CN117925663A - 一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。本发明提供了一种用于rAAV包装的质粒系统，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有核酸内切酶识别的位点序列和/或识别所述序列的核酸内切酶序列。本发明在rAAV生产过程中可以有效降低非rAAV相关序列错误包装进入AAV病毒衣壳的比率，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗载体，具有安全性高、转导能力强等特点，目前已有几款基于rAAV的基因治疗药物上市，还有很多基于rAAV的基因治疗临床试验正在开展。rAAV生产系统主要包括基于HEK293细胞的质粒转染生产系统、基于昆虫细胞和杆状病毒的生产系统、基于HEK293细胞和腺病毒的生产系统。基于HEK293细胞的质粒转染生产系统，可贴壁培养以及悬浮培养，同时也包括一质粒或者多质粒转染的方式，简单、快速，是被广泛采用的rAAV生产系统。以经典的三质粒转染生产系统为例，该生产系统涉及使用三个质粒共转染HEK293细胞：一个辅助质粒pHelper，提供能够表达腺病毒元件蛋白的核酸序列；一个辅助质粒pRep-Cap，提供能够表达AAV的Rep和Cap蛋白的核酸序列，其中Rep蛋白负责AAV基因组的复制与协助AAV基因组颗粒的组装，Cap蛋白组成AAV外壳；一个包括目的序列的质粒，可简称为pGOI，目的序列的上下游各有一个天然AAV基因组中的5′ITR和3′ITR序列。
在rAAV生产过程中，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)，会由ITR/类ITR介导或随机方式将其错误包装进入AAV病毒衣壳，降低rAAV病毒的纯度和效价，带来不可预测的副作用，给体内的基因治疗带来风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有核酸内切酶识别的位点序列和/或识别所述序列的核酸内切酶序列。
本发明的质粒系统采用核酸内切酶降低重组腺相关病毒中质粒骨架核酸序列残留，核酸内切酶通过识别并附着特定的核苷酸序列，并以内切方式水解DNA特定部位。通过设计在载体骨架上靠近目的DNA片段的区域添加核酸内切酶识别的序列，以核酸内切酶进行切割后，可将包含目的核酸片段与载体骨架分离从而防止由ITR/类ITR介导将载体骨架错误包装。在rAAV生产过程中可以有效降低非rAAV相关序列错误包装进入AAV病毒衣壳的比率，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述核酸内切酶包括归巢核酸内切酶、限制性核酸内切酶中的任意一种。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有I-SceI归巢核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有所述核酸内切酶序列的pAAVS1。
作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有I-SceI归巢核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有I-SceI归巢核酸内切酶序列的pAAVS1。
所述质粒pGOI包括来自不同血清型、ITR序列及其优化的序列。所述质粒pRep-Cap包括来自不同血清型、表达Rep蛋白的核酸序列和表达Cap蛋白的核酸序列及其优化的核酸序列。所述质粒pHelper包括来自不同辅助病毒质粒、表达腺病毒原件蛋白的核酸序列及其优化的序列。
第二方面，本发明提供了一种用于rAAV生产的细胞，所述细胞稳定表达核酸内切酶；所述细胞包括所述的质粒系统；所述质粒系统包括插入有识别所述核酸内切酶位点的序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
优选的，所述核酸内切酶为I-SceI归巢核酸内切酶；所述质粒系统包括插入有识别I-SceI归巢核酸内切酶的位点序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
第三方面，本发明提供了一种降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留的方法，采用所述的质粒系统转染包装细胞。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述包装细胞包括HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293A、Hela、Vero、CHO中的至少一种，以及其它用于rAAV生产的细胞。
第四方面，本发明将所述的质粒系统、所述细胞在rAAV生产中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的质粒系统采用核酸内切酶降低重组腺相关病毒中质粒骨架核酸序列残留，即采用核酸内切酶系统去除质粒骨架核酸序列进行rAAV生产，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)，被错误包装进入AAV病毒衣壳的比例大大降低，在rAAV生产过程中可以有效降低非rAAV相关序列错误包装进入AAV病毒衣壳的比率，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。
