CN117778431A - 一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。本发明用于rAAV包装的质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。本发明在rAAV生产过程中可以有效降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗载体，具有安全性高、转导能力强等特点，目前已有几款基于rAAV的基因治疗药物上市，还有很多基于rAAV的基因治疗临床试验正在开展。rAAV生产系统主要包括基于HEK293细胞的质粒转染生产系统、基于昆虫细胞和杆状病毒的生产系统、基于HEK293细胞和腺病毒的生产系统。基于HEK293细胞的质粒转染生产系统，可贴壁培养以及悬浮培养，同时也包括一质粒或者多质粒转染的方式，简单、快速，是被广泛采用的rAAV生产系统。以经典的三质粒转染生产系统为例，该生产系统涉及使用三个质粒共转染HEK293细胞：一个辅助质粒pHelper，提供能够表达腺病毒元件蛋白的核酸序列；一个辅助质粒pRep-Cap，提供能够表达AAV的Rep和Cap蛋白的核酸序列，其中Rep蛋白负责AAV基因组的复制与协助AAV基因组颗粒的组装，Cap蛋白组成AAV外壳；一个包括目的序列的质粒，可简称为pGOI，目的序列的上下游各有一个天然AAV基因组中的5′ITR和3′ITR序列。
在rAAV生产过程中，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)，会由ITR/类ITR介导或随机方式将其错误包装进入AAV病毒衣壳，降低rAAV病毒的纯度和效价，带来不可预测的副作用，给体内的基因治疗带来风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。
本发明的用于rAAV包装的质粒系统，在rAAV生产过程中可以有效降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留，即有效降低非rAAV相关序列错误包装进入AAV病毒衣壳的比率，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述基因编辑酶为成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR associated(Cas)核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFNs)中的至少一种。
优选的，所述基因编辑酶为Cas9核酸酶。基因编辑酶可识别和结合特定的基因序列，并将其切割或重组。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/Cas(CRISPR associated)系统是一种由细菌及古细菌进化形成的、用于抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。在开发CRISPR/Cas9系统中，Cas9蛋白与人工设计的sgRNA(single-guided RNA)结合形成复合体，在sgRNA的引导下结合到与sgRNA上互补配对的20bp靶DNA序列，并将靶DNA切割。通过设计在在载体骨架上靠近目的DNA片段的区域添加特异的的20bp靶序列+PAM序列，在rAAV包装过程中表达Cas9蛋白和sgRNA，可通过sgRNA引导Cas9蛋白识别靶DNA序列后将其切割，使含目的核酸片段与载体骨架部分相分离，从而降低由ITR/类ITR介导包装载体骨架的概率。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有所述基因编辑酶序列的pAAVS1。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有Cas9编辑靶位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有Cas9序列的pAAVS1。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pGOI、pRep-Cap和插入有所述基因编辑酶序列的pHelper。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有Cas9编辑靶位点序列的pGOI、pRep-Cap和插入有Cas9序列的pHelper。
所述质粒pGOI包括来自不同血清型、ITR序列及其优化的序列。所述质粒pRep-Cap包括来自不同血清型、表达Rep蛋白的核酸序列和表达Cap蛋白的核酸序列及其优化的核酸序列。所述质粒pHelper包括来自不同辅助病毒质粒、表达腺病毒原件蛋白的核酸序列及其优化的序列。
第二方面，本发明提供了一种降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留的方法，采用所述的质粒系统转染包装细胞。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述包装细胞包括HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293A、Hela、Vero、CHO中的至少一种，以及其它用于rAAV生产的细胞。
第三方面，本发明将所述的质粒系统在rAAV生产中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的用于rAAV包装的质粒系统进行rAAV生产，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)被错误包装进入AAV病毒衣壳的比例大大降低，能够降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留，有效提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
