组腺相关病毒载体样品是共有AAV ITR(例如,AAV2 ITR)的多种不同血清型的AAV病毒载体样品,例如,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ载体样品。
在一个实施方案中,本发明方法中的辅助病毒是HSV1-rc/ΔUL2。
在一个实施方案中,本发明方法中的包含辅助病毒的溶液是包含辅助病毒的各种培养基,例如,所述培养基是包含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基、包含10%胎牛血清的DMEM培养基(也称为DMEM完全培养基),且使用辅助病毒以最终每孔MOI=5~10感染细胞。
在一个实施方案中,将本发明方法中的重组腺相关病毒载体样品的稀释倍数设置为:使最终至少有一个AAV病毒载体样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阳性孔,且至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阴性孔。
在一个实施方案中,本发明方法中的步骤(3)的细胞裂解液包含Tween20和蛋白酶K,例如,所述细胞裂解液为:0.05%Tween201mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
在一个实施方案中,本发明方法中的步骤(3)的细胞裂解是如下实施的:37℃放置1-3h,例如2h;50-60℃(例如55℃)放置0.5-1.5h,例如1h;95℃放置20-40分钟,例如,30分钟。
在一个实施方案中,本发明方法中的步骤(4)还使用例如AAV病毒载体基因组DNA、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体作为qPCR时的标准品,根据标准品Ct值绘制标准曲线,计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Eff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效。所述作为qPCR时的标准品的AAV病毒载体基因组DNA、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体是不同于待检AAV病毒载体样品的、具有已知AAV病毒载体基因组DNA含量的标准品。
优选地,记录每个稀释度的阳性孔比率,当满足条件:
a.标准品Ct值的标准曲线R2≥0.99,90%≤Eff%≤110%;
b.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阳性孔;
c.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阴性孔,
则,实验结果可靠,进一步计算TCID50作为感染滴度。
感染滴度的计算公式为:感染滴度T=101+d(s-0.5)/V,
其中d为log稀释倍比(例如,当10倍比稀释AAV病毒载体样品时,d=1);
s为初始稀释度的对数与各测试稀释度的阳性孔比例之和;
V是经稀释AAV病毒载体样品的接种体积(mL);
优选地,所测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约100%、小于约50%、小于约40%或小于约30%,更优选地,所测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约20%、10%。
在第二方面,本发明提供了一种用于检测重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的试剂盒,其包含:
(1)携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒,例如HSV1-rc/ΔUL2;
(2)靶向AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列(例如,各血清型AAV共有的AAV ITR序列或特定的目的基因序列)的引物和探针序列,例如,SEQ ID NO:5-6的引物序列和SEQ ID NO:7的探针序列;
(3)qPCR标准品,例如,AAV病毒载体基因组DNA(例如,各血清型AAV病毒载体基因组DNA)、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体,用于根据标准品Ct值绘制标准曲线,计算机计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Efff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效;所述AAV病毒载体基因组DNA、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体是不同于待检AAV病毒载体样品的、具有已知AAV病毒载体基因组DNA含量的标准品。
在一个实施方案中,本发明的用于检测重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的试剂盒还包含:
(4)HSV1及AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞;
(5)任选地,细胞裂解液,例如,细胞裂解液包含Tween20和蛋白酶K,例如,所述细胞裂解液为0.05%Tween201mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
发明的效果
本发明具有如下方面的有益技术效果:
(i)本发明利用有限稀释法进行AAV感染滴度检测,本发明的方法能够检测AAV的单个感染事件,因此可以提供绝对的AAV载体感染活性定量,且利用qPCR的本发明的检测方法相较于现有技术中的DNA探针杂交方法重复性更好,精确度更高,灵敏度更高,可直接定量样品感染性滴度,不需要与阳性对照比较计算结果,且操作上更加方便快捷。
(ii)本发明筛选出了对多种血清型的AAV病毒载体均敏感的多株细胞系。当采用以各AAV病毒载体共有的AAV2 ITR为靶点设计的特异性引物和探针进行qPCR检测时,本发明的检测方法适用于含有AAV2 ITR结构的各种血清型AAV载体,与以AAV载体中的特定目的基因(例如,用于疾病治疗的目的基因)为模板设计引物和探针序列的方法相比,本发明方法的通用性大大提高。