附图说明
图1为体外添加I-SceI归巢核酸内切酶消化质粒后进行rAAV包装；
图1中，图a-c：体外添加I-SceI归巢核酸内切酶消化质粒pGOI-IRS，消化后的质粒pGOI-IRS和pRep-Cap、pHelper质粒，共同用于rAAV生产(+I-SceI组)，pGOI、pRep-Cap、pHelper三质粒用于rAAV生产(CT组)，rAAV包装的WPRE滴度(a)、ori滴度(b)、反包率(c)。图d-f：+I-SceI组相比于对照CT组的WPRE滴度倍数(d)、ori滴度倍数(e)、反包率倍数(f)。
图2为pAAVS1的质粒图谱。
图3为添加pAAVS1/I-SceI质粒进行rAAV包装；
图3中，图a-c：pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI四质粒用于rAAV生产(+pI-SceI组)，pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1四质粒用于rAAV生产(EV组)，rAAV包装的WPRE滴度(a)、ori滴度(b)、反包率(c)。图d-f：+pI-SceI组相比于对照EV组的WPRE滴度倍数(d)、ori滴度倍数(e)、反包率倍数(f)。
图4为使用稳定表达I-SceI归巢核酸内切酶的细胞I-SceI KI进行rAAV包装；
图4中，图a-c：pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper三质粒转染稳定表达I-SceI归巢核酸内切酶的细胞I-SceI KI，用于rAAV生产(I-SceI KI组)，pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper三质粒转染细胞293T，用于rAAV生产(293T组)，rAAV包装的WPRE滴度(a)、ori滴度(b)、反包率(c)。图d-f：I-SceI KI组相比于对照293T组的WPRE滴度倍数(d)、ori滴度倍数(e)、反包率倍数(f)。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述WPRE滴度是目的DNA片段的拷贝数；所述ori滴度是载体骨架的拷贝数；所述反包率是载体骨架拷贝数相比于目的DNA片段拷贝数的比例。
实施例1：体外添加I-SceI归巢核酸内切酶消化质粒后进行rAAV包装
(1)载体构建及质粒提取
根据I-SceI归巢核酸内切酶识别位点(I-SceI Recognition Site，IRS)的序列信息(TAGGGATAACAGGGTAAT)、pGOI质粒信息(Addgene：27970)，设计一对包含I-SceI识别位点、用于扩增GOI片段的嵌合引物(GOI-ISceI-F：gggggcggagcctatggaaaaacgcTAGGGATAACAGGGTAATcagcaacgcggcctttttac；GOI-ISceI-R：tgcgccgctacagggcgcgtactatATTACCCTGTTATCCCTAggttgctttgacgtatgcgg)，设计一对包含I-SceI识别位点、用于扩增载体骨架的嵌合引物(VB-ISceI-F：tcacaccgcatacgtcaaagcaaccTAGGGATAACAGGGTAATatagtacgcgccctgtagcg；VB-ISceI-R：gaaccgtaaaaaggccgcgttgctgATTACCCTGTTATCCCTAgcgtttttccataggctccg)。
然后分别使用GOI-ISceI-F/GOI-ISceI-R、VB-ISceI-F/VB-ISceI-R扩增pGOI质粒。扩增体系为：25μL 2×PrimerSTAR Max Premix(TaKaRa，#R045A)、1.5μL Forwardprimer(10μM)、1.5μL Reverse primer(10μM)、50ng pGOI质粒，使用灭菌水补至50μL。扩增条件为：95℃预变性3min；98℃变性10sec，57℃退火25sec，72℃延伸15sec/kb(32个循环)；72℃延伸3min。扩增完成后于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的DNA片段的凝胶，使用“HiPure Gel Pure DNA Micro Kits”(Megan，#D21111-03)回收纯化目的DNA，获得GOI片段、载体骨架片段。
使用Gibson Assembly方法，连接回收纯化获得的两个DNA片段。反应体系为：15μL3/4×Gibson Assembly Master Mix、20ng载体骨架片段、100ng GOI片段，用灭菌水补至20μL。混匀后置于50℃温育30min。将连接的DNA转化XL 10-Gold Chemically CompetentCell(上海唯地，#DL 1050)，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pGOI质粒的5′ITR的5′端、3′ITR的3′端分别添加I-SceI识别位点IRS的质粒，命名为pGOI-IRS。
