CN111344412A - 人类中aav基因疗法的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于人类中基于AAV的基因疗法的手段和方法。特别地，本发明涉及人类患者的治疗，所述人类患者可能被怀疑具有针对打算用于所述治疗的AAV的抗体。

Description

人类中AAV基因疗法的手段和方法

发明领域

本发明涉及用于人类中基于AAV的基因疗法的手段和方法。特别地，本发明涉及人类患者的治疗，所述人类患者可能被怀疑具有针对打算用于所述治疗的AAV的抗体。

发明背景

腺相关病毒(AAV)被认为是用于人类基因疗法最有希望的病毒载体之一。AAV具有有效感染分裂人类细胞以及非分裂人类细胞的能力。野生型AAV病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的单个染色体位点中，并且最重要的是，即使AAV存在于许多人类中，其也并未与任何疾病相关。鉴于这些优点，重组腺相关病毒(rAAV)正在B型血友病、恶性黑素瘤、囊性纤维化和其他疾病的基因疗法临床试验中进行评估。大量的临床试验和欧洲的基因疗法药物如Alipogene tiparvovec(

，uniQure)的批准，有望使AAV成为临床实践的主体。

成功施用AAV载体的一个主要挑战是克服在暴露于基于野生型AAV或AAV的载体后发展的中和抗体(免疫球蛋白)(NAb)的存在。在这两种情况下，针对病毒衣壳蛋白的中和血清型特异性抗体可降低用相同血清型AAV的基因转移效率。

与其他血清型相比，观察到人类中针对AAV5血清型的特有的(endemic)NAB滴度相对较低(Boutin et al.，Hum Gene Ther 2010，21：704-712)。在用AAV治疗人类中，已经报道了如此低的特有的NAB滴度影响转导并导致转基因表达严重降低(Manno et al.，NatureMedicine，2006，12(3)，342-347)。因此，该领域的普遍共识是避免治疗具有完全NAB滴度的患者。因此，目前临床上关于预先存在的免疫力的实践涉及对人类患者进行筛选以排除应该具有针对AAV衣壳的中和抗体的患者(Brimble et al.Expert Opin Biol Ther 2016，16(1)：79-92和Boutin et al.Hum Gene Ther 2010，21：704-712)。为了减少第一次施用时NAb的形成以允许第二次施用，已经尝试了免疫抑制方案(Corti et al.，Mol Ther-MethClin Dev(2014)1，14033；Mingozzi et al.Mol Ther vol.20no.7，1410-1416；McIntoshet al.Gene Ther 2012，19，78-85))。此外，已经提出了克服预先存在的抗体的策略，其包括血浆置换和免疫抑制方案的使用(例如Chicoine et al.，Mol Ther 2014，vol.22no.2338-347；Hurlbut et al.Mol Ther 2010，vol.18no.11 1983-1984and Mingozzi etal.Mol Ther vol.20no.7，1410-1416)。这些策略已在动物模型中测试，其得到了有限的成功。

因此，本领域需要使得能够在具有或可能怀疑具有AAV中和抗体的人类患者中施用rAAV基因疗法载体。

发明简述

现在，本发明人已经出乎意料地发现，特别是对于AAV5基因疗法载体，并且与现有技术的建议相反，具有特有的预先存在的抗AAV5抗体(即由特有的暴露所致的预先存在的抗AAV5抗体)的人类患者可被视为适合于进行治疗。这与现有技术中应将中和抗体的存在视作排除标准(例如对于参加临床试验的患者)的看法相反。换句话说，现有技术的看法是，具有针对AAV5的抗体，更特别是针对AAV5的特有的预先存在的抗体的患者不被认为适合于进行用AAV5基因疗法载体的治疗。本文公开的令人惊讶的发现是，具有特有的预先存在的抗AAV5抗体的人类患者可以被认为适合于进行治疗，该发现不仅涉及例如发现具有非常低水平的预先存在的抗AAV5抗体的人类患者的亚群，更确切的说，该发现基本上涉及大多数(如果不是全部)人类群体中针对预先存在的抗AAV5抗体评分为阳性并且先前未进行过任何AAV5基因疗法的患者。

