CN108884446A

CN108884446A - 基于aav的条件表达系统

Info

Publication number: CN108884446A
Application number: CN201780021155.5A
Authority: CN
Inventors: U·科西诺夫斯基; S·郎格尔; Z·鲁日齐; C·蒂里翁
Original assignee: West Lyon Biotechnology LLC
Current assignee: West Lyon Biotechnology LLC
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-30
Publication date: 2018-11-23
Also published as: JP7090548B2; AU2017213170A1; US20190032082A1; WO2017129822A1; IL260655B2; EP3408380A1; CA3012409A1; US11926841B2; US11155831B2; JP2022104952A; JP2019504628A; EP3408380B1; IL260655B; US20220073947A1; CN116948988A; IL260655A; AU2017213170B2

Abstract

本发明提供了一种细胞，其包含(aa)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)能够被(a)辅助多肽和任选的(b)辅助多核苷酸活化的启动子；和(iii)在(aa)(ii)的所述启动子控制下的转基因编码序列；以及(ab)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸活化的启动子；和(ii)在(ab)(i)的所述启动子控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；其中，所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

Description

基于AAV的条件表达系统

本发明涉及一种细胞，其包含(aa)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)能够被(a)辅助多肽和任选的(b)辅助多核苷酸活化的启动子；和(iii)在(aa)(ii)的所述启动子控制下的转基因编码序列；以及(ab)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸活化的启动子；和(ii)在(ab)(i)的所述启动子控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；其中，所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

在本说明书中引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文献公开的内容虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但在此通过引用整体并入本文。更具体地，所有参考文献均通过引用并入本文，引入的程度就像是每个文件都被特定且单独地指明。

功能相关基因的条件表达成为研究病毒复制、筛选抗病毒物质、检测临床相关病毒意图(intention)和病毒载体繁殖的重要分子生物学方法。标准条件基因表达系统需要要么施用特定药物(如用于基于TetR的系统的多西环素)，要么对基于Cre/loxP的系统的病毒基因组进行修饰(Rupp et al.,J.Virol.79,486-94(2005),Ruzsics Z,KoszinowskiUH.Mutagenesis of the cytomegalovirus genome,pp.41-61(2008))。

AAV是小的细小病毒，其作为Ad制剂中的一种污染物被发现(Atchison et al.,Science 149,754-756(1965))，并因此作为腺相关病毒被命名。作为细小病毒科的成员，AAV具有约5kb的单链DNA。当然，当细胞同时感染AAV和腺病毒时，也会发生AAV的裂解循环(Alazard-Dany et al.,PLoS Pathogens 5(2009),McCarty et al.,Annu Rev Genet,pp.819-45(2004),Myers et al.,J.Virol.35,65-75(1980))。AAV属于依赖病毒(Dependovirus)属。该属名的使用是因为单独的AAV感染不是裂解性的。在用AAV感染细胞后，病毒将其基因组递送到宿主细胞中，在那里它整合入细胞基因组并保持潜伏。为了启动AAV的裂解循环，需要用辅助病毒(例如腺病毒(Ad)或疱疹病毒)进行重叠感染。

AAV感染动物以及人类。主要从人体以及各种Ad血清型分离出的是AAV2、AAV3和AAV5。尚未发现AAV导致人类的任何疾病(Monahan&Samulski,Mol.Med.Today 6,433-440(2000))。

在治疗病毒感染过程中的决策以及新型抗病毒药物的开发需要强有力且可靠的手段和方法以确定某种病毒的存在以及其对已知或尚未确定的抗病毒药物的应答性。并且，对条件表达系统的需求是持续的。

本发明满足了这些需求，尤其是在腺病毒科和疱疹病毒科的病毒的领域。

相应地，本发明提供了一种细胞，其包含(aa)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)能够被(a)辅助多肽和任选的(b)辅助多核苷酸活化的启动子；和(iii)在(aa)(ii)的所述启动子控制下的转基因编码序列；以及(ab)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸活化的启动子；和(ii)在(ab)(i)的所述启动子控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；其中，所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

应理解，本发明还提供了一种包含(aa)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)能够被(a)辅助多肽和任选的(b)辅助多核苷酸活化的启动子；和(iii)在(aa)(ii)的所述启动子控制下的转基因编码序列；以及(ab)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸活化的启动子；和(ii)在(ab)(i)的所述启动子控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；其中，所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

所述细胞可以是体外细胞(in vitro cell)、离体细胞(ex vivo cell)、培养细胞或细胞系细胞。

从最广泛的意义上说，所述细胞可以是任何脊椎动物细胞。鉴于本申请集中在人和兽医学中的应用，应理解(如下文更详细的描述)，优选的细胞是源于哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物或人类的细胞。示例性细胞在实施例中显见。

术语“核酸”具有其本领域确定的含义，且指的是核苷酸的缩聚物。优先选择的所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸。虽然并不是优选的，但仍设想1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，或至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的核苷酸是核糖核苷酸和/或化学修饰的核苷酸，所述化学修饰的核苷酸优选在2'位置被修饰，例如2'-甲氧基或2'-氟。还设想了含有糖磷酸主链的替代物的核酸，包括肽核酸。

就碱基而言，碱基组优选限于A、G、C和T。在核酸的设计中，可考虑所述细胞的密码子使用和/或密码子偏好。

可通过瞬时转染将(aa)的核酸和/或(ab)的核酸引入所述细胞中。相对(aa)核酸和(ab)核酸中的一种或两种而言，所述细胞可以是稳定细胞系的细胞。

如从以上提供的(aa)核酸和(ab)核酸的各自定义显见的，已进行了腺相关病毒(AAV)基因组的结构元件的使用。

更详细地：反向末端重复(ITR)序列是AAV病毒的已知特征；参见，例如，Wangetal.,J.Mol.Biol.250,573-580(1995)。示例性ITR序列可在公众可获得的序列数据库的相应条目中找到。例如，AAV2的基因组序列可在GenBank参考序列NC_001401.2中找到。可使用2015年8月15日的GenBank版本209.0进行序列检索。在所提到的参考序列中，可在位置1-145和4535-4679处找到两个ITR。大小高达约5.2kb的核酸可被包装到AAV衣壳中，且其含有2个ITR。也可包装含有一个ITR的核酸。例如，对于AAV2，超过5.2kb的包装容量的核酸就是这种情况，依据Wu等人2010年的出版物(Wu et al.,Effect of genome size on AAVpackaging.Mol.Ther.(2010)18:80-86)，其可作为5'ITR截短的核酸被包装到AAV衣壳中。在这种情况下，被包装的核酸仅含有一个ITR。将载体DNA包装到预先形成的衣壳中的过程从3'ITR开始。

在核酸序列(aa)中需要有ITR序列的存在。在优选的实施方案中，ITR序列还存在于包含在(ab)核酸序列中的启动子的上游。

(aa)核酸和(ab)核酸中的任何一个都需要能够被辅助多肽和任选的辅助多核苷酸活化的启动子。如本领域已知的，转录起始于启动子，其需要与一种或多种蛋白质接触以保持活性，通常是多蛋白质复合物。在本申请中，优选在AAV中出现的启动子。下面进一步公开了优选的AAV启动子，且包括p40野生型启动子，这些启动子与AAV启动子相比具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性，并保留启动子活性；并且这些启动子与p40野生型启动子相比具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性，并保留启动子活性。无需再费周折就能评估启动子活性，例如通过进行实施例3公开的腺病毒诱导实验。术语“p40”和“p40启动子”包括以上定义的p40野生型启动子的同系物。下面进一步公开了p40的结构和功能细节。此类启动子以及与本发明一致的任何启动子应答于(i)AAV rep基因产物和(ii)一种或多种辅助多肽和任选的辅助多核苷酸。通常，所述的一种或多种辅助多肽与一种或多种rep蛋白一起组装形成多蛋白复合物，该多蛋白复合物使所述启动子具有活性。已经证明，人腺病毒的辅助功能可启动病毒复制，并进而识别ITR并活化来自人和非人物种的AAV病毒的启动子。例如，Xiao等人(Xiao et al.，J Virol.73:3994-4003(1999))对人类腺病毒5型用于猿猴AAV1的复制进行了描述。还可找到更多有关ITR识别和复制启始的信息，例如，Gavin等人的《病毒学杂志》73，9433-9445(1999)。特别地，启动子和rep基因可分别选自不同的AAV。

虽然这是来源于或衍生自腺相关病毒的启动子的典型运作方式，但应理解——根据本发明的定义——二者中的任一启动子均能够被一种或多种辅助多肽和任选的辅助多核苷酸(即也不存在任何rep基因产物)活化。因此，当利用本发明时，一开始的情况是不存在rep基因产物，一定水平的rep基因产物源自累积。由于rep基因产物的量随时间增加，两者中任一启动子的进一步活化导致转基因(aa)(iii)的扩增表达。

术语“辅助多肽”和“辅助多核苷酸”衍生自辅助病毒的概念。为了发生转基因编码序列的复制和转录，需要以反式提供某些辅助功能。这可以通过辅助病毒来完成，但并非必须如此。事实上，根据本发明，所述辅助功能可以以一种或多种多肽或以编码该一种或多种多肽的核酸的形式来提供，并且在适用的情况下，以一种或多种核酸提供所述辅助多核苷酸。所述辅助多肽和辅助多核苷酸可来源于或衍生自天然存在的病毒，例如腺相关病毒或选自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒。在最广泛的意义上，所述辅助多肽通过能够分别活化(aa)核酸和(ab)核酸中包含的启动子的需求而被功能性限定，并且优选地与由(ab)(ii)的AAV rep基因编码的rep蛋白结合。

因此，应理解优选与AAV启动子(即在AAV中存在的启动子)结合的辅助多肽。此外应理解，所述辅助多肽优选活化所述AAV启动子，即它们触发或增强发生自所述启动子的转录。在本领域中已知的是，来自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒的与启动子结合的多肽通常能够与AAV启动子结合并活化AAV启动子。在不确定的情况下，技术人员可以不费周折地在启动子结合测定或启动子活化测定中确定由腺病毒科或疱疹病毒科成员的基因编码的给定多肽是否能够结合和活化AAV启动子。

所述一种或多种辅助多肽和任选的辅助多核苷酸应理解为辅助病毒的最小形式。在一个优选的实施方案中，所述一种或多种辅助多肽是诱导腺相关病毒裂解复制所需的多肽。在另一优选的实施方案中，所述一种或多种辅助多肽和任选的辅助多核苷酸是辅助病毒的裂解循环产物。特别优选的辅助多肽组是(a)包含或是由腺病毒基因座E1、E2和E4编码的多肽组成或(b)包含或由腺病毒蛋白E1a、E1b-55K、E2a和E4orf6组成；参见Samulski&Shenk，J.Virol.62,206-210(1988)。优选的辅助多核苷酸是腺病毒VA。VA是一种RNA(参见Winter et al.，J.Virol.，86，5099-5109(2012)和Matsushita et al.，Journal ofGeneral Virology,85,2209-2214(2004))。辅助功能的优选来源是腺病毒5。另一优选的辅助多肽组是包含或由HSV-1蛋白UL5、UL8、UL52和UL29组成的组，前三者形成解旋酶/引发酶复合物，且后者编码单链DNA结合蛋白；另见Weindler&Heilbronn，J.Virol.65，2476-2483(1991)。这些辅助多肽的序列可以从例如GenBank的序列数据库中获得，尤其是本文提及的GenBank版本。通常，对产生辅助功能的病毒基因组序列进行了注释，且该基因组序列包含关于提供所述辅助功能的各个基因的序列的信息。例如，这适用于HSV-1和Ad5的基因组序列(如下文进一步所述)。

