CN115298316A - 用于制备腺相关病毒载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码至少一种AAVRep多肽的核酸分子，其中AAV(p5)、(p19)和(p40)启动子中的一种或多种已被修饰以减少或消除一种或多种Rep多肽的表达，或所述核酸分子不编码功能性(Rep52)或(Rep40)多肽，或所述核酸分子不编码功能性腺病毒抑制剂序列。本发明还涉及用于通过使用2‑腺病毒系统生产重组AAV载体的方法，其中AAV复制和包装所需的所有基因(即本发明的AAVrep序列、AAVcap和包含转基因的AAV转移载体)可以在两种腺病毒内编码。

Description

用于制备腺相关病毒载体的方法

本发明涉及编码至少一种AAV Rep多肽的核酸分子，其中AAV p5、p19和p40启动子中的一种或多种已被修饰以减少或消除一种或多种Rep多肽的表达，或所述核酸分子不编码功能性Rep52或Rep40多肽，或所述核酸分子不编码功能性腺病毒抑制剂序列。

本发明还涉及用于通过使用2-腺病毒系统生产重组AAV载体的方法，其中AAV复制和包装所需的所有基因(即本发明的AAV rep序列、AAV cap和包含转基因的AAV转移载体)可以在两种腺病毒内编码。

腺相关病毒(AAV)是属于细小病毒科的单链DNA病毒。这种病毒能够感染广泛的宿主细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞二者。此外，它是一种非致病性病毒，在大多数患者中仅产生有限的免疫反应。

在过去几年中，源自AAV的载体已成为一种非常有用且有前景的基因递送模式。这是由于这些载体的以下特性：

-AAV是小型无包膜病毒，并且它们只有两个天然基因(rep和cap)。因此，它们可以很容易地被操纵以开发用于不同基因治疗的载体。这是通过去除AAV基因组中的rep和cap基因并用可以为患者提供治疗益处的外源序列(转基因)替换这些序列来实现的。

-AAV颗粒不易被剪切力、酶或溶剂降解。这有利于这些病毒载体的简单纯化和最终配制。

-AAV是非致病性的并且具有低免疫原性。这些载体的使用进一步降低了不良炎症反应的风险。与其他病毒载体诸如慢病毒、疱疹病毒和腺病毒不同，AAV是无害的，被认为不会导致任何人类疾病。

-使用AAV载体可以将最高达约4500bp的基因序列递送到患者中。

-虽然已显示野生型AAV载体有时会将遗传物质插入人类19号染色体，但通过从病毒基因组中去除rep和cap基因，大多数AAV基因治疗载体通常会消除此特性。在这种情况下，病毒在宿主细胞内保持游离形式。这些游离体在非分裂细胞中保持完整，而在分裂细胞中，它们在细胞分裂过程中丢失。

天然AAV基因组包含两个基因，每个基因编码多个开放阅读框(ORF)：rep基因编码AAV生命周期和病毒基因组的位点特异性整合所需的非结构蛋白；cap基因编码结构衣壳蛋白。

此外，这两个基因的侧翼是由145个碱基组成的反向末端重复(ITR)序列，其具有形成发夹结构的能力。这些发夹序列是第二条DNA链的不依赖引物酶的合成以及将病毒DNA整合到宿主细胞基因组中所必需的。

为了消除病毒的任何整合能力，重组AAV载体从病毒基因组的DNA中去除了rep和cap。为了产生这样的载体，将期望的转基因与驱动转基因转录的启动子一起插入反向末端重复(ITR)之间；并且rep和cap基因在第二质粒中反式提供。还提供了辅助基因，例如腺病毒E4、E2a和VA基因。rep、cap和辅助基因可以在转染到细胞中的另外的质粒上提供。

传统上，AAV载体的产生已经通过许多不同的途径实现。

最初，AAV是使用野生型(WT)腺病毒血清5型产生的，同时用编码rep和cap基因以及AAV基因组的质粒转染细胞。这使得WT腺病毒提供许多促进病毒复制的反式因子。然而，这种方法存在许多限制：例如，每批AAV必须在制造后与腺病毒(AV)颗粒分离，以提供纯产品，并且确保去除所有Ad5是具有挑战性的。此外，在生产过程中细胞将大量资源用于生产腺病毒颗粒而不是AAV的事实也是不可取的。

在其他系统中，已使用了表达rep和cap基因的稳定包装细胞系。在这样的系统中，rep和cap基因被整合到细胞基因组中，因此不需要基于质粒的rep和cap基因。然而，由于其固有的毒性，这些基因通常仅以低频率整合(例如每个细胞1-2个拷贝)。这些系统需要用腺病毒载体感染。

最近，基于腺病毒的系统已被编码AAV生产所需的腺病毒基因组部分的质粒所取代。虽然这解决了一些关于最终病毒制剂中存在腺病毒颗粒的担忧，但仍然存在许多问题。这些问题包括需要预先制造足够的质粒以转染到生产细胞系中，以及转染本身固有的低效过程。这些系统的产量也低于使用基于Ad5的方法的产量。

过去，对在腺病毒中编码AAV基因(rep和cap)和AAV转移载体已进行了广泛探索(Fisher,K.J等人,1996；Liu,X.L.等人,1999)。虽然AAV基因组和AAV Cap DNA序列在插入腺病毒基因组时是可以耐受的，但AAVRep蛋白和DNA序列对腺病毒是致命的并抑制它们的复制。尽管AAVRep对腺病毒复制有毒性，但一些出版物报道了成功生产编码AAV Rep多肽的腺病毒。然而，这些腺病毒通常是不稳定的，加上生产中的低滴度，或在病毒多次传代后丢失rep基因(Zhang,H.G等人，2001；Zhang,X和Li,C-Y,Mol.Ther.2001)。

AAVRep对腺病毒的抑制是由两种主要机制引起的。首先，AAVRep蛋白是腺病毒启动子(包括MLP、E2B、E4)的有效抑制剂(Timpe J.M.等人,2006)。其次，腺病毒抑制剂序列在AAV rep DNA内编码(位于p40启动子内，病毒通常使用该启动子驱动cap基因的表达)。出版物表明，通过使这种“抑制性”p40 DNA序列乱序，腺病毒可以耐受AAV rep基因(Sitaraman,V.等人,2011；Weger,S.等人,J.Virol.2016)。

本发明基于使AAV rep基因能够稳定编码到腺病毒载体中的步骤组合；AAV rep基因以前从未成功插入并维持在腺病毒载体中。特别地，在一些实施方案中，AAV rep基因启动子p5、p19和p40都已被修饰或去除。p5启动子已被去除以减少Rep 78和Rep 68多肽的表达，从而降低它们的毒性；p19启动子已被去除以停止Rep52和Rep40多肽的表达；p40启动子内的AV抑制剂序列已被去除或修饰，或者其转录被阻止。

当使用AV制造AAV时，优选对于每种基因不同的期望AAV只需要修饰一种AV。然而，rep基因、cap基因和转移AAV基因组的组合分子大小将超过E1/E3缺失的AV载体的包装能力。

发明人现在已经发现可以通过使用两种AV来获得优势。鉴于遗传上不同的AAV可以包含独特的衣壳和转移AAV基因组，本发明的一个方面涉及使细胞与两种AV载体接触：一种包含AAVRep编码序列，并且另一种包含Cap编码序列和转移AAV基因组序列(后者定义为侧翼为AAV反向末端重复的序列)。

发明人还确定了同一AV内Rep编码序列和AAVITR序列的存在对AV生长有害。虽然可以回收这样的AV，但其产量通常比AV独立包含每种序列时低5-10倍。

因此，在本发明的另一方面，Rep编码序列不包含驱动其表达的启动子；并且其转录方向与AV基因组中E2A、E2B和E4转录单位的转录方向相匹配。这确保了Rep多肽以低、基础或最低水平表达，以降低对细胞的毒性；并且它不能通过嵌入腺病毒包装信号元件中的强E1A启动子的转录通读转录到高水平。

在又一个方面，包含rep基因的第一AV还可以任选地编码一种蛋白质，该蛋白质可以转录激活第二AV中驱动cap基因表达的启动子。这使得仅当两种AV存在于同一细胞内时才诱导cap基因的转录，从而减少在AV制造过程中表达AAV cap基因的负担。

本发明的一个目的是提供包含AAV rep基因的核酸分子，其中rep基因启动子已被修饰或消除以使核酸分子整合到腺病毒载体中，和/或其随后的表达毒性较小。

本发明的另一个目的是提供包含本发明核酸分子的腺病毒载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供用于产生包含本发明核酸分子的修饰的宿主细胞和腺病毒载体的方法；以及用于产生AAV的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，其中所述核酸分子的核苷酸序列编码至少一种AAVRep多肽，其中所述Rep多肽编码序列具有以下特征中的两个或三个：

(i)其不与功能性AAV p5启动子可操作地关联；

(ii)其不包含功能性AAV p19启动子或其不编码功能性Rep52和Rep40多肽；

(iii)其不包含功能性AAV p40启动子或其不包含功能性腺病毒抑制剂序列。

优选地，所述核苷酸序列编码功能性AAVRep78和Rep68多肽。优选地，在不存在可操作地关联的启动子的情况下，所述核酸分子不能表达功能性AAVRep52或Rep40多肽。

本发明的所述核酸分子可以是DNA或RNA。它可以是单链或双链。

如本文所用，术语“rep基因”是指编码一个或多个开放阅读框(ORF)的基因，其中每个所述ORF编码AAVRep非结构蛋白或其变体或衍生物。这些AAVRep非结构蛋白(或其变体或衍生物)参与AAV基因组复制和/或AAV基因组包装。

野生型rep基因包含三个启动子：p5、p19和p40。两种不同长度的重叠信使核糖核酸(mRNA)可以产生自p5和p19。这些mRNA中的每一种都包含内含子，其可以使用单个剪接供体位点和两个不同的剪接受体位点剪接或不剪接。因此，可以形成六种不同的mRNA，其中只有四种是有功能的。未能去除内含子的两种mRNA(一种从p5转录，一种从p19转录)通读到共享的终止子序列并分别编码Rep78和Rep52。去除内含子并使用最5’剪接受体位点不会产生任何功能性Rep蛋白——它不能产生正确的Rep68或Rep40蛋白，因为序列其余部分的框发生了移码，并且它也不能产生Rep78或Rep52的正确C末端，因为终止子被剪接。相反，去除内含子并且使用3’剪接受体将包括Rep68和Rep40的正确C末端，同时剪接了Rep78和Rep52的终止子。因此，唯一的功能性剪接或者是完全避免剪接内含子(产生Rep78和Rep52)，或者是使用3’剪接受体(产生Rep68和Rep40)。因此，可以从这些启动子合成四种具有重叠序列的不同功能性Rep蛋白。

在野生型rep基因中，p40启动子位于3'端。Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)的转录在野生型AAV基因组中从该启动子开始。

四种野生型Rep蛋白是Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。因此，野生型rep基因是编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因。

如本文所用，术语“rep基因”包括野生型rep基因及其衍生物；和具有同等功能的人工rep基因。所述野生型rep基因编码功能性Rep78、Rep68、Rep52和Rep40多肽。

在一个特别优选的实施方案中，所述核苷酸序列编码功能性Rep78和Rep68多肽。

如本文所用，术语Rep78多肽是指SEQ ID NO:22的多肽或其变体，所述变体与Rep78多肽具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且编码功能性Rep78多肽。如本文所用，术语Rep68多肽是指SEQ ID NO:23的多肽或其变体，所述变体与Rep68多肽具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且编码功能性Rep68多肽。

在AAV的生产中，在没有足够的功能性Rep多肽的情况下，由于待包装的ITR质粒较少并且其不能有效包装的事实，将观察到较低的滴度(例如基因组拷贝)(这可以通过qPCR确定)。观察结果可能还包括夸大的空:满颗粒比；这可以通过ELISA或光密度测量来确定。

