CN114657152A

CN114657152A - 一种新型aav血清型及其制备方法

Info

Publication number: CN114657152A
Application number: CN202210343804.6A
Authority: CN
Inventors: 唐玉旭; 马大明; 孔令洁; 王泱洲
Original assignee: Suzhou Boteng Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Suzhou Boteng Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明公开了一种新型AAV血清型及其制备方法，新型AAV血清型的病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。本发明的新型AAV血清型的制备方法包括以下步骤：将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；以PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装得到新型AAV血清型。本发明的新型AAV血清型制成的生物基因治疗药物进入人体后，能避免人体内可能预先存在的抗体对病毒与细胞的相互作用的干扰，提高基因治疗的效果。

Description

一种新型AAV血清型及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种新型AAV血清型。

背景技术

腺相关病毒AAV的Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，衣壳由三种亚基VP1、VP2和VP3按比例组成。VP1和VP2蛋白共享VP3序列，并在其N端具有其他残基。VP1的N端具有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要；VP3蛋白的核心由保守的β-桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异。许多人体内已经有野生型AAV抗体，因此可能已经有了预防AAV感染的方法。这些预先存在的抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，并严重阻碍基因治疗的结果。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对背景技术中所述的现有的AAV血清型在使用于人体时，人体内可能存在的野生型AAV抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，影响基因治疗的效果的问题，提供一种能够解决前述问题的新型AAV血清型。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。

本发明的第二个目的在于提供一种新型AAV血清型的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；

S2、将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；

S3、以步骤S2中的PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；

S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型，新型AAV血清型的VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒的AAV VP3序列。

作为上述方案的进一步改进，所述的AAV病毒为AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒。使用AA2血清型病毒或AAV5血清型病毒，都可以用于制备本发明的新型AAV血清型。

作为上述方案的进一步改进，所述的步骤S1中，AAV病毒的VP3序列为AAV2血清型病毒的VP3序列、AAV5血清型病毒的VP3序列，或是AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列，即为AAV2.5T序列。

作为上述方案的进一步改进，步骤S1中，鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对时，比对其中的同源序列，找出的同源序列位点即为可插入鹿或猪细小病毒序列的氨基酸序列位点。

作为上述方案的进一步改进，步骤S2中，在病毒外壳蛋白基因序列中插入引物进行引物扩增，扩增后的基因经纯化回收后再混合进行无引物PCR反应。

本发明的有益效果为：1）本发明的新型AAV血清型将鹿或猪细小病毒序列替换AAV的3’末端，制成的生物基因治疗药物进入人体后，能避免人体内可能预先存在的抗体对病毒与细胞的相互作用的干扰，提高基因治疗的效果；2）本发明的新型AAV血清型的制备方法，可以对AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒的VP3序列的3’末端进行替换，替换的氨基酸序列是与之具有同源氨基酸序列的动物的细小病毒序列的AAV VP3序列，采用该方法能制成多种新型AAV血清型，提高基因治疗的效果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP1、VP2和VP3序列的比例为1：1：10，该AAV血清型是将AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒序列AAV2.5T序列的3’末端替换成鹿的细小病毒序列的AAV VP3序列制成的新型AAV血清型。

新型AAV血清型的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将鹿细小病毒的VP3序列与AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列进行比对，鹿细小病毒的VP3序列为SEQ ID NO：1，AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列简称为AAV2.5T序列，其序列为SEQ ID NO：2，确定鹿细小病毒序列可插入AAV2.5T序列的氨基酸序列位点，比对时找出鹿细小病毒的VP3序列与AAV2.5T序列的氨基酸序列中的同源序列，作为插入鹿细小病毒的VP3序列的区域，通过比对找出6组同源序列，详见后面的同源序列；

S2、将所有序列扩增后，按比例加入进行无引物PCR反应；

S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型的VP3序列的3’末端替换成鹿细小病毒的AAV VP3序列，新型AAV血清型的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