应理解，可使用功能性同系物替代这些特异性辅助多肽和多核苷酸。如上所述，功能性同系物分别与相应的亲本多肽或多核苷酸相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性。所述同系物保留其辅助功能，即触发上文所定义的转基因编码序列的转录的能力。优选地，所述触发转录的能力是亲本序列触发转录的能力的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

本领域技术人员可以毫不费力地确定所述多肽和多核苷酸(当适用时)的其他替代方案，该替代方案满足第一方面所述的功能要求。例如，在所述启动子控制下的蛋白质编码序列可与一种或多种辅助多肽结合，并且任选存在地还可与一种或多种rep基因产物结合。蛋白质产物量的增加表明所述启动子能够被一种或多种辅助多肽活化，任选地存在一种或多种rep蛋白。在所述启动子控制下的所述蛋白质可以是本发明第一方面意义上的转基因编码序列。

还可找到更多关于辅助功能的示例性信息，例如，McPherson et al.，Virology147，217-222(1985)。

根据本发明第一方面的细胞不是提供AAV颗粒的手段。而是符合新制备的结构蛋白VP1、VP2和VP3缺失的要求表达的。具体来说，所述细胞不包含cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。但是，可以想到的是，为了制备所述细胞，用AAV颗粒来影响转导。所述颗粒包含结构蛋白VP1、VP2和VP3；然而，所述颗粒和所获得的细胞都不能用来重新制备所述结构蛋白或任何cap基因产物。

令人惊讶的是，尽管不存在cap基因，但本发明的细胞提供了功能性条件表达系统。

根据第一方面的细胞是应答于一种或多种辅助多肽时用于表达转基因编码序列的手段。从下面公开的本发明的优选应用中显见的是，辅助多肽和辅助多核苷酸(当适用时)可由病毒提供，特别是与人类和兽医医学有关的病原性病毒。能够提供辅助功能的病毒的存在(即辅助多肽)将引起转基因编码序列的表达。转基因编码序列的翻译产物的存在和数量是确定辅助物的存在、数量和/或活性的手段。由于辅助物的量和/或活性可能受到抗病毒药物的存在的影响，因此抗病毒药物的存在和/或活性也可通过使用根据本发明第一方面的细胞来确定。

此类细胞在本文中也被称为“条件表达系统”，并且所述细胞中包含的核酸被称为“复制子载体”。条件表达系统的优点是它可以通过腺病毒感染和疱疹病毒感染活化。然而，条件表达系统与腺病毒或疱疹病毒基因组没有显示出任何同源性。这排除了复制子载体和目标病毒之间任何不期望的同源重组。例如，在Mohr等人，PLoS Pathog 8(6):e1002728.doi:10.1371/journal.ppat.1002728(2012)中对同源情况下可能出现的困难进行了描述。此外，条件表达系统在游离和整合状态下都表现良好；参见下面进一步公开的相应优选实施方案。条件表达系统的关键特征是其活化涉及(i)复制子载体的复制和(ii)转录以及转基因编码序列的翻译(当适用时)。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含(a)(aa)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)能够被辅助多肽和任选的(b)的辅助多核苷酸活化的启动子；(iii)在(aa)(ii)的所述启动子控制下的转基因编码序列；(ab)核酸，其在5'至3'方向包含：(i)能够被所述辅助多肽和任选的(b)的所述辅助多核苷酸活化的启动子；(ii)在(ab)(i)的所述启动子控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；和任选的(b)一个或多个以可表达形式编码所述辅助多肽并可选地提供所述辅助多核苷酸的核酸；其中，所述试剂盒既不包含AAV cap基因也不包含表达任何AAV cap基因产物的方法。

在其最广泛的定义中，根据本发明第二方面的试剂盒包含两种核酸：(aa)和(ab)(如涉及本发明第一方面中所定义的)。任选地，所述试剂盒包含一种或多种以可表达形式编码上述辅助多肽且在适用情况下提供所述辅助多核苷酸的核酸。因此，在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含三种不同类型的核酸：(aa)、(ab)和(b)。第一方面所需的细胞可包含在根据第二方面的试剂盒中，但不是必须的。

就所述试剂盒确实包含细胞而言，优选所述(aa)和(ab)的核酸包含在所述细胞中，其中所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。因此，其原因是以上关于第一方面所解释的那些：本发明并不旨在提供用于产生AAV颗粒的手段和方法。

优选地，所述细胞不包含AAV cap基因或用于编码VP1、VP2或VP3中的任何一种的核酸中的任何一种。就实际需要在根据第二方面的试剂盒上适用优选的实施方式，下面是其更详细的描述。

根据本发明第一和第二方面的优选转基因编码序列是那些在表达后产生转基因蛋白(优选产生可检测信号的转基因蛋白)的转基因编码序列。实例包括萤光素酶和本领域已知的其他报告基因(包括荧光报告分子，例如EGFP和RFP)。

在本发明任一方面的都特别优选的实施方案涉及编码荧光素酶的转基因编码序列，核酸(aa)中的启动子是AAV p40，核酸(ab)中的启动子是与p19启动子结合的AAV p5启动子。在备选方案中，p40可用于二者中的任一核酸。在那种情况下，分别优选可直接活化p40的辅助多肽或辅助病毒。

进一步优选的转基因包括荧光蛋白，例如GFP和转基因，所述转基因的基因产物可通过酶测定法检测(例如β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖醛酸酶(GUS)和碱性磷酸酶(AP))。

术语“来源于”是指物质组合物，特别是多肽或核酸，其与相应的天然来源中出现的相同。

术语“衍生自”从允许进行修饰的角度来讲具有更通用的含义，它允许进行修饰使得所述物质组合物与其天然产生的不同，而同时至少在相当大程度上保持其功能。在相当大程度上保持其功能优选是指保持至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80、至少90％的功能，或保持100％的功能或活性。

在根据第一方面的组和第二方面的试剂盒的优选实施方案中，(i)(aa)和(ab)的核酸序列包含在单个环状核酸中，其中优选地，(ab)的核酸序列位于(aa)的在5'至3'方向在(aa)(i)之后(aa)(ii)之前的核酸的序列中；(ii)(aa)和(ab)的核酸序列各自包含在不同的环状核酸中；(iii)(aa)和(ab)的核酸序列包含在单个线性核酸中，其中优选地，(ab)的核酸序列优选位于(aa)的在5'至3'方向在(aa)(i)之后(aa)(ii)之前的核酸的序列中；或(iv)(aa)和(ab)的核酸序列各自包含在不同的线性核酸中。

特别优选环状核酸，即选项(i)和(ii)。在这两个优选选项中，选项(i)即单个环状核酸是特别优选的。因为，除其他原因外，与环状DNA相比，通常宿主细胞对线性DNA的不良反应更强。

在另一个优选的实施方案中，(aa)和(ab)的核酸序列包含在单个线性核酸中，其中优选地，(ab)的核酸序列位于(aa)的在5'至3'方向在(aa)(i)之后(aa)(ii)之前的核酸的序列中；并且转基因编码序列(aa)(iii)之后是反向的腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列。

这种单一核酸优选包含在本发明的病毒粒子中。

环状核酸(例如选项(i)和(ii)的那些)具有特定的技术效果。特别地，环状核酸一旦出现在细胞中就会被细胞机制扩增。

另一方面，线性核酸，即根据选项(iii)和(iv)的线性核酸，能够被稳定整合到宿主细胞的基因组中。

无论哪种情况，优选本发明的核酸不编码rep和所述转基因编码序列的产物的融合蛋白。事实上，(aa)(i)和(aa)(ii)之间的具有序列(ab)的上述选项(i)的构型不编码融合蛋白。

在第一和第二方面的进一步优选的实施方案中，(i)(aa)和(ab)的核酸序列包含在所述细胞的基因组DNA中；或(ii)(ab)的核酸序列包含在所述细胞的基因组DNA中。

在另一个优选的实施方案中，(i)(aa)(ii)的启动子选自AAV启动子p40、p5、p19和来自病毒的天然编码所述辅助多肽的晚期启动子，优选AAV p40启动子；和/或(ii)(ab)(i)的启动子选自启动子p5、p19和p40，优选p5或p19，且更加优选p5和p19启动子的组合。所述晚期启动子的实例是腺病毒主要晚期启动子(MLP)、来自HCMV的UL94-启动子和来自HSV-1的UL16启动子。

类似于上文关于p40启动子的描述，本文使用的术语“p5”和“p19”接受其功能同源性。特别地，分别与p5和p19野生型启动子具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性并保留启动子活性的启动子是被接受的。

p5位于上述GenBank数据库条目中公开的AAV2基因组序列的190和310位置之间。可找到更多有关p5启动子的信息，例如，Chang et al.,J.Virol.63,3479-3488(1989)。如上述GenBank条目NC_001401.2所公开的，启动子p19和p40分别位于AAV2基因组序列的720至873和1700至1853位置。在McCarty,J.Virol.65,2936-2945(1991)中可找到更多关于两者中任一启动子的信息。

在一个优选的实施方案中，p40启动子包含延伸的rep-结合位点和/或从上述AAV2基因组的位置1700延伸至位置2287。位置1854至2287处包括5'UTR，其又包括小的内含子(位置1907至2227)。当需要完全和严格的调整时，优选存在5'UTR。

更详细地，并且不希望受特定理论的束缚，通过辅助多肽和辅助多核苷酸(例如VARNA)活化p40启动子包括p5和p19启动子的活化/脱阻抑，其又引起活化p40启动子rep蛋白表达。

两种优选的腺病毒辅助多肽的分子机制如下：

腺病毒E1a：将E1a:p300:YY1结合至p5启动子诱导YY1活化结构域的暴露并导致p5启动子的活化驱动rep表达，导致p19和p40启动子的活化。在抑制状态下，YY1转录因子与rep蛋白相接近，与p5rep结合元件相结合，这导致p5启动子的抑制。(Shi et al.,Cell.1991Oct 18；67(2):377-88.PMID:1655281)。

腺病毒E2a：腺相关病毒P5启动子和腺病毒E1a和E2a早期和主要晚期启动子通过表达的增加(6至27倍)来响应DNA结合蛋白。(Chang,and Shenk,J.Virol.(1990),64:2103-2109)。