Rep 78/68多肽结合ATP并具有解旋酶活性，并且可以参与协助单链基因组前体的积累以及将新形成的DNA链包装到预先形成的AAV衣壳中。

可以通过蛋白质印迹确定Rep 78或Rep 68多肽变体是否表达，以确定这些多肽是否以正确的分子量产生。

可以使用确定ATP消耗的生物发光ATP测定法以多肽的纯化形式测定这些多肽的功能。由于Rep78和Rep68二者具有解旋酶活性，因此也可以使用适当的解旋酶测定。

在生物发光ATP测定中，具有野生型Rep78多肽(例如SEQ ID NO:22)的ATP消耗水平的至少80％(优选至少90％)的ATP消耗水平的测试Rep78多肽可以被认为是功能性Rep78多肽。

在生物发光ATP测定中，具有野生型Rep68多肽(例如SEQ ID NO:23)的ATP消耗水平的至少80％(优选至少90％)的ATP消耗水平的测试Rep68多肽可以被认为是功能性Rep68多肽。

具有野生型Rep78多肽(例如SEQ ID NO:22)的解旋酶活性水平的至少80％(优选至少90％)的解旋酶活性水平的测试Rep78多肽可以被认为是功能性Rep78多肽。

具有野生型Rep68多肽(例如SEQ ID NO:23)的解旋酶活性水平的至少80％(优选至少90％)的解旋酶活性水平的测试Rep68多肽可以被认为是功能性Rep68多肽。

野生型AAV(血清2型)rep基因核苷酸序列在SEQ ID NO:1中给出。

在一个实施方案中，术语“rep基因”或Rep多肽编码序列是指与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，并且其编码一种或多种Rep78、Rep68、Rep52和Rep40多肽，优选功能性Rep78和68多肽。

Rep52和Rep40核苷酸序列在本文中在SEQ ID NO:16和17中给出。Rep78和Rep68核苷酸序列在本文中在SEQ ID NO:20和21中给出。

如本文所用，术语“cap基因”是指编码一个或多个开放阅读框(ORF)的基因，其中每个所述ORF编码AAV Cap结构蛋白或其变体或衍生物。这些AAV Cap结构蛋白(或其变体或衍生物)形成AAV衣壳。

三种Cap蛋白必须具有功能，才能产生能够感染合适细胞的感染性AAV病毒颗粒。三种Cap蛋白分别是VP1、VP2和VP3，它们的大小通常分别为87kDa、72kDa和62kDa。因此cap基因是编码三种Cap蛋白VP1、VP2和VP3的基因。

在野生型AAV中，这三种蛋白质从p40启动子翻译以形成单个mRNA。合成此mRNA后，可以切除长或短内含子，从而形成2.3kb或2.6kb的mRNA。

AAV衣壳由以1:1:10的比例呈二十面体对称排列的60个衣壳蛋白亚基(VP1、VP2和VP3)构成，估计大小为3.9MDa。

如本文所用，术语“cap基因”包括野生型cap基因及其衍生物，以及具有同等功能的人工cap基因。AAV(血清2型)cap基因核苷酸序列和Cap多肽序列分别在SEQ ID NO:2和3中给出。如本文所用，术语“cap基因”优选指具有SEQ ID NO:2中给出的序列的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:3的多肽的核苷酸序列；或与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列，或与编码SEQ ID NO:3的多肽的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％或99％核苷酸序列同一性并且编码VP1、VP2和VP3多肽的核苷酸序列。

rep基因和cap基因优选是病毒基因或源自病毒基因。更优选地，它们是AAV基因或源自AAV基因。在一些实施方案中，AAV是腺相关依赖病毒A(dependoparvovirus A)。在另一些实施方案中，AAV是腺相关依赖病毒B。

已知11种不同的AAV血清型。所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。组织特异性由衣壳血清型决定。AAV可以来自血清1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型、10型或11型。优选地，AAV是血清1型、2型、5型、6型、7型、8型或9型。最优选地，AAV血清型为5(即AAV5)。

rep基因和cap基因(以及其中的每个蛋白质编码ORF)可以来自一种或多种不同的病毒(例如2、3或4种不同的病毒)。例如，rep基因可以来自AAV2，而cap基因可以来自AAV5。

本领域技术人员认识到AAV的rep和cap基因因进化枝和分离株而异。来自所有这样的进化枝和分离株的这些基因的序列及其衍生物均涵盖在本文中。

如本文所用，术语“重组AAV基因组”是指包含侧翼为AAV反向末端重复(ITR)的转基因(代替rep和cap基因)的AAV基因组。如本文所用，术语“AAV基因组”、“AAV转移载体”和“转移质粒”在本文中可互换使用。它们都指包含转基因侧翼的5'-和3'-病毒(优选AAV)反向末端重复(ITR)的载体。

转基因可以是编码或非编码序列。它可以是基因组DNA或cDNA。优选地，转基因编码多肽或其片段。优选地，转基因与一种或多种转录和/或翻译控制元件(例如增强子、启动子、终止子序列等)可操作地关联。

在一些实施方案中，转基因编码治疗性多肽或其片段。优选的治疗性多肽的实例包括抗体、CAR-T分子、scFV、BiTE、设计的锚蛋白重复序列(DARPins)和T细胞受体。

在一些实施方案中，治疗性多肽是G-蛋白偶联受体(GPCR)，例如DRD1。在一些实施方案中，治疗性多肽是免疫治疗靶标，例如CD19、CD40或CD38。在一些实施方案中，治疗性多肽是涉及人类视觉或视网膜功能的基因(例如RPE65或REP)的功能性拷贝。在一些实施方案中，治疗性多肽是涉及人类血液生产的基因的功能性拷贝，或者是血液成分，例如因子IX，或参与β和α地中海贫血或镰状细胞性贫血的那些。在一些实施方案中，治疗性多肽是涉及免疫功能的基因的功能性拷贝，例如在严重联合免疫缺陷病(SCID)或腺苷脱氨酶缺乏症(ADA-SCID)中的。在一些实施方案中，治疗性多肽是增加/减少细胞增殖的蛋白质，例如生长因子受体。在一些实施方案中，治疗性多肽是离子通道多肽。

在一些优选的实施方案中，治疗性多肽是免疫检查点分子。优选地，免疫检查点分子是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(例如CD27、CD40、OX40、GITR或CD137)的成员，或B7-CD28超家族(例如CD28、CTLA4或ICOS)的成员。优选地，免疫检查点分子为PD1、PDL1、CTLA4、Lag1或GITR。

在一些优选的实施方案中，转基因编码CRISPR酶(例如Cas9、dCas9、Cpfl或其变体或衍生物)或CRISPR sgRNA。

野生型AAV p5启动子促进Rep 78和Rep 68多肽的表达。p5启动子位于野生型rep基因的5’端。

野生型AAV2 p5启动子具有如SEQ ID NO:4中给出的核苷酸序列。核心序列以粗体突出显示。

如本文所用，术语“功能性p5启动子”是指由SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的其变体组成的核苷酸序列或包含它们的核苷酸序列，并且能够促进编码一种或多种AAVRep多肽(优选Rep 78和Rep68多肽)的可操作关联的核苷酸分子的转录。

p5启动子的活性水平可以通过将测试p5启动子序列与合适的转基因可操作地关联并测定转基因的表达水平来确定。

当与相同转基因可操作地关联时，低于野生型p5启动子表达水平的5％(优选低于1％)的表达水平可以被认为是无功能的。

在一些实施方案中，在本发明的核酸分子中，(i)Rep多肽编码序列未与功能性AAVp5启动子可操作地关联。优选地，该核苷酸序列位于Rep多肽编码序列的上游(5’)，更优选位于紧邻Rep多肽编码序列的上游(即连续连接到Rep多肽编码序列的5’末端)。以此方式，降低了Rep78和Rep68多肽的表达，从而降低了这些多肽对腺病毒的毒性。

在不存在可操作地关联的启动子的情况下，Rep 78和/或Rep 68多肽仅能够从本发明的核酸分子以低、基线或最低水平表达。

例如，野生型AAV p5启动子序列(例如SEQ ID NO:4)可因核心区域中存在突变(如上文突出显示)而变得无功能，或者它可在启动子的TATA元件中具有突变，由此TATA元件不能被TATA结合蛋白和/或启动转录所需的其他转录因子结合。

因此，在一个实施方案中，Rep多肽编码序列与在核心区和/或TATA元件中具有一个或多个突变的AAV p5启动子可操作地关联。优选地，与SEQ ID NO:4的启动子相比，这些突变降低了AAV p5启动子的启动子活性，最优选使其无功能(如上文所定义)。

在一些优选的实施方案中，Rep多肽编码序列与由SEQ ID NO:4的核苷酸序列的变体组成或包含所述变体的核苷酸序列可操作地关联，所述变体与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且其中，如果变体与转基因可操作地关联，则转基因的表达水平低于来自与转基因可操作地关联的具有SEQ ID NO:4的启动子的表达水平的5％(优选低于1％)。

在另一些实施方案中，Rep多肽编码序列未与功能性或非功能性AAV p5启动子可操作地关联。

在该实施方案中，Rep多肽编码序列可以与与SEQ ID NO:4具有小于99％、95％、90％或85％序列同一性并且优选地没有或基本上没有启动子活性的核苷酸序列可操作地关联。

在一些实施方案中，Rep多肽编码序列未与IRES元件可操作地关联。在一些实施方案中，p5启动子未被IRES替代。

在本发明该方面的一些实施方案中，Rep多肽编码序列与SEQ ID NO:5(形成人β-珠蛋白基因的5'-非翻译区(UTR)的一部分的序列)可操作地关联。

野生型AAV p19启动子促进Rep 52和Rep 40多肽的表达。p19启动子位于野生型rep基因内。

野生型AAV2 p19启动子具有SEQ ID NO:6中给出的核苷酸序列。突出显示的部分是TATA框和TSS元件。

如本文所用，术语“功能性p19启动子”是指由SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的其变体组成的核苷酸序列或包含它们的核苷酸序列，并且能够促进编码一种或多种AAVRep多肽(优选Rep 52和Rep40多肽)的可操作关联的核苷酸分子的转录。

p19启动子的活性水平可以通过将测试p19启动子序列与合适的转基因可操作地关联并测定转基因的表达水平来确定。低于野生型p19启动子(当与相同转基因可操作地关联时)表达水平的5％(优选低于1％)的表达水平可以被认为是无功能的。

在一些实施方案中，在本发明的核酸分子中，(ii)Rep多肽编码序列不包含功能性AAV p19启动子。在不存在可操作地关联的启动子的情况下，Rep 52和/或Rep 40多肽不能从本发明的核酸分子中表达。以此方式，Rep52和/或Rep40多肽的表达被阻止或抑制。这些多肽对于重组AAV颗粒的产生不是必需的，但它们能够抑制腺病毒的产生。因此，在其中腺病毒包含本发明的核酸分子的系统中，Rep52和/或Rep40多肽表达的阻止或抑制增强了腺病毒的产生。

例如，野生型AAV p19启动子序列(例如SEQ ID NO:6)可因TSS元件中存在突变而变得无功能，或者可在启动子的TATA元件中具有突变，由此TATA元件不能被TATA结合蛋白和/或启动转录所需的其他转录因子结合。

因此，在一个实施方案中，Rep多肽编码序列与在TSS元件和/或TATA元件中具有一个或多个突变的AAV p19启动子可操作地关联。优选地，与SEQ ID NO:6的启动子相比，这些突变降低AAV p19启动子的启动子活性，最优选使其无功能(如上文所定义)。

在一些实施方案中，AAV p19启动子具有包含一些或全部TATA框的缺失。更优选地，Rep多肽编码序列具有p19启动子，其中TATA框已通过将TATA框的一个或多个(例如1、2、3或4个)核苷酸替换为替代核苷酸而消除，例如将TATA序列转换为TTTT。优选地，改变是同义突变或者改变保留了编码序列的框。在这些实施方案中，p19启动子可能仍然是功能性的，或非功能性的。

