CN117247434B - 衣壳修饰型病毒载体及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种衣壳修饰型病毒载体及其制备和用途。具体地，本法提供了腺相关病毒衣壳蛋白改构体、含有所述衣壳蛋白的重组AAV病毒颗粒，其制备方法以及在疾病治疗与预防中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和病毒学领域，具体涉及一种衣壳修饰型病毒载体及其制备和用途。
背景技术
使用病毒传递治疗性遗传物质在基因治疗领域已取得了重大进展。由于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的低免疫原性和对非分裂细胞进行有效转导的能力，作为用于基因治疗的高效病毒载体的腺相关病毒已吸引了相当多的关注。AAV可感染多种细胞和组织类型，其病毒系统在过去十年中取得了重大进展，使这种病毒系统适用于人类的基因治疗。
在AAV的正常的“野生型”（wtAAV）形式中，长度约4600个核苷酸(nt)的单链分子被包装到病毒衣壳中。病毒感染细胞后，细胞的分子机制将AAV单链DNA转化为双链形式。只有这种双链DNA形式才可能被转录成RNA，然后通过其他细胞途径将其翻译成多肽。
重组腺相关病毒载体已成功用于人疾病的多种临床前动物模型的体内基因转移，并已成功用于广泛的多种治疗性基因的长期表达(Dayaand Berns ,2008；Niemeyer etal.,2009；Owen et al.,2002；Keen-Rhinehart et al.,2005；Scallan et al.,2003；Songet al.,2004)。当靶向免疫特权位点时(用于莱贝尔先天性黑蒙的眼部递送)，AAV载体也在人体中产生了长期的临床益处(Bainbridge et al.,2008；Maguire et al .,2008；Cideciyan et al .,2008)。这种载体的一个主要优点是其相对低的免疫原性，仅引起有限的炎症响应，并且在某些情况下，部分对转基因产物免疫耐受的腺相关病毒具有低致病性以及在各种器官组织中长期稳定表达蛋白的能力(LoDuca et al.,2009)，这些特性使AAV在基因治疗领域具有明显的优势，适用于递送治疗性基因。然而，由于野生型AAV血清型通常广谱地感染哺乳动物的多个组织或器官，具备广泛的组织靶向性，导致基因传递到脱靶的组织，从而加剧了机体的不良反应。AAV颗粒的衣壳蛋白不仅在复制过程可以调节AAV的装配，而且还促进了病毒与质膜上的受体相互作用并进入到靶细胞。
已注册的AAV血清型的种类总数已经超过200种，而灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身。值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入，研究人员发现不同血清型的AAV之间可以杂交，而杂交后的AAV会兼有杂合双方的特点，因此，AAV亚型顺势诞生。
现有专利技术中（CN103561774B）涉及到眼用基因治疗的AAV病毒载体是AAV2.7m8，该血清型是在AAV2血清型VP3蛋白的可变区VIII发生插入突变，其已知的技术是将AAV2衣壳VP1蛋白的第587和588氨基酸之间整合了外源的7个氨基酸的短肽（短肽显著提高了AAV穿过视网膜内界膜并转导视网膜内层的能力），同时也减弱了AAV2病毒衣壳结合细胞表面HSPG受体的能力。然而，AAV2.7m8血清型采取玻璃体(IVT)给药时依然没有解决视网膜外层（感光细胞层等）转导能力有限的技术问题，现有已知的其他血清型在大动物实验中对视网膜内层组织的感染力非常有限，几乎无法转导视网膜外层细胞，目前基于AAV2的变体血清型往往会面临病毒产量低，空壳率高，商业化制备难度高等各种问题。
因此，眼科基因治疗产品的开发迫切需要一款具备穿透视网膜内界膜和外界膜能力的病毒衣壳。该病毒衣壳需要具备对眼组织尤其是视网膜外层组织的更高转导活性，同时需要具备高产毒，低免疫原性等优良性质，在IVT给药的方式下可以有效穿透视网膜组织的内层，最终抵达PR层，实现在视网膜外层组织的广域分布。
发明内容
本发明提供了一种AAV衣壳蛋白变体。本发明还提供了包含AAV衣壳蛋白变体和编码目的核酸序列的多核苷酸的rAAV颗粒。本发明还提供了rAAV颗粒的用途，用于治疗眼科疾病，包括治疗视网膜脉络膜疾病。还提供了包括向有需要的哺乳动物眼内施用rAAV颗粒的治疗方法，以及用rAAV颗粒转导视网膜类器官和iRPE细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种腺相关病毒（AAV）衣壳蛋白变体，其特征在于，所述AAV衣壳蛋白变体相对于亲本AAV衣壳蛋白具有来源于AAV2衣壳蛋白VP1可变区VIII的替换多肽。
在另一优选例中，所述的替换多肽如LQRGNRQAATADVNT（SEQ ID NO: 14）所示。
在另一优选例中，所述的亲本AAV衣壳蛋白为AAV1衣壳蛋白、AAV2衣壳蛋白、AAV3衣壳蛋白、AAV4衣壳蛋白、AAV5衣壳蛋白、AAV6衣壳蛋白、AAV7衣壳蛋白、AAV8衣壳蛋白、AAV9衣壳蛋白、AAV10衣壳蛋白、AAV11衣壳蛋白、AAV12衣壳蛋白、或AAV13衣壳蛋白。
在另一优选例中，所述的亲本AAV衣壳蛋白为AAV9衣壳蛋白。
在另一优选例中，所述的AAV9衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1可变区的多肽。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1可变区VIII的多肽或其邻近多肽。
在另一优选例中，所述的邻近多肽相对衣壳蛋白VP1可变区VIII前后偏离10个氨基酸，优选5个氨基酸，更优选3个氨基酸，更优选1个氨基酸。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1可变区VIII区的多肽。
在另一优选例中，被替换的多肽长度为5-20个氨基酸，优选10-15个氨基酸。
在另一优选例中，被替换的多肽长度与替换多肽相同。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1中对应SEQ ID NO: 1所示序列第574-588位、575-589位、576-590位、577-591位、578-592位、579-593位、580-594位、581-595位、582-596位、583-597位、584-598位、585-599位、586-600位、587-601位、588-602位、589-603位、590-604位、591-605位、592-606位、593-607位、或594-608位的多肽
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1序列第574-588位、575-589位、576-590位、577-591位、578-592位、579-593位、580-594位、581-595位、582-596位、583-597位、584-598位、585-599位、586-600位、587-601位、588-602位、589-603位、590-604位、591-605位、592-606位、593-607位、或594-608位的多肽。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1中对应SEQ ID NO: 1所示序列584-598位的多肽。
在另一优选例中，所述的替换多肽替换亲本AAV衣壳蛋白VP1序列584-598位的多肽。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于SEQ ID NO: 1所示的亲本AAV9衣壳蛋白VP1具有以下突变：
第584-598位氨基酸替换为LQRGNRQAATADVNT（SEQ ID NO: 14）。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体进一步包含插入的功能肽。
在另一优选例中，所述插入的功能肽具有选自下组的功能：
1）增强AAV衣壳蛋白变体的组织特异靶向性；
2）改变亲本AAV衣壳蛋白的受体结合基序空间结构；或
3）弱化亲本AAV衣壳蛋白与半乳糖 (Glu)的结合活性。
在另一优选例中，所述功能肽的长度为6-16个氨基酸，优选为7-11个氨基酸，例如7、8、9、10或11个氨基酸。
在另一优选例中，所述的功能肽包含如LALGETTRPA（SEQ ID NO: 16）、LALGDVTRPA（SEQ ID NO: 17），或LALGEVTRPA（SEQ ID NO: 18）所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的功能肽插入到对应亲本AAV衣壳蛋白VP1氨基酸序列的585-602位的任意两个相邻氨基酸残基之间。
在另一优选例中，所述的功能肽插入到对应亲本AAV衣壳蛋白VP1氨基酸序列的第585位和586位之间、第586位和587位之间、第587位和588位之间、第588位和589位之间、第590位和600位之间、第600位和601位之间、或第601位和602位之间。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体包含如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:20所示的序列。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于亲本AAV9衣壳蛋白VP1进一步具有以下突变：
对应SEQ ID NO: 1所示序列第489-497位、490-498位、491-499位、492-500位、或493-501位氨基酸替换为KTPGGNATR（SEQ ID NO: 21）。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于SEQ ID NO: 1所示的亲本AAV9衣壳蛋白，第489-497位、490-498位、491-499位、492-500位、或493-501位氨基酸替换为KTPGGNATR（SEQ ID NO: 21）。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于亲本AAV衣壳蛋白进一步具有以下突变：
对应SEQ ID NO: 1所示序列第240位氨基酸突变为亲水氨基酸。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于SEQ ID NO: 1所示的亲本AAV9衣壳蛋白，在第240位氨基酸处由异亮氨酸I突变为亲水氨基酸。