附图说明
图1为pAAVS1的质粒图谱。
图2为添加pAAVS1/Cas9质粒进行rAAV包装；
图2中，图a-c：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/Cas9四质粒用于rAAV生产(+pCas9组)，pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1四质粒用于rAAV生产(EV组)，rAAV包装的WPRE滴度(a)、ori滴度(b)、反包率(c)；图d-f：+pCas9组相比于对照EV组的WPRE滴度倍数(d)、ori滴度倍数(e)、反包率倍数(f)。
图3为在质粒pHelper上添加Cas9核酸酶表达盒核酸序列后进行rAAV包装；
图3中，图a-c：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper/Cas9三质粒用于rAAV生产(+Cas9组)，pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper三质粒用于rAAV生产(CT组)，rAAV包装的WPRE滴度(a)、ori滴度(b)、反包率(c)；图d-f：+Cre组相比于对照CT组的WPRE滴度倍数(d)、ori滴度倍数(e)、反包率倍数(f)。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述WPRE滴度是目的DNA片段的拷贝数；所述ori滴度是载体骨架的拷贝数；所述反包率是载体骨架拷贝数相比于目的DNA片段拷贝数的比例。
实施例1：添加pAAVS1/Cas9质粒进行rAAV包装
(1)pAAVS1/Cas9载体的构建
设计用于扩增Cas9片段的引物(Cas9-F：ttacaaagacgatgacgataagatgGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGC；Cas9-R：agcgagctctaggaattcttatcaGTCGCCTCCCAGCTGAGACA)和扩增pAAVS1骨架的引物(VB-F：tgataagaattcctagagctcgct；VB-R：catcttatcgtcatcgtctttgtaa)。
使用Cas9-F/Cas9-R扩增pX330质粒(Addgene：42230)，使用VB-F/VB-R扩增pAAVS1质粒(其质粒图谱如图1所示其核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示)。扩增体系为：25μL 2×KOD OnePCR Master Mix(ToYoBo，#KMM-101)、1.0μL Forward primer(10μM)、1.0μLReverse primer(10μM)、20ng DNA模板，使用灭菌水补至50μL。扩增条件为：95℃预变性3min；98℃变性10sec，58℃退火5sec，68℃延伸10sec/kb(32个循环)；68℃延伸3min。扩增完成后于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的DNA片段的凝胶，使用“HiPure Gel Pure DNAMicro Kits”(Megan，#D21111-03)回收纯化目的DNA，获得Cas9片段、pAAVS1-VB片段。
使用Gibson Assembly方法，连接回收纯化获得的两个DNA片段。反应体系为：7.5μL 3/4×Gibson Assembly Master Mix、100ng Cas9片段、100ng pAAVS1-VB片段用灭菌水补至10μL。混匀后置于50℃温育30min。将连接的DNA转化XL10-Gold ChemicallyCompetent Cell，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pAAVS1质粒上插入Cas9编码框序列的质粒，命名为pAAVS1/Cas9。
(2)pGOI-Tgfp载体的构建
根据GFP荧光蛋白(GenBank accession：AAB02572)序列信息，设计靶向GFP荧光蛋白的靶位点序列(GGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGG，Tgfp)。根据pGOI质粒信息(Addgene：27970)、pX330质粒序列信息，设计一对包含Tgfp序列、用于扩增GOI片段的嵌合引物(GOI-F：tatggaaaaacgccagcaacgGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGcctttttacggttccGOI-R：cgtatgcggtgtgaaataCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCcacagatgcgtaaggaga)；设计用于扩增载体骨架的引物(VB-F：ttttctccttacgcatctgtgggccacaagttcagcgtgtccggtatttcacaccgcat；VB-sgRNA-R：aaggaatcatgggaaataggccctcggagacggtcacagcttgtc；VB-sgRNA-F：agtggcaccgagtcggtgcttttttcgcgcgagacgaaagggcct；VB-R：ccaggaaccgtaaaaaggccggacacgctgaacttgtggcccgttgctggcgtttttcc)；设计用于扩增sgRNA的引物(sgRNA-F：gagggcctatttcccatgattcctt；sgRNA-Tgfp-R：TTCCAGCATAGCTCTTAAAcgacacgctgaacttgtggccGGTGTTTCGTCCTTTCCACaagata；sgRNA-Tgfp-F：tGTGGAAAGGACGAAACACCggccacaagttcagcgtgtcgTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGC；sgRNA-R：aaaaaagcaccgactcggtgccact)。