因此，一方面，本发明提供了用于人类患者的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类患者没有用确定抗AAV5抗体的测定来进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过AAV5基因疗法载体的医学治疗。换句话说，提供了用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中抗AAV5抗体的状态未知，并且其中所述人类在进行所述医学治疗之前未进行AAV5基因疗法载体的医学治疗。根据一个方面，本发明使以下成为可能：治疗以前没有用AAV5基因疗法载体治疗过的患者或将以前没有用AAV5基因疗法载体治疗过的患者包括在临床试验中，而不用在医学治疗之前筛选抗AAV5抗体的存在。

在另一方面，提供了用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过AAV5基因疗法载体的医学治疗，如在人类中所观察到的，所述人类具有对应于至多第100个百分点的抗AAV5抗体水平，优选至多第95个百分点的抗AAV5抗体水平。优选地，所述人类患者对于抗AAV5抗体的测试为阳性。

附图说明

图1：预处理样品的NAb测定结果。A：十个预给药样品的中和结果。百分之五十的标记显示为虚线。B：三个阳性样品3、4、5的曲线拟合结果。通过非线性回归拟合四参数曲线。滴度计算为拟合的曲线通过50％标记(在水平轴上方显示)时的理论稀释度。

图2A：AAV5中和抗体与总抗AAV5抗体的比较。群体筛选研究中报告的中和(NAb)滴度与总(TAb)ELISA结果的比较。每个空心符号代表一个健康个体的成对的NAb和TAb结果。所治疗患者的NAb和TAb结果重叠显示(▲，指定的研究对象3、4和5)。

图2B：AAV5 NAb滴度与FIX水平的比较。将第1组给药后FIX活性的百分比针对给药前NAb滴度作图。

图3：AAV NAb滴度标度。描绘了针对AAV5的NAb滴度的人类群体百分比(50个对象)。注意到在人类群体中观察到的NAb滴度完全不落入在AAV5治疗的人类患者中观察到的NAb滴度。

图4.描绘的是野生型AAV5的VP1氨基酸序列。在VP2的氨基酸起始位置(T，由于ACG起始位点)和VP3的氨基酸起始位置(M)下划线。

图5.描绘的是杂合的VP1序列的VP1氨基酸序列，其由与AAV5衍生的VP2和VP3编码序列连接的N端AAV2衍生的VP1序列(带下划线)组成。VP1蛋白因此是杂合AAV2/AAV5衣壳蛋白。用于编码所述杂合VP1的AAV衣壳的表达构建体也可编码VP2和VP3序列，其将不是杂合VP2和VP3衣壳蛋白，而是野生型序列AAV5 VP2和VP3蛋白。

图6.显示的是野生型AAV5的VP1氨基酸序列，在野生型AAV5序列的第1位和第2位之间具有Ala插入。因此，VP1衣壳由具有插入的氨基酸的AAV5野生型序列组成，并且编码的VP2和VP3蛋白是未经修饰的野生型AAV5 VP2和VP3蛋白。

定义

“AAV载体”是指通过使用分子方法衍生自野生型AAV的重组腺相关病毒(AAV)载体。AAV载体与野生型(wt)AAV载体有所区别，因为病毒基因组的至少一部分已被转基因(其相对于野生型AAV核酸序列而言为非天然核酸)取代。

AAV载体，包括AAV衣壳和AAV基因组ITR的组合，可以使用本领域已知的方法来产生，如Pan et al.(J.of Virology(1999)73：3410-3417)，Clark et al.(Human GeneTherapy(1999)10：1031-1039)，Wang et al.(Methods Mol.Biol.(2011)807：361-404)andGrimm(Methods(2002)28(2)：146-157)所述，其在此通过引用并入本文。可选地，可以使用杆状病毒表达系统(BEVS)在昆虫细胞中产生AAV载体。Urabe et al(Urabe et al.[2002]Human Gene Therapy 13(16)：1935-1943)描述了产生rAAV的最初杆状病毒系统，并且所述系统由三种杆状病毒组成，即Bac-Rep、Bac-cap和Bac-vec，将其共感染昆虫细胞(例如SF9)导致rAAV的生成。这样产生的rAAV的性质，即包括效力在内的物理和分子特征，与在哺乳动物细胞中生成的rAAV没有显著差异(Urabe[2002]同上)。Urabe(2002，同上)的最初的杆状病毒系统得到了进一步开发(参见例如Kohlbrenner et al.(2005)Molecular Therapy 12(6)：1217-1225；Urabe et al.(2006)Journal of Virology 80(4)：1874-1885；WO 2007/046703；WO 2007/148971；WO 2009/014445和WO 2009/104964)。