非功能性p19序列的一个实例在SEQ ID NO:7中给出。突出显示的序列是突变的TATA框元件，其使启动子非功能性。

在一些优选的实施方案中，Rep多肽编码序列与由SEQ ID NO:6的核苷酸序列的变体组成或包含所述变体的核苷酸序列可操作地关联，所述变体与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且其中，如果变体与转基因可操作地关联，则转基因的表达水平低于来自与转基因可操作地关联的具有SEQ ID NO:6的启动子的表达水平的5％(优选低于1％)。

在另一些实施方案中，Rep编码多肽序列编码功能性AAV p19启动子，但不编码功能性Rep 52和/或Rep40多肽。优选地，Rep78/68多肽的活性没有受到显著影响。

例如，Rep52/40多肽的起始密码子可以突变以消除这些多肽的表达。在一个实例中，编码起始密码子(甲硫氨酸)的核苷酸序列可以突变，优选地不显著影响Rep78/68多肽的表达。

非功能性Rep52序列的实例包括由SEQ ID NO:16的核苷酸序列的变体或编码SEQID NO:18的氨基酸序列的核苷酸序列的变体组成的核苷酸序列或包含它们的核苷酸序列，所述变体与所述核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性并且不编码功能性Rep52多肽序列。

非功能性Rep40序列的实例包括由SEQ ID NO:17的核苷酸序列的变体或编码SEQID NO:19的氨基酸序列的核苷酸序列的变体组成的核苷酸序列或包含它们的核苷酸序列，所述变体与所述核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性并且不编码功能性Rep40多肽序列。

Rep 52/40蛋白结合ATP并具有解旋酶活性，并且可以参与协助单链基因组前体的积累和协助将新形成的DNA链包装到预先形成的AAV衣壳中。与Rep78和Rep68不同，它们通常被认为对于AAV生产是一次性的。

可以通过蛋白质印迹确定Rep 52或Rep 40多肽变体是否表达，以确定这些多肽是否以正确的分子量产生。可以使用确定ATP消耗的生物发光ATP测定法以多肽的纯化形式测定这些多肽的功能。由于Rep52和Rep40二者具有解旋酶活性，因此也可以使用适当的解旋酶测定。

具有低于野生型Rep52多肽(例如SEQ ID NO:18)的解旋酶活性水平的5％(优选低于1％)的解旋酶活性水平的测试Rep52多肽可以被认为是非功能性Rep52多肽。

具有低于野生型Rep40多肽(例如SEQ ID NO:19)的解旋酶活性水平的5％(优选低于1％)的解旋酶活性水平的测试Rep40多肽可以被认为是非功能性Rep40多肽。

野生型AAV p40启动子促进AAV Cap多肽的表达。p40启动子位于野生型AAV rep基因的3’末端附近。

野生型AAV2 p40启动子具有SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列。突出显示的元件是TATA元件。

如本文所用，术语“功能性p40启动子”是指由SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的其变体组成的核苷酸序列或包含它们的核苷酸序列，并且能够促进编码一种或多种AAVRep多肽(优选一种或多种AAV Cap多肽)的可操作关联的核苷酸分子的转录。

p40启动子的活性水平可以通过将测试p40启动子序列与合适的转基因可操作地关联并测定转基因的表达水平来确定。低于野生型p40启动子(当与相同转基因可操作地关联时)表达水平的5％(优选低于1％)的表达水平可以被认为是无功能的。

在一些实施方案中，在本发明的核酸分子中，(ii)Rep多肽编码序列不包含功能性AAV p40启动子。以这种方式，腺病毒抑制剂序列不被转录。

例如，野生型AAV p40启动子序列(例如SEQ ID NO:8)可因启动子的TATA元件中存在突变而变得无功能，由此TATA元件不能被TATA结合蛋白和/或启动转录所需的其他转录因子结合。

因此，在一个实施方案中，Rep多肽编码序列与在TATA元件中具有一个或多个突变的AAV p40启动子可操作地关联。优选地，与SEQ ID NO:8的启动子相比，这些突变降低AAVp40启动子的启动子活性，最优选使其无功能(如上文所定义)。

在一些优选的实施方案中，Rep多肽编码序列与由SEQ ID NO:8的核苷酸序列的变体组成或包含所述变体的核苷酸序列可操作地关联，所述变体与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性，并且其中，当变体与转基因可操作地关联时，转基因的表达水平低于来自与转基因可操作地关联的具有SEQ ID NO:8的启动子的表达水平的5％(优选低于1％)。

在另一些实施方案中，Rep多肽编码序列未与功能性或非功能性AAV p40启动子可操作地关联。在该实施方案中，Rep多肽编码序列可以与与SEQ ID NO:8具有小于99％、95％、90％或85％的序列同一性并且优选地没有或基本上没有启动子活性的核苷酸序列可操作地关联。

优选的非功能性p40启动子序列在SEQ ID NO:9中给出。在该序列中，TATA框元件、转录起始位点和转录因子结合位点发生突变，而Rep78和Rep68多肽编码序列保持不变。

野生型AAV p40启动子序列包含腺病毒抑制剂序列。如本文所用，术语“功能性腺病毒抑制剂序列”是指其中当它以腺病毒基因组的顺式存在时，导致腺病毒复制的显著抑制的核苷酸序列。野生型AAV2腺病毒抑制剂具有SEQ ID NO:10中的序列。该序列形成p40启动子和腺病毒抑制剂序列。TATA元件和转录起始位点形成抑制剂序列的核心。

优选地，将功能性腺病毒抑制剂序列定义为具有SEQ ID NO:10中所示序列或与其具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性并且能够抑制宿主细胞中的腺病毒载体复制的其变体的序列。

可以通过分子克隆将腺病毒抑制剂序列(顺式或反式)包括到AV载体的序列中，然后尝试在哺乳动物细胞中回收AV来确定腺病毒抑制剂序列的活性水平。将野生型腺病毒抑制剂序列插入AV将完全阻止任何AV载体的回收和生长。通过修饰腺病毒抑制剂序列的序列，有可能以不同程度成功回收AV载体。这可以通过测量回收的AV的感染滴度以确定抑制水平来计算。可用于测量AV滴度的测定法包括TCID50法和噬菌斑测定法。

低于来自野生型腺病毒抑制剂序列(在相同条件下)的活性水平的5％(优选低于1％)的活性水平可以被认为是无功能的。

野生型AAV rep基因包含含有腺病毒抑制剂序列的p40启动子序列。

在一些实施方案中，在本发明的核酸分子中，(iii)Rep多肽编码序列不包含功能性腺病毒抑制剂序列。

例如，可以从Rep多肽编码序列中去除腺病毒抑制剂序列，或者可以使腺病毒抑制剂序列无功能(例如通过在腺病毒抑制剂序列中产生一个或多个突变)。

可以以使得腺病毒抑制剂序列在宿主细胞中的转录不会显著抑制野生型腺病毒在宿主细胞中的复制的方式修饰腺病毒抑制剂序列。

优选地，Rep多肽编码序列编码功能性Rep78和Rep68多肽，即去除腺病毒抑制剂序列或使腺病毒抑制剂序列无功能不影响Rep78和Rep68多肽的氨基酸编码序列。

优选地，p40启动子内的AV抑制剂序列通过同义密码子交换去除以保留Rep编码氨基酸。这减少了对AV基因的抑制。

在一些实施方案中，不必保留Rep52和/或Rep40多肽的正确编码序列。

在一个实施方案中，Rep多肽编码序列包含功能性p40启动子序列，即去除腺病毒抑制剂序列或使腺病毒抑制剂序列无功能不影响、不显著降低或不完全消除p40启动子的功能。

在另一个实施方案中，Rep多肽编码序列不包含功能性p40启动子序列，即去除腺病毒抑制剂序列或使腺病毒抑制剂序列无功能完全消除了p40启动子的功能。

优选地，没有功能性p40启动子序列的核苷酸序列具有SEQ ID NO:11中给出的序列。在SEQ ID NO:11中，p40启动子内的AV抑制剂序列已通过同义密码子交换去除以保留Rep编码氨基酸，以减少对AV基因的抑制。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子不包含与AAVRep多肽编码序列可操作地关联的异源启动子。

在另一些实施方案中，本发明的核酸分子不包含与AAVRep多肽编码序列邻接的启动子。

如本文所用，在启动子和基因的上下文中，术语“可操作地关联(operably-associated)”是指启动子和所讨论的基因位于彼此足够近的距离内，以使启动子能够促进基因的表达。在一些实施方案中，启动子和基因是并列的或者是邻接的。

优选地，Rep多肽编码序列(rep基因)具有SEQ ID NO:12中给出的序列，或与其具有至少80％、85％、90或95％核苷酸序列同一性的其变体，其中p19启动子是非功能性的并且p40启动子是非功能性的并且腺病毒抑制剂序列是非功能性的。在SEQ ID NO:12中，p19和p40启动子被去除，保留了Rep78和Rep68编码序列。

在另一些优选实施方案中，Rep多肽编码序列具有以下特征：

(i)其不与功能性AAV p5启动子可操作地关联；以及

(iii)其不包含功能性AAV p40启动子并且其不包含功能性腺病毒抑制剂序列。

更优选地，Rep多肽编码序列具有p19启动子，其中TATA框已被去除，例如通过将TATA框的一个或多个(例如1、2、3或4个)核苷酸替换为替代核苷酸，例如将TATA序列转换为TTTT。

在一些实施方案中，AAV p19启动子具有包含一些或全部TATA框的缺失，或者一个或多个TATA碱基已从TATA改变为替代核苷酸。优选地，改变是同义突变或者改变保留了编码序列的框。

p19启动子可以是功能性的，即能够从其表达Rep40和Rep52多肽，或者可以是非功能性的。

在又一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸分子的腺病毒载体。本发明的核酸分子稳定整合到腺病毒基因组中。

为了容纳本发明的核酸分子，一个或多个腺病毒基因的部分或全部可以缺失(优选不是腺病毒辅助基因的基因)。

例如，本发明的核酸分子可以插入到腺病毒早期基因之一中或插入到已经从腺病毒中缺失早期基因的位点中。在后一个实例中，缺失的早期基因可以通过包含缺失基因的细胞系(例如包含腺病毒E1A和E1B区域的HEK293细胞)反式互补。

本发明的核酸分子可以插入到包含E1缺失的腺病毒基因组区域中。在另一些情况下，对腺病毒非必需的基因也可以缺失并且这些位点可以用于插入本发明的核酸分子。例如，本发明的核酸分子可以插入腺病毒的E3区，因为大多数E3基因可以在腺病毒载体中缺失。

本发明的核酸分子可以以正义或反义方向(相对于腺病毒基因的转录方向)插入到腺病毒基因中。本发明的一个优选实施方案是本发明的核酸分子在插入E1区时与E4、E2A和E2B表达盒的转录方向相同。这是为了防止E1A启动子(通常保留在E1缺失的AV中)充当启动子来驱动rep基因表达。E1A启动子不能被去除，因为它包含AV包装信号。

本发明的一个优选实施方案是Rep编码序列不包含上游启动子。

在一些优选的实施方案中，本发明的核酸分子被插入到腺病毒E1基因中，优选其中E1基因的一部分已经缺失。优选地，E1基因是E1A和/或E1B。

在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸分子的腺病毒载体，其中Rep多肽(由本发明的核酸分子编码)以低、基线或最低水平表达。优选地，Rep多肽编码序列未与任何功能性启动子可操作地关联。如本文所用，术语“低、基线或最低水平”是指来自本发明的核酸分子的Rep78多肽的表达水平低于与野生型p5启动子可操作地关联(在野生型AAVrep基因中)的野生型Rep 78多肽的表达水平的50％、40％、30％、20％或10％。以此方式，提供了足够的Rep多肽以便能够产生至少一些AAV，但Rep多肽的表达水平不足以完全抑制腺病毒复制。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子被整合到腺病毒基因组中，使得本发明的核酸分子的表达由腺病毒启动子驱动，优选以低或最低水平驱动。