优选的启动子元件如下。

p40启动子的调节和诱导涉及完整的p40启动子结构，并且优选地还包括p5和p19启动子的元件/序列。

p5启动子调节rep78及其可变剪接变体p68的表达。Rep78和Rep68能够结合线性DNA序列，该序列包含在靠近B和C回文的腺相关病毒(AAV)末端重复的A茎环25-bp序列内((McCarthy et al.,J.Virol.(1994),68:4988-4997)。p5启动子含有YY1的关键转录因子结合位点和MLTF的主要晚期转录因子的(参考Shi等人，1991)。ITR中的几个rep-结合元件(A-茎环rep结合位点)、p5和p19启动子分别对于调节在潜伏期间rep介导的p5启动子的抑制十分重要。反过来，在腺病毒辅助病毒存在下的产出性性生产期间，ITR中的rep蛋白结合位点、p5和p19启动子充当p19和p40启动子活性的反式激活因子(Pereira et al,J Virol.(1997),71:1079-88)。p5启动子内的Rep结合序列位于YY1起始序列和TATA结合位点之间(McCarthy等人，1994)。rep介导的p19启动子的活性主要受两个位点影响：SP1-50和CArG-140位点。p40启动子的Rep诱导依赖于SP1-50和TATA-30位点及先前提及的p19CArG-140位点(Ph.D.thesis by Daniel Francis Lackner；University of Florida DigitalCollections)。p19启动子包含几个位于转录起始位点上游的转录因子结合位点：SP1-50、GGT-110、SP1-130、cArG-140。已发现-50，-110和-130位点结合SP1，而-140位点结合SRE转录因子(Pereira and Muzyczka,J.Virol.(1997a),71:1747-1756)。p40启动子含有AP1-40、SP1-50、GGT-70和MLTF-100位点(Pereira and Muzyczka,J.Virol.(1997b),71:4300-4309)。

如上所述，p40启动子优选包含延伸的rep-结合位点，其增加了从AAV内含子的mRNA剪接。因此，本发明的构建体优选含有延伸至2248nt的全长p40启动子(Qiu andPintel,Mol Cell Biol.(2002),22:3639-52)。

衍生自AAV启动子的替代或合成启动子优选至少含有转录因子结合位点和rep结合位点，包括AAV内含子有效剪接所需的p40启动子近端位点。

在另一个优选实施方案中，至少一种(ab)(ii)的AAV rep基因编码序列编码AAVRep78和/或AAV Rep68多肽，其中优选地，至少一种(ab)(ii)的AAV rep基因编码序列进一步编码AAV Rep52和/或AAV Rep40多肽。

所述rep蛋白的GenBank条目(GenBank版本209.0)如下：YP_680422.1(Rep68)、YP_680423.1(Rep78)、YP_680424.1(Rep40)和YP_680425.1(Rep52)；还参见图1D和SEQ ID NO：6至9。rep蛋白在AAV复制中的作用在本领域中是众所周知的，例如，在Labow et al.,J.Virol.60,251-258(1986)；Hermonat et al.,J.Virol.51,329-339(1984)；Ni et al.,J.Virol.68,1128-1138(1994)；and Ryan et al.,J.Virol.70,1542-1553(1996)。可以理解的是可使用功能同源物代替上述定义的特异性rep蛋白。功能同源物与上述提及的特定序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性并且能够进行复制。优选地，复制活性至少为由上述特定序列定义的亲本蛋白质复制活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在本发明第一和第二方面的另一个优选实施方案中，现有情况下(b)的核酸包含在(i)辅助病毒中；或(ii)所述细胞还包含(b)的所述核酸。

如上所述，一种或多种辅助多肽是辅助病毒的最小形式。该优选实施方案的项目(i)引入了用辅助病毒作为提供所述辅助多肽的要求。辅助病毒可被功能性定义为能够感染根据本发明的细胞的病毒，并提供诱导根据本发明的复制子载体的复制及转基因编码序列转录的基因产物。辅助功能可由待检测或待表征的病毒提供；本发明的优选应用参见下面的进一步公开。

在另一个优选实施方案中，(aa)的核酸序列包含两个AAV反向末端重复序列，其中第二个反向末端重复序列位于(aa)(iii)的转基因序列之后并且为倒置方向。

在另外一个优选的实施方案中，所述辅助多肽和当适用时(b)的辅助多核苷酸源起于选自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。与该实施方案有关的特别优选病毒为腺病毒5(Ad5)、HSV-1、HSV-2和HCMV。这些病毒的基因组序列可在上述数据库中找到。例如，数据库条目AC_000008.1中的Ad5和数据库条目NC_001806.2中的HSV-1。

如上所述，在优选的实施方案中所述细胞为真核细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、灵长类动物细胞或人细胞。

在一个特别优选的实施方案中，所述辅助病毒是HCMV或所述一种或多种来源于或衍生自HCMV的辅助多肽，并且所述细胞是人包皮成纤维细胞(HFF)或MRC5细胞。

在另一个特别优选的实施方案中，所述辅助病毒是腺病毒，且所述细胞是293细胞。

在另一个特别优选的实施方案中，所述辅助病毒是HSV-1或HSV-2，且所述细胞是HFF细胞。

在另一个特别优选的实施方案中，所述辅助病毒是HSV-1或HSV-2，且所述细胞是239细胞。

在另一个特别优选的实施方案中，所述辅助病毒是HSV-1或HSV-2，且所述细胞是Vero细胞。

根据第二方面的试剂盒的特别优选的实施方案中，(a)所述细胞提供在容器中；(b)所述细胞在多孔板的孔中多次提供；(c)所述试剂盒包含含有说明的手册，优选地为如下将进一步公开的实施本发明的方法的说明。

在上述优选实施方案中描述的实施方案(b)涉及实现预先配置应用于高吞吐量的试剂盒。例如，包含在所述多孔板的孔中的细胞可在低温下(优选低于或低于-80℃)储存。在使用它们之前，从冷冻装置中取出细胞并解冻。可使用这种多孔板的设想的测定法包括向每个孔添加临床样品、孵育预定量的时间(例如两天)，以及可检测信号的后续检测，例如由荧光素酶产生的发光信号，如上所述，荧光素酶是优选的转基因编码序列。

类似地，同样根据实施方案(a)，其被设计用于非高吞吐量形式的单独测试，所述细胞可在低温下(优选低于或在-80℃下)提供或储存。

如在第一和第二方面定义的条件表达系统及其优选实施方案可获得大量的应用。应用包括以下其他方面的应用。

在第三方面，本发明提供了用于确定优选为致病性病毒和/或优选选自腺病毒和疱疹病毒的病毒是否被抗病毒药物抑制的方法，所述方法包括使第一方面的试剂盒与包含所述病毒的样品接触，其中所述接触在(i)所述抗病毒药物的存在下和(ii)当药物不存在时进行，其中在(ii)的情况下，根据分别由所述试剂盒或病毒粒子定义的更大量的转基因编码序列的产物表示所述病毒受到所述试剂的抑制。

进一步解释，事实证明某些致病病毒对抗病毒药物如阿昔洛韦的治疗具有抗性，而其他病毒则不然。出于差异诊断的目的，并且作为治疗决策的辅助，第三方面的方法可用以确定包含在给定样品中的病原性介质对给定的抗病毒药物(如阿昔洛韦)是否具有抗性。

在第三方面的优选实施方案中以及特别是存在阿昔洛韦的情况下，如果在20μg/ml阿昔洛韦存在下产生的转基因蛋白质的量或所述转基因蛋白质发出的信号分别为不存在阿昔洛韦时的量或信号强度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％，优选50％，则认为疱疹病毒科的成员是抗性的。在第三方面的更加优选的实施方案中以及特别是存在阿昔洛韦的情况下，如果在20μg/ml阿昔洛韦存在下产生的转基因蛋白质的量或所述转基因蛋白质发出的信号，分别为不存在阿昔洛韦时的量或信号强度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％优选至少30％，则认为疱疹病毒科的成员是抗性的。

在经修改的实施方案中，可使用候选抗病毒药物代替已建立的抗病毒治疗剂，从而提供鉴定和/或验证新型抗病毒药物的可用手段和方法。因此，与第三个方面相关的本发明提供了一种用于确定候选抗病毒药物是否针对病毒具有抗病毒活性的方法，所述病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科，所述方法包括使第一方面的试剂盒与所述病毒接触，其中所述接触在(i)所述候选抗病毒药物的存在下和(ii)其不存在时完成的，其中根据试剂盒定义的转基因编码序列的产物量在情况(ii)下较大表示所述候选抗病毒药物对所述病毒具有抗病毒活性。在该实施方案中，所述病毒优选是选自腺病毒科、疱疹病毒科或腺相关病毒的实验室病毒毒株。或者可使用临床分离物。与此相关的还有下面将要进一步公开的第五方面。

在第四方面，本发明提供了条件基因表达的方法，其包括向第一方面定义的细胞中引入一种或多种编码一种或多种辅助多肽的核酸，并任选地提供一种或多种如前述任一实施例中所定义的辅助多核苷酸，从而表达由所述转基因编码序列编码的产物。

所述引入可通过瞬时转染或稳定转染进行。而且，稳定转染可用于所述一种或多种核酸的第一子集。而瞬时转染可用于所述一种或多种核酸的第二子集。

在第五方面，本发明提供一种检测或量化感染性病毒的方法，所述病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科，所述方法包括使根据第一方面的细胞与包含或怀疑包含所述感染性病毒的样品接触，其中所述细胞定义的转基因编码序列使根据第一方面的细胞与包含或怀疑包含所述感染性病毒的样品接触，其中根据所述细胞定义的转基因编码序列的产物的存在和/或量表示所述感染性病毒的存在和/或量。

优选地，所述样品是取自个体(例如人)的样品。优选地，所述样品是组织样品，例如组织活检或体液。优选的体液包括支气管肺泡灌洗液(BAL)、疱疹水疱和其中所含的液体。

除了对选自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒进行检测和/或定量，第六方面的所述方法可类似地用于基于选自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒检测或定量复制型病毒载体的目的。

在第六方面，本发明提供了鉴定对病毒具有抗病毒活性的化合物的方法，所述病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科，所述方法包括以下步骤：(a)向如前述任一实施方案中所定义的细胞群中的细胞引入编码一种或多种辅助多肽的核酸，并任选地提供一种或多种如前述任一实施方案中所定义的辅助多核苷酸；(b)确定在所述导入后由步骤(a)的细胞群表达的(aa)(iii)的所述转基因编码序列编码的产物的量；(c)使前述任一实施方案中所定义的细胞群与待测化合物接触；(d)向步骤(c)的细胞群的细胞导入步骤(a)中定义的所述核酸；(e)确定在所述导入后由步骤(d)中的细胞群表达的所述转基因编码序列编码的产物的量；(f)将步骤(b)中测定的所述产物的量与步骤(e)中测定的所述产物的量进行比较，其中步骤(e)中测定的产物相对于步骤(b)中测定的产物的量较少，表明测试化合物具有抗病毒活性。