在另一优选例中，所述的亲水氨基酸为苏氨酸T。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列至少有95%的序列同一性。
在另一优选例中，所述的AAV衣壳蛋白变体的氨基酸序列选自下组：
(i)如SEQ ID NO: 2-6中任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO: 2-6中任一项所示的氨基酸序列至少有95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的AAV衣壳蛋白变体。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO: 8-12中任一项所示。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体中含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体为质粒。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有如本发明第三方面所述的载体，或基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞进一步含有包含目的核酸的辅助质粒。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为植物细胞、昆虫细胞、或动物细胞，优选为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为HEK-293T细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种重组腺相关病毒（rAAV）颗粒，所述rAAV颗粒包含：
(i)如本发明第一方面所述的AAV衣壳蛋白变体。
(ii)包装在所述AAV衣壳内的目的核酸。
在另一优选例中，所述的目的核酸为眼科疾病相关基因、或用于治疗眼科疾病的蛋白质的编码核酸。
在另一优选例中，所述的rAAV颗粒对靶细胞的转导效率E1与含亲本AAV衣壳蛋白的AAV颗粒的转导效率E0之比E1/E0≥2，优选E1/E0≥5，更优选E1/E0≥10。
在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的rAAV颗粒的方法，包括步骤：在合适的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述rAAV颗粒。
在另一优选例中，所述的方法还包括从培养物中分离和/或纯化所述rAAV颗粒的步骤。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a) 如本发明第五方面所述的rAAV颗粒；和
(b) 药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合，所述药物组合包括：
(a) 第一活性成分：如本发明第五方面所述的rAAV颗粒、或如本发明第七方面所述的药物组合物；和
(b) 第二活性成分。
在另一优选例中，所述的第二活性成分为免疫调节剂，例如免疫抑制剂。
在另一优选例中，所述的第二活性成分为眼科治疗剂。
在本发明的第九方面，提供了如本发明第五方面所述的rAAV颗粒、或如本发明第七方面所述的药物组合物、或如本发明第八方面所述的药物组合、或其组合在制备治疗眼部疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述的眼部疾病选自下组：先天性白内障、青光眼、先天性的视网膜、虹膜或者脉络膜缺损、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、病理性的近视、先天性的视神经病变、斜视、圆锥角膜、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1A-1E显示了四个RC-C07突变体血清型衣壳质粒的分子构建，病毒制备和衣壳蛋白检测。其中图1A-1D分别是RC-C07V2，RC-C07V5，RC-C07V6以及RC-C07V7质粒图谱（SnapGene软件绘制）；图1E是WB检测的纯化后变体血清型的衣壳蛋白组分比例。
图2A-2F显示了不同RC-C07变体在体外细胞中的转导活性与亲本的比较。其中图2A是变体血清型体外感染HEK293T后绿色荧光的图片；图2B是四种变体在CHO中的荧光照片；图2C-2D代表上述变体血清型转导293T细胞的荧光占比和平均荧光强度；图2E-2F变体血清型体外转导CHO细胞的荧光百分比和平均荧光强度（MFI）的统计图（FACS分析），NC代表空白对照。
图3A-3E显示了变体血清型在视觉细胞系和iRPE（ipsc诱导分化）中的转导活性比较研究。图3A-3B分别是C07血清型变体在ARPE19中的绿色荧光占比及其平均荧光强度（MFI）；图3C和3D分别是C07变体以两种MOI感染感光细胞（661W）后的绿色荧光占比（图3C）和平均荧光强度MFI（图3D）；图3E是4种血清型变体在ipsc来源的人源视网膜色素细胞中的活性比较（阳性感染细胞占比）。
图4A-4H显示了不同C07变体血清型（IVT给药）体内转导活性与现有血清型（AAV2和AAV2.7m8）的比较。其中图4A-4B是小鼠给药2周，4周和6周后的BAF荧光活体成像照片；图4C-4D是相对荧光面积的统计图；图4E-4F是给药6周后视网膜组织切片绿色荧光平均强度的统计（ImageJ），图4G-4H是向IVT施用6种rAAV 6周后，视网膜组织的免疫荧光染色的全景和局部照片（其中DAPI标记的为细胞核，EGFP为绿色自发荧光蛋白，RPE65标记的为视网膜色素上皮层，Opsin标记的为感光细胞层）。
图5A-5E显示了不同给药方式下新血清型在眼组织中转导活性和分布。其中图5A是小鼠IVT给药下眼组织活体自发荧光成像的照片（BAF）；图5B-5C分别是活体成像图片的荧光面积的统计和平均荧光强度的统计。图5D-5E分别代表的是玻璃体注射（IVT）和视网膜下腔给药（SR）方式下视网膜组织中的荧光分布。
图6A和6B显示了RC-C07V5血清型在食蟹猴（NHP）视网膜组织中的分布研究。图6A是2种血清型（RC-C07V5&RC-C15）IVT给药2周和4周的自发荧光活体成像照片（BAF）；食蟹猴视网膜组织的荧光图片；图6B是2种血清型感染4周后的视网膜组织的切片图片（黄斑和视盘附近的分布）。
图7显示了新血清型在人源视网膜类器官（OV）中的转导活性比较。其显示了四种血清型在ipsc诱导分化86天的OV中的分布图片，OV类器官组织切片进行免疫荧光标记图（DAPI蓝色标记的是细胞核，EGFP是自发绿色荧光，CRX红色标签抗体标记的是光感受器细胞（PR），Panoorama是绿色荧光全景图，Merge是蓝色，绿色和红色三张图片的组合）。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种具有视网膜高转导活性的新AAV衣壳蛋白。具体地，本发明通过在亲本AAV9衣壳蛋白中使用特定序列进行替换，构建了转导效率显著提升的重组AAV颗粒。通过插入10个氨基酸的功能肽，进一步提升了转导效率和对视网膜的嗜侵性。本发明的新血清型（例如RC-C07V7血清型）对视网膜细胞（PR和RPE）的嗜侵性与现有血清型AAV9相比显著增强，弱化了AAV9血清型依赖Glu（半乳糖）进入细胞的能力，同时上述变化使新血清型获得了玻璃体腔给药途径下高效的内界膜穿透能力。与亲本血清型相比，本发明的新AAV血清型对视网膜内层细胞的嗜侵性提高了10倍以上，并且无论是视网膜下还是玻璃体腔给药，均能在视网膜组织中实现全层分布，同时能够稳定持续表达外源增补的蛋白。同时，改造后的病毒的稳定性显著提升。在此基础上，完成了本发明。
AAV的组织特异性(即组织嗜性)由是衣壳血清型决定的，并且本发明所述的合理设计的新血清型能够改变传统AAV的组织嗜性，同时又进一步提高了AAV在眼组织外层的转导活性。特定的裸露在衣壳表面氨基酸的修饰和外源肽的嵌合都会显著影响AAV作为递送工具的特异性和转导效率。例如，改变AAV衣壳的识别受体的基序（配体的改变），通过删除和额外增加衣壳现有的组织特异性受体结合基序改变衣壳的靶向性。例如，眼组织细胞是所需靶点时，例如可以通过改变衣壳来增强眼组织的嗜性，或者当眼睛组织不是所需靶点时，可以降低现有AAV对该组织的嗜性。当临床应用的场景希望该载体能够将靶基因更有效地递送至眼球视网膜中的不同细胞并更有效地对其进行转导时，可以向该对象施用较低剂量的新型血清型（如本发明的RC-C07V5/RC-C07V7变体）。
已知的血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11。其中AAV9描述于美国专利第7,198,951号及gao等人, j.virol. [病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中，目前合计发现11种AAV的受体，分为初级受体(Primaryreceptor)和共受体(Co-receptor)。初级受体负责在细胞表面与AAV碰撞结合，单独的初级受体并不能介导AAV的入胞，此类受体主要以细胞表面糖蛋白的糖链居多；共受体负责把已经与初级受体结合的AAV转运至细胞内，即与初级受体共同介导的病毒入胞。单独的共受体并不能介导AAV的入胞，此类受体主要以跨膜蛋白为主。另外一种是新发现的受体（例如AAVR），同时具备初级受体和共受体的功能。已知AAV9是一种不能有效转导大多数实验用细胞系(心肌和神经细胞转导活性稍高)，但却能穿透血脑屏障、进入中枢神经系统的特殊AAV血清型。近期的研究发现，对某些细胞进行去唾液酸预处理后能够提升AAV9的结合和转导效率3~15倍。进一步的细胞表面糖链分析表明，唾液酸预处理能暴露更多的半乳糖(Gluactose, Glu)结合位点，从而推断半乳糖可能是AAV9的主要受体。借助竞争性抑制实验、定点突变实验、细胞结合实验、分子对接模拟及X射线衍射手段证实了Glu是AAV9的主要受体，还发现了AAV9衣壳表面与Glu结合的5个主要氨基酸位点(N470、D271、N272、Y446和W503)。它们在AAV9衣壳表面形成一个活性口袋、在受体识别和结合的过程中发挥重要作用。就目前已知的所有AAV血清型中、仅有AAV9可以与末端为Glu的受体结合。
本发明对AAV衣壳蛋白进行了特定位置的氨基酸突变。进一步地在衣壳表面（VR可变区）嵌合组织靶向性肽，基于此在现有血清型衣壳（AAV1-13）上，设计出的变体衣壳（RC-C07变体）。进一步通过计算机AI辅助筛选出潜在具备视网膜组织靶向性短肽。本发明构建了包括RC-C07V2、RC-C07V5、RC-C07V6、RC-C07V7等新血清型并在体内体外验证了衣壳的转导活性。