提取高浓度、高纯度的pGOI、pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper质粒。于体外添加I-SceI归巢核酸内切酶(New England Biolabs，#R0649S)，将pGOI-IRS质粒进行酶切。酶切体系为：5.0μL 10×NEB buffer、10μL I-SceI酶、10μg pGOI-IRS质粒，用灭菌水补至50μL。酶切条件为：37℃温育90min、65℃温育20min。酶切后，使用“HiPure Gel Pure DNA MicroKits”进行纯化。
(2)rAAV包装及滴度测定
转染前一天，使用DMEM培养基将293T细胞悬浮后计数，以6×106个细胞/皿均匀铺于10-cm细胞培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养至细胞汇合度约80％。
设置CT组质粒：pGOI、pRep-Cap、pHelper；+I-SceI组质粒：添加I-SceI归巢核酸内切酶处理后的pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper。
转染当天，更换新鲜的DMEM培养基。分别将pGOI、pRep-Cap、pHelper(CT组)，添加I-SceI归巢核酸内切酶处理后的pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper(+I-SceI组)按2.0μg∶2.5μg∶2.5μg比例混合，每组3个重复。用0.5mL DMEM与质粒DNA混合，用0.5mL DMEM与8.4μLPEIpro混合，然后将PEIpro混合液加入到DNA混合液中并混匀，室温静置15min。将DNA-PEIpro混合液加入生长好的细胞中，轻轻混匀后放回培养箱培养。
转染后72h，加入1％氯仿裂解细胞后收集至50mL离心管。加入核酸酶消化后使用PEG8000将rAAV浓缩纯化。纯化后的rAAV经DNaseI消化后，用qRT-PCR测定WPRE滴度和ori滴度，以梯度稀释的质粒标准品制作标准曲线。根据标准品曲线计算rAAV样品的WPRE滴度和ori滴度。
体外添加I-SceI归巢核酸内切酶消化质粒pGOI-IRS，消化后的质粒pGOI-IRS和pRep-Cap、pHelper质粒，共同用于rAAV生产(+I-SceI组)。相比于pGOI、pRep-Cap、pHelper三质粒用于rAAV生产(CT组)，+I-SceI组生产的rAAV，质粒骨架反包进入rAAV衣壳的比率(反包率)降低至对照CT组的0.23倍。
实施例2：添加pAAVS1/I-SceI质粒进行rAAV包装
(1)载体构建及质粒提取
根据公共数据库查询获得I-SceI归巢核酸内切酶序列信息，然后进行密码子优化(ATGCACATGAAGAACATCAAGAAGAACCAGGTGATGAACCTGGGCCCCAACAGCAAGCTGCTGAAAGAGTACAAGAGCCAGCTGATCGAGCTGAACATCGAGCAGTTCGAGGCCGGCATCGGCCTGATTCTGGGAGATGCTTACATTAGATCCAGAGACGAGGGCAAGACCTACTGCATGCAGTTCGAGTGGAAGAACAAAGCCTATATGGACCACGTGTGCCTGCTGTACGACCAGTGGGTGCTGAGCCCTCCTCATAAGAAGGAGAGAGTGAATCACCTGGGAAACCTGGTGATCACCTGGGGAGCCCAGACCTTCAAGCACCAGGCTTTCAATAAGCTGGCCAACCTGTTCATCGTGAACAACAAAAAGACCATCCCCAACAACCTGGTGGAGAACTACCTGACCCCCATGAGCCTGGCCTACTGGTTCATGGACGACGGCGGAAAGTGGGACTACAATAAGAACAGCACCAATAAAAGCATCGTGCTGAACACCCAGAGCTTCACCTTTGAAGAGGTGGAGTACCTGGTGAAGGGACTGCGCAACAAGTTCCAGCTGAACTGCTACGTGAAGATCAACAAAAACAAGCCCATCATCTACATTGACAGCATGAGCTACCTGATCTTCTATAACCTGATTAAGCCTTATCTGATCCCCCAGATGATGTACAAACTGCCCAACACCATCAGCAGCGAAACCTTCCTGAAATGA)，并委托擎科生物进行基因合成。设计用于扩增I-SceI片段的引物(ISceI-F：ttacaaagacgatgacgataagatgCACATGAAGAACATCAAGAA；ISceI-R：agcgagctctaggaattcttaTCATTTCAGGAAGGTTTCGCTGCT)和扩增pAAVS1骨架的引物(VB-F：tgataagaattcctagagctcgct；VB-R：catcttatcgtcatcgtctttgtaa)。