所述引入可通过瞬时转染或稳定转染进行。而且，稳定转染可用于所述一种或多种核酸的第一子集。以及瞬时转染可用于所述一种或多种核酸的第二子集。

在另一个方面，本发明还提供了病毒粒子，其包含核酸，所述核酸在5'至3'方向包含：(i)腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；(ii)至少一种能够被(a)辅助多肽和任选的(a)辅助多核苷酸活化的启动子，优选AAV启动子p5和AAV启动子p19；(iii)在(ii)的所述启动子的控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；(iv)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸活化的启动子；优选AAV启动子p40；(v)在(iv)的所述启动子的控制下的转基因编码序列；(vi)一个多聚腺苷酸化位点；以及(vii)腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；其中，所述病毒粒子不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

术语“病毒粒子”具有其本领域确定的含义并且涉及病毒颗粒。优选地，所述病毒颗粒在任何细胞外。通常，病毒粒子包含一个或多个被衣壳包围的核酸分子或由其组成，所述衣壳通常包含病毒编码的蛋白质或由其组成。

包含在所述病毒粒子中的核酸表现出上文关于本发明的细胞和本发明的试剂盒进一步公开的那些特征。在适用的范围内，本发明的细胞和试剂盒的优选实施方案限定了本发明的病毒粒子的优选实施方案。

在优选的实施方案中，所述病毒粒子由上文限定的核酸和所述衣壳蛋白组成。

编码衣壳蛋白的基因可以从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和rhAAV10获得。衣壳蛋白质可以是合成的并含有肽插入，或者可以通过DNA家族改组获得(含有来自不同AAV血清型的cap基因的混合)；参见例如，Michelfelder S,Varadi K,RauppC,Hunger A,Korbelin J,Pahrmann C,Schrepfer S,Muller OJ,Kleinschmidt JA,TrepelM.PLoS One.2011；6(8):e23101；MCiller OJ,Kaul F,Weitzman MD,Pasqualini R,ArapW,Kleinschmidt JA,Trepel M.Nat Biotechnol.2003Sep；21(9):1040-6；and Grimm D,Lee JS,Wang L,Desai T,Akache B,Storm TA,Kay MA.J Virol.2008Jun；82(12):5887-911。

优选的衣壳蛋白是VP1、VP2和VP3。

通常，衣壳蛋白由AAV的cap基因编码。需要注意的是，病毒粒子通常包含cap基因产物，然而，如上所定义并且与本发明的其他方面一致，本发明的病毒粒子不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

优选的衣壳蛋白是VP1、VP2和VP3。

本发明的病毒粒子优选是感染性病毒粒子。因此，它能够感染细胞，包括已经被另一种病毒感染的细胞，所述其他病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科。

关于包含在本发明的病毒粒子中的核酸的拓扑结构，优选线性核酸。特别优选的线性核酸显示在SEQ ID NO:10中。SEQ ID NO:10对应于SEQ ID NO:1的1至4854位。

本发明的病毒粒子是包含在所述病毒粒子中的核酸的优选运输载体。

至于本说明书表征的实施方案，特别是在权利要求中的那些，其旨在将从属权利要求中提到的每个实施方案与所述从属权利要求所引用的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1叙述3个备选方案A、B和C，从属权利要求2叙述了3个备选方案D、E和F以及从属于权利要求1和2的从属权利要求3叙述3个备选方案G、H和I的情况下，应理解，除非另有特别说明，该说明书明确地公开了对应于组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方案。

类似地，并且在独立权利要求和/或从属权利要求没有叙述替代方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求引用多个在先权利要求，则认为由此涵盖的主题的任何组合被明确公开。例如，在独立权利要求1，从属权利要求2引用权利要求1，并且从属权利要求3引用权利要求2和1的情况下，从属权利要求3和1的主题的组合与权利要求3、2和1的主题的组合一样，都是清楚且明确地公开的。在存在另一从属权利要求4其引用权利要求1至3中的任一项的情况下，权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合均清楚且明确地公开。

附图说明：

图1

A)本发明复制子的示意图。ITR，反向末端重复＝AAV ori；REP，rep基因＝AAV的非结构蛋白；GLuc，高斯荧光素酶ORF；HYG，潮霉素表达盒；pBR332，细菌载体)。

B)用于分析的基于AAV的复制子载体的实验设置。为了测试基于AAV的复制子，用AAV复制子载体(AAV-R)转染靶细胞。然后用待分析的病毒感染这些细胞(例如，具有复制能力的腺病毒(Ad))。在腺病毒(Ad)DNA复制开始后，Ad基因组扩增。伴随地，并且随着腺病毒蛋白质和RNA的表达(伴有腺病毒辅助功能)，AAV复制子载体被复制和扩增。然后诱导复制子编码的目的基因的表达，并在分泌后，可在细胞培养物上清液中检测蛋白质。

C)本发明优选的复制子载体的序列。

D)优选的rep蛋白的序列。

E)具有进一步注释的本发明复制子的示意图。

图2

A)在瞬时转染时腺病毒诱导的复制子应答。用pAV-GLuc-Hyg(GLuc)或pAV-GFP-Hyg(GFP)转染293A和U2OS细胞，并用MOI 100表达m-Cherry蛋白(ADChe)的AD5感染或空白处理(空白对照)。转导后24小时，测量荧光素酶活性并将值与相应的空白感染的细胞进行比较。以三个实验为代表。描述的是技术上一式三份(technical triplicate)的平均值和标准差。

B)腺病毒感染后诱导稳定细胞系的复制子应答。以MOI 100用ADChe感染AAV复制子阴性LE2A2和阳性LE2D8细胞系，并在72hpi下测量荧光素酶的诱导。将测量的荧光素酶活性值与相应的空白感染细胞进行比较。以四个实验为代表。描述的是技术上一式三份的平均值和标准差。

图3

A)HSV-1感染诱导的AAV复制子的荧光素酶表达。用AAV复制子载体转染293A细胞。以MOI 0.2、0.5和2用HSV1感染细胞，并在转染之后的72小时后，在24和48hpi测量上清液中的荧光素酶活性。将值与空白感染的细胞进行比较。描述的是技术上一式三份的平均值和标准差。

B)用HSV1感染含有复制子的稳定细胞系后的荧光素酶表达。以MOI 0.1、1和10用HSV1感染细胞系LE2D8。在12、24、36和48hpi测量上清液中的荧光素酶活性。将值与空白感染的细胞进行比较。描述的是技术上一式三份的平均值和标准差。

图4

A)AAV复制子的最佳诱导需要生产性的(productive)辅助病毒感染。用AAV复制子载体pAV-GLuc-Hyg转染293A和U2OS细胞，并以MOI为1、10和100用表达mCherry(ADChe)的第一代人腺病毒5型载体或野生型人腺病毒5型(AD5-WT)3dpt进行感染。在2dpi的上清液中测量荧光素酶活性与空白感染的细胞进行比较。描述的是一个代表性数据集的技术上一式三份的平均值和标准差。

B)AD5感染后复制子载体的扩增。从用AAV复制子载体转染的293A和U2OS纯化基因组及病毒DNA，并用ADChe转导。通过相对实时PCR确定每个单倍体基因组的GLuc的拷贝数。管家基因GADPH的扩增用于93A和U2OS细胞系的单倍体基因组数量的定量测定。描述的是一式两份样品的平均值和标准差。

C)HSV1感染后LE2D8细胞中AAV复制子载体的扩增。在24和48小时后，以MOI 0.1、1和10用HSV1感染的LE2D8细胞系纯化基因组和病毒DNA。通过半定量实时PCR确定每个单倍体基因组的GLuc的拷贝数。细胞的管家基因GADPH的扩增用于细胞系的单倍体基因组数量的定量。描述的是一式两份样品的平均值和标准差。

图5

A)用ACV敏感和ACV抗性的HSV1毒株感染ACV处理的LE2D8细胞。以MOI0.035用野生型HSV-1或ACV抗性HSV-1感染后，用不同浓度的ACV处理LE2D8细胞系，ACV浓度范围为0.05至144μg/ml。评估48hpi GLuc活性并与受感染的但未处理的细胞进行比较。以三个实验为代表。描述的是技术上一式三份的平均值和标准差。

B)通过终点稀释测定验证ACV敏感和ACV抗性HSV1毒株的抗性测试。以MOI0.035用野生型HSV1或ACV抗性HSV1感染后，用不同浓度的ACV处理LE2D8细胞系，ACV的浓度范围为1至96μg/ml。在7dpi计数感染并计算TCID50值。描述的是技术上两次重复实验的平均值和标准差。

图6

临床HSV2分离株对于基于AAV复制子的抗性试验的适用性。以MOI 0.035用敏感性的HSV2(A)或ACV抗性HSV2毒株(B)感染后，用不同浓度的ACV(0.8、4、20、100和500μM)处理LE2D8细胞系。评估48hpi GLuc活性。描述的是技术上一式三份的平均值和标准差。

图7

来自不同物种的人腺病毒诱导的复制子应答。用pAV-GLuc-Hyg转染293A细胞，并用表达m-Cherry蛋白(ADChe)的Ad5感染293A细胞作为对照，以及以MOI 1用几种不同的血清型：Ad12(种类A，A12)、Ad3和Ad11(种类B，B3和B11)、Ad9和Ad17(种类D，D9和D17)、Ad4(种类E，E4)感染293A细胞。感染后24小时，测量荧光素酶活性，并将该值与空白感染的细胞的荧光素酶活性进行比较。描述的是技术上一式三份的相对诱导值(倍数诱导)的平均值和标准差。

图8

已经转染的细胞的冷冻和预接种允许HSV-1感染诱导AAV复制子。用pAV-GLuc-Hyg转染293A细胞，冷冻并在转染后(A)24小时和(B)48小时后预接种到96孔板上。将转染的细胞解冻，并在解冻后4、6、20和26小时后以MOI 0.01、0.1和0.1用HSV-1进行感染。在48hpi测量GLuc活性。描述了受感染的细胞和空白感染的细胞之间荧光素酶活性的比例(诱导倍数)；显示了技术上一式三份的平均值和标准差。

图9

AAV复制子系统转导的诱导性。(A)用指定密度的rAAV复制子颗粒(pt/细胞)转导A549细胞，并以MOI 10用Ad5进行感染，6hpt(小时转导后)或保持空白感染。48hpi测量GLuc活性并与经转导但未受感染的细胞进行比较。值代表三次实验的平均值。(B)用rAAV转到Vero细胞，并在6hpt后以MOI 0、1用HSV-1或HSV-2感染Vero细胞。将24hpi和48hpi的上清液中的荧光素酶活性测量结果与空白感染的经转导的细胞进行比较。值代表三次实验的平均值。(C)rAAV复制子颗粒转导的HFF细胞以MOI 1用HCMV进行感染，6hpt，并且在第4天和第7天后收集Sp。测量p.i.荧光素酶活性，并将该值与空白感染的经转导的细胞的荧光素酶活性进行比较。值代表一次实验的平均值。误差棒显示与技术上一式三份的平均值的标准偏差。