以本发明构建的RC-C07V5血清型为例，是将AAV9衣壳VP1的可变区VIII（584-598aa）的15个功能氨基酸（HQSAQAQAQTGWVQN, SEQ ID NO: 13）突变替换为25个特定氨基酸（LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT, SEQ ID NO: 19），其中LALGDVTRPA（SEQ ID NO: 17）是具备视网膜组织的功能性短肽，该25个氨基酸的替换突变可以适用于大部分已知血清型（目前已在AAV8和AAV9得到了验证），可变区VIII区域的突变弱化了AAV9衣壳结合细胞表面Glu（半乳糖）的结合能力，同时让RC-C07V5新衣壳获得了更高效的内界膜穿透能力（通过玻璃体腔给药）。与现有已知的血清型（不限于AAV1-13血清型）相比，本发明的rAAV颗粒对感光细胞的嗜性显著提高，与亲本相比提高了1-2个数量级。本发明的rAAV颗粒无论是视网膜下还是玻璃体腔给药，均能在视网膜全层分布，同时稳定持续表达外源的增补蛋白。改造后的病毒的稳定性与现有血清型保持一致。本发明插入的10肽（LALGDVTRP）具备靶向感光细胞的作用，同时，通过对RC-C07V5衣壳的三维空间结构预测分析发现：VP1的可变区域VIII的额外插入的10肽位置（优选VP1 588aa-589aa之间）也改变了现存配体和受体结合的空间结构，使得衣壳获得了与潜在新受体特异性结合的开关，进一步弱化了亲本AAV9与Glu受体的结合活性。本发明的新AAV血清型（例如RC-C07V5）的生物特性包括可通过多受体（包括与肝素识别受体HSPG主受体Glu辅助受体）进入细胞，具有显著增加的穿透静态屏障（内界膜ILM）的能力，能够抵达视网膜外层组织。与现有亲本血清型相比，本发明的新AAV血清型转导效率得到显著提升。
因此，在一个方面，本发明涉及获得视网膜组织嗜性的重组AAV病毒颗粒（rAAV）的VP1变体的方法：
（1）以AAV9衣壳蛋白VP1为亲本，通过衣壳蛋白的三维空间结构分析，在裸露在衣壳表面潜在与受体识别的基序位置，对亲本血清型衣壳进行定向理性设计，在衣壳蛋白表面找到合适的VR区，优选可变区VIII区进行氨基酸的替换，改变亲本衣壳表面的识别受体的基序。同时在合适位置嵌合6mer-12mer（氨基酸），例如6mer，7mer、8mer、9mer、10mer、11mer、12mer的功能性短肽，从而筛选得到非半乳糖依赖性的新血清型；和/或
（2）由于AAV9衣壳表面VR-I区域的第240位的非极性氨基酸异亮氨酸I具备一定的疏水性（VP1-3共有），影响了衣壳的亲和力，将氨基酸I突变为亲水性的残基（优选苏氨酸T），容易被细胞表面受体识别并进一步影响转导活性。因此本发明对C07V5衣壳表面特定位置的氨基酸进行突变，获得了RC-C07V7血清型，不仅维持了衣壳的稳定性，也提高了病毒在进入细胞内的效率，对相关组织细胞的转导效率进一步提升。
术语
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
术语“约”或“大约”包括在值的统计上有意义的范围内。此类范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，还更优选在10％内，且甚至更优选在5％内或在1%内。由术语“约”或“大约”所涵盖的容许变化取决于所研究的特定系统，并且可以由本领域普通技术人员容易地了解。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项或全部。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的多肽时，也旨在涵盖由该具体序列组成的多肽。
如本文所述，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中间的VP1基因和rep基因。ITR对于病毒的复制和包装具有决定性作用。VP1基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。因腺相关病毒较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)。同时作为一种有特点的基因转移载体，其还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
术语“衣壳蛋白”是指作为病毒衣壳的部分的蛋白质。对于腺相关病毒，衣壳蛋白一般称为VP1、VP2和/或VP3，并且各自由单个VP1基因编码。对于AAV，这三种AAV衣壳蛋白经由交替的mRNA剪接和/或交替的翻译起始密码子，以重叠的方式由衣壳开放读码框(ORF)产生。所有三种蛋白质都使用共同的终止密码子（Warrington等人(2004)J.Virol.78:6595）。AAV9的VP1一般从2.4-kb mRNA上的ATG起始密码子(氨基酸M1)翻译，而AAV9的VP2和VP3起于较小的2.3-kb mRNA，使用较弱的ACG起始密码子用于产生VP2(氨基酸T138)，并且通读翻译到下一个可用的ATG密码子(氨基酸M203)用于产生最丰富的衣壳蛋白VP3。腺相关病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列是本领域众所周知的，并且一般是保守的，特别依赖于细小病毒。参见Rutledge等人(1998)J.Virol.72:309-19。相应地，尽管本文提供的氨基酸位置可以相对于AAV的VP1衣壳蛋白提供，并且如无特别说明，本文提供的氨基酸位置参考SEQ ID NO: 1所示的AAV9 VP1的氨基酸位置确定，技术人员能够分别地且容易地确定相同氨基酸在AAV的VP2和/或VP3衣壳蛋白内的位置，以及氨基酸在不同血清型中的相应位置。本文所述的“衣壳蛋白”包括1型AAV(AAV1)、2型AAV(AAV2)、3型AAV(AAV3)、4型AAV(AAV4)、5型AAV(AAV5)、6型AAV(AAV6)、7型AAV(AAV7)、8型AAV(AAV8)、9型AAV(AAV9)等现有血清型。
本文所用术语“rAAV”指重组腺相关病毒，也称为重组腺相关病毒颗粒或重组AAV。
术语“视网膜细胞”在本文中可指任何细胞类型，包括视网膜，例如视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞和光感受器细胞(包括杆状细胞和锥状细胞)、缪勒胶质细胞和视网膜色素上皮细胞。
如本文使用的，短语“可操作的连接”包括组分或元件的物理并列(例如，在三维空间中)，所述组分或元件彼此直接或间接相互作用，或以其它方式彼此协调以参与生物事件，所述并列达到或允许此类相互作用和/或协调。在一些实施方案中，“可操作的连接”涉及相关组分或元件彼此的共价连接。然而，本领域技术人员了解，在一些实施方案中，不需要共价连接来达到有效的可操作连接。
术语“衣壳蛋白变体”包括与作为亲本的相应衣壳蛋白相比，具有至少一个突变（例如取代、缺失或插入）的衣壳蛋白。
在本文中，氨基酸突变可以是氨基酸取代、缺失、或插入。可以进行取代、缺失或插入的任意组合来获得具有期望性质的优化的变体。氨基酸缺失和插入包括在多肽序列的氨基和/或羧基末端的缺失和插入，也包括在多肽序列内部的缺失和插入。在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸取代，例如单氨基酸取代，或若干个氨基酸取代的组合。在一些实施方案中，氨基酸突变是插入，例如几个氨基酸片段的插入。插入的氨基酸可以简单地插入衣壳蛋白的两个给定氨基酸之间。氨基酸的插入也可以与衣壳蛋白的给定氨基酸在插入位点处的缺失一起进行。
在本文中，当提及衣壳蛋白待突变的氨基酸位置时，通过参考SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列予以确定。可以通过与SEQ ID NO: 1进行氨基酸序列比对，鉴定具有其它氨基酸序列的杂合蛋白或多肽上的对应氨基酸位置。例如，当提及“I240”时，是指SEQ ID NO:1（RC-C07）的第240位的异亮氨酸I，或经比对在其他衣壳蛋白的氨基酸序列上的对应位置的氨基酸残基。
在本文中，在提及对衣壳蛋白的突变时，以如下方式来描述单氨基酸取代：[原始氨基酸残基/位置/取代的氨基酸残基]或者[位置/取代的氨基酸残基]。例如，位置240的异亮氨酸（或对应的其他氨基酸）取代为苏氨酸，可以表示为I240T或表示为240T。相应地，可以通过“和”或“-”将各单氨基酸取代连接起来，以表示在多个给定位置的组合突变。
在本文中，当提及对衣壳蛋白的突变时，以以下方式来描述插入：[原始氨基酸的位置-插入片段-原始氨基酸位置+1]。例如，位置588和589位间插入片段LALGDVTRPA，可以表示为588-LALGDVTRPA-589。
术语“转导”或“感染”等指通过病毒载体将核酸引入靶细胞内。术语“转导效率”指在与设定数目的包含目的核苷酸的病毒载体一起温育后，表达目的核苷酸的细胞级分(例如百分比)。确定转导效率的众所周知的方法包括用荧光报道基因转导的细胞的荧光激活细胞分选，用于目的核苷酸表达的PCR等。
氨基酸序列或核酸序列的“同一性”或“同一性百分数(%)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体序列的氨基酸残基/核苷酸相同的氨基酸残基/核苷酸百分数。在一些实施方案中，本发明包括本发明蛋白质或多肽或核酸的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的多肽或蛋白质或核酸而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性改变。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”包括施用组合物或杂合多肽以预防或延迟疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“有效量”指本发明的rAAV或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中rAAV或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40%、甚至更优选地至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“多核苷酸”指任何长度的核苷酸聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可被非核苷酸组分中断。如本文所使用，术语多核苷酸可交替地指双链和单链分子。
术语“目的核酸”是指待通过重组AAV病毒颗粒转导的核酸，其编码例如预防性或治疗性蛋白质，特别是用于预防或治疗眼科疾病的蛋白质，例如AIPL1、PROM1、RS1、RPE65、大分子抗体及抗体类似物等。