上述步骤S1中，AAV2.5T序列的外壳蛋白基因序列中与鹿细小病毒的VP3序列的6组同源氨基酸序列为：

1）AAV2.5T序列中的第203-213位的氨基酸序列：GDNNQGADGVG。

鹿细小病毒的VP3序列中的第447-465位的氨基酸序列：GISNNSTSTASPGGTESQG。

2）AAV2.5T序列中的第315-324位的氨基酸序列：VTVQDSTTTI。

鹿细小病毒的VP3序列中的第567-580位的氨基酸序列：VSMGSGSTSSTYTI。

3）AAV2.5T序列中的第371-390位的氨基酸序列：TLNRDNTENPTERSSFFCLE。

鹿细小病毒的VP3序列中的第627-673位的氨基酸序列：TLGGISAEPKEHRITNTSTFCNGTRITNQTWTERHHSVQDSELFLIE。

4）AAV2.5T序列中的第429-469位的氨基酸序列：NPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP。

鹿细小病毒的VP3序列中的第712-803位的氨基酸序列：NPCQQLRFYNIKNTHYEDTKQDIDVVMCTSSSDTTCSNECGTSGSNNKIKRKRITVETKGNVDHHNRIQLQNNNVKILRASNTRPAMWLPAP。

5）AAV2.5T序列中的第557-609位的氨基酸序列：QPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIW。

鹿细小病毒的VP3序列中的第891-965位的氨基酸序列：QTTHPAIYTNGECLPPNKTFQLVINTRRGADGPSNSTHIKNSTTDTTNFGIEQCYGMMPGQVAEKQSGFYENQIW。

6）AAV2.5T序列中的第645-725位的氨基酸序列：PGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL。

鹿细小病毒的VP3序列中的第1002-1093位的氨基酸序列：PANSTTDMGKYKSPIMGSILNQYMTFQIQYAMKWEYLP-KSRNKCWNPITPPQLPQPSNGHNVIYNLDTRRQGNQYCIPDETWAFKQRIRNRR。

上述的步骤S2中，AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒序列的VP3序列AAV2.5T序列的外壳蛋白基因序列按顺序分为13个部分，PCR扩增片段分为3组，第1-3部分为第1组，第4-8部分为第2组，第9-13部分为第3组，分组情况如下：

第1组，第1-3部分分别为：

1、CAP-F+A1R；

2、CAP-F+A3R；

3、D2F + A3R。

第2组，第4-8部分分别为：

4、A4F+A5R；

5、D4F+A5R；

6、A7F+A7R；

7、A7F+A8R；

8、A6F+A7R。

第3组，第9-13部分分别为：

9、A9F+A9R；

10、A9F+A11R；

11、A11F+A11R；

12、A11F+2511R；

13、A13F+2511R。

分组后，在第2组的原第5部分与第6部分之间插入4组引物片段，作为第6-9部分，第二组的原第6和第7部分改为第10和第11部分，并在第11部分后面加入1组引物片段，作为第12部分，第二组的原第8部分改为第13部分，扩增后第二组包括了第4-13部分。

第3组的原第9-12部分改为第14-17部分，并在第17部分的后面加入两个引物片段，成为第18部分和第19部分，将原第13部分改为第20部分，并在第20部分的后面加入三个引物片段，作为第21部分、第22部分和第23部分。

扩增后的病毒外壳蛋白基因序列包括以下3组：

第1组，第1-3部分分别为：

1、CAP-F+A1R on 2.5T template；

2、CAP-F+A3R on 2.5T template；

3、D2F+A3R on 2.5T template。

第2组，第4-13部分分别为：

4、A4F+A5R on 2.5T template；

5、D4F+A5R on 2.5T template；

6、DD4F+DD6R on D template；

7、DD4F+DD8R on D template；

8、DD6F+DD8R on D template；

9、DD6F+DD6R on D template；

10、A7F+A7R on 2.5T template；

11、A7F+A8R on 2.5T template；

12、DD8F+DD8R on D template；

13、A6F+A7R on 2.5T template。

第3组，第14-23部分分别为：

14、A9F+A9R on 2.5T template；

15、A9F+ A11R on 2.5T template；

16、A11F+A11R on 2.5T template；

17、A11F + 2511R on 2.5T template；

18、DD10F+DD10R on D template；

19、DD12 F+DD12R on D template；

20、A13F+2511R on 2.5T template；

21、DD10F+CAP-R on D template；

22、DD10F+DD12R on D template；

23、DD12F+CAP-R on D template。

上述的2.5T template为AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒序列AAV2.5T序列的外壳蛋白基因序列模板，D template为鹿细小病毒的基因序列模板。