(iii)本发明方法中的辅助病毒为携带Rep、Cap的HSV1-rc,这使被AAV病毒载体样品感染的细胞系不需要被改造来表达AAV包装所需的Rep、Cap蛋白,因此本发明的方法除了能够利用例如HEK293细胞检测对该细胞敏感的各AAV血清型的病毒滴度之外,还能够利用其他任意对AAV相应血清型敏感的细胞系进行AAV病毒滴度检测,这进一步提高了本发明方法的通用性。
(iv)本发明的方法用携带rep、cap基因的辅助病毒HSV1-rc取代现有技术中使用的野生型腺病毒(AdV),且由于辅助病毒HSV1-rc本身携带rep、cap基因而无需制备携带rep、cap基因的重组Hela细胞株,进一步地,辅助病毒携带的rep、cap基因会随着辅助病毒的迅速大量复制而复制,因此,它们的表达量理论上远高于现有技术的重组细胞中整合在细胞基因组中的rep、cap表达量,这使得待测AAV病毒载体样品的扩增数量有大幅提高,从而提高了本发明方法的检测灵敏度。
附图简述
结合以下附图一起阅读时,将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的,图中显示了目前优选的实施方案。然而,应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1显示了辅助病毒HSV1-rc基因组上的rep基因和cap基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图,其中泳道M:分子量标志物;泳道1:HSV1-rc rep基因的PCR扩增片段;泳道3:HSV1-rc cap基因的PCR扩增片段;泳道2和4:PCR时使用H2O的阴性对照。
图2显示了“材料和方法”中的重组AAV载体样品AAV1-EGFP、AAVDJ-EGFP感染HEK-293细胞时的EGFP表达。
图3显示了重组AAV9-EGFP病毒载体样品感染HEK-293细胞时,将辅助病毒HSV1-rc分别以MOI=2.5、5或10接种时获得的绿色荧光蛋白的表达。
发明详述
除非另外限定,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外,本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书,将使用以下定义,并且只要适当,以单数形式使用的术语也可以包括复数,并且反之亦然。要理解,本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案,并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用,术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
术语“复制缺陷型”是指不能完全有效复制的病毒载体。复制缺陷型病毒是关于病毒基因组复制或病毒颗粒合成和组装必不可少的一种或多种功能的突变型或缺陷型。复制缺陷型病毒可以在表达所缺失基因产物的互补细胞系中繁殖。然而,在正常靶细胞中,复制缺陷型病毒可表达病毒基因产物,但不会复制形成感染性子代病毒颗粒。
术语“重组腺相关病毒载体”、“腺相关病毒载体”、“AAV载体”和“rAAV载体”在本文中可互换地使用,是人们随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解,将野生型AAV病毒改造成的一种高效的外源基因转移工具。病毒载体包含载体基因组和蛋白质衣壳。病毒载体衣壳可由领域内已知的任何AAV血清型提供,包括目前所鉴定的人和非人AAV血清型及有待鉴定的AAV血清型(参见:Choi VW等人2005,Schmidt等人2008)。病毒衣壳可与其他载体组分混合并匹配以形成杂交病毒载体,例如病毒载体的ITR和衣壳可来自不同的AAV血清型。在一个方面,ITR可来自AAV2血清型,而衣壳来自例如AAV2或AAV8血清型。另外,本领域技术人员应认识到,载体衣壳也可以是镶嵌型衣壳(例如:由来自不同血清型的衣壳蛋白质的混合物构成的衣壳)或甚至是嵌合衣壳(例如:含有用于产生标志物和/或改变组织向性的外来或不相关蛋白质序列的衣壳蛋白质)。
术语“载体基因组(vg)”是指包装在rAAV衣壳内形成rAAV载体的核酸序列。AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带待转运的外源基因表达框。AAV病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过其他外源质粒或辅助病毒等提供,由此降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。进一步地,AAV病毒本身不具有致病性,这使得AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs序列还能够使包装得到的重组腺相关病毒载体所携带基因组自我互补,形成双链,显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z等人,GeneTher.2003;10(26):2105-2111;McCarty DM等人,GeneTher.2003;10(26):2112-2118)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒,即所谓的双链AAV病毒。它不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV),即传统的AAV病毒。
scAAV病毒载体的包装容量更小,仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半,约为2.2kb-2.5kb,但感染细胞后转导效率更高。
如本文所用,术语“ITR”或“反向末端重复序列”是指存在于AAV和/或rAAV中的可以形成T形回文结构的核酸序列,其通常是完成AAV的裂解和潜伏生命周期所必需的。
如本文所用,术语“rep基因产物”和“Rep蛋白”可互换地使用。AAV的rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs和GAGY重复基序特异性结合,启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序和/或GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心,因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同,但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。