AAV衣壳蛋白变体
在一些实施方案中，本发明涉及一种新的AAV衣壳蛋白变体，其具有以下一种或多种性质：
（1）其为Glu非依赖性的血清型，即具有较弱的结合Glu受体的能力并保证了高效的内界膜屏障的穿梭能力；
（2）其提高了病毒在细胞内的稳定性；
（3）衣壳结构更加稳定；
（4）相比现有血清型产毒高，和/或空壳率显著降低；
（5）其产生的重组病毒颗粒对视网膜细胞（例如感光细胞和/或视网膜色素上皮细胞）的转导效率（例如视网膜组织转导活性）相比亲本血清型显著提升；
（6）其产生的重组病毒颗粒在玻璃体腔给药和/或视网膜下给药能对视网膜细胞均具有更高的转导活性。
在一个实施方案中，所述衣壳蛋白变体相对于亲本AAV衣壳蛋白VP1包含以下氨基酸突变：I240T。
在一些实施方案中，本发明涉及一种AAV衣壳蛋白变体，其包含改造的衣壳蛋白VP1，在AAV可变区VIII及其附近区域（例如在第587位和588位之间、第588位和589位之间、或第590位和600位之间）插入6-16个氨基酸的功能肽(6mer-16mer)，功能肽优选不超过11个氨基酸，优选地，所述插入片段为6、7、8、9、10或11个氨基酸。在一些实施方案中，插入的功能肽可以是新的靶向性短肽，或改变了原先的受体结合基序空间结构的多肽，或与潜在新的受体特异性结合的多肽，或弱化了AAV9与Glu的结合活性的多肽。在一些实施方案中，所述插入的功能肽为10肽。在一些实施方式中，所述功能肽包含LALGETTRPA、LALGDVTRPA，或LALGEVTRPA。在一些实施方案中，所述功能肽可以由LALGETTRPA、LALGDVTRPA，或LALGEVTRPA组成。在一些实施方案中，被插入的功能肽可以为在氨基酸序列LALGETTRPA、LALGDVTRPA或LALGEVTRPA的一个或两个末端额外分别添加1-3个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，功能肽可以为在氨基酸序列LALGETTRPA、LALGDVTRPA或LALGEVTRPA的一个或两个末端额外分别删除1-3个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，功能肽可以由与氨基酸短肽LALGETTRPA、LALGDVTRPA，或LALGEVTRPA具有1-2个氨基酸突变（例如取代突变或缺失突变）的多肽组成，所述突变不改变或基本不改变含有本发明衣壳蛋白变体的AAV病毒颗粒的稳定性或组织嗜性。
在一些实施方案中，本发明涉及一种AAV衣壳蛋白变体，其包含改造的AAV衣壳蛋白VP1，其相对于亲本AAV9衣壳蛋白VP1包含以下氨基酸突变，或仅由以下氨基酸突变组成：亲本VP1 HQSAQAQAQTGWVQN （SEQ ID NO: 13）氨基酸短肽突变为LQRGNRQAATADVNT（SEQ IDNO: 14），第588位N和589位R之间插入LALGDVTRPA，以及亲本第240位的氨基酸由I突变为T。
本发明还涉及一种质粒，其包含编码本发明的衣壳蛋白变体的核酸。
目的核酸
本发明的衣壳蛋白可以包装目的核酸构成病毒颗粒。
适用于被本发明病毒颗粒编码的目的核酸是任何编码治疗或预防性蛋白质的核酸，特别是编码用于眼科疾病预防或治疗的蛋白质的核酸，例如眼科相关基因，例如RPE65、AIPL1、PROM1、RS1基因等。在一些实施方案中，用于预防或治疗眼科疾病的蛋白质包括但不限于例如RPE65、AIPL1、PROM1、RS1或抗体类似物等。
目的核酸可以包含在表达盒中而包装在AAV衣壳内。
在一些实施方案中，表达盒包含至少一个ITR序列，从而使得载体基因组可以顺利被衣壳组装。表达盒可以是单链DNA、双链DNA或单链RNA或双链RNA。
在一些实施方案中，所述表达盒可以包含一个或多个调节序列以指导目的核酸编码序列在靶细胞（例如视网膜靶细胞，例如感光细胞或视神经细胞）中的表达。调节序列可以选自与编码序列可操作地连接的转录起始序列、终止序列、启动子和/或增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和多聚腺苷酸化(聚A)区域，包括人生长激素多聚腺苷酸化区域；反向重复序列（例如L-ITR或R-ITR）；选择性标记或报道基因，例如抗性基因；微小RNA；转录后调控序列，例如WPRE（土拨鼠肝炎病毒的转录后调控序列）；稳定细胞质mRNA的序列；核酸限制性位点；同源重组序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。
在一些优选的实施方案中，调节序列位于5’UTR或3’UTR中。在一些优选的实施方案中，调节序列选自以下一个或多个：
启动子、反向重复序列、内含子、增强子、转录后调控序列、多聚腺苷酸化区域、选择性标记或报道基因。
适用于本发明的启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括猿猴和人)的启动子。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。组成型启动子独立于调节影响而起始RNA合成。
本发明的表达盒还可包含选择性标记或报道基因，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在靶细胞中的表达。本发明的“选择性标记”或“报道基因”可以选自本领域中已知的那些。合适的报道基因包括，但不限于，增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶和分泌的胚胎碱性磷酸酶(seAP)，其可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的序列，等等。此类选择性标记或报道基因(其可以位于或不位于待包装至病毒颗粒中的病毒基因组之外)可以用于发出质粒在细菌细胞中的存在的信号，诸如抗生素抗性标记基因，例如氨苄青霉素或四环素抗性或卡那霉素抗性。
本发明的表达盒或表达载体还可以包含多聚腺苷酸化区域，例如hGHpA（人生长激素多聚腺苷酸化区域）。
本发明的表达盒或表达载体还可以包含内含子，例如嵌合型或天然基因的内含子。
病毒颗粒
本发明涉及一种重组AAV病毒（rAAV）颗粒，其包含
(i)本发明的AAV衣壳蛋白变体；和
(ii)包装在所述AAV衣壳内的目的核酸，例如眼科疾病相关基因或用于治疗眼科疾病的蛋白质的编码核酸。
制备方法
本发明的涉及一种制备重组AAV病毒颗粒(rAAV)的方法。本领域已知许多方法用于包装生产rAAV，目前常用的rAAV包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒作为辅助病毒的系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装系统、以及基于杆状病毒的包装系统。每种包装系统都各具特点，本领域技术人员可以根据需要做出合适的选择。
用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：1)合适的宿主细胞，包括例如源自人的细胞系如HEK-293T细胞，或源自昆虫的细胞系 (对于杆状病毒生产系统的情况而言)；2)合适的辅助功能体，其由野生型或突变体腺病毒(如温度敏感的腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和VP1基因和基因产物；4)目的基因/目的核酸，其侧翼有至少一个AAV保留完整功能的ITR序列，并优选地处于可操作的连接的启动子的驱动之下；和5)合适的培养体系，以支持rAAV生产。
在一些实施方案中，本发明涉及一种生产重组AAV病毒颗粒的方法，其包括在足以产生重组AAV病毒颗粒的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包括包含编码根据本发明所述的衣壳蛋白变体的核酸或本发明所述的衣壳蛋白变体编码核酸的质粒。
在一些实施方案中，所述包装细胞还包括包含目的核酸的辅助质粒和/或转移质粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括从培养上清液中分离重组AAV病毒颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括裂解所述包装细胞，并且从所述细胞裂解产物中分离重组AAV病毒颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下中的一步或多步：
a.清除细胞碎片，
b.用全能核酸酶处理含有重组AAV病毒颗粒的上清液，
c.浓缩重组AAV病毒颗粒，
d.纯化所述重组AAV病毒颗粒。
因此，本发明还涉及一种用于产生重组AAV病毒颗粒的包装细胞，所述包装细胞包括包含编码本发明所述的衣壳蛋白变体的核酸或本发明的衣壳蛋白编码核酸或本发明的表达盒的质粒。
组合物、药物或制剂
本发明提供一种制剂或组合物或药物，所述制剂或组合物或药物含有(a) 本发明所述的rAAV，以及(b)药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版、R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C. Owen、Pharmaceutical Press、London、Chicago。
在一些实施方案中，药用辅料包括但不限于一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。合适的药用辅料将是本领域技术人员己知的。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温®)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的制剂或组合物或药物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，本发明的制剂或组合物或药物是液体，优选地是可注射液体。优选地，可注射液体作为胶囊或在注射器中被提供。
本发明的rAAV或包含其的制剂、组合物或药物可以静脉内施用、肌内施用、皮下施用、口服施用、粘膜接触、腹膜内施用和病灶内施用，优选局部施用于眼睛，例如通过视网膜内施用或玻璃体内施用，例如玻璃体腔内注射、视网膜下腔注射或脉络膜上腔注射。在一些实施方案中，本发明的rAAV或包含其的制剂或组合物或药物可通过视网膜内施用或玻璃体内施用，例如通过玻璃体腔内或视网膜下腔施用，例如玻璃体腔内施用（IVT施用）。在任一种施用模式中，优选地，本发明的制剂或组合物或药物作为可注射液体被提供。