在另一些实施方案中，本发明的核酸分子被整合到腺病毒基因组中，使得本发明的核酸分子的表达由可操作地关联的异源启动子驱动，优选以低或最低水平驱动。

可操作地关联的启动子可以是组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在另一些实施方案中，启动子是可诱导的或可抑制的。

组成型启动子的实例包括CMV、SV40、PGK(人或小鼠)、HSV TK、SFFV、泛素、延伸因子α、CHEF-1、FerH、Grp78、RSV、腺病毒E1A、CAG或CMV-β-珠蛋白启动子，或由其衍生的启动子。

优选地，rep基因启动子是SV40启动子，或由其衍生的启动子，或与人细胞和人细胞系(例如HEK-293细胞)中的SV40启动子相比强度相等或降低的启动子。

在一些实施方案中，启动子通过包含可诱导或可抑制调节(启动子)元件是可诱导或可诱导的。

例如，启动子可以是可被多西环素、四环素、IPTG或乳糖诱导的启动子。

在本发明的一些实施方案中，本发明的核酸分子不包含任何功能性启动子并且不与任何功能性启动子可操作地关联。

在一些实施方案中，本发明的腺病毒载体另外包含编码AAV cap基因的核苷酸分子。

优选地，AAV cap基因不与AAV rep基因或本发明的核酸分子并列。特别地，AAVcap基因优选不与rep基因p40启动子(野生型AAV p40启动子或本发明的p40启动子序列)可操作地关联。

例如，AAV cap基因优选不存在于腺病毒基因组中的AAV rep基因(或rep基因启动子)或本发明核酸分子的1、2、3、4或5Kb内。

优选地，AAV cap基因与异源启动子可操作地关联。

优选地，AAV cap基因与组成型或诱导型启动子可操作地关联。

在一些实施方案中，AAV cap基因不与启动子可操作地关联或与最小启动子可操作地关联，例如CMV、RSV、SV40启动子的最小启动子区域，或包含TATA框和足够的调节结合位点以启动所述TATA框下游的基础转录的任何复合核心启动子区域。在不使用启动子时，不会出现TATA框。这维持了cap基因的低、基线或最低水平的表达。

如本文所用，术语“低、基线或最低水平”是指cap基因的表达水平低于与野生型40启动子可操作地关联(例如在野生型AAV中)的野生型cap基因的表达水平的50％、40％、30％、20％或10％。

如本文所用，术语“异源”是指与所讨论的基因不天然关联的遗传元件。

在本发明的一个优选实施方案中，AAV cap基因不与AAV rep基因或本发明的核酸分子并列。

特别地，AAV cap基因在启动子的控制下整合到AV中，该启动子由编码激活蛋白和rep基因的AV中编码的蛋白质激活。

在本发明的又一个实施方案中，包含本发明的核酸分子的腺病毒载体(第一腺病毒载体)另外编码能够转录激活(远程)启动子(例如存在于第二腺病毒载体中的启动子)的多肽。优选地，第二腺病毒载体中的启动子是与AAV cap基因可操作地关联(即驱动其表达)的启动子。

在一些实施方案中，腺病毒载体编码能够转录激活不存在于腺病毒载体中的启动子的多肽。

这种多肽的实例包括来自单纯疱疹病毒的VP16转录激活因子和来自p53蛋白的反式激活因子结构域。这些序列可以连接到DNA结合域，例如结合cumate结合位点或四环素结合位点的那些。

这允许仅当第一和第二腺病毒载体都存在于同一细胞中时才诱导cap基因的转录，从而减少在腺病毒制造过程中表达AAV cap基因的负担。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含游离地位于宿主细胞内的本发明的核酸分子。所述宿主细胞可以是分离的细胞，例如它们不存在于活的动物或哺乳动物中。优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

所述哺乳动物细胞的实例包括来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、兔、驴、马、绵羊、牛和猿的任何器官或组织的细胞。优选地，所述细胞是人细胞。所述细胞可以是原代细胞或永生化细胞。优选的细胞包括HEK-293、HEK 293T、HEK-293E、HEK-293FT、HEK-293S、HEK-293SG、HEK-293FTM、HEK-293SGGD、HEK-293A、MDCK、C127、A549、HeLa、CHO、小鼠骨髓瘤、PerC6、911和Vero细胞系。HEK-293细胞已被修饰以包含E1A和E1B蛋白，这消除了将在辅助质粒上提供这些蛋白质的需要。同样，PerC6和911细胞包含类似的修饰，并且也可以使用。

最优选地，所述人细胞是HEK293、HEK293T、HEK293A、PerC6、911或HeLaRC32。其他优选的细胞包括Hela、CHO和VERO细胞。

发明人已经发现，同一腺病毒内存在Rep编码序列和AAVITR序列对腺病毒的生长是有害的。虽然可以回收这样的腺病毒，但其产量通常比AV独立包含每种序列时低5-10倍。因此，通过分离Rep编码序列和AAVITR序列，即通过将它们置于两个单独的腺病毒载体中，可以获得优势。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含：

(A)包含本发明的核酸分子的第一腺病毒载体，以及

(B)第二腺病毒载体，其包含

(i)编码AAV Cap多肽的核酸分子，和/或

(ii)编码重组AAV基因组的核酸分子。

优选地，所述第一腺病毒载体还编码能够转录激活存在于第二腺病毒载体中的启动子的多肽。优选地，所述第二腺病毒载体中的启动子是与AAV cap基因可操作地关联(即驱动其表达)的启动子。

WO2019/020992公开了晚期腺病毒基因的转录可以通过将阻遏元件插入主要晚期启动子来调节(例如抑制)。通过“关闭”腺病毒晚期基因的表达，细胞的蛋白质制造能力可以转向生产期望的重组蛋白或AAV颗粒。优选地，本发明的腺病毒载体包含可阻遏的主要晚期启动子(MLP)，更优选地，其中MLP包含一种或多种能够调节或控制腺病毒晚期基因转录的阻遏元件，并且其中一种或多种阻遏元件插入MLP TATA框的下游。

用于产生病毒(优选AAV)颗粒的优选特征包括以下：

-其中一种或多种阻遏元件插入在MLP TATA框和转录的+1位置之间。

-其中阻遏元件是能够被阻遏蛋白结合的元件。

-其中编码能够与阻遏元件结合的阻遏蛋白的基因在腺病毒基因组内编码。

-其中阻遏蛋白在MLP的控制下转录。

-其中阻遏蛋白是四环素阻遏物、乳糖阻遏物或蜕皮激素阻遏物，优选四环素阻遏物(TetR)。

-其中阻遏元件是四环素阻遏物结合位点，包含SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成。

-其中MLP的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或15中所示的序列或由其组成。

-其中阻遏元件的存在不影响腺病毒E2B蛋白的产生。

-其中腺病毒载体编码腺病毒L4100K蛋白并且其中L4100K蛋白不受MLP的控制。

-其中转基因插入在腺病毒早期区域之一内，优选在腺病毒E1区域内而不是在转移质粒中。

-其中转基因在其5’-UTR中包含三联前导序列(Tripartite Leader，TPL)。

-其中转基因编码治疗性多肽。

-其中转基因编码病毒蛋白，优选能够在细胞内或细胞外装配以产生病毒样颗粒的蛋白，优选其中转基因编码诺如病毒VP1或乙型肝炎HBsAG。

在又一个实施方案中，本发明还提供了一种用于产生修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将本发明的核酸分子引入宿主细胞，使得核酸分子：

(i)稳定整合到宿主细胞的基因组中，或

(ii)在宿主细胞内游离存在。

优选地，本发明的核酸分子游离地存在于宿主细胞内。

在本发明的一些实施方案中，细胞中的本发明核酸分子不包含任何功能性启动子并且其不与任何功能性启动子可操作地关联。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是表达或能够表达Cap多肽和/或AAV基因组的细胞。

例如，所述宿主细胞可以是其中一种或多种包含编码Cap多肽和/或AAV基因组的核苷酸序列的DNA分子稳定整合的细胞。编码Cap多肽和/或AAV基因组的核苷酸序列优选与合适的调节元件(例如诱导型或组成型启动子)可操作地关联。

例如，所述宿主细胞可以是包含一种或多种DNA质粒或载体的宿主细胞，所述DNA质粒或载体包含编码Cap多肽和/或AAV基因组的核苷酸序列。编码Cap多肽和/或AAV基因组的核苷酸序列优选与合适的调节元件(例如诱导型或组成型启动子)可操作地关联。

所述宿主细胞可以是AAV包装细胞或AAV生产细胞。

如本文所用，术语将一种或多种质粒或载体“引入”到细胞中包括转化，以及任何形式的电穿孔、缀合、感染、转导或转染等。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生修饰的腺病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将本发明的核酸分子引入腺病毒载体。

优选地，所述核酸分子稳定整合到腺病毒载体基因组中。

在本发明的一些实施方案中，腺病毒载体基因组中的本发明核酸分子不包含任何功能性启动子并且其不与任何功能性启动子可操作地关联。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用本发明的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞；

(b)用第二腺病毒载体感染宿主细胞，

其中所述第二腺病毒载体包含含有转基因的重组AAV基因组，其中所述第一和第二腺病毒载体中的至少一种包含AAV cap基因；

(c)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养哺乳动物宿主细胞；以及

(d)从细胞或细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

至少一种腺病毒载体还包含足够的用于包装AAV基因组的辅助基因(例如E4、E1、E2a和VA)。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，所述载体包含

(i)含有转基因的重组AAV基因组，以及

(ii)AAV cap基因，

其中哺乳动物宿主细胞包含游离地位于宿主细胞内或稳定整合到宿主细胞基因组中的本发明的核酸分子；

(b)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养哺乳动物宿主细胞；以及

(c)从宿主细胞或细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

腺病毒载体还包含足够的用于包装AAV基因组的辅助基因(例如E4、E2a和VA，包括E2A基因)。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用本发明的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，

其中所述哺乳动物宿主细胞包含稳定整合到宿主细胞基因组中的重组AAV基因组，其中所述重组AAV基因组包含转基因，并且其中：

(i)所述腺病毒载体另外包含AAV cap基因，或

(ii)AAV cap基因稳定整合在哺乳动物宿主细胞基因组中，或

(iii)用包含AAV cap基因的第二腺病毒载体感染细胞；

(b)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养哺乳动物宿主细胞；以及

(c)从细胞或细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

存在于细胞中的至少一种腺病毒载体还包含足够的用于包装AAV基因组的辅助基因(例如E4、E1A、E1B和VA，以及任选的E2A基因)。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用本发明的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，其中：

(i)所述第一腺病毒载体还包含AAV cap基因，或

(ii)用包含AAV cap基因的第二腺病毒载体感染细胞；

(b)用包含转基因的重组AAV感染哺乳动物宿主细胞；

(c)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养哺乳动物宿主细胞；以及

(d)从细胞或细胞培养基中分离和/或纯化AAV颗粒。

被引入(感染)到细胞中的至少一种腺病毒载体还包含足够的用于包装AAV基因组的辅助基因(例如E4、E1A、E1B和VA，以及任选的E2A基因)。

步骤(a)和(b)中的步骤可以以任意顺序进行。最初可以通过任何合适的方式制备包含转基因的初始重组AAV。

在上述实施方案中，可以随后将包含转基因和腺病毒载体的初始重组AAV重新引入(例如重新感染)到另外的宿主细胞中以重复该过程。在腺病毒的主要晚期启动子受到调节的情况下，将主要产生AAV。因此，除了从上述实施方案产生的AAV(例如一部分)之外，可以通过向宿主细胞添加更多的腺病毒载体来重复该过程，从而通过添加更多的腺病毒载体来传代AAV。因此，可以根据需要重复步骤(a)和/或(b)。

有许多已建立的算法可用于比对两个氨基酸或核酸序列。通常，一个序列充当参考序列，测试序列可以与之比较。序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的氨基酸或核酸序列的比对可以例如通过计算机执行的算法(例如GAP、BESTFIT、FASTA或TFASTA)或BLAST和BLAST 2.0算法来进行。