如本文所用,术语“cap基因产物”和“Cap蛋白”可互换地使用。AAV的cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中,VP3分子量最小,但数量最多,在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1∶1∶10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的;VP2协助VP3进入细胞核;VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
术语“感染复数(Multiplicity of infection;MOI)”的概念起源于噬菌体感染细菌的研究,最初是指每个细菌的平均噬菌体数。通过将添加的噬菌体数除以添加的细菌数来确定MOI。MOI给出的是每个细菌的平均噬菌体数量,每个细菌中的平均噬菌体数量可以是0.1、1、2、10等,具体数值取决于实验设计。现在,MOI广义地指感染时病毒数量和细胞数量的比值。例如,将1千万个病毒添加到1百万个细胞中,则MOI为10。
术语“空斑形成单位(plaque forming unit;PFU)”又称蚀斑形成单位,是计量病毒(或噬菌体)的一种单位,但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是:用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时,经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃,形成肉眼可见的空斑(噬菌体时可直接观察,病毒时则需借助于活体染色的方法)。在理论上,一个病毒体就可以形成一个空斑。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。空斑形成单位数或感染中心数通常就是指PFU的数值。
病毒滴度即病毒悬液的浓度,又称病毒的效价、毒力或毒价。感染滴度的单位一般表示为PFU/ml。但由于测定PFU往往重复性较差,因此近些年许多研究开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
半数组织培养物感染量(50%tissue culture infective does,TCID50)是指当实验材料是组织培养物(细胞)时,组织培养物(细胞)半数感染量。对于包含细胞的N个孔,用含有一个TCID50的病毒液去感染,有50%的包含细胞的孔(即,N/2个孔)被感染。
循环阈值(Ct)定义为这样的热循环数,在所述热循环数处的荧光信号超过背景的荧光信号,由此超过阈值而呈阳性。
II.本发明的测定腺相关病毒载体感染滴度的方法
用于生产包含重组腺相关病毒(rAAV)载体的基因药物的方法通常包括:从rAAV生产培养物中分离出rAAV载体颗粒;确定所述分离的rAAV载体颗粒的物理滴度(即,病毒载体的基因组滴度);使用本发明的方法确定所述分离的rAAV载体颗粒的感染性;以及配制所述分离的rAAV颗粒以产生基因药物。
在所述生产基因药物的方法中,除了确定分离的rAAV载体颗粒的物理滴度外,还确定了所述分离的rAAV载体颗粒的感染滴度。本领域技术人员公知,基因药物制剂在使用前的保存过程中,保存温度、保存期间的长短或者反复冻融等通常对物理滴度的影响较小,但是对有效感染细胞的病毒颗粒数量的影响往往较大。因此,有必要在使用前准确快速地检测rAAV载体颗粒的感染滴度。在一些实施方案中,用于生产包含重组腺相关病毒(rAAV)载体的基因药物的方法包括:从rAAV生产培养物中分离出rAAV载体颗粒;使用本发明的方法确定所述分离的rAAV载体颗粒的感染性;以及配制所述分离的rAAV颗粒以产生基因药物。
用于生产rAAV载体颗粒的rAAV生产培养物都需要:(1)合适的宿主细胞,包括例如人衍生的细胞系,诸如HeLa、A549或HEK293细胞以及它们的衍生物(例如,HEK293T细胞、HEK293F细胞);其他哺乳动物细胞系,诸如Vero;或昆虫衍生的细胞系诸如SF9(对使用杆状病毒生产系统而言);(2)合适的辅助病毒功能,由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒、或提供辅助功能的质粒构建体提供;(3)AAV rep和cap基因以及基因产物;(4)与AAVITR序列侧接的转基因(例如,治疗性转基因);以及(5)支持rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。本领域已知合适的培养基可用于生产rAAV载体,所述培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基,包括例如MEM培养基、DMEM培养基、Sf-900 II SFM培养基等。
本发明涉及一种通用的测定腺相关病毒载体感染滴度的方法,其特征在于:
-采用携带AAV的rep-cap基因的重组HSV1病毒作为辅助病毒(HSV1-rc),将辅助病毒HSV1-rc和梯度稀释的AAV载体样品共同感染HSV1及AAV载体敏感细胞,其中所述HSV1-rc提供AAV载体基因组在所述敏感细胞中复制和产生子代AAV载体所需要的Rep蛋白、Cap蛋白,由此发挥辅助病毒的作用;
在一个实施方案中,本发明的测定腺相关病毒载体感染滴度的方法包括如下步骤:
(1)将检测用细胞(例如:HSV1及AAV载体敏感细胞,包括但不限于BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞,等)接种至96孔板,37℃,5%CO2培养箱培养,例如过夜培养。
(2)将待检测的AAV病毒载体样品用预先配制好的含辅助病毒HSV1-rc的溶液进行倍比系列稀释,例如,进行10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍系列稀释;
(3)当步骤(1)中的细胞达到约75%汇片时,弃去96孔板中的细胞培养液,加入步骤(2)的100μL系列稀释的各浓度AAV病毒载体样品,每个浓度设置多个复孔,例如设置6-12个,例如10个复孔;另外,设置仅加入含辅助病毒的溶液作为阴性对照,其为不含AAV病毒载体样品的含辅助病毒的溶液,37℃,5%CO2培养。
(4)培养结束后,每孔加入细胞裂解液裂解。