通过实施例说明本发明：

实施例1

示例性复制子载体

为了测试AAV复制子系统的特征，我们构建了携带荧光素酶ORF作为标记基因的AAV复制子载体。这使我们能够在不同的实验环境中测试AAV复制子的诱导能力。我们使用pAV1质粒(ATCC#VR37215)作为AAV序列的来源。我们将AAV的独特识别位点XhoI和Apal之间替换成包含多个克隆位点和衍生自pTRE-Hyg(Invitrogen)的潮霉素抗性盒的合成寡核苷酸序列。XhoI位点位于AAV VP1ORF最开始的p40转录起始位点下游380nt处，且Apal位点位于右侧ITR(486nt上游)的前端cap编码序列的末端。在该中间体中，我们插入从pGLuc(NEB)PCR扩增的荧光素酶ORF。该构建体被称为pAV1-GLuc-Hyg(图1A和1C以及SEQ ID NO:1)。出于控制原因，我们还将绿色荧光蛋白(GFP)的ORF插入到扩增存在于pEGFP-N1(Clontech)中的ORF的相同位置。该对照构建体被称为pAV1-GFP-Hyg。

在本研究中，为了研究诱导型基因表达系统的基于AAV复制子的实验设置具有三个组成部分：靶细胞、具有目的基因表达盒的AAV复制子构建体和感兴趣的病毒。首先将复制子载体导入靶细胞，并然后用感兴趣的病毒感染携带靶细胞的复制子。如果感染的病毒可以诱导AAV复制(是AAV辅助病毒)，则病毒的复制周期将在靶细胞中进行。辅助病毒的裂解周期的产物将诱导AAV复制子载体的复制并激活目的基因的表达。在感染后的不同时间点分析转基因表达，并与携带靶细胞的未感染复制子的基因表达进行比较。

实施例2

通过基于AAV的复制子系统提供靶细胞：瞬时和稳定的转染子

我们使用两种不同的转染方案测试了AAV复制子载体的诱导型表达。首先，我们用携带报告基因的AAV复制子载体瞬时转染不同的细胞类型。这种方法使我们能够在不同的细胞系中测试我们的系统。在不同细胞中使用瞬时转染方案的优点是AAV复制子技术适用于在特定细胞系中复制的辅助病毒。该方法的缺点在于转染方案延长了测定时间，并且由于实验之间的转染效率不同，需要通过额外的管家标记标准化基因表达数据。因此，我们还生成了基于293A细胞的稳定细胞系，其携带AAV复制子的整合拷贝。为了产生稳定的细胞系，用pAV1-GLuc-Hyg转染人293A细胞(Invitrogen)并选择潮霉素抗性。稳定克隆通过在连续的潮霉素存在下的限制稀释法进行分离。在测试一组获得的克隆后，我们选择复制子阴性(LE2A2)和复制子阳性稳定克隆(LE2D8)，并用连续传代扩增它们。然后将这些基于293A的细胞系用于以下实验，在稳定转染的背景下测试AAV复制子技术。该方法提供了更短的测试时间和测试以测定重现性。该技术的缺点是基因表达水平预期低于使用瞬时系统获得的基因表达水平。

实施例3

使用不同病毒诱导复制子系统

3.1腺病毒诱导

为了测试AAV复制子载体是否应答于其最常用的辅助病毒，我们首先测试复制子对腺病毒(Ad)感染的应答。为此，我们用以下转染U2OS和293A细胞：作为占位DNA的1μgLitmus28、0.5μg pO6-CMVmChe，其组成性地表达作为管家标记基因的mCherry和遵循SuperFect转染试剂(Qiagen)转染方案的0.5μg特异性构建体。特异性构建体是表达荧光素酶的AAV复制子(pAV-GLuc-Hyg)和携带GFP表达框(pAV-GFP-Hyg)的对照复制子载体。转染后48小时，将转染的细胞以3.3×10⁴/孔的密度接种到96孔板中。之后每次均使用技术上一式三份，用表达mCherry(ADChe)的5型重组腺病毒以MOI(感染复数)100感染细胞。将表达mCherry标记基因的E1和E3缺失的第一代AD5载体用作一种互补依赖性腺病毒的模型。由于293A细胞能够反式补充，所述E1基因在这种缺陷病毒中缺失，因此这些细胞支持这种Ad的生产性病毒循环。然而，U2OS细胞不能补充第一代Ad载体的遗传缺陷。因此，在这些细胞中，只发生病毒进入和一些早期基因表达，DNA复制和生产性感染不能进行。

为分析荧光素酶基因表达的表达，我们使用Gaussia Luciferase Flex测定试剂盒测量20μl细胞培养物上清液中的荧光素酶活性，该细胞培养物直接取自于受感染的96孔板的测定孔。用以下参数调节照度计：注射50μl GLuc测定溶液，振荡2s，35-40s延迟和10s整合。记录每个样品的初始发光度，并将这些数值与转染的但未被感染的细胞的初始发光度数值进行比较。每次测量均技术上一式三份进行一次测量，且数据如图2A所示。如所预期的，用表达GFP的复制子载体转染的对照细胞在感染后没有显示出发光的差异，因为它们不表达荧光素酶。在用pAV1-GLuc-Hyg转染的U2OS细胞中观察到荧光素酶信号的中度增加，表明顿挫型Ad感染能够诱导一些衍生自AAV复制子的荧光素酶表达。然而，在293A细胞中，荧光素酶表达增加约100倍，表明生产性腺病毒感染能够强烈诱导基于AAV复制子的基因表达。

为了测试在稳定细胞系的情况下是否可以通过Ad感染诱导基于AAV的复制子，我们用ADChe以MOI 100感染LE2A2和LE2D8细胞系。如图2B所示，复制子阴性LE2A2细胞对Ad感染没有应答，但复制子阳性LE2D8细胞对Ad感染产生应答，针对Ad感染的荧光素酶表达增加超过30倍。

3.2通过单纯疱疹病毒感染诱导基于AAV的复制子载体

由于AAV也可通过疱疹病毒共感染而被重新激活，因此我们测试了AAV复制子载体对HSV-1感染的应答。为此，如前所述(2.1)用pAV1-GLuc-Hyg转染293A细胞，并在转染后第3天(dpt)以MOI 0.2、0.5和2进行HSV1感染。在该实验中使用的HSV1毒株是衍生自BAC的单纯性疱疹病毒1型(HSV1)实验室毒株(Nagel et al.J Virol.,82:3109-3124(2008))。感染后24小时和48小时(hpi)测量上清液中的荧光素酶活性，并与空白感染的细胞进行比较(图3A)。

在用HSV1感染后第一天，在所有样品中都可检测到来自AAV复制子的荧光素酶表达的诱导，以MOI 2感染的细胞产生最高值(50倍)。在感染后第2天，荧光素酶活性甚至更高，其值在320倍(MOI 0.2)和390倍(MOI 2)诱导之间。这些值是我们在本研究过程中测量到的最高诱导值。

为了测试，当稳定系统提供AAV复制子时，如果HSV1的复制子诱导同样存在，我们以MOI 0.1、1和10用HSV1感染细胞系LE2D8，并分别在12、24、36和48小时后收集上清液。评价荧光素酶表达并将该值与空白感染的细胞进行比较(图3B)。

以MOI 10感染后12小时，已检测到12倍的荧光素酶表达诱导。感染后24小时，荧光素酶诱导的病毒载量相关增长是明显的。以MOI 1感染后仅36小时，接收最大诱导，其值为120倍诱导。

令我们惊讶的是，我们可以得出结论，在瞬态和稳定系统的背景下，HSV1都是AAV复制子载体的最强诱导物。

3.3复制子复制涉及诱导基因表达的机制

接下来，我们想要测试最佳AAV复制子应答是否需要生产性的辅助病毒复制。为此，使用SuperFect作为转染试剂，用1.25μg Litmus28，0.5μg特异性DNA(pAV-GLuc-Hyg)和0.25μg管家标记基因转染293A和U2OS细胞。最后一个质粒是萤火虫荧光素酶的表达载体。我们将其作为转染对照(而不是上述实验中使用的mCherry表达质粒)引入测定中，以允许使用光度测定法在实验之间进行定量标准化。用ADChe载体和野生型5型Ad(AD5-WT)3dpt以MOI 1、10和100感染细胞。48小时后收集上清液，并以上文所述方法测量荧光素酶活性。整个实验重复3次，并ADChe诱导6次。

如图4A所示，在用增加剂量的ADChe感染复制子转染的293A细胞后，观察到荧光素酶表达的明显增加。在293A细胞中用野生型AD5感染也是如此。然而，在U2OS细胞中，仅观察到野生型AD5感染的相似增加。在用ADChe感染后，仅观察到中度诱导，其是剂量依赖性的。由于ADChe不能在缺乏E1基因的U2OS细胞中复制，而野生型AD5复制良好，这些数据表明AAV复制子应答由两个组分组成。可以在任何细胞中观察到的第一种，最可能基于Ad早期基因的亚组对AAV启动子的反式激活。第二种，更明显的效果似乎取决于生产性Ad感染。

为了确认生产性Ad感染确实诱导包括复制子载体扩增的AAV复制子机制，我们建立了半定量实时PCR以直接测量Ad感染时瞬时转染的pAV-GLuc-Hyg复制子载体的拷贝数的变化。

转染后三天，将2孔转染细胞接种到12孔板上，并以MOI 100用ADChe感染或进行空白处理。在第1天和第2天后收集细胞，并使用血液和组织试剂盒根据制造商的说明纯化细胞DNA。为了分析靶序列的复制效率，使用Green PCR Kit，通过Lightcycler系统进行GLuc定量PCR。使用重复的样品进行实时PCR反应。热循环条件为在95℃下15分钟，在95℃下15秒(变性)，在58℃下30秒(退火)和在70℃下30秒(延伸)的45个扩增循环。解链曲线分析在65℃下进行15秒，并最后在冷却阶段达到37℃。

我们使用引物GLucfor(GTGTAGGCCTCGGATCCAGCCACCATGGGAGTC；SEQ ID NO:2)和GLucrev(CCATAGAGCCCACCGCATCCCC；SEQ ID NO:3)扩增GLuc基因，和引物GADPH(TGGTATCGTGGAAGGACTCA；SEQ ID NO:4)和GAPDHrev(CCAGTAGAGGCAGGGATGAT；SEQ ID NO:5)用于扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的人管家基因，其存在于人细胞中每个单倍体基因组的一个拷贝中。每个单倍体基因组的拷贝数(拷贝数/HG/)根据以下公式在倍增达到线性相位(CT)的点确定：

拷贝数/HG/＝2^(CTh"CTI)。当HG是管家基因时，CTh是管家基因的CT值且CTI是GLuc扩增的CT值。使用每条扩增曲线的CT值计算GLuc特异性扩增的初级拷贝数，并对于GAPDH的拷贝数进行标准化。这容许对两天的GLuc拷贝数的相对定量(图4B)。