氨基酸序列同一性百分比和核苷酸序列同一性百分比可以使用BLAST比对方法获得(Altschul等人(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofproteindatabase search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402；以及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。优选使用标准或默认比对参数。

标准蛋白质-蛋白质BLAST(blastp)可用于在蛋白质数据库中寻找相似序列。与其他BLAST程序一样，blastp旨在寻找局部相似区域。当序列相似性跨越整个序列时，blastp还会报告全局比对，这是蛋白质鉴定目的的首选结果。优选使用标准或默认比对参数。在一些情况下，可以取消“低复杂度过滤器”。

BLAST蛋白质搜索也可以使用BLASTX程序进行，分数＝50，字长＝3。为了获得用于比较目的的间隙比对(gapped alignment)，可以使用Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中所述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于执行迭代搜索，以检测分子之间的远距离关系。(参见同上的Altschul等人(1997)同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数。

关于核苷酸序列比较，MEGABLAST、不连续-megablast和blastn可用于实现这一目标。优选使用标准或默认比对参数。MEGABLAST被设计为专门用于有效地查找非常相似的序列之间的长比对。不连续MEGABLAST可用于发现与本发明的核酸相似但不相同的核苷酸序列。

BLAST核苷酸算法通过分解成称为单词的短子序列来找到相似的序列。该程序首先识别与查询词的完全匹配(单词命中)。然后，BLAST程序分多个步骤扩展这些单词命中，以生成最终的间隙比对。在一些实施方案中，可以用BLASTN程序执行BLAST核苷酸搜索，分数＝100，字长＝12。

控制BLAST搜索灵敏度的重要参数之一是字长。blastn比MEGABLAST更灵敏的最重要原因是它使用更短的默认字长(11)。正因为如此，blastn在查找与来自其他生物的相关核苷酸序列的比对方面优于MEGABLAST。字长在blastn中是可调整的，并且可以从默认值减小到最小值7以提高搜索灵敏度。

通过使用新引入的不连续megablast页面(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)，可以实现更灵敏的搜索。此页面使用的算法类似于Ma等人(Bioinformatics.2002Mar；18(3):440-5)报告的算法。不连续megablast不需要精确的单词匹配作为用于比对扩展的种子，而是在模板的较长窗口内使用不连续的单词。在编码模式中，通过关注在第一个和第二个密码子位置寻找匹配而忽略第三个位置的错配，以考虑第三个碱基摆动。使用相同字长在不连续MEGABLAST中搜索比使用相同字长的标准blastn更灵敏有效。不连续megablast的独特参数是：字长：11或12；模板：16、18或21；模板类型：编码(0)、非编码(1)或两者兼有(2)。

在一些实施方案中，可以使用默认参数来使用BLASTP 2.5.0+算法(例如可从NCBI获得)。

在另一些实施方案中，可以使用BLAST全局比对程序(例如可从NCBI获得)，使用具有以下间隙成本(gap costs)的两个蛋白质序列的Needleman-Wunsch比对：存在11和延伸1。

本文阐述的每个参考文献的公开内容通过引用整体而具体并入本文。

附图说明

图1：这显示了野生型AAV基因组的结构，示出了rep基因内的多种AAV启动子。

图2：AAVRep蛋白可以抑制腺病毒主要晚期启动子的基础转录。

图3：AAVRep DNA稳定整合和并随腺病毒基因组复制。

图4：与无辅助质粒转染方法相比，用TERA载体共感染显著增加了HEK293细胞中AAV的产生。

图5：与无辅助质粒转染方法相比，用编码AAV转移基因组和AAV2 cap的TERA载体和编码AAVRep78-68的TERA的共感染显著增加了HEK293细胞中AAV的产生。

图6：通过用TERA-AAV和TERA-RepCap共感染HEK293细胞或无辅助质粒转染产生AAV。结果显示为总AAV感染颗粒和转导颗粒相对于包含AAV颗粒的总基因组的比率。通过改进的TCID50方法进行定量，其中将AAV的连续稀释液添加到HEK293细胞中，并以最低稀释度对GFP阳性细胞计数。然后根据TCID50方法反向计算AAV滴度。

图7：证明本发明不干扰如WO2019/020992中公开的可抑制腺病毒系统。显示了总感染性腺病毒颗粒，表明当AAVRep和Cap基因整合到腺病毒载体中时，这种方法仍可用于防止AAV制剂的腺病毒污染。通过针对腺病毒六邻体序列的QPCR进行定量。

图8：证明将AAVRep、Cap和基因组整合到腺病毒载体中允许无质粒AAV生产，并且与基于质粒的生产方法相比显著提高产量。使用针对AAV载体中的EGFP表达盒的QPCR进行定量。

图9：编码AAV rep和AAV Cap基因的腺病毒载体的连续传代。相对于腺病毒六邻体序列，这些序列的QPCR定量表明，这些基因已被稳定插入并且可以在长时间内繁殖。

图10：显示来自TERA-RepCap的AAVRep表达的蛋白质印迹显示了AAVRep的所有主要同种型的表达。

图11：用编码AAVRep(TERA-RepCap、TERA2.0或TERA2.0+Dox)或AAV2参考材料的腺病毒载体感染的细胞的蛋白质印迹。

图12：证明与无辅助方法相比，当用一种编码来自AAV血清5型的Rep和Cap并且一种编码AAV基因组的两种腺病毒载体(TERA2.0)感染细胞时，AAV产量更高。

图13：证明与无辅助方法相比，当用一种编码来自AAV血清6型的Rep和Cap并且一种编码AAV基因组的两种腺病毒载体(TERA2.0)感染细胞时，AAV产量更高。

图14：证明与无辅助方法相比，当用一种编码来自AAV血清9型的Rep和Cap并且一种编码AAV基因组的两种腺病毒载体(TERA2.0)感染细胞时，AAV产量更高。

图15A表明与编码Rep的质粒或三重质粒/无辅助方法相比，将Rep编码序列整合到腺病毒载体中显著增加了AAV产量。图15B表明，即使当Rep启动子由强CMV启动子驱动时，整合到腺病毒载体中的AAV生产力也显著优越。

实施例

本发明通过以下实施例进一步说明，其中份数和百分比以重量计，度数以摄氏度计，除非另有说明。应当理解，这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，根据前面的描述，除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

在以下实施例中，提及“TERA载体”是指腺病毒载体，其中来自主要晚期启动子的晚期腺病毒基因的转录受到调节，如WO2019/020992中所述。WO2019/020992公开了可以通过将阻遏元件插入主要晚期启动子来调节(例如抑制)晚期腺病毒基因的转录。通过“关闭”腺病毒晚期基因的表达，细胞的蛋白质制造能力可以转向生产期望的重组蛋白或AAV颗粒。

WO2019/020992公开了在主要晚期启动子中包含阻遏元件的腺病毒载体也可以在下游编码TetR蛋白，并且在主要晚期启动子的转录控制下。在没有多西环素的情况下，TetR蛋白将与主要晚期启动子阻遏元件结合并阻止启动子的活性。在多西环素存在的情况下，TetR蛋白不能与主要晚期启动子中的阻遏元件结合。因此，在存在多西环素的情况下，腺病毒的主要晚期启动子是活性的并且腺病毒的结构基因被表达并且病毒可以复制。

载体“TERA-AAV”编码AAV转移基因组。

载体“TERA-RepCap”编码AAV Rep和Cap。在这种构建体中，没有功能性Rep p5或p40启动子；不存在Rep腺病毒抑制剂序列；并且Rep p19启动子已被修饰以缺失TATA框，尽管启动子仍然是功能性的。rep基因插入在腺病毒的E1区。Cap由CMV启动子表达。cap基因插入在腺病毒的E1区。CMV启动子的转录方向不朝向Rep编码序列。

TERA2.0方法是指将TERA-AAV和TERA-RepCap添加到细胞的过程。

载体TERA-RepCap5、TERA-RepCap6和TERA-RepCap9分别编码来自AAV5、AAV6或AAV9的AAVRep和Cap基因。在TERA-RepCap5中，Cap基因由最小CMV启动子区域驱动。在TERA-RepCap6和TERA-RepCap9中，Cap基因由全长CMV启动子驱动。在这些构建体中，没有功能性Rep p5或p40启动子；不存在Rep腺病毒抑制剂序列；并且Rep p19启动子已被修饰以消除TATA框，尽管该启动子仍然是功能性的。rep基因插入在腺病毒的E1区。Cap基因表达盒插入在腺病毒的E1区。最小CMV启动子或全长CMV启动子的转录方向不朝向Rep编码序列。

三重质粒转染或无辅助方法是指腺病毒辅助质粒(与腺病毒的用途相反)、编码自然界中发现的AAVRep和Cap的质粒、以及包含在AAV ITR之间插入了CMV驱动的EGFP表达盒的AAV基因组的质粒的转染。

质粒pRepCap2、pRepCap5、pRepCap6、pRepCap9分别编码来自AAV2、AAV5、AAV6或AAV9的AAVRep和Cap基因。在这些构建体中，AAVrep和Cap基因的配置与它们在自然界中发现的一样。

质粒pAAV-EGFP编码来自AAV基因组的左和右ITR。在ITR之间插入了驱动EGFP报告基因的表达的CMV启动子，然后是多腺苷酸化信号。

质粒pHelper包含AAV辅助所需的腺病毒序列。这包括E4区、E2A区和VA基因。该质粒不编码腺病毒E1区，因为它存在于本文所述研究中使用的HEK293细胞中。

实施例1：AAVRep蛋白抑制腺病毒主要晚期启动子的转录

为了确定AAVRep蛋白对腺病毒主要晚期启动子(MLP)转录的影响，通过分子克隆方法将野生型MLP或TetR可抑制MLP序列插入表达EGFP报告蛋白的质粒中。将MLP启动子质粒与对照CMV质粒或在CMV启动子控制下表达AAVRep78、Rep68、Rep52或Rep40的质粒构建体共转染到HEK293细胞中。转染后48小时通过流式细胞术对EGFP报告基因表达进行量化。

结果如图2A和2B所示。这些结果表明，Rep蛋白的高表达抑制了腺病毒主要晚期启动子或包含TetR结合位点的修饰形式的主要晚期启动子的活性。

实施例2：AAVRep DNA稳定整合并随腺病毒基因组复制

为了构建编码AAVRep78和Rep68多肽的腺病毒载体，将p5和p19启动子(参与AAVRep52和AAVRep40的转录)和p40腺病毒抑制剂序列乱序(同时保留AAVRep78和Rep68多肽)，并通过分子克隆方法插入腺病毒载体的E1缺失区。

这导致产生了图3B中所示的载体，其中腺病毒载体编码Rep编码序列以及表达EGFP的AAV基因组。

将腺病毒载体基因组转染到HEK293细胞中，并在转染后约15天在观察到完全细胞病变效应后收获病毒载体。随后将载体在HEK293细胞中传代(>5)，并用脱氧核糖核酸酶处理腺病毒颗粒以降解任何封装的DNA。通过QPCR确定AAV Rep基因和腺病毒六邻体基因序列的存在。结果如图3A所示，并且载体如图3B所示。

图3A表明AAVRep编码DNA和腺病毒六邻体DNA的频率相等，证明插入腺病毒基因组的Rep DNA是稳定的。

实施例3：与无辅助质粒转染方法相比，用TERA载体共感染显著增加了HEK293细胞中AAV的产生。

将HEK293细胞以9e4个细胞/孔接种在48孔组织培养板中24小时。将细胞用无辅助质粒进行三重转染，或在0.5ug/ml多西环素或DMSO存在下用以下进行共转染：A)编码具有EGFP表达盒的AAV转移基因组和由CMV启动子驱动的AAV2 Cap2基因的TERA(TERA-AAV-Cap)，MOI为100，和B)编码具有EGFP表达盒的AAV转移基因组和AAV Rep78-68的TERA(TERA-AAV-Rep)，MOI为50。在转导96小时后收获AAV载体，并通过QPCR对封装的AAV颗粒和污染的腺病毒颗粒进行定量。