下列为上述的第一组到第三组中使用的引物的具体序列：

引物CAP-F的DNA序列为：

GTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAAC。

引物A1R的DNA序列为：

Gcccaatgggccgccacct。

引物D2F的DNA序列为：

gaggtggcggcccattgggcATCTCTAACAATTCAACTTCAACTGCATCCCCCGGAGGCACAGAATCACAgggcaatgcctcgggagatt。

引物A3R的DNA序列为：

CCTCTTTGACTTGAATGTTGAAGATTTTGACTCTG。

引物A4F的DNA序列为：

CAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGG。

引物A5R的DNA序列为：

GTCGCGTAACCGTACTGCGG。

引物D4F的DNA序列为：

cttcaacattcaagtcaaagaggtTAGCATGGGATCAGGCAGTACTAGCTCCACATATACTATCACAGAATCACAAACAGCTACCATGC。

引物DD4F的DNA序列为：

cttcaacattcaagtcaaagaggtTAGCATGGGATCAGGCAGTACTAG。

引物DD6R的DNA序列为：

cagcatcttgctgggaaagtacTCAATAAGAAAGAGCTCAGAGTCTTGAACTGAG。

引物DD8R的DNA序列为：

gttccagccctgggttcggcccatgGGGGCTGGAAGCCACATAG。

引物DD6F的DNA序列为：

ctgccgcagtacggttacgcgACTCTCGGTGGCATATCAGCTG。

引物A7F的DNA序列为：

GTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAAC。

引物A7R的DNA序列为：

GGGTTGGCCAGCTTGAAGAG。

引物A8R的DNA序列为：

GTTCCAGCCCTGGGTTCGG。

引物DD8F的DNA序列为：

gtcagaacctCttcaagctggccaacccATGTCAACAACTTAGATTTTATAATATCAAAAATACACATTATGAAGATACC。

引物A6F的DNA序列为：

GTCTTTACGCTGCCGCAGTAC。

引物A9F的DNA序列为：

CCCATGGGCCGAACCCAG。

引物A9R的DNA序列为：

CTGCGTCTCGCTCTCGCT。

引物A11R的DNA序列为：

GGCACAGGCGTGTTCTTGATG。

引物A11F的DNA序列为：

ATCTGGGCCAAGATCCCAGAG。

引物DD10F的DNA序列为：

gctcatcaccagcgagagcgagacgcagACAACACACCCAGCAATATACACCAATG。

引物DD10R的DNA序列为：

gcccccgtCTCTGGGATCTTGGCCCAGATTTGGTTTTCATAAAATCCTGATTGTTTTTCTGCTACTTG。

引物DD12R的DNA序列为：

ctgggggtcgttgtagttgtttgtgtaCTGTGGTAGTTGTGGAGGCGT。

引物A13F的DNA序列为：

CAGTACACAAACAACTACAACGACCC。

在步骤S2中所述的PCR 无引物聚合酶链式反应过程为：

将上述的病毒外壳蛋白基因序列的23个部分中的第2部分作为一个模板，记为#2组，第7部分作为一个模板，记为#7组，第1部分和第3部分作为A组，第4-6、8-13部分作为B组，其余作为C组，

首先，设置各组的模板浓度：#2组: 51.6 ng/µl；#7组: 48.2 ng/µl；A组 83.4ng/µl；B组18.7 ng/µl；C组 85.7 ng/µl。