(5)qPCR检测,使用具有已知AAV病毒载体基因组DNA含量的选自AAV病毒载体基因组DNA、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体的材料作为qPCR时的标准品,根据标准品Ct值绘制标准曲线,拟合线性回归方程,计算相关系数R2和扩增效率Efff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效。
在一个实施方案中,步骤(1)中检测用细胞为待检测血清型AAV病毒载体样品相应的敏感细胞。在一个实施方案中,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ检测细胞为HEK293细胞。
在一个实施方案中,步骤(2)中的含辅助病毒的溶液为含HSV1-rc的培养基,例如,所述培养基是包含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培养基,以最终每孔MOI=5~10使用HSV1-rc病毒感染细胞。
在一个实施方案中,步骤(2)中AAV载体样品的稀释倍数的设置应使最终至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阳性孔,且至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阴性孔。
在一个实施方案中,步骤(3)中AAV病毒载体样品感染后的细胞培养时间为48~72h。
在一个实施方案中,步骤(4)中细胞裂解液包含Tween20和蛋白酶K,例如,所述细胞裂解液为:0.05%Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
在一个实施方案中,如下实施步骤(4)中的细胞裂解:37℃放置1-3h,例如2h;50-60℃(例如55℃)放置0.5-1.5h,例如1h;95℃放置20-40分钟,例如,30分钟。
在一些实施方案中,步骤(5)中的qPCR检测用引物和探针为靶向AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列的探针和引物,例如,靶向各血清型AAV共有的AAV ITR序列或针对特定的目的基因序列的探针和引物。优选地,步骤(5)中的qPCR检测用引物和探针为靶向AAV ITR(例如,AAV2 ITR)的引物和探针序列,例如,SEQ ID NO:5-6的引物序列和SEQID NO:7的探针序列。
通过定量PCR(qPCR)使用特异性引物和探针确定AAV载体在每个细胞孔中的复制。在例如Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)上测量扩增循环阈值(Ct)。在一个实施方案中,来自阴性对照的10个复孔的平均Ct值用作评分阳性孔或阴性孔的基础。
优选地,记录每个稀释度的阳性孔比率,当满足条件:
a.标准品Ct值的标准曲线R2≥0.99,90%≤Eff%≤110%。
b.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阳性孔;
c.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阴性孔,
则,实验结果可靠,进一步计算TCID50作为感染滴度。
感染滴度的计算公式为:感染滴度T=101+d(s-0.5)/V,
其中d为log稀释倍比(例如,当10倍比稀释AAV病毒载体样品时,d=1);
s为初始稀释度的对数与各测试稀释度的阳性孔比例之和;
V是经稀释AAV病毒载体样品的接种体积(mL)。
在一些实施方案中,根据本发明的方法测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约100%、小于约50%、小于约40%或小于约30%。在一些实施方案中,根据本发明的方法测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约20%、10%。
III.本发明的试剂盒
本发明还提供了一种定量检测AAV感染滴度的试剂盒,其包含:
(1)携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒,例如HSV1-rc/AUL2(参见:伍志坚,吴小兵,侯云德,一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1[J].中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(001):74-76);
(2)靶向AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列(例如,各血清型AAV共有的AAV ITR序列或特定的目的基因序列)的引物和探针序列,例如,SEQ ID NO:5-6的引物序列和SEQ ID NO:7的探针序列;
(3)qPCR标准品,例如,AAV病毒载体基因组DNA(例如,各血清型AAV病毒载体基因组DNA)、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体,用于根据标准品Ct值绘制标准曲线,计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Efff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效。
在一个实施方案中,本发明的用于检测重组腺相关病毒载体的感染滴度的试剂盒还包含:
(4)HSV1及AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞;
(5)任选地,细胞裂解液,例如,0.05%Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
实施例
材料和方法
病毒
本说明书中使用的重组AAV病毒载体样品为AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP及AAVDJ-EGFP,其中,EGFP:增强型绿色荧光蛋白。