结果如图4A所示，并且载体如图4B所示。这些结果表明，可以使用TERA-AAV-Cap和TERA-AAV-Rep的组合以高滴度生产AAV。图4A显示所达到的滴度明显高于使用三重转染或无辅助方法所达到的滴度。图4B显示了包含TERA-AAV-Rep和TERA-AAV-Cap的AAV成分的腺病毒基因组的示意图。

实施例4：与无辅助质粒转染方法相比，用编码AAV转移基因组和AAV2 cap的TERA载体和编码AAVRep78-68的TERA的共感染显著增加了HEK293细胞中AAV的产生。

将HEK293细胞以9e4个细胞/孔接种在48孔组织培养板中24小时。将细胞用无辅助质粒进行三重转染或在0.5ug/ml多西环素或DMSO存在下用以下进行共转染(以表明的MOI)：A)TERA-AAV-Cap、B)TERA-AAV-Rep或C)编码AAV Rep78-68的TERA(TERA-Rep78-68)。在转导96小时后收获AAV载体，并通过QPCR对封装的AAV颗粒和污染的腺病毒颗粒进行定量。

结果如图5所示。这些结果表明，包含所有AAV成分的两种病毒提供了改进的AAV滴度，远远高于无辅助/三重质粒转染方法所达到的滴度。各种病毒载体组合如图5所示，展示了该方法的灵活性和多功能性。在每次生产运行中，至少一种病毒载体包含本发明的Rep构建体。

实施例5：使用TERA2.0系统在HEK293细胞中产生AAV2载体，TERA2.0系统由两种TERA载体组成，一种编码AAV转移基因组，第二种编码AAV rep和cap。

直到本文描述的本发明的开发，才可能将AAVRep和Cap二者编码到单个腺病毒载体中。为了简化AAV制造方法，构建了编码来自血清2型的AAV Rep和AAV衣壳二者的新腺病毒载体(TERA-RepCap)。在本实施例中，测试了使用这种新腺病毒载体(TERA-RepCap)与TERA-AAV相结合的AAV生产，这种方法称为TERA-2.0。该方法与三重质粒转染/无辅助方法进行了比较。

将HEK293细胞用TERA-AAV和TERA-RepCap感染以体现TERA2.0方法，每种的MOI为25。

此外，用无辅助质粒(pAAV-EGFP；pRepCap2；pHelper)对HEK293细胞进行三重转染。在载体收获前将细胞培养4天。将样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并通过qPCR使用针对EGFP转基因的引物和探针进行定量。将从这两种方法产生的AAV载体用于感染新鲜的HEK293细胞并通过TCID50测定量化转导单位。

结果如图6所示。右轴上显示的基因组拷贝(GC)与转导单位(TU)的比率是通过将由qPCR确定的完整AAV颗粒除以从TCID50测定中测量的转导单位来确定的。该实施例的结果表明，与由三重质粒转染产生的制备物相比，使用TERA2.0感染细胞(用TERA-AAV和TERA-RepCap共感染)能够使转导活性AAV载体的产生增加1000倍。

实施例6：确定使用TERA2.0方法的AAV2生产过程的污染腺病毒水平。

在使用TERA2.0方法(用TERA-AAV和TERA-RepCap共感染，每种的MOI为25)感染并用0.5ug/ml多西环素或DMSO(-DOX)培养4天的HEK293细胞中进行AAV生产。在不存在多西环素(DMSO组)的情况下，腺病毒晚期基因被抑制，并且病毒复制周期被截断。此外，生长培养基中多西环素的存在使来自TERA载体的晚期腺病毒基因的表达和腺病毒的产生成为可能。通过三轮冻融收获载体，并通过感染新鲜HEK293细胞和用0.5ug/ml多西环素培养来通过TCID50测定法检测污染腺病毒。

该实施例表明，在不存在多西环素的情况下使用两种TERA载体(一种编码AAV转移基因组，另一种编码AAVRep和Cap)生产AAV载体显著抑制了腺病毒的复制并产生了干净的AAV制剂。与多西环素存在下AAV的产生相比，观察到污染腺病毒减少了9log以上。

实施例7：在1L搅拌罐生物反应器中，与三重质粒转染方法相比，使用TERA2.0系统在HEK293细胞中生产AAV2载体。

使用TERA2.0方法(用TERA-AAV和TERA-RepCap共感染)感染HEK293细胞悬浮液，每种的MOI为25TCID50单位/细胞。

此外，用无辅助质粒(pAAV-EGFP；pRepCap2；pHelper)对HEK293细胞进行三重转染。在载体收获前将细胞培养4天。将样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并通过qPCR使用针对EGFP转基因的引物和探针进行定量，以确定完整颗粒(病毒基因组(VG))的滴度。

该实施例表明，在悬浮适应的HEK293细胞中，可以使用编码AAV转移基因组以及AAVRep和Cap的TERA载体的共感染来产生AAV2载体。通过这种方法获得的AAV2载体滴度使完整颗粒增加了超过100倍。

实施例8：通过qPCR评估编码AAV rep和cap的TERA载体的遗传稳定性。

将编码TERA-RepCap的质粒DNA转染到HEK293细胞中进行载体回收，并通过连续传代进一步扩增。在HYPERFlask细胞培养容器中感染HEK293细胞(MOI-15)。3天后收获载体并通过氯化铯超速离心纯化以产生连续传代4。重复该过程以产生载体传代5、6和7。从每个传代的纯化的TERA-RepCap载体中提取DNA，并通过qPCR对AAV2 rep和cap以及Ad5六邻体基因进行量化。图9中的数据显示了AAV2 rep和cap基因相对于Ad5六邻体的拷贝数，并与编码TERA-RepCap的DNA质粒进行了比较(无显著性差异，双因素ANOVA)。

该实施例表明，在HEK293细胞中连续传代期间，AAVRep和Cap基因在TERA载体内稳定繁殖。

实施例9：评估来自编码AAV rep和cap的TERA载体的AAVRep表达。来自使用TERA2.0方法的AAV生产过程的Rep蛋白的蛋白质印迹检测。

将HEK293细胞用编码AAV转移基因组(TERA-AAV)以及AAV Rep和Cap(TERA-RepCap)的TERA载体共感染(每种MOI-25)。在感染24小时和48小时后收获样品，并通过蛋白质印迹用AAV2 Rep抗体探测总细胞提取物(25uL)。数据呈现为重复的生物学重复。

结果如图10所示。该实施例表明，编码AAV Rep和Cap的TERA载体表达了高水平的AAVRep 52和40，并且还表达了低水平的Rep78和Rep68。

实施例10：评估来自使用编码AAV rep和cap的TERA载体产生的颗粒的AAV2衣壳蛋白。

将HEK293细胞用TERA-AAV和TERE-RepCap(在存在或不存在0.5μg/mL多西环素的情况下)共感染(每种MOI-25)，或通过50GC/细胞的AAV2颗粒(由TERA2.0产生)和TERA-RepCap(MOI-25)共转染。在感染96小时后收获样品并用抗AAV2 VP1/2/3抗体探测细胞裂解物(25uL)。

结果如图11所示；还显示了标准AAV2(ATCC VR-1616)。该结果表明，AAV2衣壳亚基VP1、VP2和VP3的相对组成与来自参考标准的AAV2载体以及来自三重质粒转染方法产生的材料相同。

实施例11：使用TERA2.0系统在HEK293细胞中产生AAV5载体，TERA2.0系统由两种TERA载体组成，一种编码AAV转移基因组，第二种编码AAV rep和cap5。将AAV生产与三重质粒转染方法进行比较。

使用前面描述的TERA2.0方法感染HEK293细胞，但其中AAV2衣壳更换为来自AAV血清5型的衣壳(TERA-AAV和TERA-RepCap5，其中Rep不从异源启动子表达，而Cap5从最小CMV启动子表达)。以25的MOI使用TERA-AAV，并且以75个基因组拷贝(GC)/细胞使用TERA-RepCap5。替代地，将HEK293细胞用无辅助质粒(pAAV-EGFP；pRepCap5；pHelper)进行三重转染。在载体收获前将细胞培养4天。样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并使用针对EGFP转基因的引物和探针通过qPCR进行定量。

结果如图12所示。该实施例的结果表明，与三重质粒转染/无辅助方法相比，编码AAV转移基因组以及AAV rep和cap5基因的两种TERA载体的共感染能够使完整的AAV5颗粒增加超过16倍。

实施例12：使用TERA2.0系统在HEK293细胞中产生AAV6载体，TERA2.0系统由两种TERA载体组成，一种编码AAV转移基因组，第二种编码AAVRep和Cap6。将AAV生产与三重质粒转染方法进行比较。

使用前面描述的TERA2.0方法感染HEK293细胞，但其中AAV2衣壳更换为来自AAV血清6型的衣壳(TERA-AAV和TERA-RepCap6)。以25的MOI使用TERA-AAV，并且以75个基因组拷贝(GC)/细胞使用TERA-RepCap6。另外，将HEK293细胞用无辅助质粒(pAAV-EGFP；pRepCap6；pHelper)进行三重转染。在载体收获前将细胞培养4天。样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并使用针对EGFP转基因的引物和探针通过qPCR进行定量。

结果如图13所示。该实施例的结果表明，与三重质粒转染/无辅助方法相比，编码AAV转移基因组以及AAVRep和Cap6基因的两种TERA载体的共感染能够使完整的AAV6颗粒增加超过18倍。

实施例13：使用TERA2.0系统在HEK293细胞中产生AAV9载体，TERA2.0系统由两种TERA载体组成，一种编码AAV转移基因组，第二种编码AAVRep和Cap9。将AAV生产与三重质粒转染方法进行比较。

使用前面描述的TERA2.0方法感染HEK293细胞，但其中AAV2衣壳更换为来自AAV血清9型的衣壳(TERA-AAV和TERA-RepCap9)。以25的MOI使用TERA-AAV，并且以50个基因组拷贝(GC)/细胞使用TERA-RepCap9。另外，将HEK293细胞用无辅助质粒(pAAV-EGFP；pRepCap9；pHelper)进行三重转染。在载体收获前将细胞培养4天。样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并使用针对EGFP转基因的引物和探针通过qPCR进行定量。

结果如图14所示。该实施例的结果表明，与三重质粒转染/无辅助方法相比，编码AAV转移基因组以及AAV rep和Cap9基因的两种TERA载体的共感染能够使完整的AAV9颗粒增加超过8.5倍。

实施例14:与无辅助质粒方法或用编码由天然AAV p5启动子驱动的Rep编码序列的质粒替换TERA-Rep相比，在HEK293细胞中使用I)编码AAVRep(TERA-Rep)和II)编码由CMV启动子驱动的AAV-EGFP和AAV Cap2表达盒(ERA-AAV-EGFP-Cap2)的两种TERA载体产生AAV2载体。

为了产生AAV2-EGFP载体，将HEK293细胞用TERA-Rep(MOI5、10或50)和TERA-AAV-EGFP-Cap2(MOI100)共感染。将这与用质粒p5-Rep(其中Rep78/68多肽由其天然p5启动子表达)转染并且用TERA-AAV-EGFP-Cap2(MOI100)感染的HEK293细胞进行比较。在载体收获前将细胞培养4天。样品在37℃下用脱氧核糖核酸酶处理2小时，并通过qPCR使用针对EGFP转基因的引物和探针进行定量。将完整AAV2-EGFP的生产力与无辅助转染方法(HF)进行比较，无辅助转染方法中HEK293细胞用AAV转移基因组质粒(pAAV-EGFP)、质粒pRepCap2和质粒pHelper转染。对照样品用填充DNA(pUC19)代替pRepCap2转染，以控制脱氧核糖核酸酶处理的效率。

图15A的结果显示与通过其中Rep由天然p5 AAV启动子表达的转染和通过无辅助质粒的转染实现Rep表达质粒相比，TERA-Rep和TERA-AAV-EGFP-Cap2两种TERA载体的共转染产生了显著更多量的完整AAV2载体。