组合物或制剂或药物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明的所述组合物，例如药物组合物或药物制剂中，还可以包含其他活性成分，例如一种或多种其它治疗剂，例如免疫调节剂（例如免疫抑制剂）。
组合产品
本发明还提供了组合产品（例如药物组合产品），其包含本发明的rAAV，以及一种或多种其它治疗剂。本发明的组合产品可用于本发明的治疗方法中。
本发明还提供了包含所述组合产品的成套药盒，例如所述成套药盒在同一包装内包含：
含有本发明的rAAV或包含其的药物的第一容器;
包含一种或多种其它治疗剂（例如免疫调节剂）的药物组合物的第二容器。
在一些实施方案中，其他治疗剂为免疫调节剂，例如免疫抑制剂，例如用于降低rAAV颗粒所产生的免疫反应，如免疫炎症反应。
治疗方法
在一个实施方案中，本发明的rAAV、制剂或组合物或药物用于治疗眼部疾病。
在一些实施方案中，眼部疾病包括但不限于以下例如先天性白内障、青光眼、先天性的视网膜、虹膜或者脉络膜缺损、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、病理性的近视、先天性的视神经病变、斜视、圆锥角膜等。
在一个实施方案中，本发明的rAAV、制剂或组合物或药物经由眼内施用，例如经由视网膜内施用或玻璃体内施用，例如视网膜下腔施用或玻璃体腔内施用。在一个实施方案中，所述施用是注射。
在一个实施方案中，本发明还涉及重组AAV病毒颗粒，包含其的制剂或组合物或组合产品在制备药物中的用途，所述药物用于治疗本发明的眼部疾病。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的AAV血清型衣壳结构稳定、相同条件下包装产毒高，亲和纯化后空壳率降低；
(b)本发明的AAV血清型在体内和体外对感光细胞（photoreceptor，PR）和/视网膜色素上皮细胞（RPE）的转导活性显著高于亲本血清型。与野生型AAV9血清型相比，本发明血清型眼内（鼠）玻璃体腔给药方式下视网膜组织的转导活性提高了2个数量级；
(c) 本发明的AAV血清型在玻璃体腔给药途径下具有高效的内界膜穿透能力。与亲本AAV9血清型相比，本发明的AAV血清型对视网膜类器官的光感受器细胞的嗜侵性提高了100倍以上。
(d) 本发明的AAV新血清型通过视网膜下腔或玻璃体腔给药时，均能在视网膜组织中实现全域分布，同时能够稳定持续表达外源增补的蛋白，改造后的病毒的衣壳稳定性显著提升。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press、1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例中涉及的衣壳蛋白变体结构特点及改造方法：
RC-C07-V1 (SEQ ID NO: 2)：将SEQ ID NO: 1第584-598位氨基酸序列替换为LQRGNARQAATADVNT。
RC-C07-V2 (SEQ ID NO: 3)：对SEQ ID NO: 2进行588-LALGETTRPA-589插入。
RC-C07-V5 (SEQ ID NO: 4)：对SEQ ID NO: 2进行588-LALGDVTRPA-589插入。
RC-C07-V6 (SEQ ID NO: 5)：将SEQ ID NO: 4 的491-499位氨基酸序列替换为KTPGGNATR（SEQ ID NO: 21）。
RC-C07-V7 (SEQ ID NO: 6)：对SEQ ID NO: 4进行I240T突变。
实施例1 RC-C07变体血清型的质粒构建和病毒检测
RC-C07-V2 serotype衣壳质粒的构建
首先将AAV9 血清型衣壳质粒（pRC-C07）的VP1基因及下游部分polyA序列用2003bp处的SwaI及4351bp处的SmaI充分酶切，得到一条线性化载体，除去AAV9的VP1基因及下游部分polyA序列，并用一个含有RC-C07-V2衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段通过同源重组代替。该片段是通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增得到的，利用AAV9质粒为模板PCR，得到2个扩增产物：
(a) 582-599aa突变区上游，5’末端扩增引物为RC-C07-F1：AACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG（SEQ ID NO: 22），3’末端扩增引物为RC-C07-V2-R1：GCAGGTCTTGTTGTTTCGCCGAGTGCTAGGTTGCCTCTCTGGAGGTTGGTGGCCACTTGTCCATAGGAC（SEQ ID NO:24）；
(b) 582-599aa突变区下游，5’末端扩增引物为RC-C07-V2-F2：AACAACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGG（SEQ ID NO: 25），3’末端扩增引物为RC-C07-R2：CGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAG（SEQ ID NO: 23），
以上2个扩增产物通过overlap得到含有RC-C07-V2衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段。
RC-C07-V5 serotype衣壳质粒的构建
以上述成功克隆的pRC-C07-V2质粒为骨架，将RC-C07-V2质粒的VP1基因及下游部分polyA序列用2003bp处的SwaI及4381bp处的SmaI充分酶切得到一条线性化载体，除去RC-C07-V2的VP1基因及下游部分polyA序列，并用一个含有RC-C07-V5衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段通过同源重组代替。该片段是通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增得到的，利用RC-C07-V2 质粒为模板PCR，得到2个扩增产物：
(a) 593-594aa突变区上游，5’末端扩增引物为RC-C07-F1：AACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG（SEQ ID NO: 22），3’末端扩增引物为RC-C07-V5-R1：GGTCTTGTCACGTCGCCGAGTGCTAGGTTGCCTC（SEQ ID NO: 26）；
(b) 593-594aa突变区下游，5‘末端扩增引物为RC-C07-V5-F2：CGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGC（SEQ ID NO: 27），3’末端扩增引物为RC-C07-R2：CGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAG（SEQ ID NO: 23），
以上2个扩增产物通过overlap得到含有RC-C07-V5衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段。
RC-C07-V6 serotype衣壳质粒的构建
以得到的RC-C07-V5 serotype质粒为骨架，将RC-C07-V5质粒的VP1基因及下游部分polyA序列用2003bp处的SwaI及4381bp处的SmaI充分酶切得到一条线性化载体，除去RC-C07-V5的VP1基因及下游部分polyA序列，并用一个含有RC-C07-V6衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段通过同源重组代替。该片段是通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增得到的，利用RC-C07-V5 质粒为模板PCR，得到2个扩增产物
(a) 491-499aa突变区上游，5’末端扩增引物为RC-C07-F1：AACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG（SEQ ID NO: 22），3’末端扩增引物为RC-C07-V6-R1：GCGTTGCCGCCAGGGGTCTTTGAGACACGTTGTTGTCGG（SEQ ID NO: 28）；
(b) 491-499aa突变区下游，5’末端扩增引物为RC-C07-V6-F2：CCCTGGCGGCAACGCCACCAGAGAATTTGCTTGGCCTGGAGC（SEQ ID NO: 29），3’末端扩增引物为RC-C07-R2：CGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAG（SEQ ID NO: 23），
以上2个扩增产物通过overlap得到含有RC-C07-V6衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段。
RC-C07-V7 serotype衣壳质粒的构建
以实施例中已经成功得到的RC-C07-V5 serotype衣壳质粒为骨架，将RC-C07-V5质粒的VP1基因及下游部分polyA序列用2003bp处的SwaI及4381bp处的SmaI完全酶切得到一条线性化载体，除去RC-C07-V5的VP1基因及下游部分polyA序列，并用一个含有RC-C07-V7衣壳及下游部分polyA序列的2378bp SwaI/SmaI片段通过同源重组代替。该片段是通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增得到的，利用RC-C07-V5 质粒为模板PCR，得到2个扩增产物：
(a) I240T突变区上游，5’末端扩增引物为RC-C07-F1：AACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG（SEQ ID NO: 22），3’末端扩增引物为RC-C07-V7-R1：TGCTGGTGGTGGTGACTCTGTCCCCCAGCCATTG（SEQ ID NO: 30）；
(b) I240T突变区下游，5’末端扩增引物为RC-C07-V7-F2：GACAGAGTCACCACCACCAGCACCCGAACCTG（SEQ ID NO: 31），3’末端扩增引物为RC-C07-R2：CGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAG（SEQ ID NO: 23），
以上2个扩增产物通过overlap得到含有RC-C07-V7的VP1及下游部分polyA序列（2378bp）SwaI/SmaI片段。
上述克隆得到的新的血清型的衣壳质粒，均是以RC-C07（AAV9）血清型衣壳质粒（pRC-C07）骨架作为质粒构建的基础。