通过三质粒法制备所述重组AAV病毒载体样品。具体而言,AAV载体质粒(pAAV2neo-EGFP)、辅助质粒(pHelper)(AAV Helper Free System,AgilentTechnologies)和AAV 1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ血清型相应的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-RC)分别按照1∶1:1的摩尔比混匀后,采用PEI法转染悬浮的HEK293T细胞,转染48h后,收获细胞和培养上清,按照吴小兵等报道的AAV载体纯化方法进行纯化(Wu,X.等人,Anovel method for purification of recombinant adenoassociated virus vectors ona large scale.Chinese Science Bulletin,2001.46(6):p.485-488),获得重组AAV病毒载体样品AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP及AAVDJ-EGFP。
本发明中使用辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2。HSV1-rc/ΔUL2是吴小兵等将AAV2的Rep-Cap基因置于人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus typel,HSV1)基因组中,构成用于简便且大量生产rAAV病毒的全能辅助病毒(伍志坚,吴小兵,侯云德.一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1[J].中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(001):74-76.)。本发明中使用的HSV1-rc/ΔUL2毒株为吴小兵赠予。
细胞
本说明书中使用细胞Vero、Hela、HEK-293、HEK293T和BHK-21,来自美国ATCC细胞库。
试剂
细胞裂解液:0.05%Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
胎牛血清:购自ExCell bio,货号:FCS500。
Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(2×Conc.),购自TaKaRa,货号:RR390。
ROX Reference Dye II(50×Conc.):购自TaKaRa,货号:RR390A。
无RNase水:TaKaRa,货号:9012,使用时加入F68至终浓度为0.05%。
Pluronic F-68非离子表面活性剂(100×)(10%v/v)(简称F68):购自ThermoFisher,货号:24040032。
DNase I、10×DNase I缓冲液:购自TaKaRa,货号:2212。
20mM EDTA:实验室配制。
DNeasy Blood&Tissue试剂盒:购自QIAGEN,货号:69504
实施例1.辅助病毒HSV1-rc的扩增、鉴定和辅助病毒HSV1-rc的感染滴度检测
对数生长期的Vero细胞以2.5×106个细胞/ml接种于T 25培养瓶。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h后,将HSV1-rc/ΔUL2毒种以MOI=1感染Vero细胞,继续培养48h-72h后收取细胞和培养上清,反复冻融3次,离心,收取上清。阴离子交换层析法粗纯及浓缩,再用分子筛法进行精纯并分装,保存在-80℃冰箱。
按照病毒DNA提取试剂盒(DNeasy B1ood&Tissue试剂盒:购自QIAGEN,货号:69504)操作步骤提取上述经精纯并分装、保存的HSV1-rc/ΔUL2的DNA,分别采用rep引物和cap引物PCR扩增HSV1-rc/ΔUL2基因组上的rep基因和cap基因。PCR反应程序为94℃,45s变性;58℃,1 min退火;72℃,2.5min延伸,循环30次。用于扩增rep基因的上游引物为5’-ATGCCG GGG TTT TAC GAG ATT-3’(SEQ ID NO:1),下游引物为5’-TTG TTC AAA GAT GCA GTCATC-3’(SEQ ID NO:2);用于扩增Cap基因的上游引物为5’-ATG GCT GCC GAT GGT TATCTT-3’(SEQ ID NO:3),下游引物为5’-CAG ATT ACG AGT CAG GTA TCT-3’(SEQ ID NO:4)。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,其中,第1泳道在1500bp-2000bp之间有特异性条带,与rep基因大小相符;第3泳道在2000bp附近有特异性条带,与cap基因大小相符,表明所制备的辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2含有rep基因和cap基因。
参考张静等报道的噬斑法(张静,李伟华,陈顺英等,用蚀斑法进行麻疹疫苗的病毒滴定.微生物学免疫学进展,1999(01):37-40)在Vero细胞中测定经精纯并分装、保存的HSV1-rc/ΔUL2的感染滴度(PFU/mL),HSV1-rc/ΔUL2病毒稀释倍数为105-107,每个稀释度2个复孔,置于6孔板中,计数每孔的空斑个数,HSV1-rc/ΔUL2病毒的感染滴度计算公式为PFU/mL=空斑个数均值×对应稀释倍数。
当HSV1-rc/ΔUL2病毒稀释倍数为105和106时,计数的空斑数大于200;当HSV1-rc/ΔUL2病毒稀释倍数为107时,计数的空斑个数分别为58和64,由此,所制备的HSV1-rc/ΔUL2病毒感染滴度为6.10×108PFU/mL。
实施例2.用于检测AAV病毒载体感染滴度的细胞
由于不同细胞对不同血清型AAV病毒载体的敏感性不同,为提高检测结果的灵敏度,检测AAV载体的感染滴度时使用较敏感细胞是有利的。
选取“材料和方法”中的AAV血清型2、5、8和9且带有增强型绿色荧光蛋白基因的重组AAV病毒载体样品AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP以MOI=2×105vg/细胞分别感染Vero、HEK-293、Hela和BHK-21细胞。在72小时观察绿色荧光蛋白表达情况,筛选对各血清型AAV病毒载体的敏感细胞。
结果如表1所示,以上血清型AAV病毒载体样品均可感染这四种细胞。选择其中的HEK293细胞进行进一步的实验。
表1病毒载体样品AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP和AAV9-EGFP感染不同细胞后,表达绿色荧光蛋白的细胞比例
注:以上计数荧光比例均是在相同参数下拍照并计数而获得的。