图15B中的结果显示了与图15A中相同的实验，但其中驱动Rep表达的p5启动子被强CMV启动子替换；相对于TERA-Rep的使用，这不会提高AAV的生产力。

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序列

SEQ ID NO:1

Rep核苷酸序列(AAV血清2型)

atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG

SEQ ID NO:2

Cap核苷酸序列(AAV血清2型)

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SEQ ID NO:3

Cap氨基酸序列(AAV血清2型)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:4

gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgcc

SEQ ID NO:5

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SEQ ID NO:6

gtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtac

SEQ ID NO:7

gtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtacctcagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtac

SEQ ID NO:8

Ggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggt

SEQ ID NO:9

gtgacaaaacaagaggtgaaggacttctttcgttgggccaaagaccatgtggtcgaggtcgaacacgagttctatgtgaagaaaggaggcgcgaagaagcgcccagcgccatcggacgctgacatctccgaaccgaagcgcgtgagagagagcgtggcacaaccatcaacctcggatgccgaggcatccatcaattatgcggacaggt

SEQ ID NO:10

Gtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggt

SEQ ID NO:11gtgacaaaacaagaggtgaaggacttctttcgttgggccaaagaccatgtggtcgaggtcgaacacgagttctatgtgaagaaaggaggcgcgaagaagcgcccagcgccatcggacgctgacatctccgaaccgaagcgcgtgagagagagcgtggcacaaccatcaacctcggatgccgaggcatccatcaattatgcggacaggt

SEQ ID NO:12

atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtacctcagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtcatcgacggaaatagcaccactttcgagcatcaacagcctctgcaggatcggatgtttaagttcgagctgacgaggcggctcgaccatgatttcgggaaagtgacaaaacaagaggtgaaggacttctttcgttgggccaaagaccatgtggtcgaggtcgaacacgagttctatgtgaagaaaggaggcgcgaagaagcgcccagcgccatcggacgctgacatctccgaaccgaagcgcgtgagagagagcgtggcacaaccatcaacctcggatgccgaggcatccatcaattatgcggacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagatgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaattcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctga

SEQ ID NO:13

TetR结合位点

tccctatcag tgatagaga

SEQ ID NO:14

修饰的MLP

cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg

ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca

SEQ ID NO:15

修饰的MLP

cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta

tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca

SEQ ID NO:16

Rep52核苷酸序列

CATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgaCTGCATCTTTGAACAATAG

SEQ ID NO:17

Rep40核苷酸序列

ATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagattggctcgaggacactctctcTAG

SEQ ID NO:18

Rep52氨基酸序列(AAV血清2型)

MELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ*

SEQ ID NO:19

Rep40氨基酸序列(AAV血清2型)

MELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRLARGHSL*

SEQ ID NO:20

Rep78核苷酸序列(AAV血清2型)

atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgggcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtacctcagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG

SEQ ID NO:21

Rep68核苷酸序列(AAV血清2型)

ATGCCGGGGTTTTACGAGattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtGGACTAATATGGAACAGTACCTCAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagTAG

SEQ ID NO:22

Rep78氨基酸序列(AAV血清2型)

MPGFYEIVIKVPSDLDGHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDMDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHMHVLVETTGVKSMVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNMEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ*

SEQ ID NO:23

Rep68氨基酸序列(AAV血清2型)

MPGFYEIVIKVPSDLDEHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDMDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHMHVLVETTGVKSMVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNMEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYAD*

序列表自由文本

<210>1

<213>Rep核苷酸序列(腺相关病毒2)

<210>2

<213>Cap核苷酸序列(腺相关病毒2)

<210>3

<213>Cap氨基酸序列(腺相关病毒2)

<210>4

<213>野生型腺相关病毒2p5启动子

<210>5

<213>形成智人β-珠蛋白基因5'-非翻译区(UTR)的一部分的序列

<210>6

<213>野生型腺相关病毒2p19启动子

<210>7

<223>非功能性p19序列

<210>8

<213>野生型腺相关病毒2p40启动子

<210>9

<223>非功能性p40启动子序列

<210>10

<213>野生型腺相关病毒2腺病毒抑制剂

<210>11

<223>不含功能性p40启动子序列的核苷酸序列

<210>12

<223>具有消除了p19和p40启动子的rep基因序列，保留Rep78和Rep68编码序列

<210>13

<223>TetR结合位点

<210>14

<223>修饰的MLP

<210>15

<223>修饰的MLP

<210>16

<223>Rep52核苷酸序列

<210>17

<223>Rep40核苷酸序列

<210>18

<213>Rep52氨基酸序列(腺相关病毒2)

<210>19

<213>Rep40氨基酸序列(腺相关病毒2)

<210>20

<213>Rep78核苷酸序列(腺相关病毒2)

<210>21

<213>Rep68核苷酸序列(腺相关病毒2)

<210>22

<213>Rep78氨基酸序列(腺相关病毒2)

<210>23

<213>Rep68氨基酸序列(腺相关病毒2)

序列表

<110> 牛津遗传学有限公司；

牛津大学创新有限公司

<120> 用于制备腺相关病毒载体的方法

<130> FSP1V223463ZX

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1866

<212> DNA

<213> Rep核苷酸序列(腺相关病毒2)

<400> 1

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caatag 1866

<210> 2

<211> 2559

<212> DNA

<213> Cap核苷酸序列(腺相关病毒2)

<400> 2

cagttgcgca gccatcgacg tcagacgcgg aagcttcgat caactacgca gacaggtacc 60

aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg 120

agagaatgaa tcagaattca aatatctgct tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt 180

gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt 240

gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca 300

atgtggattt ggatgactgc atctttgaac aataaatgat ttaaatcagg tatggctgcc 360

gatggttatc ttccagattg gctcgaggac actctctctg aaggaataag acagtggtgg 420

aagctcaaac ctggcccacc accaccaaag cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg 480

ggtcttgtgc ttcctgggta caagtacctc ggacccttca acggactcga caagggagag 540

ccggtcaacg aggcagacgc cgcggccctc gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc 600

gacagcggag acaacccgta cctcaagtac aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc 660

cttaaagaag atacgtcttt tgggggcaac ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag 720

agggttcttg aacctctggg cctggttgag gaacctgtta agacggctcc gggaaaaaag 780

aggccggtag agcactctcc tgtggagcca gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc 840

cagcagcctg caagaaaaag attgaatttt ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct 900

gacccccagc ctctcggaca gccaccagca gccccctctg gtctgggaac taatacgatg 960

gctacaggca gtggcgcacc aatggcagac aataacgagg gcgccgacgg agtgggtaat 1020

tcctcgggaa attggcattg cgattccaca tggatgggcg acagagtcat caccaccagc 1080

acccgaacct gggccctgcc cacctacaac aaccacctct acaaacaaat ttccagccaa 1140

tcaggagcct cgaacgacaa tcactacttt ggctacagca ccccttgggg gtattttgac 1200

ttcaacagat tccactgcca cttttcacca cgtgactggc aaagactcat caacaacaac 1260

tggggattcc gacccaagag actcaacttc aagctcttta acattcaagt caaagaggtc 1320

acgcagaatg acggtacgac gacgattgcc aataacctta ccagcacggt tcaggtgttt 1380

actgactcgg agtaccagct cccgtacgtc ctcggctcgg cgcatcaagg atgcctcccg 1440

ccgttcccag cagacgtctt catggtgcca cagtatggat acctcaccct gaacaacggg 1500

agtcaggcag taggacgctc ttcattttac tgcctggagt actttccttc tcagatgctg 1560

cgtaccggaa acaactttac cttcagctac acttttgagg acgttccttt ccacagcagc 1620

tacgctcaca gccagagtct ggaccgtctc atgaatcctc tcatcgacca gtacctgtat 1680

tacttgagca gaacaaacac tccaagtgga accaccacgc agtcaaggct tcagttttct 1740

caggccggag cgagtgacat tcgggaccag tctaggaact ggcttcctgg accctgttac 1800

cgccagcagc gagtatcaaa gacatctgcg gataacaaca acagtgaata ctcgtggact 1860

ggagctacca agtaccacct caatggcaga gactctctgg tgaatccggg cccggccatg 1920

gcaagccaca aggacgatga agaaaagttt tttcctcaga gcggggttct catctttggg 1980

aagcaaggct cagagaaaac aaatgtggac attgaaaagg tcatgattac agacgaagag 2040

gaaatcagga caaccaatcc cgtggctacg gagcagtatg gttctgtatc taccaacctc 2100

cagagaggca acagacaagc agctaccgca gatgtcaaca cacaaggcgt tcttccaggc 2160

atggtctggc aggacagaga tgtgtacctt caggggccca tctgggcaaa gattccacac 2220

acggacggac attttcaccc ctctcccctc atgggtggat tcggacttaa acaccctcct 2280

ccacagattc tcatcaagaa caccccggta cctgcgaatc cttcgaccac cttcagtgcg 2340

gcaaagtttg cttccttcat cacacagtac tccacgggac aggtcagcgt ggagatcgag 2400

tgggagctgc agaaggaaaa cagcaaacgc tggaatcccg aaattcagta cacttccaac 2460

tacaacaagt ctgttaatgt ggactttact gtggacacta atggcgtgta ttcagagcct 2520

cgccccattg gcaccagata cctgactcgt aatctgtaa 2559

<210> 3

<211> 735

<212> PRT

<213> Cap氨基酸序列(腺相关病毒2)

<400> 3

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

435 440 445

Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

450 455 460

Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly

465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

580 585 590

Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

690 695 700

Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 4

<211> 130

<212> DNA

<213> 野生型腺相关病毒2 p5启动子

<400> 4

gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat gtggtcacgc 60

tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga ggtttgaacg 120

cgcagccgcc 130

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 形成智人β-珠蛋白基因5'-非翻译区(UTR)的一部分的序列

<400> 5

agatctttgt cgatcctacc atccactcga cacacccgcc agcggccgct gccaagcttc 60

cgagctctcg aattc 75

<210> 6

<211> 273

<212> DNA

<213> 野生型腺相关病毒2 p19启动子

<400> 6

gtcacaaaga ccagaaatgg cgccggaggc gggaacaagg tggtggatga gtgctacatc 60

cccaattact tgctccccaa aacccagcct gagctccagt gggcgtggac taatatggaa 120

cagtatttaa gcgcctgttt gaatctcacg gagcgtaaac ggttggtggc gcagcatctg 180

acgcacgtgt cgcagacgca ggagcagaac aaagagaatc agaatcccaa ttctgatgcg 240

ccggtgatca gatcaaaaac ttcagccagg tac 273

<210> 7

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非功能性p19序列

<400> 7

gtcacaaaga ccagaaatgg cgccggaggc gggaacaagg tggtggatga gtgctacatc 60

cccaattact tgctccccaa aacccagcct gagctccagt gggcgtggac taatatggaa 120

cagtacctca gcgcctgttt gaatctcacg gagcgtaaac ggttggtggc gcagcatctg 180

acgcacgtgt cgcagacgca ggagcagaac aaagagaatc agaatcccaa ttctgatgcg 240

ccggtgatca gatcaaaaac ttcagccagg tac 273

<210> 8

<211> 209

<212> DNA

<213> 野生型腺相关病毒2 p40启动子

<400> 8

ggtcaccaag caggaagtca aagacttttt ccggtgggca aaggatcacg tggttgaggt 60

ggagcatgaa ttctacgtca aaaagggtgg agccaagaaa agacccgccc ccagtgacgc 120

agatataagt gagcccaaac gggtgcgcga gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc 180