在空白感染的293A细胞中检测到55至78个GLuc拷贝，其来源于维持转染的复制子载体DNA。在ADChe感染后第1天，在293A细胞中检测到每个单倍体宿主基因组大约有300个复制子基因组，其在第2天增加至650个拷贝数。这些数据证实，在293A细胞中，生产性病毒感染确实诱导了AAV复制子载体的复制。相反，在ADChe不能复制的U2OS细胞中，每个单倍体基因组的复制子载体的拷贝数从第1天的170拷贝减少到第2天的130拷贝，与空白处理组类似(160至65拷贝)。第二天的相对拷贝数的这种减少可通在测定期间细胞分裂造成的细胞基因组拷贝的增加来解释。

为了在稳定转染的背景下测试AAV复制子载体的复制，我们在12孔板中用HSV1实验室毒株感染LE2D8细胞。如上文那样测量AAV复制子拷贝数的变化。

以MOI 0.1、1和10用HSV-1感染LE2D8细胞系或进行空白处理。在感染后24和48小时后纯化所有DNA。然后进行实时PCR，扩增细胞管家基因GAPDH和转基因编码序列GLuc。根据GLuc特异性扩增的初级拷贝数计算的CT值对GAPDH的CT值进行标准化。

两天的GLuc拷贝数的定量清楚地显示GLuc拷贝数对病毒载量的依赖性。以MOI0.1空白感染的和感染的细胞中，在第1天GLuc拷贝数在检测限附近。然而，在MOI 0.1时，在第2天在每个单倍体基因组可检测到6份GLuc拷贝。以MOI 1用HSV1感染的细胞中，在两天都检测到约30个GLuc拷贝；在MOI为10时，GLuc拷贝的进一步中度增加也是明显的(第1天39拷贝数和第2天42拷贝数)(图4C)。这些数据显示，在瞬时和稳定转染设定中，辅助病毒感染确实诱导了复制子载体的复制。

实施例4

基于AAV的复制子技术可用于测试临床病毒分离株的药物敏感性

考虑到复制子阳性细胞系LE2D8对HSV1复制应答的事实，我们建立了一种辨别药物敏感性和耐药性临床分离株的试验。阿昔洛韦(ACV)是用于治疗人类HSV1感染的最突出的药物。它是鸟苷类似物并抑制病毒DNA聚合酶，且因此ACV抑制HSV1复制。如果AAV复制子应答取决于HSV1复制，那么在存在ACV的情况下，系统应该对ACV敏感的HSV1毒株(在这种情况下不能复制)的感染和ACV抗性毒株(可以在这种情况下复制)的感染作出不同应答。

将细胞系LE2D8以3.3×10⁴细胞/孔的密度接种到96孔板上。接种后两小时，不处理细胞或用不同浓度的ACV(CAS：59277-89-3)(0.05至144μg/ml)处理细胞。处理后，以MOI为0.035，立即用野生型ACV敏感性HSV-1实验室毒株或ACV抗性毒株感染细胞。毒株由马克斯·冯·Pettenkofer研究机构(LMU Munich)的Gundula Jager博士友情提供。仅在感染后48小时，如先前实验测量20μl上清液中的荧光素酶活性。将ACV处理的细胞的荧光素酶活性与未经处理的细胞感染后获得的荧光素酶活性进行比较。将未经处理的细胞的荧光素酶诱导设定为100％，并将ACV处理的细胞的活性描述为未经处理的值的％(图5A)。

对于已经处于6-12μg/ml ACV浓度的实验室毒株，可观察到强烈的抑制作用，将未经处理的细胞的荧光素酶活性降低至20％。相反，衍生自抗性HSV1毒株诱导的AAV复制子的荧光素酶表达类似于未经处理的对照组，该现象表明ACV处理不能抑制病毒复制。

为了验证新建立的基于复制子的测定，我们进行了终点稀释测定，以监控在ACV处理的存在下产生的病毒的量。这种用于检测病毒生长的标准化测定非常灵敏但非常耗时，因为需要5-7天才能获得结果。为了在测定条件下用标准方法测试病毒产生，我们收集了包含敏感性的和ACV抗性的HSV-1的测定上清液，即以不同浓度的ACV(分别为1、6、12、48和96μg/ml)处理的经感染的LE2D8细胞的上清液。随后使用96孔板形式的HEK细胞进行终点稀释测定。在第7天收集感染性计数后计算组织培养感染剂量50(TCID50)(图5B)。这些数据证实ACV敏感性实验室毒株的病毒复制确实受到ACV处理的抑制，并且ACV在测定条件下不能抑制抗性HSV1毒株在LE2D8细胞上的复制。

下一步，我们对HSV2临床分离株分析了基于AAV复制子的抗药性测试的可用性。我们通过与弗莱堡的Universitatsklinikum Freiburg的临床诊断合作，测试了不同已知的和未知的HSV-2分离株。

为了测试单个HSV-2病毒分离株，在用0.8、4、20、100和500μM浓度的ACV处理及用1:10稀释的HSV-2分离物感染2小时之前，将LE2D8以3.3×10⁴细胞的密度接种到96孔板中，均使用技术上一式三份。感染48小时后，通过发光测定法测量上清液中的GLuc活性，并将值与如上所述的未经处理的和空白感染的细胞进行比较。在图6A和6B中，我们展示了由ACV敏感性的HSV-2和ACV抗性的HSV-2分离株之一诱导的复制子应答的实施例。

基于抗性测试的AAV复制子能够区分衍生自HSV感染患者的ACV敏感性的和ACV抗性的HSV-2病毒分离株。在图6A中，结果显示了敏感性毒株的典型模式，通过与未经处理的细胞相比，用20μM和更高浓度的ACV处理降低GLuc的活性量。相反，抗性HSV-2毒株的荧光素酶诱导模式是不同的。对于测试的ACV浓度，GLuc诱导从未降低至未经处理的值的50％以下。

用不同的Ad诱导基于AAV的复制子载体

根据其遗传学和生物学特征，包括人腺病毒在内的乳腺腺病毒分为六种(种类A-F)。AAV复制子系统被证明可被重组和野生型人腺病毒5型(Ad5)(一种C型腺病毒)很好地诱导。由于在临床实践中腺病毒分离株经常从除C以外的其他种类中发现(主要是种类B和D)，因此我们测试了代表其他种类的不同人腺病毒是否能够诱导出与我们观察到的Ad5相当的复制子应答。为此，按照FuGene HD转染试剂(Promega)的转染方案，用pAV1-GLuc-Hyg转染293A细胞，并在转染后3天进行感染。将细胞以3.3×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板上，并用以下人腺病毒血清型以MOI 1进行感染：Ad12(种类A)、Ad3和Ad11(种类B)、Ad9和Ad17(种类D)、Ad4(种类E)。使用重组腺病毒5型(ADChe)以MOI 1进行的感染作为对照。感染48小时后(hpi)测量上清液中的荧光素酶活性，并与相应的空白感染细胞进行比较(图7)。在用所有腺病毒血清型感染后，可观察到衍生自AAV-复制子的荧光素酶表达的诱导，产生16至58倍诱导值，与用ADChe的诱导相当(20倍)。这些数据表明，用衍生自不同种类的大范围的人腺病毒可以很好地诱导AAV-复制子应答。

实施例5

通过使用冻存转染的细胞感染诱导AAV复制子

可通过瞬时转染引入AAV复制子，或使用稳定的细胞系。如果应用瞬时转染，则测定可能需要3天及以上，因为必须在转染和感染之间等待以使细胞在转染后恢复。为了在瞬时转染中节省这72小时的测定时间，我们根据制造商的方案，使用FuGene用0.6μg pAV1-GLuc-Hyg和5μg Litmus 28填充DNA，在6孔板中转染2E+05 293A细胞。24和48小时后，将细胞重新悬浮在冷冻培养基(杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)，20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO))中，并以密度为3×10⁴个细胞/孔接种到96孔板上：密封平板，并然后在-80℃下快速冷冻。为了解冻平板，将150μl的生长培养基直接加入每个孔中，并将细胞在正常细胞培养条件下温育2小时。然后，除去上清液并向每个孔中加入100μl的生长培养基。解冻后的4、6、20和26小时，用HSV-1实验室毒株以MOI分别为0.01、0.1和1感染预转染的293A细胞。感染48小时后，如先前实验中那样，测量20μl上清液中荧光素酶活性。通过将HSV-1感染后的值与空白感染的细胞进行比较来计算荧光素酶活性的诱导(图8)。

在转染后12或48小时的冷冻96孔板中可观察到通过HSV-1感染诱导报告基因，与病毒颗粒的量无关。通常，感染平板后诱导更高，所述平板在转染后48小时冷冻。这里以MOI0.01的感染显示8倍荧光素酶诱导，而转染后24小时冷冻平板后荧光素酶诱导为3倍。通过在转染后48小时冷冻平板并且在解冻后28小时以MOI 1进行感染获得最高诱导(58倍)。

该数据显示AAV-复制子转染的细胞的冷冻和预接种是可能的且不影响它们对HSV-1感染的诱导能力。所描述的方法允许配置标准化产品，其可快速投入使用。

实施例6

含有AAV复制子基因的重组AAV2载体的诱导

由于我们希望克服基于某些细胞系中低转染效率的限制，我们研究了重组腺相关病毒(rAAV)作为潜在的复制子载体转导系统。为此，我们用质粒pDP2rs转染2,30E+08 HEK293TN细胞(Grimm,D.,M.A.Kay and J.A.Kleinschmidt(2003).“辅助无病毒，可光控和基于双质粒的血清型1至6的腺相关病毒载体的产生”分子疗法7(6):839-850)以生产AAV和根据制造商的方案使用PEI(Polyscience,PEI“Max”,MW40,000)构建本发明的被称作的pAV1-GLuc-Hyg。48小时后，通过三轮冷冻-解冻裂解经转染的细胞。释放的rAAV-Replicon颗粒经碘克沙醇密度离心纯化并浓缩(Zolotukhin,S.,B.J.Byrne,E.Mason,I.Zolotukhin,M.Potter,K.Chesnut,C.Summerford,R.J.Samulski and N.Muzyczka(1999).“使用新方法进行重组腺相关病毒纯化提高感染滴度和产率”基因治疗(六月第六期):973-985)。

为了测试rAAV复制子转基因表达的诱导能力，将重组病毒颗粒转导至A549细胞、Vero细胞和原代细胞系HFF中，在96孔板中使用不同量的每细胞的rAAV复制子颗粒(pt/细胞)。6小时后，转导的细胞系分别以MOI 10用Ad5进行感染、用HSV-1和HSV-2以MOI 0.1进行感染、用HCMV以MOI 1进行感染或保持空白感染。随后在感染后48小时后收集转导的经Ad感染的细胞的上清液，在感染24和48小时后收集经HSV-1和HSV-2感染的细胞，并在感染后4和7天后收集经HCMV感染的细胞。如先前实验一样，在20μl上清液中测量荧光素酶活性。通过比较转导及感染后和转导和空白感染的细胞的值来计算荧光素酶活性的诱导(图9)。