使用ISceI-F/ISceI-R扩增I-SceI基因片段，使用VB-F/VB-R扩增pAAVS1质粒(其质粒图谱如图2所示，其核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示)。扩增体系为：25μL 2×PrimerSTAR Max Premix(TaKaRa，R045A)、1.5μL Forward primer(10μM)、1.5μL Reverseprimer(10μM)、50ng DNA模板，使用灭菌水补至50μL。扩增条件为：95℃预变性3min；98℃变性10sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec/kb(32个循环)；72℃延伸3min。扩增完成后于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取含目的DNA片段的凝胶，使用“HiPure Gel Pure DNA MicroKits”(Megan，#D21111-03)回收纯化目的DNA，获得I-SceI基因片段、pAAVS1-VB片段。
使用Gibson Assembly方法，连接回收纯化获得的两个DNA片段。反应体系为：7.5μL 3/4×Gibson Assembly Master Mix、10ng I-SceI基因片段、25ng pAAVS1-VB片段，用灭菌水补至10μL。混匀后置于50℃温育30min。将连接的DNA转化XL10-Gold ChemicallyCompetent Cell，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pAAVS1质粒上插入I-SceI编码框序列的质粒，命名为pAAVS1/I-SceI。
提取高浓度、高纯度的pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI质粒。
(2)rAAV包装及滴度测定
转染前一天，使用DMEM培养基将293T细胞悬浮后计数，以6×106个细胞/皿均匀铺于10-cm细胞培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养至细胞汇合度约80％。
设置EV组质粒：pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1；+pI-SceI组质粒：pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI。
转染当天，更换新鲜的DMEM培养基。分别将pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1(EV组)，pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI(+pI-SceI组)按6.0μg∶7.5μg∶7.5μg∶3.0μg比例混合，每组3个重复。用0.5mL DMEM与质粒DNA混合，用0.5mL DMEM与28.8μLPEIpro混合，然后将PEIpro混合液加入到DNA混合液中并混匀，室温静置15min。将DNA-PEIpro混合液加入生长好的细胞中，轻轻混匀后放回培养箱培养。
转染后72h，加入1％氯仿裂解细胞后收集至50mL离心管。加入核酸酶消化后使用PEG8000将rAAV浓缩纯化。纯化后的rAAV经DNaseI消化后，用qRT-PCR测定WPRE滴度和ori滴度，以梯度稀释的质粒标准品制作标准曲线。根据标准品曲线计算rAAV样品的WPRE滴度和ori滴度。
pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI四质粒用于rAAV生产(+pI-SceI组)，相比于pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1四质粒用于rAAV生产(EV组)，+pI-SceI组生产的rAAV，质粒骨架反包进入rAAV衣壳的比率(反包率)降低至对照EV组的0.37倍。
实施例3：使用表达I-SceI归巢核酸内切酶细胞进行rAAV包装
(1)载体构建及质粒提取
设计靶向AAVS1位点的sgAAVS1引物(sgAAVS1-F：CACCtaaggaatctgcctaacagg；sgAAVS1-R：AACcctgttaggcagattcctta)。配制引物退火体系：2.0μL Forward primer(10μM)、2.0μL Reverse primer(10μM)，使用灭菌水补至20μL。于98℃温育5min，自然冷却至室温。
使用BpiI(ThemoFisher Scientific，#FD1014)将pX330质粒(Addgene：42230)酶切。酶切体系为：5.0μL 10×FastDigest buffer、2.0μL BpiI酶、2.0μg pX330质粒，用灭菌水补至50μL。酶切条件为：37℃温育30min、65℃温育5min。酶切后，使用“HiPure Gel PureDNA Micro Kits”进行纯化。
配制DNA连接反应体系：1.0μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1.0μL T4 DNALigase(TaKaRa，#6022)、0.5μL pX330酶切产物、2.0μL退火引物，用灭菌水补至10μL。混匀后置于16℃温育约2h。将连接的DNA转化XL 10-Gold Chemically Competent Cell，利用含氨苄青霉素的LB培养基进行筛选后，挑选单克隆送往擎科生物进行测序。最终获得在pX330质粒上插入sgAAVS1靶位点的，命名为pX330/sgAAVS1。
提取高浓度、高纯度的pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper、pAAVS1/I-SceI、pX330/sgAAVS1质粒。