同样地,使用“材料和方法”中的AAV血清型1和DJ且带有增强型绿色荧光蛋白基因的重组AAV病毒载体样品AAV1-EGFP、AAVDJ-EGFP测试了HEK293细胞对AAV1,AAVDJ血清型的敏感性。结果如图2所示,表明HEK293细胞对AAV1、AAVDJ血清型也具有很好的敏感性。
实施例3.确定辅助病毒HSV1-rc的最佳加入MOI
由表1和图2可见,HEK293细胞对AAV病毒载体样品AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP及AAVDJ-EGFP均具有敏感性。
在本实施例中,以AAV病毒载体样品AAV9-EGFP感染HEK-293细胞,旨在获得使用辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的情况下,加入HSV1-rc/ΔUL2的最佳MOI。
具体而言,将对数生长期的HEK-293细胞以1.0×104个细胞/孔接种96孔板,在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h后以MOI=2×105vg/细胞接种AAV9-EGFP病毒载体,并分别以MOI=2.5、5或10接种辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2,共三个实验组。继续培养72h后观察绿色荧光蛋白表达情况,当荧光细胞比例在0~25%、25~50%、50~75%或75~100%时,分别记作“+”,“++”,“+++”和“++++”。根据荧光细胞比例确定辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的最佳加入MOI值。
结果如图3所示,显示了对HEK293细胞接种AAV9-EGFP并以MOI=2.5、5或10分别接种辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2后,表达绿色荧光蛋白的HEK-293细胞比例分别为+,++和++,因此AAV9感染HEK-293细胞时,辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的适宜加入量为MOI=5~10。
实施例4.确定AAV病毒载体样品感染滴度的最佳检测时间
将HEK-293细胞接种至96孔板(接种量为1.0×104个细胞/孔),37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。
用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)配制含辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2(MOI=5)的稀释液,用该稀释液将AAV9-EGFP病毒载体样品10倍系列稀释,然后分别取100μL感染96孔板中的HEK-293细胞。于37℃,5%CO2培养箱中分别培养48小时、72小时,并在荧光显微镜下观察荧光强度,判断感染后培养的最佳时间。
对各稀释度的AAV9-EGFP载体样品,每个稀释度共设置10个复孔。NC表示阴性对照(negative control),为不含AAV9-EGFP载体样品的稀释液。
结果如表2所示,AAV9-EGFP病毒载体感染HEK-293细胞后48小时检测结果与感染HEK-293细胞后72小时检测结果无明显差异,因此AAV病毒载体样品感染滴度的最佳检测时间为AAV病毒载体样品感染HEK-293细胞后48小时~72小时。
表2AAV9病毒载体感染细胞48h、72h的检测结果
实施例5.AAV病毒载体样品的感染滴度测定
用“材料和方法”中的三质粒法制备了另一批次的AAV9-101病毒载体样品,物理滴度为2.75×1013vg/mL。通过本发明的下述方法检测了该AAV9病毒载体样品的感染滴度。
用含10%胎牛血清的DMEM培养基配制含辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2(MOI=5)的用于稀释AAV病毒载体样品的稀释液。使用该含辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的稀释液对本实施例的AAV9病毒载体样品进行10倍比系列稀释。
对数生长期的HEK-293细胞按照1.0×104个/孔接种于96孔板,在含10%胎牛血清的DMEM培养基(即,DMEM完全培养基)中培养HEK-293细胞24h。弃去96孔板中的细胞培养上清,每孔加入50μL上述含辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的各AAV9-EGFP病毒载体稀释样品,每个稀释度10个复孔。阴性对照孔加入50μL含辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2的DMEM完全培养基。
继续培养48h~72h后,每孔加入85μL细胞裂解液,37℃孵育1h,55℃孵育2h,95℃孵育0.5h获得DNA模板。
采用针对各血清型AAV载体基因组共有的AAV ITR设计探针和引物进行qPCR检测。
ITR-正向引物:5′-GGA ACC CCT AGT GAT GGA GTT-3′(SEQ ID NO:5),
ITR-反向引物:5′-CGG CCT CAG TGA GCGA-3′(SEQ ID NO:6),
ITR-探针:5′-FAM-CAC TCC CTC TCT GCG CGC TCG-BHQ-3′(SEQ ID NO:7)。
qPCR反应条件如下。维持阶段:95℃20sec;循环阶段(40个循环):95℃3sec;60℃30sec。获得在qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环阈值(Cycle Threshold,Ct)。使用AAV2病毒载体基因组DNA(其基因组DNA含量是已知的)作为qPCR时的标准品,根据标准品Ct值线性拟合标准曲线,计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Eff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,认为本次qPCR检测结果有效。
当检测孔的Ct值<阴性对照孔Ct平均值-3×SD时,记作阳性孔。
感染滴度的计算公式为:感染滴度T=101+d(s-0.5)/V,
其中,d为log稀释倍比(即10倍比稀释AAV病毒载体样品时,d=1);