总之，转导的细胞和未转导的细胞之间的发光没有差异，表明了一个严格调节的系统。所有受试的病毒都可在用rAAV复制子颗粒转导后的细胞中诱导复制子应答。在Ad5、HSV-1和HSV-2感染的情况下，可观察到增加的取决于rAAV颗粒的量的信号诱导。在转导rAAV颗粒和Ad5感染后，测量到本研究过程中GLuc的最高诱导倍数(13.500倍)。对于HSV-1，可观察到复制子应答的类似增加，其显示其最大为2800倍的增加。此外，在HSV-2存在的情况下GLuc的诱导为215倍，且在HCMV存在的情况下，诱导值为215倍，这证实了通过重组AAV颗粒转导复制子系统的有用性。

序列表

<110> 西里昂生物技术有限责任公司

<120> 基于AAV的条件表达系统

<130> X3009 PCT

<150> EP 16 15 3329.4

<151> 2016-01-29

<160> 10

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 8977

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Conditional expression system

<400> 1

atcgataagc ttctagagat ctgggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 60

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 120

cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttcctggag gggtggagtc 180

gtgacgtgaa ttacgtcata gggttaggga ggtcctgtat tagaggtcac gtgagtgttt 240

tgcgacattt tgcgacacca tgtggtcacg ctgggtattt aagcccgagt gagcacgcag 300

ggtctccatt ttgaagcggg aggtttgaac gcgcagccgc catgccgggg ttttacgaga 360

ttgtgattaa ggtccccagc gaccttgacg ggcatctgcc cggcatttct gacagctttg 420

tgaactgggt ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga ttctgacatg gatctgaatc 480

tgattgagca ggcacccctg accgtggccg agaagctgca gcgcgacttt ctgacggaat 540

ggcgccgtgt gagtaaggcc ccggaggccc ttttctttgt gcaatttgag aagggagaga 600

gctacttcca catgcacgtg ctcgtggaaa ccaccggggt gaaatccatg gttttgggac 660

gtttcctgag tcagattcgc gaaaaactga ttcagagaat ttaccgcggg atcgagccga 720

ctttgccaaa ctggttcgcg gtcacaaaga ccagaaatgg cgccggaggc gggaacaagg 780

tggtggatga gtgctacatc cccaattact tgctccccaa aacccagcct gagctccagt 840

gggcgtggac taatatggaa cagtatttaa gcgcctgttt gaatctcacg gagcgtaaac 900

ggttggtggc gcagcatctg acgcacgtgt cgcagacgca ggagcagaac aaagagaatc 960

agaatcccaa ttctgatgcg ccggtgatca gatcaaaaac ttcagccagg tacatggagc 1020

tggtcgggtg gctcgtggac aaggggatta cctcggagaa gcagtggatc caggaggacc 1080

aggcctcata catctccttc aatgcggcct ccaactcgcg gtcccaaatc aaggctgcct 1140

tggacaatgc gggaaagatt atgagcctga ctaaaaccgc ccccgactac ctggtgggcc 1200

agcagcccgt ggaggacatt tccagcaatc ggatttataa aattttggaa ctaaacgggt 1260

acgatcccca atatgcggct tccgtctttc tgggatgggc cacgaaaaag ttcggcaaga 1320

ggaacaccat ctggctgttt gggcctgcaa ctaccgggaa gaccaacatc gcggaggcca 1380

tagcccacac tgtgcccttc tacgggtgcg taaactggac caatgagaac tttcccttca 1440

acgactgtgt cgacaagatg gtgatctggt gggaggaggg gaagatgacc gccaaggtcg 1500

tggagtcggc caaagccatt ctcggaggaa gcaaggtgcg cgtggaccag aaatgcaagt 1560

cctcggccca gatagacccg actcccgtga tcgtcacctc caacaccaac atgtgcgccg 1620

tgattgacgg gaactcaacg accttcgaac accagcagcc gttgcaagac cggatgttca 1680

aatttgaact cacccgccgt ctggatcatg actttgggaa ggtcaccaag caggaagtca 1740

aagacttttt ccggtgggca aaggatcacg tggttgaggt ggagcatgaa ttctacgtca 1800

aaaagggtgg agccaagaaa agacccgccc ccagtgacgc agatataagt gagcccaaac 1860

gggtgcgcga gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc ggaagcttcg atcaactacg 1920

cagacaggta ccaaaacaaa tgttctcgtc acgtgggcat gaatctgatg ctgtttccct 1980

gcagacaatg cgagagaatg aatcagaatt caaatatctg cttcactcac ggacagaaag 2040

actgtttaga gtgctttccc gtgtcagaat ctcaacccgt ttctgtcgtc aaaaaggcgt 2100

atcagaaact gtgctacatt catcatatca tgggaaaggt gccagacgct tgcactgcct 2160

gcgatctggt caatgtggat ttggatgact gcatctttga acaataaatg atttaaatca 2220

ggtatggctg ccgatggtta tcttccagat tggctcgagg acactctctc tgagctagct 2280

tcgtacggat cctcggatcc agccaccatg ggagtcaaag ttctgtttgc cctgatctgc 2340

atcgctgtgg ccgaggccaa gcccaccgag aacaacgaag acttcaacat cgtggccgtg 2400

gccagcaact tcgcgaccac ggatctcgat gctgaccgcg ggaagttgcc cggcaagaag 2460

ctgccgctgg aggtgctcaa agagatggaa gccaatgccc ggaaagctgg ctgcaccagg 2520

ggctgtctga tctgcctgtc ccacatcaag tgcacgccca agatgaagaa gttcatccca 2580

ggacgctgcc acacctacga aggcgacaaa gagtccgcac agggcggcat aggcgaggcg 2640

atcgtcgaca ttcctgagat tcctgggttc aaggacttgg agcccatgga gcagttcatc 2700

gcacaggtcg atctgtgtgt ggactgcaca actggctgcc tcaaagggct tgccaacgtg 2760

cagtgttctg acctgctcaa gaagtggctg ccgcaacgct gtgcgacctt tgccagcaag 2820

atccagggcc aggtggacaa gatcaagggg gccggtggtg actaagcggc cgcgtgtgga 2880

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 2940

accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 3000

aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 3060

agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 3120

gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 3180

ttttgcaaaa agcttccatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 3240

tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 3300

gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 3360

atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 3420

cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 3480

cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 3540

tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 3600

cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 3660

ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 3720

cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 3780

tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 3840

ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 3900

ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 3960

agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 4020

atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 4080

caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 4140

ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 4200

ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagttcta gaggatcata atcagccata ccacagggcc 4260

catctgggca aagattccac acacggacgg acattttcac ccctctcccc tcatgggtgg 4320

attcggactt aaacaccctc ctccacagat tctcatcaag aacaccccgg tacctgcgaa 4380

tccttcgacc accttcagtg cggcaaagtt tgcttccttc atcacacagt actccacggg 4440

acacggtcag cgtggagatc gagtgggagc tgcagaagga aaacagcaaa cgctggaatc 4500

ccgaaattca gtacacttcc aactacaaca agtctgttaa tcgtggactt accgtggata 4560

ctaatggcgt gtattcagag cctcgcccca ttggcaccag atacctgact cgtaatctgt 4620

aattgcttgt taatcaataa accgtttaat tcgtttcagt tgaactttgg tctctgcgta 4680

tttctttctt atctagtttc catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta 4740

actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 4800

ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 4860

gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatct tccataccta ccagttctgc gcctgcagca 4920

atggcaacaa cgttgcccgg atccggtcgc gcgaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg 4980

atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 5040

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 5100

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 5160

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 5220

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 5280

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 5340

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 5400

tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 5460

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 5520

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 5580

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 5640

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 5700

atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 5760

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 5820

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 5880

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 5940

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 6000

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 6060

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 6120

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 6180

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 6240

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 6300

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 6360

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 6420

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 6480

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 6540

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 6600

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 6660

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 6720

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 6780

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 6840

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 6900

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 6960

gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 7020

tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc 7080

tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 7140

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 7200

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa 7260

gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct 7320

cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg 7380

cggttttttc ctgtttggtc actgatgcct ccgtgtaagg gggatttctg ttcatggggg 7440

taatgatacc gatgaaacga gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg 7500

cccggttact ggaacgttgt gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga 7560

gaaaaatcac tcagggtcaa tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg 7620

gtagccagca gcatcctgcg atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc 7680

gcgtttccag actttacgaa acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg 7740

cagacgtttt gcagcagcag tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct 7800

aaccagtaag gcaaccccgc cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc 7860

gcacccgtgg ccaggaccca acgctgcccg agatgcgccg cgtgcggctg ctggagatgg 7920

cggacgcgat ggatatgttc tgccaagggt tggtttgcgc attcacagtt ctccgcaaga 7980

attgattggc tccaattctt ggagtggtga atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat 8040

tcaggtcgag gtggcccggc tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta 8100

tagggcggcg cctacaatcc atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat 8160

cgccgtgacg atcagcggtc cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc 8220

ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg 8280

catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt 8340

cgcgaacgcc agcaagacgt agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg 8400

cttctcgccg aaacgtttgg tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa 8460

gattccgaat accgcaagcg acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc 8520

gccgaaaatg acccagagcg ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac 8580

agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt 8640

gaaggctctc aagggcatcg gtcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca 8700

gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga 8760

gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 8820

gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc 8880

gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagagctc 8940

tagagctcta gagaattctc atgtttgaca gcttatc 8977

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 2

gtgtaggcct cggatccagc caccatggga gtc 33

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 3

ccatagagcc caccgcatcc cc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 4

tggtatcgtg gaaggactca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 5

ccagtagagg cagggatgat 20

<210> 6

<211> 536

<212> PRT

<213> Adeno-associated virus - 2

<220>

<223> Rep 68

<400> 6

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp

1 5 10 15

Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu

20 25 30

Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile

35 40 45

Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu

50 55 60

Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val

65 70 75 80

Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu

85 90 95

Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu

115 120 125

Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys

145 150 155 160

Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu

165 170 175

Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His

180 185 190

Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn

195 200 205

Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

225 230 235 240

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

245 250 255

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

260 265 270

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

275 280 285

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

290 295 300

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

305 310 315 320

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

340 345 350

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

355 360 365

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

370 375 380

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

385 390 395 400

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

405 410 415

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

420 425 430

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

435 440 445

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

450 455 460

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

465 470 475 480

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

485 490 495

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

500 505 510

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

515 520 525

Arg Leu Ala Arg Gly His Ser Leu

530 535

<210> 7

<211> 621

<212> PRT

<213> Adeno-associated virus - 2

<220>

<223> Rep 78

<400> 7

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp

1 5 10 15

Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu

20 25 30

Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile

35 40 45

Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu

50 55 60

Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val

65 70 75 80

Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu

85 90 95

Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu

115 120 125

Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys

145 150 155 160

Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu

165 170 175

Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His

180 185 190

Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn

195 200 205

Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

225 230 235 240

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

245 250 255

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

260 265 270

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

275 280 285

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

290 295 300

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

305 310 315 320

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

340 345 350

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

355 360 365

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

370 375 380

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

385 390 395 400

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

405 410 415

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

420 425 430

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

435 440 445

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

450 455 460

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

465 470 475 480

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

485 490 495

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

500 505 510

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

515 520 525

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

530 535 540

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

545 550 555 560

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

565 570 575

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

580 585 590

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

595 600 605

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

610 615 620

<210> 8

<211> 312

<212> PRT

<213> Adeno-associated virus - 2

<220>

<223> Rep 40

<400> 8

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

Arg Leu Ala Arg Gly His Ser Leu

305 310

<210> 9

<211> 397

<212> PRT

<213> Adeno-associated virus - 2

<220>

<223> Rep 52

<400> 9

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

305 310 315 320

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

325 330 335

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

340 345 350

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

355 360 365

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

370 375 380

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

385 390 395

<210> 10

<211> 4854

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Conditional expression system