然后，按比例加入下列体积的混合样品，

分别加入2xQ5 10 µl；#2组1.5 µl；#A组1.2 µl；#7组1 µl；#B组5 µl；#C组1.6 µl。

然后执行下列的聚合酶链式反应循环程序，

98°C 30s；

[98°C 8s, 72°C (−0.5°C/cycle) 1min] x10 Cycle；

[98°C 8s, 70°C (−0.5°C/cycle) 20s, 72°C 1min] x25 Cycle；

72°C for 2min。

用Zymo试剂盒纯化PCR反应液，用15µl洗脱液洗脱；进行无缝克隆Gibson组装；将8µl纯化PCR产物 + 7µl线性化载体pIR2Noc + 15µl NEBuilder混合；在50°C孵育1小时；用10µl连接产物转化DH10B感受态细胞；将转化后的感受态细胞转移至100ml LB含青霉素的培养基中孵育过夜后大抽文库质粒；取其中100µl感受态细胞涂在青霉素平板上转染，计算转化效率。准备两个1.5ml离心管准备转染样品：每皿转染200 ng文库质粒+ 28.8µgpHelper质粒加入到DMEM无血清培养基。

使用转染试剂为PEI-max以1：3的比例加入到DMEM无血清培养基；涡旋每个管，等待5分钟；将PEI溶液转移到DNA溶液中，短暂旋涡，室温下孵育10-15分钟；转移至30ml 含有2-3% 胎牛血清的DMEM培养基中；从培养皿中吸走旧的培养基，加入含有转染混合物的培养基，培养3-4天；收集培养基和细胞，细胞在-80度和37度反复冻融4次，加入终浓度为0.15U/ml的全能核酸酶37℃摇动孵育30分钟，再加入0.25%Triton-X100 37°C摇动孵育30分钟，然后离心从培养基和裂解液中提取10µl样品:DNaseI处理(1µl DNase处理50µl反应，37°C 30分钟，75°C 10分钟)；加入0.6µl蛋白酶K, 56°C孵育40分钟；将病毒基因组DNA纯化回收；将纯化病毒基因组DNA作为模板依次使用原液，10倍稀释和100倍稀释液进行Q5聚合酶链式反应循环程序进行扩增，用CAP-F+CAP-R作为引物；反应程序为：

98°C 30s；

32x [98°C 8s / 68°C 20s / 72°C 60s]；

72°C 2 min；

4°C。

从凝胶中切割PCR产物，如附图1所示，划线的位置即为切胶回收的片段，切割时，从最大的片段剪切到2.65 kb。例如，如果2.5 kb可见，只剪切>=2.5 kb，而不是更低，直到2.65 kb，如果没有明显可见片段，则剪切2.3 kb以上的所有片段，直到2.65 kb。

然后对片段进行测序，筛选出其中最优化的目的条带，将筛选出的目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型的VP3序列的3’末端替换成鹿细小病毒的AAV VP3序列。

下列为采用上述的实施例获得的一种新型AAV血清型的氨基酸序列：

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQELLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQTTHPAIYTNGECLPPNKTFQLVINTRRGADGPSNSTHIKNSTTDTTNFGIEQCYGMMPGQVAEKQSGFYENQIWCRNPNTDMADGGGNPLIAQWGIKSPPHLILVRMLPTPANSTTDMGKYKSPIMGSILNQYMTFQIQYAMKWEYLPKSRNKCWNPITPPQLPQPSNGHNVIYNLDTRRQGNQYCIPDETWAFKQRIRNRR。

通过实验检测，将本发明的新型AAV血清型制成生物基因治疗药物，在患者使用后，人体内存在的AAV抗体对本发明的新型AAV血清型病毒与人体细胞的相互作用不会产生干扰，具有显著的基因治疗效果，证明本发明的新型AAV血清型对于体内存在AAV抗体的患者同样能够达到很好的疗效。

上述虽然只介绍了鹿细小病毒的AAV序列与AAV2.5T序列相结合的方案，但是本领域技术人员在本发明记载的方案的基础上，可以得到猪细小病毒的AAV序列与AAV2.5T序列相结合的方案，得到与上述的序列不同的新型AAV血清型。而且，虽然上述只公开了得到的一种新型AAV血清型，但是鹿细小病毒的AAV序列与AAV2.5T序列相结合的方案，有6段氨基酸序列是具有同源性的，所以这6段同源氨基酸序列都能与AAV2.5T序列相结合，得到不同的新型AAV血清型，所以能得到的新型AAV血清型的种类数量是很多的。虽然在本申请中没有一一列举，但是采用本发明上述公开的方法即可得到这些新型AAV血清型。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州博腾生物制药有限公司