Sanger测序结果表明RC-C07V2/ RC-C07V5/ RC-C07V6/ RC-C07V7/血清型VP1基因序列分别成功构建到pRC-C07载体上，分别形成pRC-C07V2， pRC- C07V5，pRC- C07V6和pRC- C07V7（Snapgene绘制的部分质粒图谱见图1A），进一步将新构建的4种血清型质粒及其他实验对照病毒分别进行rAAV的包装和纯化。
重组AAV病毒的包装和纯化：
首先复苏后悬浮的HEK293，当30ml摇瓶HEK293细胞密度达到2E6/ml后，进行三质粒转染。转染前配制合适的转染体系，对于每个30ml摇瓶的包装体系，优选按照以下体系进行转染混合物配制：转染液的配制 （30mL体系）： （1）将60ug质粒，按照辅助质粒：衣壳质粒：目的基因质粒=2：1：0.3的比例，加入1.5 mL DynamisTM Medium培养基中；（2）质粒稀释液中加入60 μL的Fecto VIR-AAV，立即用涡旋仪震荡3秒混匀，室温静置30 min。转染后72h，用细胞上清将细胞吹起，1500rpm离心收集细胞沉淀。加入裂解液37℃摇床裂解1h，水平转子4000rpm离心10min收集上清，0.45μm针式过滤器过滤之后按10μl体积分装。可以通过实时定量PCR法检测细胞中总病毒的基因拷贝数（vg）。收集后的细胞样本经过三次液氮的反复冻融，利用碘克沙醇密度梯度离心法去除杂蛋白和空壳，得到纯净的rAAV。
将上述制备的多种血清型病毒进行物理滴度的检测，其中polyA荧光探针作为引物，具体检测过程如下：
标准品的制备：使用GOI-E04（Genescript全基因合成）质粒进行制备。选择包含CAG-EGFP表达盒的GOI-E04质粒，其序列如SEQ ID NO: 32所示，酶切后切胶并进行线性DNA胶回收，回收产物用Nanodrop测定DNA浓度，按照公式c（copy/ul）=质粒浓度（ng/ul）*（1e-9）* 阿伏伽德罗常数 / (660 g/mol*质粒碱基对数)计算拷贝数，将质粒标准品稀释至1e9copy/ul，分装后冻存于-80℃。
配制qPCR反应体系（20ul）：2X Probe Premix 10ul，10uM hGHpA F和R引物各0.4ul，hGHpolyA探针引物0.8ul，50X ROX II 0.4ul，模板2ul，补水至20ul。按照程序：95℃5min。95℃ 5s，60℃ 30S，40 Cycle完成检测，输出数据后，滴度（VG/ml）=输出结果*稀释倍数*1000。
如图1E所示：在贴壁的293T中，同时将AAV9（RC-C07），RC-C07V2，RC-C07V5，RC-C07V6和RC-C07V7病毒作为实验组（样本量E9vg），AAV2病毒作为实验参照组，使用anti-VP1的抗体（Progen 61058），检测上述纯化后的病毒衣壳组分，判断病毒的实心率以及VP1、VP2和VP3的蛋白相对比值，从图1E结果可以发现，RC-C07四个变体血清型的衣壳的VP1、VP2和VP3蛋白相对量和比例与亲本病毒相比未发生明显变化，表明VR区域的替换突变未改变rAAV三种衣壳蛋白的占比，同时四个突变体的病毒经过亲和纯化后，实心率与母本相比无显著差异。
实施例2 RC-C07及其变体血清型在体外细胞系中的转导活性比较
rAAV病毒在细胞中的感染率和平均荧光强度流式检测法（FACS）：
1. 准备待感染的贴壁培养的HEK293T（或CHO）细胞，和五种血清型的病毒AAV9、RC-C07V1、RC-C07V2、RC-C07V3、RC-C07V4。RC-C07V1和RC-C07V2如SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示。RC-C07-V3通过将SEQ ID NO: 1（RC-C07）第491-499位氨基酸序列替换为KTPGGNATR（SEQ ID NO: 21），第584-598位氨基酸序列替换为LQRGNRQAATADVNT（SEQ IDNO: 14）改造得到。RC-C07-V4通过将SEQ ID NO: 1（RC-C07）的第584-599位氨基酸序列替换为LQRGNRDLDPKATEVE（SEQ ID NO: 15）得到。
2. Day1 细胞铺板：待细胞消化脱落后，以1000rpm离心5min收集细胞，重悬计数，按照1E+4/孔铺于96 孔板。
3. Day2 病毒感染：细胞铺板24h后计数；
使用完全培养基稀释AAV，按照病毒感染复数分别是20，100和500倍计算每孔所需的病毒vg，并进行待感染病毒样本的原液稀释：
取出过夜培养的细胞，从孔板中吸出完全培养基后，加入100μL含有稀释后的病毒的培养基（每个MOI双复孔）：放入37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养72小时。
4. Day5 拍照消化细胞：72小时后，弃去培养基，向细胞中加入100μL PBS洗涤细胞并弃去PBS，加入20μL Typsin，置于37℃培养箱中消化3min，加入80μL 含10% FBS的DMEM终止消化，流式检测细胞荧光占比（FITC通道）。
5. 导出数据，FlowJo分析处理流式结果，生成excel文件，用Graphpad作柱状图。
图2A-2F显示了RC-C07及其变体在不同MOI下在HEK293T和CHO细胞中的转导活性比较。从图2A-2B显示的荧光照片（Nikon 荧光显微镜拍摄）中可以看出，与亲本血清型AAV9相比，RC-C07V1和RC-C07V2在HEK293T和CHO细胞中的转导效率大幅提升。并且相同MOI下，两个变体血清型在293T中的转导效率高于CHO中。当MOI为500时，对照病毒AAV9未见明显的荧光信号。图2C-2F显示了流式（FACM）结果，分别代表不同RC-C07变体在293T和CHO细胞中绿色荧光细胞的占比和平均荧光强度。与荧光照片的数据一致，RC-C07V1和RC-C07V2的转导活性显著强于另外两个变体（RC-C07V3和RC-C07V4）。在感染复数未饱和（MOI=100）的条件下，RC-C07V2的体外转导活性超过了RC-C07V1，细胞中平均荧光强度（MFI）两者未见显著差异。
结果提示，使用来源于AAV2衣壳蛋白的序列LQRGNARQAATADVNT替换AAV9衣壳蛋白的相应区域构建得到的RC-C07V1具有显著提升的转导效率。在感染复数未饱和的情况下，进一步插入多肽LALGETTRPA（SEQ ID NO: 16）的RC-C07V2具有更高的转导效率。
在四种变体衣壳中，RC-C07V2血清型在体外细胞系中的转导活性最高，因此基于理性设计的原则，在RC-C07V2血清型的基础上，进一步设计了新的变体，分别是RC-C07V5，RC-C07V6，RC-C07V7（方法见实施例1）。
实施例3 RC-C07及其变体在视觉相关细胞中的活性比较
流式检测AAV病毒在视网膜色素上皮细胞（ARPE19），感光细胞（661W）和诱导分化的人源色素上皮细胞（iRPE）转导活性的流程如下：
1. 准备待感染的细胞：ARPE19（购自于ATCC），661w（购自于(Lonza)）， iRPE（ipsc诱导分化），三种细胞不存在支原体感染（QC验证），同时将纯化的RC-C07V2-EGFP、RC-C07V5-EGFP、RC-C07V6-EGFP、RC-C07V7-EGFP及AAV9-EGFP五种携带荧光报告基因的病毒，进行基因拷贝数的滴度的检测（qPCR法），记录完毕后-80℃保存。
2. Day1：细胞铺板：将待检测细胞消化下来，1000rpm离心5min，计数，按照HEK293T 1E+4/well铺于96孔板。
3. Day2：病毒感染，将空白组铺板24h的细胞进行计数，利用完全培养基梯度稀释AAV，以96孔板中感染前的细胞总数作为基数。MOI按照每种细胞的易感染性设置2个梯度。
取出过夜培养的细胞，吸出完全培养基后加入100μL稀释病毒后的培养基 （每个梯度设置双复孔），放入37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养72小时。
4. Day5：拍照消化细胞，弃去培养基，向细胞中加入100μL PBS，弃PBS，加入20μLTypsin，置于37℃培养箱中消化3min，加入80μL含10% FBS的DMEM终止消化，使用流式细胞仪检测细胞中自发荧光情况。
5. 导出数据，FlowJo分析处理流式原始结果，生成Excel，Graphpad绘制柱状图。
图3A-3E分别代表的五种血清型在不同细胞中的阳性细胞占比和荧光强度的统计结果，分别是在ARPE19，661W和iRPE三种细胞中进行的RC-C07变体的体外转导活性比较，高低感染复数的rAAV感染三种不同细胞72h后，收集绿色荧光细胞分别进行流式检测（Beckman，FITC激发通道）。
图3A代表ARPE19细胞中的绿色荧光细胞百分比，图3B代表不同血清型在ARPE19细胞中平均荧光强度，从图示统计结果可以发现，在ARPE19细胞中RC-C07V5的转导活性最强（转导活性强度：C07V5＞C07V2＞C07V7＞C07V6），C07V2和C07V7也保持了较高的RPE转导活性，而在图3C-3D中，不同血清型在光感受细胞（661W）中的绿色荧光细胞比例显示RC-C07V5血清型的转导活性均高于（包括荧光细胞百分比和平均荧光强度）RC-C07V6和AAV9两种血清型，表明理性设计改造的RC-C07V5血清型对光感受器细胞的嗜性显著高于亲本。
图3E是本发明的四种血清型变体在ipsc诱导分化的原代RPE细胞中的转导活性的评估，当感染复数MOI=E4，RC-C07V2和RC-C07V5血清型对iRPE的转导活性高于另外两种血清型，体外转导活性由强到弱的顺序为：RC-C07V2＞RC-C07V5＞ RC-C07V6＞ RC-C07V7。
与传统的ARPE19（视网膜色素上皮细胞）细胞系相比，ipsc诱导分化的iRPE细胞（图3E）中，细胞与细胞之间的紧密连接程度较高，这也反应了在ARPE19（图3A）中，MOI为500时的，变体血清型C07V5的阳性细胞率已经接近iRPE中10倍病毒剂量感染的比例。同时iRPE可以更好的模拟视网膜组织中RPE细胞特有的五边形状。四种变体在iRPE中的转导活性是接近的，但与亲本衣壳相比，变体无论在iPRE还是ARPE19中的感染效率都得到了显著的提升。
实施例4变体血清型在鼠眼内的转导活性和组织部分比较
自发荧光（BAF）检测方法：
活体自发荧光检测（AF）的检测步骤：首先对6-8周龄C57小鼠（集萃生物提供）进行检查（每组2只小鼠，6组，双眼玻璃体腔给药；每组检查4只眼睛的AF）。核对好耳标后，双眼眼表进行滴加药物进行散瞳，使用舒泰混合液按照60mg/kg麻醉剂量麻醉小鼠，双眼滴加表面麻醉剂，眼表涂上凝胶佩戴角膜接触镜。将检查设备的HRA控制面板进入IR模式，对焦小鼠眼底直至图像清晰，然后切换至FA模式，调节SENS值至100，调节焦距至能清晰看到视网膜的血管。降低SENS值至60，开始进行照片的拍摄，保证照片的曝光强度在合理区间。