<400> 10

tgggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 180

ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat 240

gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga 300

ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg 360

accttgacgg gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg 420

aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga 480

ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc 540

cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc 600

tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg 660

aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg 720

tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc 780

ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac 840

agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga 900

cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc 960

cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca 1020

aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca 1080

atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta 1140

tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt 1200

ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt 1260

ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg 1320

ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct 1380

acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg 1440

tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc 1500

tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga 1560

ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga 1620

ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc 1680

tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa 1740

aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa 1800

gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc 1860

agccatcgac gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat 1920

gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga 1980

atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg 2040

tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc 2100

atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt 2160

tggatgactg catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat 2220

cttccagatt ggctcgagga cactctctct gagctagctt cgtacggatc ctcggatcca 2280

gccaccatgg gagtcaaagt tctgtttgcc ctgatctgca tcgctgtggc cgaggccaag 2340

cccaccgaga acaacgaaga cttcaacatc gtggccgtgg ccagcaactt cgcgaccacg 2400

gatctcgatg ctgaccgcgg gaagttgccc ggcaagaagc tgccgctgga ggtgctcaaa 2460

gagatggaag ccaatgcccg gaaagctggc tgcaccaggg gctgtctgat ctgcctgtcc 2520

cacatcaagt gcacgcccaa gatgaagaag ttcatcccag gacgctgcca cacctacgaa 2580

ggcgacaaag agtccgcaca gggcggcata ggcgaggcga tcgtcgacat tcctgagatt 2640

cctgggttca aggacttgga gcccatggag cagttcatcg cacaggtcga tctgtgtgtg 2700

gactgcacaa ctggctgcct caaagggctt gccaacgtgc agtgttctga cctgctcaag 2760

aagtggctgc cgcaacgctg tgcgaccttt gccagcaaga tccagggcca ggtggacaag 2820

atcaaggggg ccggtggtga ctaagcggcc gcgtgtggaa agtccccagg ctccccagca 2880

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca 2940

ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc 3000

ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 3060

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 3120

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttccatga 3180

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg 3240

tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 3300

gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 3360

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 3420

aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 3480

acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt cgcggaggcc atggatgcga 3540

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 3600

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 3660

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga 3720

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 3780

acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 3840

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 3900

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 3960

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 4020

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 4080

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 4140

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 4200

agagttctag aggatcataa tcagccatac cacagggccc atctgggcaa agattccaca 4260

cacggacgga cattttcacc cctctcccct catgggtgga ttcggactta aacaccctcc 4320

tccacagatt ctcatcaaga acaccccggt acctgcgaat ccttcgacca ccttcagtgc 4380

ggcaaagttt gcttccttca tcacacagta ctccacggga cacggtcagc gtggagatcg 4440

agtgggagct gcagaaggaa aacagcaaac gctggaatcc cgaaattcag tacacttcca 4500

actacaacaa gtctgttaat cgtggactta ccgtggatac taatggcgtg tattcagagc 4560

ctcgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta attgcttgtt aatcaataaa 4620

ccgtttaatt cgtttcagtt gaactttggt ctctgcgtat ttctttctta tctagtttcc 4680

atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 4740

tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 4800

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgca 4854

Claims

1.包含核酸的病毒粒子，所述核酸在5'至3'方向包含：

(i)腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；

(ii)至少一个能够被(a)辅助多肽和任选的(a)辅助多核苷酸激活的启动子，优选为AAV启动子p5和AAV启动子p19；

(iii)在(ii)中所述启动子的控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；

(iv)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸激活的启动子，优选AAV启动子p40；

(v)在(iv)中所述启动子的控制下的转基因编码序列；

(vi)多聚腺苷酸位点；和

(vii)腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；

其中，所述病毒粒子不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

2.权利要求1的病毒粒子，其中所述病毒粒子包含AAV衣壳蛋白，其中优选地所述病毒粒子由权利要求1中定义的所述核酸和所述衣壳蛋白组成。

3.细胞，其包含：

(aa)核酸，其在5'至3'的方向包含

(i)至少一个腺相关病毒(AAV)末端反向重复(ITR)序列；

(ii)能够被(a)辅助多肽和任选的(a)辅助多核苷酸激活的启动子；和

(iii)在(aa)(ii)中的所述启动子的控制下的转基因编码序列；

和

(ab)核酸，其在5'至3'的方向包含

(i)能够被所述辅助多肽和任选的所述辅助多核苷酸激活的启动子；和

(ii)在(ab)(i)中的所述启动子的控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；

其中所述细胞不包含AAV cap基因和/或不能表达任何AAV cap基因产物。

4.试剂盒，其包含：

(a)(aa)核酸，其在5'至3'的方向包含

(i)至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列；

(ii)能够被所述辅助多肽和任选的(b)辅助多核苷酸激活的启动子；

(iii)在(aa)(ii)中所述启动子的控制下的转基因编码序列；

(ab)核酸，其在5'至3的'方向包含

(i)能够被所述辅助多肽和任选的(b)的辅助多核苷酸激活的启动子；

(ii)在(ab)(i)中所述启动子的控制下的至少一个AAV rep基因编码序列；

和任选的

(b)一个或多个以可表达形式编码所述辅助多肽和任选提供的所述辅助多核苷酸的核酸；

其中所述试剂盒既不包含AAV cap基因也无法表达任何AAV cap基因产物。

5.权利要求2的试剂盒，其中(aa)和(ab)的所述核酸包含在细胞中，其中所述细胞不包含AAV cap基因和/或无法表达任何AAV cap基因产物。

6.权利要求1或2的病毒粒子，权利要求3的细胞，或权利要求4或5的试剂盒，其中

(i)(aa)和(ab)的核酸的序列被包含在单个环状核酸中，其中(ab)的核酸的序列优选位于(aa)的在5'至3'的方向位于(aa)(i)之后和(aa)(ii)之前的核酸的序列内；

(ii)(aa)和(ab)的核酸的序列各自包含在单独的环状核酸中；

(iii)(aa)和(ab)的核酸的序列被包含在单个线性核酸中，其中(ab)的核酸的序列优选位于(aa)的在5'至3'方向位于(aa)(i)之后和(aa)(ii)之前核酸的序列内；或

(iv)(aa)和(ab)的核酸的序列各自被包含在单独的线性核酸中。

7.权利要求3或6的细胞或权利要求5或6的试剂盒，其中

(i)(aa)和(ab)的核酸的序列被包含在所述细胞的基因组DNA中；或

(ii)(ab)的核酸的序列被包含在所述细胞的基因组DNA中。

8.前述权利要求中任一项所述的细胞、试剂盒或病毒粒子，其中，

(i)(aa)(ii)的启动子选自AAV启动子p40、p5、p19和来自天然编码所述辅助多肽的病毒的晚期启动子，优选为AAV p40启动子；和/或

(ii)(ab)(i)的启动子选自启动子p5、p19和p40，优选p5或p19，甚至更优选p5和p19启动子的组合。

9.前述权利要求中任一项所述的细胞、试剂盒或病毒粒子，其中(ab)(ii)的至少一个AAV rep基因编码序列编码AAV Rep78和/或AAV Rep68多肽，其中优选地(ab)(ii)的至少一个AAV rep基因编码序列进一步编码AAV Rep52和/或AAV Rep40多肽。

10.前述权利要求中任一项所述的细胞或试剂盒，其中(b)的核酸当其存在时，被包含在：

(i)辅助病毒中；或

(ii)所述细胞还包含所述(b)的核酸。

11.前述权利要求中任一项所述的细胞、试剂盒或病毒粒子，其中(aa)的核酸序列包含两个AAV反向末端重复序列，其中第二个反向末端重复序列位于(aa)(iii)的转基因序列之后并且为倒置方向。

12.前述权利要求中任一项所述的细胞或试剂盒，其中所述辅助多肽和(b)的辅助多核苷酸，当其存在时，来源于选自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。

13.根据权利要求5至10中任一项所述的试剂盒，当它们引用权利要求5时，其中

(a)所述细胞在容器中提供；

(b)所述细胞在多孔板的孔中多次提供；和/或

(c)所述试剂盒包含含有说明书的手册，优选地说明书用于实施权利要求14至17中任一项所述的方法。

14.一种确定优选选自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒是否被抗病毒药物抑制的方法，所述方法包括使权利要求4至13中任一项所述的试剂盒或权利要求1、2、6、8、9或11中任一项所述的病毒粒子与含有所述病毒的样品接触，其中所述接触是(i)在所述抗病毒药物存在的情况下进行的和(ii)在所述抗病毒药物不存在的情况下进行的，其中在情况(ii)中，分别根据所述试剂盒或病毒粒子定义的转基因编码序列的更大量产物表明所述病毒被所述药物抑制。

15.一种用于条件基因表达的方法，其包括向权利要求3、6至9、11或12当权利要求11和12引用权利要求3或6至9时，中任一项所述的细胞引入一种或多种编码一种或多种辅助多肽的核酸，并任选地提供一种或多种如前述权利要求中任一项所述的辅助多核苷酸，从而表达由所述转基因编码序列编码的产物。

16.一种检测和/或定量感染性病毒的方法，所述病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科，所述方法包括使权利要求3、6至9、11或12当权利要求11和12引用权利要求3或6至9时，中任一项所定义的细胞与样品进行接触，所述样品包含或疑似包含所述感染性病毒，其中根据所述细胞定义的转基因编码序列产物的存在和/或量，指示所述感染性病毒的存在和/或量。

17.一种鉴定化合物的方法，所述化合物对病毒具有抗病毒活性，所述病毒优选选自腺病毒科和疱疹病毒科，所述方法包括以下步骤：

(a)向如前述权利要求中任一项所述的细胞群的细胞中引入前述权利要求中任一项所述的编码一种或多种辅助多肽并任选地提供的一种或多种辅助多核苷酸的核酸；

(b)确定在所述引入后由步骤(a)的细胞群表达的由(aa)(iii)的所述转基因编码序列编码的产物的量；

(c)使前述权利要求中任一项所述的细胞群与待测化合物接触；

(d)向步骤(c)的细胞群的细胞中引入步骤(a)中定义的所述核酸；

(e)确定在所述引入后由步骤(d)的细胞群表达的所述转基因编码序列编码的产物的量；

(f)将在步骤(b)中确定的所述产物的量与步骤(e)中确定的所述产物的量进行比较，其中步骤(e)中确定的产物相对于步骤(b)中确定的产物的量较少，表明经测试的化合物具有抗病毒活性。