<120> 一种新型AAV血清型及其制备方法

<130> 20220329

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Met Thr Asp Arg Ala Arg Gly Glu Gly Gly Ser Ser Ile Ala Leu His

1 5 10 15

Leu Gly Glu Thr Phe Lys Leu Leu Ile Asp His Lys Tyr Asn Thr His

20 25 30

Pro Asp Thr Glu Ala Tyr Tyr Thr Asp Ser Ser Gly Ala Lys Tyr Glu

35 40 45

Lys Arg Arg Tyr Ile Phe Val Gly Ala Asp Gln Asp Thr Glu Gln Ala

50 55 60

Trp Ala Asp Gln Gln Ala Tyr Asn Lys Leu Pro Gly Gln Lys Ile Lys

65 70 75 80

Gly Pro His Gly Lys Trp Ala Gly Trp Thr Phe Pro Asn Pro Pro Asp

85 90 95

Asp Val Val Trp Pro Glu Ser Ser Leu Asp Pro Thr Arg Ser Gln Pro

100 105 110

Asp Pro Arg Pro Thr Pro Thr Ser Pro Pro Thr Gln Gln Phe Asn Trp

115 120 125

Thr Gly Gly Gly Trp Pro Thr Asn Thr Glu Leu Pro Ser Ser Asn Val

130 135 140

Pro Gln Met Gly Ile Gly Ser Gln Gly Asn Val Gln Phe Ser Pro Met

145 150 155 160

Thr Ala Asp Glu Thr Thr Ile Glu Arg Ala Lys Asn Glu Gly His Pro

165 170 175

Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ser Pro Glu Ile Ala His Asp Leu Glu Thr

180 185 190

Leu Glu His Glu Thr Glu Glu Ser Glu Phe Asn Met Gln Leu Ile Lys

195 200 205

Gln Ala Ile Ala Glu Thr His Asp Ser Glu Asp Ile Glu Thr Arg Ala

210 215 220

Lys Asp Gly Glu Gly Ala Asp Gln Thr Ser Leu Thr Val His Gly Arg

225 230 235 240

Tyr Val Gly Pro Gly Asn Pro Leu Pro Ala Gly Lys Pro Ser Ser Lys

245 250 255

Leu Asp Glu Ile Ala Leu Arg His Asp Ile Arg Tyr His Val Glu Leu

260 265 270

Lys His Lys His Trp Pro Tyr Leu Thr Tyr Gln Tyr Ala Asp Lys Ile

275 280 285

Met Ile Asp Glu Ile Asn Gln Asn Met Glu Gln Ile Thr Tyr Gln Tyr

290 295 300

Ala Asp Lys Ile Met Ile Asp Glu Ile Asn Gln Asn Met Glu Gln Ile

305 310 315 320

Lys Gln Glu Gly Asn Glu Trp Leu Ala Asn Phe Ile Lys Ser Leu Trp

325 330 335

Thr Thr Gln Lys Leu Tyr Ser Ala Pro Ile Gly Val Leu Leu Glu Asn

340 345 350

Ile Ile Pro Glu Met Gly Trp Tyr Gly Asp Thr Ala Asn Lys Ile Tyr

355 360 365

Asn Phe Asn Gln Phe Gln His Ala Leu Thr Arg His Gly Lys Thr Thr

370 375 380

Trp Thr Gly Leu Asn Asp Pro Ile His Leu Pro Phe Arg Pro Asp Arg

385 390 395 400

Thr His Pro Ser Glu Thr Asp Ser Pro Ser Asn Ala Asp Ala Asp Gln

405 410 415

Ala Ala Lys Lys Lys Pro Pro Lys Ser Ala Pro Pro Ser Ser His Ser

420 425 430

Pro Thr Asn Lys Asn Leu Ser Ser Thr Asp Met Ser Thr Cys Asp Ala

435 440 445

Asn Thr Ala Pro Thr Val Asp Thr Ile Cys Thr Asn Asp Gly Leu Pro

450 455 460

Ile Gly Ile Ser Asn Asn Ser Thr Ser Thr Ala Ser Pro Gly Gly Thr

465 470 475 480

Glu Ser Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Lys Cys Pro Glu Lys Trp