使用GOI-F/GOI-R、VB-F/VB-sgRNA-R、VB-sgRNA-F/VB-R扩增pGOI质粒，使用sgRNA-F/sgRNA-Tgfp-R、sgRNA-Tgfp-F/sgRNA-R扩增sgRNA质粒(Addgene：128119)。扩增体系为：25μL2×KOD OnePCR Master Mix(ToYoBo，#KMM-101)、1.0μL Forward primer(10μM)、1.0μL Reverse primer(10μM)、20ng DNA模板，使用灭菌水补至50μL。扩增条件为：95℃预变性3min；98℃变性10sec，58℃退火5sec，68℃延伸10sec/kb(32个循环)；68℃延伸3min。扩增完成后于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的DNA片段的凝胶，使用“HiPure GelPure DNA Micro Kits”(Megan，#D21111-03)回收纯化目的DNA，获得GOI片段、VB片段。
使用VB-F/VB-R扩增VB-F/VB-sgRNA-R、VB-sgRNA-F/VB-R、sgRNA-F/sgRNA-Tgfp-R、sgRNA-Tgfp-F/sgRNA-R的第一轮PCR产物。每一个第一轮PCR片段添加20ng，扩增体系和扩增条件同第一轮扩增。扩增完成后纯化DNA片段
使用Gibson Assembly方法，连接GOI-F/GOI-R扩增获得的DNA片段1、VB-F/VB-R第二轮扩增获得的DNA片段2。反应体系为：15μL 3/4× Gibson Assembly Master Mix、100ngDNA片段1、100ng DNA片段2，用灭菌水补至20μL。混匀后置于50℃温育30min。将连接的DNA转化XL10-Gold Chemically Competent Cell(上海唯地，#DL 1050)，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pGOI质粒的5′ITR的5′端、3′ITR的3′端分别添加TelROL序列的质粒，命名为pGOI-Tgfp。
提取高浓度、高纯度的pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/Cas9质粒。
(3)rAAV包装及滴度测定
转染前一天，使用DMEM培养基将293T细胞悬浮后计数，以6×106个细胞/皿均匀铺于10cm细胞培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养至细胞汇合度约80％。
设置EV组质粒：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1；+Cas9组质粒：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/Cas9。
转染当天，更换新鲜的DMEM培养基。分别将pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1(EV组)，pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/Cas9(+Cas9组)按2.0μg∶2.5μg∶2.5μg∶1.0μg比例混合，每组3个重复。用0.5mL DMEM与质粒DNA混合，用0.5mL DMEM与10.8μL PEIpro混合，然后将PEIpro混合液加入到DNA混合液中并混匀，室温静置15min。将DNA-PEIpro混合液加入生长好的细胞中，轻轻混匀后放回培养箱培养。
转染后72h，加入1％氯仿裂解细胞后收集至50mL离心管。加入核酸酶消化后使用PEG8000将rAAV浓缩纯化。纯化后的rAAV经DNaseI消化后用qRT-PCR测定WPRE滴度和ori滴度，以梯度稀释的质粒标准品制作标准曲线。根据标准品曲线计算rAAV样品的WPRE滴度和ori滴度。
pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/Cas9四质粒用于rAAV生产(+pCas9组)，相比于pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1四质粒用于rAAV生产(EV组)，+pCas9组生产的AAV，质粒骨架反包进入rAAV衣壳的比率(反包率)降低至对照EV组的0.10倍。
实施例2：在pHelper上添加Cas9核酸酶表达盒核酸序列后进行rAAV包装
(1)载体构建及质粒提取
设计用于扩增包含Cas9表达盒片段的引物(pHel-Cas9-F：acgtcgacgtttaaaccaCGTTACATAACTTACGGTAAATGG；pHel-Cas9-R：gcctttgagtgagctgatcatatgTCCCCAGCATGCCTGCTATTCTC)。
使用pHel-Cas9-F/pHel-Cas9-R扩增pAAVS1/Cas9。扩增体系为：10μL5×PrimerSTAR GXL Buffer、4.0μL dNTP Mixture(2.5mM each)、1.0μL PrimerSTAR GXL DNAPolymerase(TaKaRa，#R050A)、1.0μL Forward primer(10μM)、1.0μL Reverse primer(10μM)、50ng DNA模板，使用灭菌水补至50μL。扩增条件为：98℃预变性1min；98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min/kb(32个循环)；72℃延伸5min。扩增完成后于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的DNA片段的凝胶，使用“HiPure Gel Pure DNA Micro Kits”(Megan，D21111-03)回收纯化目的DNA，获得Cas9表达盒片段。