选择RC-C14（AAV2.7m8变体血清型）和AAV2血清型作为本发明的对比对象。本发明的RC-C07变体血清型是AAV9的进一步改造体。从实施例2中，得出亲本AAV9体外转导活性较低，推测亲本在玻璃体注射途径下转导视网膜的组织的能力有限，而理性设计的变体血清型在光感受器细胞中的转导活性得到了显著提升，因此需要通过体内实验对变体衣壳的转导活性进行有效性验证。
图4A-4B显示了RC-C07四个变体衣壳与现有两种血清型载体在IVT玻璃体注射方式下，视网膜组织中病毒分布和转导活性的比较。将上述记载的6种血清型（AAV2、RC-C14、RC-C07V1、RC-C07V2、RC-C07V5、RC-C07V7）分别采取玻璃体腔内给药。在给药6周后评估rAAV-EGFP病毒在视网膜组织中的转导活性。每只眼的病毒给药剂量是E9vg。同时在给药2周，4周和6周三个时间点进行活体自发荧光拍照（BAF），检测每组小鼠左右眼底的荧光强度。从图4A-4B中可以观察到IVT给药两周后，四个变体血清型对应的小鼠眼底的自发绿色荧光信号均能够检测到，其中AAV2给药组的荧光信号最弱，RC-C14给药组的荧光信号较其他血清型略强，但存在个体之间的差异。给药6周后，C07V1，C07V2和C07V7变体的荧光信号随着给药时间的延长而持续增强，实验对照组（RC-C14）未见明显的增强。荧光面积和平均荧光强度（图4C-4F）的统计结果进一步显示，在玻璃体腔内给药6周后，RC-C07V2和RC-C07V7给药组小鼠眼底荧光面积与4周相比显著增强，而RC-C07V5给药组小鼠的眼底荧光强度和荧光面积与实验对照（RC-C14）相当。
进一步将给药6周后的小鼠进行眼球取材，将视网膜组织的冰冻切片，进行RPE65抗体或Opsin抗体（购自Abcam）的免疫荧光染色（红色标记的是RPE细胞层，或光感受器细胞；DAPI标记的细胞核；绿色荧光代表的是rAAV感染细胞后的自发荧光。从小鼠视网膜组织的免疫荧光图片可以发现，通过IVT给药（图4G-4H），除对照组（AAV2）外，其余四种变体血清型（RC-C07V1、RC-C07V2、RC-C07V5，RC-C07V7)均能够高效感染视网膜内层组织（神经节细胞层、神经纤维层，内核层），从全自动扫描拍照设备拼接的视网膜完整大图上可以清晰的观察到变体血清型的组织分布，其中RC-C07V5表达的绿色荧光信号在视网膜内层组织中分布最广，荧光亮度最强，进一步比较分析视网膜外层的荧光情况可以发现，RC-C07V2和RC-C07V5新血清型均可以充分转导视网膜的外网状层，外核层以及部分光感受器层（PR）的内节，进一步表明RC-C07V2和RC-C07V5玻璃体腔注射后，能在整个视网膜组织中广泛分布，荧光亮度与对照组AAV2相比得到了显著增强，对内界膜（ILM）的穿透力高于现有血清型（AAV2.7m8）。
实施例5 不同给药方式下新血清型在眼组织中转导活性和分布差异性比较
图5A-5E中描述了AAV9亲本血清型和变体衣壳在给药不同时间后眼内转导效率的差异。动物体内给药流程如下：AAV9及其变体（RC-C07V2、RC-C07V5、RC-C07V6、RC-C07V7）分别采取IVT给药的方式（4E8vg/眼）以及视网膜下腔（Subretinal）给药（4E7vg/眼）。从IVT给药2周、4周和8周的BAF眼底自发荧光照片（图5A）中可以发现，AAV9很少能感染上视网膜细胞；与对照组相比，RC-C07V2和RC-C07V5在给药2周后荧光分布及强度显著提升。给药后8周，两个变体血清型的荧光强度呈现增强的趋势，而RC-C07V6的BAF眼底绿色荧光强度未见明显的提升趋势。BAF的统计结果表明，AAV9衣壳表面可变区VIII区域中关键氨基酸的突变显著提升了亲本AAV病毒在眼组织的转导效率，尤其是在玻璃体腔给药方式下。同时，给药后一段时间RC-C07V5变体的视网膜荧光信号未发生显著的减弱现象（8周vs 2周）。图5B-5C的统计结果进一步表明了RC-C07V5血清型的病毒衣壳的突变保留了其在玻璃体液中的稳定性。这些衣壳表面特定氨基酸的存在提升了AAV病毒转导视网膜组织的效率，能够有效逃逸细胞中蛋白酶的降解，提高了AAV遗传物质入核表达外源基因的能力。
图5D显示了小鼠视网膜免疫荧光染色后的全景和局部图片。与AAV9亲本血清型相比，RC-C07V2/V5/V7三种血清型在视网膜全层分布范围广，视网膜内外层均能检测到较强的荧光信号，而RC-C07V6血清型的荧光信号主要集中在视盘附近，网膜分布范围较局限。AAV9的转导主要零星发生在视网膜内层，对光感受器层（PR）的转导能力非常有限，而RC-C07V5具备了较强的PR转导能力。当视网膜下腔给药（SR）8周后，对各组小鼠视网膜的切片进行免疫荧光染色标记。图5E的结果表明，RC-C07V6在PR层的荧光强度显著提升（对比IVT给药）。与亲本AAV9相比，四种变体血清型的视网膜下腔给药途径的转导活性显著增强。荧光信号主要位于视网膜的外层，集中在光感受器层和视网膜色素上皮层（RPE），其中RPE层的荧光信号强度显著高于PR层。结果表明，RC-C07变体血清型可以通过视网膜下腔给药，同时能够高效转导视网膜外层几乎所有的细胞，对PRE的转导能力高于PR。
实施例6 RC-C07V5 血清型在食蟹猴（NHP）视网膜组织中的分布比较
NHP眼组织的冰冻切片荧光拍照：
采用IVT给药在食蟹猴眼内分别注射RC-C07V5和RC-C15（AAV2的变体衣壳，参见CN202210436003.4）两种病毒，剂量1.5E11vg/眼，双眼给药。每组各一只食蟹猴。给药2周和4周后分别进行活体的自发荧光拍照，从BAF眼底照可以看到RC-C07V5全眼荧光信号强度和分布显著强于对照组（图6A）。
将给药4周后的猴眼进行眼球取材，在溶剂中固定数天，然后进行冰冻切片的制备。挑选出形态完整的眼球切片，PBS浸泡清洗三次，每次5min，去除组织表面OCT包埋液。用组化笔将组织圈出，平放在湿盒上。将DAPI母液用PBS（1：2000）稀释后滴加在组织上染色5min。PBS浸泡清洗三次，每次5min，然后分别使用红色荧光二抗（购自于Abcam）标记RPE65（视网膜色素上皮细胞）和opsin（视紫红质标记光感受器层）。眼球组织上滴加抗荧光淬灭封片剂，载玻片边缘点涂少许指甲油用于固定。进行镜检，对绿色，蓝色以及红色三个荧光通道进行拍照。
图6A为食蟹猴的活体自发荧光BAF结果。图6B为视网膜组织的IF免疫荧光结果。在NHP中，RC-C07V5血清型在恒河猴眼的黄斑和视盘附近的视网膜组织中（GCL（神经纤维层）和PR（光感受器层））均可见明显的绿色荧光信号。荧光信号主要集中在RGC（视网膜神经节细胞）层和PR层，并且在黄斑区域的荧光信号强于视盘周围，而RC-C15集中在黄斑附近的部分区域，主要在神经节细胞层可见少量荧光信号（图6B）。RC-C07V5和RC-C15给药组的在RPE和脉络膜血管均未见明显的荧光信号。RC-C07V5给药组猴眼视网膜表面可见明显的散点状荧光信号，切片结果显示散点状荧光信号从神经节细胞层扩散到内核层。结果显示，与RC-C15相比，RC-C07V5血清型可以高效转导黄斑和视盘附近的PR和RGC等视网膜细胞，具备对视网膜内层和外层全域转导的潜力。
实施例7 新血清型在人源视网膜类器官（OV）中的转导活性比较
3D培养系统是指多个细胞和细胞类型在液体培养基或半液体基质中的悬浮生长，可用于模拟体内一些组织器官。诱导多能干细胞（iPSC）可在一定条件下分化成为具有人类视网膜特征的3D视网膜类器官，不仅包含多种视网膜细胞（感光细胞、神经节细胞、RPE等），而且能形成与体内形态非常接近的明显分层，在本实施例中利用自研人源多能干细胞(hPSC)衍生分化的视网膜类器官(RO)，进行高通量的修饰型血清型筛选。如图7所示，使用iPSC诱导分化86天构建的视网膜类器官（OV）进行四种血清型的感染活性对比。
图7分别显示了AAV9、C07V2、C07V5、C07V7四个血清型（E10vg/OV）体外感染视网膜类器官两周的切片的免疫荧光IF结果，其中绿色标记是病毒携带的EGFP的自发荧光信号，红色标记为CRX蛋白（光感受器的标志物）。结果显示，与AAV9亲本血清型相比，C07三个变体血清型在OV中均可见明显的绿色荧光信号，OV各层分布区域广，主要集中在视网膜外层，其中C07V5和C07V2在OV中的PR（CRX标记）的转导活性最强，绿色荧光信号几乎完全覆盖了光感受器的标记区域。结果表明AAV9衣壳可变区VIII区域的特定基序的改变会改变衣壳表面的空间构象，影响了与细胞受体结合的配体的结合力。C07变体衣壳表明获得了能够与潜在AAV受体亲和力高的新配体，进一步表明AAV（1-13）血清型（VRI-VRVIII）的特定基序决定了衣壳与靶细胞表面受体结合力的强弱。通过报告基因系统进一步验证了AAV9的变体在OV中的高转导活性，验证了新血清型SR给药小鼠对PR高转导取决于对外界膜（OLM）的高穿透性，相关结果在人源的OV（视杯）模型中也得到了有效性的重复，与小鼠模型中观察到的现象保持一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列:
AAV9 VP1（SEQ ID NO: 1）
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AAV9 VP1（SEQ ID NO: 7）
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RC-C07V2 VP1（SEQ ID NO: 9）
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGAAACAACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
RC-C07V5 VP1（SEQ ID NO: 10）
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
RC-C07V6 VP1（SEQ ID NO: 11）
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAAAGACCCCTGGCGGCAACGCCACCAGAGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
RC-C07V7 VP1（SEQ ID NO: 12）
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCaccACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
AAV9 VP1 584-598aa（SEQ ID NO: 13）