485 490 495

Phe Gly Gly Val Thr Trp Glu Gly Asn Thr Phe Thr Thr Tyr Asn Thr

500 505 510

Arg Arg Cys Met Leu Thr Pro Phe Asn Thr Lys Tyr Leu Ala Arg Ser

515 520 525

Gly Val Asp Asn Thr Pro Ser Val Asp Ile Glu Thr Pro Trp Tyr Tyr

530 535 540

Phe Asp Leu Asn Ala Phe Ser Cys His Ile Asn Pro His Thr Met Gln

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu His Thr Asp Gly Ile Arg Pro Leu Ser Leu Thr Ile

565 570 575

Thr Ile Ala Glu Ile Gln Ala Lys Asp Val Ser Met Gly Ser Gly Ser

580 585 590

Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Ser Gln Thr Ala Thr Met Leu

595 600 605

Leu His Arg Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Pro Tyr Pro Ile Gly Gly Gly

610 615 620

Gln Asp Thr Ile Pro Asp His Leu Pro Gly Asp Trp Tyr Ser Leu Pro

625 630 635 640

Arg Tyr Cys Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Ile Ser Ala Glu Pro Lys Glu

645 650 655

His Arg Ile Thr Asn Thr Ser Thr Phe Cys Asn Gly Thr Arg Ile Thr

660 665 670

Asn Gln Thr Trp Thr Glu Arg His His Ser Val Gln Asp Ser Glu Leu

675 680 685

Phe Leu Ile Glu Gly Met Pro Cys Thr Gln Leu His Pro Asn Cys Ser

690 695 700

Trp Ser Tyr Gln Tyr Ser Phe Pro His Val Ser Trp Ala Leu Thr Thr

705 710 715 720

Gln Tyr Cys Trp Asn Thr Arg Arg Gln Asp Asn Pro Cys Gln Gln Leu

725 730 735

Arg Phe Tyr Asn Ile Lys Asn Thr His Tyr Glu Asp Thr Lys Gln Asp

740 745 750

Ile Asp Val Val Met Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Thr Cys Ser Asn

755 760 765

Glu Cys Gly Thr Ser Gly Ser Asn Asn Lys Ile Lys Arg Lys Arg Ile

770 775 780

Thr Val Glu Thr Lys Gly Asn Val Asp His His Asn Arg Ile Gln Leu

785 790 795 800

Gln Asn Asn Asn Val Lys Ile Leu Arg Ala Ser Asn Thr Arg Pro Ala

805 810 815

Met Trp Leu Pro Ala Pro Arg His Pro Thr Gly Asp Cys Val Phe Ile

820 825 830

Asn Pro Ala Asn Ala Leu Gly Ile Ala Asp Asn Lys Ile Asp Ser His

835 840 845

Tyr Ala Phe Ser Asn Gln Lys Lys His Ile Ile Leu Ile Glu Glu Glu

850 855 860

Leu Tyr Ser Asn Gly Thr Thr His Ser Lys Thr Cys Leu Pro Gly Pro

865 870 875 880

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<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

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Gln Arg Ile Arg Asn Arg Arg

755

Claims

1.一种新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，其特征在于：VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。

2.一种新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：所述的AAV病毒为AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒。

4.根据权利要求2所述的新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中，AAV病毒的VP3序列为AAV2血清型病毒的VP3序列、AAV5血清型病毒的VP3序列，或是AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列，即为AAV2.5T序列。

5.根据权利要求2所述的新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：步骤S1中，鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对时，比对其中的同源序列，找出的同源序列位点即为可插入鹿或猪细小病毒序列的氨基酸序列位点。

6.根据权利要求2所述的新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：步骤S2中，在病毒外壳蛋白基因序列中插入引物进行引物扩增，扩增后的基因经纯化回收后再混合进行无引物PCR反应。