使用NdeI(ThemoFisher Scientific，#FD0583)将pHelper质粒(GenBank：AF369965)酶切。酶切体系为：5.0μL 10×FastDigest buffer、2.0μL BbsI酶、2.0μgpHelper质粒，用灭菌水补至50μL。酶切条件为：37℃温育30min、65℃温育5min。酶切后，使用“HiPure Gel Pure DNA Micro Kits”进行纯化。
使用Gibson Assembly方法，连接Cas9表达盒片段盒酶切的pHelper。反应体系为：15μL 3/4×Gibson Assembly Master Mix、20ng酶切的pHelper、10ng TelN表达盒片段，用灭菌水补至20μL。混匀后置于50℃温育30min。将连接的DNA转化XL 10-Gold ChemicallyCompetent Cell，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pHelper质粒上插入Cas9表达盒的质粒，命名为pHelper/Cas9。
提取高浓度、高纯度的pGOI、pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper、pHelper/Cas9质粒。
(2)rAAV包装及滴度测定
转染前一天，使用DMEM培养基将293T细胞悬浮后计数，以6×106个细胞/皿均匀铺于10-cm细胞培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养至细胞汇合度约80％。
设置CT组质粒：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper；+Cas9组质粒：pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper/Cas9。
转染当天，更换新鲜的DMEM培养基。分别将pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper(CT组)，pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper/Cas9(+Cas9组)按2.0μg∶2.5μg∶2.5μg比例混合，每组3个重复。用0.5mL DMEM与质粒DNA混合，用0.5mL DMEM与8.4μL PEIpro混合，然后将PEIpro混合液加入到DNA混合液中，室温静置15min。将DNA-PEIpro混合液加入生长好的细胞中，轻轻混匀后放回培养箱培养。
转染后72h，加入1％氯仿裂解细胞后收集至50mL离心管。加入核酸酶消化后使用PEG8000将rAAV浓缩纯化。纯化后的rAAV经DNaseI消化后用qRT-PCR测定WPRE滴度和ori滴度，以梯度稀释的质粒标准品制作标准曲线。根据标准品曲线计算rAAV样品的WPRE滴度和ori滴度。
pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper/Cas9三质粒用于rAAV生产(+Cas9组)，相比于pGOI-Tgfp、pRep-Cap、pHelper三质粒用于rAAV生产(CT组)，+Cas9组生产的rAAV，质粒骨架反包进入rAAV衣壳的比率(反包率)降低至对照CT组的0.11倍。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。
2.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述基因编辑酶为CRISPR/Cas核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶、锌指核酸酶中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的质粒系统，其特征在于，所述基因编辑酶为Cas9核酸酶。
4.根据权利要求1～3任一项所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有所述基因编辑酶序列的pAAVS1。
5.根据权利要求4所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有Cas9编辑靶位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有Cas9序列的pAAVS1。
6.根据权利要求1～3任一项所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pGOI、pRep-Cap和插入有所述基因编辑酶序列的pHelper。
7.根据权利要求6所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有Cas9编辑靶位点序列的pGOI、pRep-Cap和插入有Cas9序列的pHelper。
8.一种降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留的方法，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的质粒系统转染包装细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述包装细胞包括HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293A、Hela、Vero、CHO中的至少一种。
10.权利要求1～7任一项所述的质粒系统在rAAV生产中的应用。
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