s为阳性比例之和(从样品原液的第一个10倍稀释度算起,10个孔均为阳性记作1;
V是本实施例的AAV9-EGFP病毒载体稀释样品的接种体积(即V=0.05mL)。
计算结果如表3所示,其中阴性对照孔Ct平均值=33.767,标准偏差(SD)=0.308,由此计算的阳性孔Ct<32.843(即,33.767-3×0.308=32.843)。
本实施例的AAV9病毒载体样品的感染滴度T=1.59×109TCID50/mL。
表3qPCR检测AAV9病毒载体样品的Ct值之一
使用相同样品进行另外2次检测,检测结果分别如表4、表5所示:
表4qPCR检测AAV9病毒载体样品的Ct值之二
表5qPCR检测AAV9病毒载体样品的Ct值之三
计算3次检测T值得算数平均值(AVERAGE)为1.20E+09,标准偏差(STDEV)为3.41E+08,CV%值为28.47%。由此可知,对于同一批次的AAV病毒载体,使用本发明的方法足以灵敏地检测单个感染事件。
实施例6.评估对各血清型AAV病毒载体样品检测的可重复性
进一步验证了检测AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAVDJ病毒载体样品的感染滴度时本发明方法的可重复性。用“材料和方法”中的三质粒法制备了AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAVDJ-EGFP病毒载体样品,基因组滴度均为1×1014vg/mL。
所述病毒载体样品的感染滴度的检测方法同实施例5。三人同步地进行检测,检测结果分别见表6中的第一组、第二组和第三组。
由表6并结合表3-5可见,本发明的方法可以检测包括AAV9在内的多种AAV血清型病毒载体样品的感染滴度,CV%值均小于50%,结果重复性较好。
表6qPCR检测AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAVDJ感染性滴度
注:CV%=STDEV/AVERAGE*100%
实施例7与检测AAV载体感染滴度的点杂交检测方法的比较
以细胞敏感性最低的AAV9-EGFP病毒载体为例,平行地用点杂交方法和qPCR法检测基因组滴度为1×1014vg/mL的又一批次AAV9病毒载体样品的感染滴度。将待测样品分别采用点杂交检测方法和qPCR方法通过梯度稀释进行终点判定。
具体而言,将待测AAV9-EGFP病毒载体样品进行10倍系列稀释,取基因组滴度102~107vg/mL的AAV9-EGFP病毒载体分别感染96孔板中的HEK293细胞,每个稀释度10个复孔,同时用HSV1-rc/ΔUL2(MOI=5)感染,48小时后,裂解细胞、转膜、探针杂交并显色或如实施例5所述方法进行qPCR检测。用q-PCR方法重复检测2次、点杂交检测方法重复检测3次,获得如表7、8、9所示的检测结果。
表7qPCR检测AAV9-EGFP病毒载体样品的Ct值(第1组)
表8qPCR检测AAV9-EGFP病毒载体样品的Ct值(第2组)
*未检出Ct值,计算其他9组数据平均值。
表9AAV9-EGFP病毒载体样品的稀释终点
综合分析表9可见,AAV9-EGFP病毒载体稀释为病毒载体基因组105vg/mL时,利用qPCR方法检测,每组分别有7个、8个显色阳性孔,而利用点杂交方法检测在AAV9-EGFP病毒载体稀释为病毒载体基因组105vg/mL及以下时已无样品孔显色阳性,由此可以看出,利用点杂交检测方法判定阳性孔灵敏度低于qPCR方法。
综上,将点杂交的结果与本发明的检测方法的qPCR检测结果相比较,现有技术中的通过点杂交方法检测的AAV9病毒载体样品感染滴度灵敏度远不如qPCR法。使用该点杂交方法检测其他血清型AAV病毒载体也存在类似情况,因此,该点杂交方法的适用范围较小,对于生产过程中病毒滴度较低的中间过程样品并不适用。
以上描述了本发明的示例性实施方案,本领域技术人员应当理解的是,这些公开内容仅是示例性的,在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此,本发明不限于文中列举的具体实施方案。
Claims (11)
1.重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的检测方法,包括如下步骤:
(1)对重组腺相关病毒载体样品进行倍比系列稀释,例如,进行10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍系列稀释,并与包含辅助病毒的溶液混合,所述重组腺相关病毒载体样品下文中也称为AAV病毒载体样品;或者,
使用包含辅助病毒的溶液对重组腺相关病毒载体样品进行倍比系列稀释,例如,进行10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍系列稀释;
例如,所述辅助病毒是携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒,例如,HSV1-rc/ΔUL2;
(2)将步骤(1)的经倍比系列稀释的各浓度重组腺相关病毒载体样品和辅助病毒与对辅助病毒及AAV病毒均敏感的细胞接触,所述细胞例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞,对每个AAV病毒载体样品浓度设置多个细胞复孔,例如设置6-12个,例如10个复孔,并培养细胞,例如培养48~72h;设置不含AAV病毒载体样品的溶液作为阴性对照;
(3)培养结束后,每孔加入细胞裂解液裂解细胞,制备DNA模板;
(4)针对AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列,例如,针对各血清型AAV共有的AAV ITR序列或针对特定的目的基因序列,设计探针和引物实施定量PCR(qPCR),检测细胞中AAV病毒载体样品经复制和增殖产生的AAV基因组拷贝数;
(5)计算重组腺相关病毒载体样品的感染滴度。
2.重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的检测方法,包括如下步骤:
(1)对重组腺相关病毒载体样品进行倍比系列稀释,例如,进行10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍系列稀释;
(2)将步骤(1)的经倍比系列稀释的各浓度重组腺相关病毒载体样品与对辅助病毒及AAV病毒均敏感的细胞接触,所述细胞例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞,对每个AAV病毒载体样品浓度设置多个细胞复孔,例如设置6-12个,例如10个复孔;然后将所述细胞用包含辅助病毒的溶液感染、培养,例如培养48~72h;设置不含AAV病毒载体样品的稀释液作为阴性对照;或者