HQSAQAQAQTGWVQN
替换多肽（SEQ ID NO: 14）
LQRGNRQAATADVNT
替换多肽（SEQ ID NO: 15）
LQRGNRDLDPKATEVE
插入的功能肽（SEQ ID NO: 16）
LALGETTRPA
插入的功能肽（SEQ ID NO: 17）
LALGDVTRPA
插入的功能肽（SEQ ID NO: 18）
LALGEVTRPA
替换多肽（SEQ ID NO: 19）
LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT
替换多肽（SEQ ID NO: 20）
LQRGNLALGETTRPARQAATADVNT
替换多肽（SEQ ID NO: 21）
KTPGGNATR
RC-C07-F1（SEQ ID NO: 22）
AACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG
RC-C07-R2（SEQ ID NO: 23）
CGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAG
RC-C07-V2-R1（SEQ ID NO: 24）
GCAGGTCTTGTTGTTTCGCCGAGTGCTAGGTTGCCTCTCTGGAGGTTGGTGGCCACTTGTCCATAGGAC
RC-C07-V2-F2（SEQ ID NO: 25）
AACAACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGG
RC-C07-V5-R1（SEQ ID NO: 26）
GGTCTTGTCACGTCGCCGAGTGCTAGGTTGCCTC
RC-C07-V5-F2（SEQ ID NO: 27）
CGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGC
RC-C07-V6-R1（SEQ ID NO: 28）
GCGTTGCCGCCAGGGGTCTTTGAGACACGTTGTTGTCGG
RC-C07-V6-F2（SEQ ID NO: 29）
CCCTGGCGGCAACGCCACCAGAGAATTTGCTTGGCCTGGAGC
RC-C07-V7-R1（SEQ ID NO: 30）
TGCTGGTGGTGGTGACTCTGTCCCCCAGCCATTG
RC-C07-V7-F2（SEQ ID NO: 31）
GACAGAGTCACCACCACCAGCACCCGAACCTG
GOI-E04质粒序列（SEQ ID NO: 32）
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTATCGATATCAAGCTTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGATATCGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGGGGCCCAGCCGGCCTCGCGAGAATTCTCTAGAACGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGAGCTGACACTAGTGCGGATCCACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTATCGATAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGCAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
Claims (15)
1.一种AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述AAV衣壳蛋白为AAV9衣壳蛋白，并且所述AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于SEQ ID NO: 1所示的亲本AAV9衣壳蛋白VP1具有以下突变：
第584-598位氨基酸替换为如SEQ ID NO: 14所示的序列。
2. 如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的AAV衣壳蛋白变体进一步包含插入的功能肽，所述的功能肽包含如SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述的功能肽插入到对应亲本AAV衣壳蛋白氨基酸序列第588位和589位之间。
3. 如权利要求2所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的AAV衣壳蛋白变体包含如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20所示的序列，所述序列替换亲本AAV9衣壳蛋白VP1的第584-598位氨基酸。
4. 如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1相对于SEQ ID NO: 1所示的亲本AAV9衣壳蛋白VP1，进一步具有选自下组的突变：
(a) 第491-499位氨基酸替换为如SEQ ID NO: 21所示的序列；
(b) 第240位氨基酸处由异亮氨酸I突变为亲水氨基酸；和
(c) (a)和(b)的组合。
5.如权利要求4所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的亲水氨基酸为苏氨酸T。
6. 如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1氨基酸序列如SEQ ID NO: 2-6中任一项所示。
7. 如权利要求1所述的AAV衣壳蛋白变体，其特征在于，所述的AAV衣壳蛋白变体的VP1氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、4或6所示。
8.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-7中任一项所述的AAV衣壳蛋白变体。
9.一种载体，其特征在于，所述载体中含有如权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求9所述的载体，或基因组中整合有如权利要求8所述的多核苷酸。
11.一种rAAV颗粒，其特征在于，所述rAAV颗粒包含：
(i)如权利要求1-7中任一项所述的AAV衣壳蛋白变体；
(ii)包装在所述AAV衣壳内的目的核酸。
12.一种制备如权利要求11所述的rAAV颗粒的方法，其特征在于，包括步骤：在合适的条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞，从而获得所述rAAV颗粒。
13. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
(a) 如权利要求11所述的rAAV颗粒；和
(b) 药学上可接受的载体。
14. 一种药物组合，其特征在于，所述药物组合包括：
(a) 第一活性成分：如权利要求11所述的rAAV颗粒、或如权利要求13所述的药物组合物；和
(b) 第二活性成分，所述的第二活性成分为免疫调节剂。
15.如权利要求11所述的rAAV颗粒、或如权利要求13所述的药物组合物、或如权利要求14所述的药物组合、或其组合在制备治疗眼部疾病的药物中的用途。
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Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2021156609A1 (en) * | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Oxford Genetics Limited | Process for making adenoassociated viral vectors |
| CN113766934A (zh) * | 2019-04-26 | 2021-12-07 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于玻璃体内递送的变体aav衣壳 |
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|---|---|---|---|---|
| CN111867635A (zh) * | 2017-10-20 | 2020-10-30 | 法国国家卫生及研究医学协会 | 包括视网膜下递送治疗有效量的重组aav9衍生载体的在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法 |
| CN111770999A (zh) * | 2017-11-27 | 2020-10-13 | 4D分子治疗有限公司 | 腺相关病毒变体衣壳和用于抑制血管生成的应用 |
| CN113766934A (zh) * | 2019-04-26 | 2021-12-07 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于玻璃体内递送的变体aav衣壳 |
| WO2021156609A1 (en) * | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Oxford Genetics Limited | Process for making adenoassociated viral vectors |
| CN115044614A (zh) * | 2021-03-09 | 2022-09-13 | 上海目镜生物医药科技有限公司 | 一种用于基因靶向与表达的aav-8型血清型的改造型载体及其构建方法及应用 |
| CN116549630A (zh) * | 2022-01-29 | 2023-08-08 | 上海目镜生物医药科技有限公司 | 一种由腺相关病毒载体介导表达的抗血管内皮生长因子基因药物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| AAV genome modification for efficient AAV production;Walaa Asaad等;Heliyon;第9卷;1-12 * |
| 腺相关病毒衣壳蛋白修饰的研究进展;陈倩影等;解放军医学院学报;第43卷(第1期);101-105 * |
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