ggaagcttcg atcaactacg cagacaggt 209

<210> 9

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非功能性p40启动子序列

<400> 9

gtgacaaaac aagaggtgaa ggacttcttt cgttgggcca aagaccatgt ggtcgaggtc 60

gaacacgagt tctatgtgaa gaaaggaggc gcgaagaagc gcccagcgcc atcggacgct 120

gacatctccg aaccgaagcg cgtgagagag agcgtggcac aaccatcaac ctcggatgcc 180

gaggcatcca tcaattatgc ggacaggt 208

<210> 10

<211> 208

<212> DNA

<213> 野生型腺相关病毒2腺病毒抑制剂

<400> 10

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 60

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 120

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 180

gaagcttcga tcaactacgc agacaggt 208

<210> 11

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有功能性p40启动子序列的核苷酸序列

<400> 11

gtgacaaaac aagaggtgaa ggacttcttt cgttgggcca aagaccatgt ggtcgaggtc 60

gaacacgagt tctatgtgaa gaaaggaggc gcgaagaagc gcccagcgcc atcggacgct 120

gacatctccg aaccgaagcg cgtgagagag agcgtggcac aaccatcaac ctcggatgcc 180

gaggcatcca tcaattatgc ggacaggt 208

<210> 12

<211> 1932

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有消除了p19和p40启动子的rep基因序列，保留

Rep78和Rep68编码序列

<400> 12

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtacctcag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt catcgacgga aatagcacca ctttcgagca tcaacagcct 1320

ctgcaggatc ggatgtttaa gttcgagctg acgaggcggc tcgaccatga tttcgggaaa 1380

gtgacaaaac aagaggtgaa ggacttcttt cgttgggcca aagaccatgt ggtcgaggtc 1440

gaacacgagt tctatgtgaa gaaaggaggc gcgaagaagc gcccagcgcc atcggacgct 1500

gacatctccg aaccgaagcg cgtgagagag agcgtggcac aaccatcaac ctcggatgcc 1560

gaggcatcca tcaattatgc ggacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagatgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataaatga tttaattcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920

cactctctct ga 1932

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TetR结合位点

<400> 13

tccctatcag tgatagaga 19

<210> 14

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的MLP

<400> 14

cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg 60

ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107

<210> 15

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的MLP

<400> 15

cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta 60

tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107

<210> 16

<211> 1195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rep52核苷酸序列

<400> 16

catggagctg gtcgggtggc tcgtggacaa ggggattacc tcggagaagc agtggatcca 60

ggaggaccag gcctcataca tctccttcaa tgcggcctcc aactcgcggt cccaaatcaa 120

ggctgccttg gacaatgcgg gaaagattat gagcctgact aaaaccgccc ccgactacct 180

ggtgggccag cagcccgtgg aggacatttc cagcaatcgg atttataaaa ttttggaact 240

aaacgggtac gatccccaat atgcggcttc cgtctttctg ggatgggcca cgaaaaagtt 300

cggcaagagg aacaccatct ggctgtttgg gcctgcaact accgggaaga ccaacatcgc 360

ggaggccata gcccacactg tgcccttcta cgggtgcgta aactggacca atgagaactt 420

tcccttcaac gactgtgtcg acaagatggt gatctggtgg gaggagggga agatgaccgc 480

caaggtcgtg gagtcggcca aagccattct cggaggaagc aaggtgcgcg tggaccagaa 540

atgcaagtcc tcggcccaga tagacccgac tcccgtgatc gtcacctcca acaccaacat 600

gtgcgccgtg attgacggga actcaacgac cttcgaacac cagcagccgt tgcaagaccg 660

gatgttcaaa tttgaactca cccgccgtct ggatcatgac tttgggaagg tcaccaagca 720

ggaagtcaaa gactttttcc ggtgggcaaa ggatcacgtg gttgaggtgg agcatgaatt 780

ctacgtcaaa aagggtggag ccaagaaaag acccgccccc agtgacgcag atataagtga 840

gcccaaacgg gtgcgcgagt cagttgcgca gccatcgacg tcagacgcgg aagcttcgat 900

caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga atctgatgct 960

gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct tcactcacgg 1020

acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt ctgtcgtcaa 1080

aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc cagacgcttg 1140

cactgcctgc gatctggtca atgtggattt ggatgactgc atctttgaac aatag 1195

<210> 17

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rep40核苷酸序列

<400> 17

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900

aactacgcag acagattggc tcgaggacac tctctctag 939

<210> 18

<211> 397

<212> PRT

<213> Rep52氨基酸序列(腺相关病毒2)

<400> 18

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

305 310 315 320

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

325 330 335

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

340 345 350

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

355 360 365

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

370 375 380

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

385 390 395

<210> 19

<211> 312

<212> PRT

<213> Rep40氨基酸序列(腺相关病毒2)

<400> 19

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

20 25 30

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

35 40 45

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

50 55 60

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

85 90 95

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

115 120 125

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

130 135 140

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

145 150 155 160

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

165 170 175

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

180 185 190

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

210 215 220

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

245 250 255

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

275 280 285

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

290 295 300

Arg Leu Ala Arg Gly His Ser Leu

305 310

<210> 20

<211> 1866

<212> DNA

<213> Rep78核苷酸序列(腺相关病毒2)

<400> 20

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtacctcag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caatag 1866

<210> 21

<211> 1589

<212> DNA

<213> Rep68核苷酸序列(腺相关病毒2)

<400> 21

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtacctcag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacagtag 1589

<210> 22

<211> 621

<212> PRT

<213> Rep78氨基酸序列(腺相关病毒2)

<400> 22

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp

1 5 10 15

Gly His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu

20 25 30

Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile

35 40 45

Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu

50 55 60

Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val

65 70 75 80

Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu

85 90 95

Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu

115 120 125

Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys

145 150 155 160

Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu

165 170 175

Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His

180 185 190

Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn

195 200 205

Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

225 230 235 240

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

245 250 255

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

260 265 270

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

275 280 285

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

290 295 300

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

305 310 315 320

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

340 345 350

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

355 360 365

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

370 375 380

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

385 390 395 400

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

405 410 415

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

420 425 430

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

435 440 445

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

450 455 460

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

465 470 475 480

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

485 490 495

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

500 505 510

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

515 520 525

Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu

530 535 540

Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys

545 550 555 560

Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu

565 570 575

Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr

580 585 590

Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp

595 600 605

Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln

610 615 620

<210> 23

<211> 528

<212> PRT

<213> Rep68氨基酸序列(腺相关病毒2)

<400> 23

Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp

1 5 10 15

Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu

20 25 30

Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile

35 40 45

Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu

50 55 60

Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val

65 70 75 80

Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu

85 90 95

Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu

115 120 125

Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly

130 135 140

Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys

145 150 155 160

Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu

165 170 175

Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His

180 185 190

Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn

195 200 205

Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys

225 230 235 240

Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala

245 250 255

Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys

260 265 270

Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln

275 280 285

Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu

290 295 300

Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala

305 310 315 320

Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro

340 345 350

Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp

355 360 365

Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala

370 375 380

Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg

385 390 395 400

Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val

405 410 415

Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser

420 425 430

Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe

435 440 445

Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln

450 455 460

Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val

465 470 475 480

Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala

485 490 495

Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val

500 505 510

Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp

515 520 525

Claims (24)

1.一种核酸分子，其中所述核酸分子的核苷酸序列编码至少一种AAVRep多肽，其中所述Rep多肽编码序列具有以下特征中的两个或三个：

(i)其不与功能性AAVp5启动子可操作地关联；

(ii)其不包含功能性AAVp19启动子和/或其不编码功能性Rep52和Rep40多肽；

(iii)其不包含功能性AAVp40启动子和/或其不包含功能性腺病毒抑制剂序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码功能性AAV Rep78和Rep68多肽。

3.如权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，其中所述核酸分子不包含p5启动子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其中所述Rep多肽编码序列具有以下特征：

(i)其不与功能性AAVp5启动子可操作地关联；以及

(iii)其不包含功能性AAVp40启动子并且其不包含功能性腺病毒抑制剂序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中，在不存在可操作地关联的启动子的情况下，所述Rep 78和/或Rep 68多肽仅能够以低、基线或最低水平表达。

6.如前述权利要求中任一项所述的核酸分子，其中，在不存在可操作地关联的启动子的情况下，所述Rep 52和/或Rep 40多肽不能被表达。

7.如前述权利要求中任一项所述的核酸分子，其中，在不存在可操作地关联的启动子的情况下，所述腺病毒抑制剂序列不能被转录。

8.如前述权利要求中任一项所述的核酸分子，其中所述腺病毒抑制剂序列被修饰为使得所述腺病毒抑制剂序列在宿主细胞中的转录不会显著抑制野生型腺病毒在所述宿主细胞中的复制。

9.一种腺病毒载体，其包含如前述权利要求中任一项所述的核酸分子。

10.如权利要求9所述的腺病毒载体，其中所述核酸分子插入腺病毒早期基因之一中或插入已经缺失一个或多个早期基因的位点中。

11.如权利要求9或权利要求10所述的腺病毒载体，其中所述核酸分子以与E4、E2A和E2B表达盒相同的转录方向插入E1区中。

12.如权利要求9-11中任一项所述的腺病毒载体，其中所述核酸分子不与上游启动子可操作地关联。

13.如权利要求9-12中任一项所述的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体额外地包含AAVcap基因，优选地其中所述AAV cap基因不与启动子可操作地关联或与最小启动子可操作地关联。

14.如权利要求9-13中任一项所述的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体额外地编码能够转录激活不存在于所述腺病毒载体中的启动子的多肽。

15.如权利要求9-14中任一项所述的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包含可阻遏的主要晚期启动子(MLP)，优选地其中所述MLP包含能够调节或控制腺病毒晚期基因转录的一种或多种阻遏元件，并且其中一种或多种阻遏元件插入MLP TATA框的下游。

16.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子游离地位于所述宿主细胞内或稳定整合到宿主细胞基因组中。

17.一种试剂盒，其包含：

(A)如权利要求9-15中任一项所述的第一腺病毒载体，

和

(B)第二腺病毒载体，其包含

(i)编码AAV Cap多肽的核酸分子，和/或

(ii)编码重组AAV基因组的核酸分子。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一腺病毒载体额外地编码能够转录激活存在于所述第二腺病毒载体中的启动子的多肽，优选地其中所述第二腺病毒载体中的启动子是与所述第二腺病毒载体中的AAV cap基因可操作地关联的启动子。

19.一种用于产生修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子引入宿主细胞，使得所述核酸分子：

(i)稳定整合到所述宿主细胞的基因组中，或

(ii)游离地存在于所述宿主细胞内。

20.一种用于产生修饰的腺病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子引入腺病毒载体中。

21.一种用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用如权利要求9-15中任一项所述的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞；

(b)用第二腺病毒载体感染所述宿主细胞，其中所述第二腺病毒载体包含含有转基因的重组AAV基因组，

其中所述第一腺病毒载体和第二腺病毒载体中的至少一个包含AAV cap基因；

(c)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；以及

(d)从所述宿主细胞或从所述细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

22.一种用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，所述腺病毒载体包含

(i)包含转基因的重组AAV基因组，以及

(ii)AAV cap基因，

其中所述哺乳动物宿主细胞包含如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其游离地位于所述宿主细胞内或稳定整合到宿主细胞基因组中；

(b)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；以及

(c)从所述细胞或从所述细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

23.一种用于产生AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用如权利要求9-15中任一项所述的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞包含稳定整合到所述宿主细胞基因组中的重组AAV基因组，其中所述重组AAV基因组包含转基因，并且其中：

(i)所述腺病毒载体额外地包含AAV cap基因，或

(ii)AAV cap基因稳定整合到所述哺乳动物宿主细胞基因组中，或

(iii)用包含AAV cap基因的第二腺病毒载体感染所述细胞；

(b)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；以及

(c)从所述细胞或从所述细胞培养基中分离或纯化AAV颗粒。

24.一种用于产生重组AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用如权利要求9-15中任一项所述的第一腺病毒载体感染哺乳动物宿主细胞，其中：

(i)所述第一腺病毒载体额外地包含AAV cap基因，或

(ii)用包含AAV cap基因的第二腺病毒载体感染所述细胞；

(b)用包含转基因的重组AAV感染所述哺乳动物宿主细胞；

(c)在培养基中以产生包含转基因的AAV颗粒的条件下培养所述哺乳动物宿主细胞；以及

(d)从所述细胞或从所述细胞培养基中分离和/或纯化AAV颗粒。

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