(2)细胞转染及筛选
转染前一天，使用DMEM培养基将293T细胞悬浮并计数，以1×106/孔均匀铺于6孔细胞培养板中。转染当天，将pAAVS1/I-SceI质粒与pX330/sgAAVS1质粒以2.0μg∶1.0μg质粒混合，加入6.0μL P3000试剂和125μL Opti-MEMI并混匀。在另一离心管加入3.75μLLipofectamin 3000、125μL Opti-MEMI并混匀。然后将DNA-P3000混合液加入Lipofectamin3000混合液，混匀后室温静置15min。将转染混合物加入6孔细胞培养板中，轻轻混匀后置于37℃、5％CO2条件培养约48～72h。
收集转染后的细胞，使用DMEM悬浮并计数。然后以1E6/孔接种于6孔细胞培养板，加入终浓度为1.0μg/mL Puro，置于37℃、5％CO2条件培养筛选约1～2周。然后于96孔细胞培养板中分离单克隆，并扩大培养，细胞标记为I-SceI KI。
(3)rAAV包装及滴度测定
转染前一天，使用DMEM培养基将293T、I-SceI KI细胞悬浮后计数，以6×106个细胞/皿均匀铺于10-cm细胞培养皿，置于37℃、5％CO2条件培养至细胞汇合度约80％。
转染当天，更换新鲜的DMEM培养基。分别将pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper(293T组)，pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper(I-SceI KI组)按2.0μg∶2.5μg∶2.5μg比例混合，每组3个重复。用0.5mL DMEM与质粒DNA混合，用0.5mL DMEM与8.4μL PEIpro混合，然后将PEIpro混合液加入到DNA混合液中并混匀，室温静置15min。将DNA-PEIpro混合液加入生长好的细胞中，轻轻混匀后放回培养箱培养。
转染后72h，加入1％氯仿裂解细胞后收集至50mL离心管。加入核酸酶消化后使用PEG8000将rAAV浓缩纯化。纯化后的rAAV经DNaseI消化后，用qRT-PCR测定WPRE滴度和ori滴度，以梯度稀释的质粒标准品制作标准曲线。根据标准品曲线，分别计算rAAV样品的WPRE滴度和ori滴度。
pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper三质粒转染稳定表达I-SceI归巢核酸内切酶的细胞I-SceI KI，用于rAAV生产(I-SceI KI组)。pGOI-IRS、pRep-Cap、pHelper三质粒转染细胞293T，用于rAAV生产(293T组)。I-SceI KI组生产的rAAV，质粒骨架反包进入rAAV衣壳的比率(反包率)降低至对照293T组的0.29倍。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (11)
1.一种用于重组腺相关病毒(rAAV)包装的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有核酸内切酶识别的位点序列和/或识别所述序列的核酸内切酶序列。
2.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述核酸内切酶包括归巢核酸内切酶、限制性核酸内切酶中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
4.根据权利要求3所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有I-SceI归巢核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap和pHelper。
5.根据权利要求1或2所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有所述核酸内切酶序列的pAAVS1。
6.根据权利要求5所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有I-SceI归巢核酸内切酶识别的位点序列的pGOI、pRep-Cap、pHelper和插入有I-SceI归巢核酸内切酶序列的pAAVS1。
7.一种用于rAAV生产的细胞，其特征在于，所述细胞稳定表达核酸内切酶；所述细胞包括权利要求3或4所述的质粒系统。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸内切酶为I-SceI归巢核酸内切酶。
9.一种降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留的方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述的质粒系统转染包装细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述包装细胞包括HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293A、Hela、Vero、CHO中的至少一种。
11.权利要求1～6任一项所述的质粒系统、权利要求7或8所述细胞在rAAV生产中的应用。
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