将对辅助病毒及AAV病毒均敏感的细胞用包含辅助病毒的溶液感染,所述细胞例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞;然后将步骤(1)的经倍比系列稀释的各浓度重组腺相关病毒载体样品与所述细胞接触,对每个AAV病毒载体样品浓度设置多个细胞复孔,例如设置6-12个,例如10个复孔,然后培养,例如培养48~72h;设置不含AAV病毒载体样品的稀释液作为阴性对照,
例如,所述辅助病毒是携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒,例如,HSV1-rc/ΔUL2;
(3)培养结束后,每孔加入细胞裂解液裂解细胞,制备DNA模板;
(4)针对AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列,例如,针对各血清型AAV共有的AAV ITR序列或针对特定的目的基因序列,设计探针和引物实施定量PCR(qPCR),检测细胞中AAV病毒载体样品经复制和增殖产生的AAV基因组拷贝数;
(5)计算重组腺相关病毒载体样品的感染滴度。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(4)中,还使用不同于待检AAV病毒载体样品的、具有已知AAV病毒载体基因组DNA含量的选自AAV病毒载体基因组DNA、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体的材料作为qPCR时的标准品,根据标准品Ct值绘制标准曲线,计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Eff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,重组腺相关病毒载体样品是不同血清型的AAV病毒载体样品,例如,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ病毒载体样品。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,包含辅助病毒的溶液是包含辅助病毒的培养基,例如,所述培养基是包含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培养基,且使用辅助病毒以最终每孔MOI=5~10感染细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,将重组腺相关病毒载体样品的稀释倍数设置为:使最终至少有一个AAV病毒载体样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阳性孔,且至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)的Ct值均为阴性孔。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中,步骤(3)中细胞裂解液包含Tween20和蛋白酶K,例如,所述细胞裂解液为:0.05%Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125uL加入纯水5.675mL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,步骤(3)中的细胞裂解是如下实施的:37℃放置1-3h,例如2h;50-60℃(例如55℃)放置0.5-1.5h,例如1h;95℃放置20-40分钟,例如,30分钟。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中,步骤(5)中感染滴度的计算方法为:
优选地,记录每个稀释度的阳性孔比率,当满足条件:
a.标准品Ct值的标准曲线R2≥0.99,90%≤Eff%≤110%;
b.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阳性孔;
c.至少有一个样品稀释度的全部复孔(例如,10个复孔)均为阴性孔,
则进一步计算TCID50作为感染滴度;
其中,感染滴度的计算公式为:感染滴度T=101+d(s-05)/V,
其中d为log稀释倍比(例如,当10倍比稀释AAV病毒载体样品时,d=1);
s为初始稀释度的对数与各测试稀释度的阳性孔比例之和;
v是经稀释AAV病毒载体样品的接种体积(mL);
优选地,所测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约100%、小于约50%、小于约40%或小于约30%,更优选地,所测定的感染滴度的变异系数(cv)小于约20%、10%。
10.用于检测重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的试剂盒,其包含:
(1)携带AAV的rep基因和cap基因的重组HSV1病毒,例如HSV1-rc/ΔUL2;
(2)靶向AAV病毒载体样品的AAV病毒载体基因组DNA序列(例如,各血清型AAV共有的AAV ITR序列或特定的目的基因序列)的引物和探针序列,例如,SEQ ID NO:5-6的引物序列和SEQ ID NO:7的探针序列;
(3)具有已知AAV病毒载体基因组DNA含量的qPCR标准品,例如,AAV病毒载体基因组DNA(例如,各血清型AAV病毒载体基因组DNA)、含AAV病毒载体基因组DNA的质粒或AAV病毒载体,用于根据标准品的Ct值绘制标准曲线,计算标准曲线的相关系数R2和扩增效率Eff%,当R2≥0.99,且90%≤Eff%≤110%时,则通过qPCR检测AAV病毒载体样品的结果有效。
11.根据权利要求10所述的用于检测重组腺相关病毒载体样品的感染滴度的试剂盒,其还包含:
(4)HSV1及AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞;
(5)任选地,细胞裂解液,例如,细胞裂解液包含Tween20和蛋白酶K,例如,所述细胞裂解液为:0.05%Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
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