术语“转基因”用于指相对于AAV核酸序列的非天然核酸。它用于指可以被引入细胞或生物体的多核苷酸。转基因包括任何多核苷酸，例如编码多肽或蛋白质的基因，转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸或未转录的多核苷酸(例如，缺少表达控制元件，如驱动转录的启动子)。优选将转基因插入反向末端重复(ITR)序列之间。转基因也可以是表达构建体，其包含可操作地连接至编码序列和3′终止序列的表达调控元件，例如启动子或转录调控序列。

“转导”是指通过病毒载体将转基因转移到受体宿主细胞中。通过本发明的rAAV载体转导靶细胞导致该载体中包含的转基因转移到转导的细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指进行DNA所递送进的细胞，比如例如个体的滑膜细胞(synoviocyte)或滑膜细胞(synovial cell)。AAV载体能够转导分裂细胞和非分裂细胞。

“基因”或“编码序列”是指“编码”特定蛋白质的DNA或RNA区域。当置于合适的调控区域如启动子的控制下时，编码序列被转录(DNA)并被翻译(RNA)成多肽。基因可以包含几个可操作地连接的片段，例如启动子、5′前导序列、内含子、编码序列和3′非翻译序列，其包含聚腺苷酸化位点或信号序列。嵌合或重组基因是通常在自然界中找不到的基因，例如这样的基因，该基因中如启动子在自然界中与所转录的DNA区域的部分或全部是不相关的。“基因的表达”是指将基因转录成RNA和/或翻译成活性蛋白的过程。

取决于两个序列的长度，可以使用全局或局部比对算法通过两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定“序列相同性”和“序列相似性”。优选使用全局比对算法(例如NeedlemanWunsch)对相似长度的序列进行比对，该全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)对基本上不同长度的序列进行比对。当序列(例如，通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对的)共享至少某个最小百分比的序列相同性(定义如下)时，然后该序列可以被称为“基本相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度(全部长度)上进行比对，以最大化匹配数并最小化空位数。当两个序列具有相似的长度时，全局比对适用于确定序列相同性。通常使用GAP默认参数，其中空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵为nwsgapdna，以及对于蛋白质，默认评分矩阵为Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。可以使用以下确定序列比对和百分比序列相同性的分数：使用计算机程序(例如可从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA获得的GCG Wisconsin Package，版本10.3)或使用开源软件，例如EmbossWIN 2.10.0版中的程序“needle”(使用全局NeedlemanWunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(对于‘needle’和‘water’，以及对于蛋白质和DNA比对，默认的空位开放罚分均为10.0，以及默认的空位延伸罚分为0.5；对于蛋白质，默认评分矩阵为Blossum62，以及对于DNA，默认评分矩阵为DNAFull)。当序列的总体长度基本不同时，优选局部比对(例如使用Smith Waterman算法的那些比对)。可选地，可以使用算法例如FASTA、BLAST等，通过对公共数据库进行搜索来确定百分比相似性或相同性。

如本文所用，“基因疗法”是将核酸序列(例如，本文所定义的转基因)插入个体的细胞和/或组织中以治疗疾病。转基因可以是取代或补充有缺陷的基因的功能性突变等位基因。基因疗法还包括插入本质上为抑制性的转基因，即抑制、降低或减少内源基因或蛋白质(例如不希望或的异常的(例如，致病性)基因或蛋白质)的表达、活性或功能的转基因。这样的转基因可以是外源的。外源分子或序列理解为通常不存在于待治疗的细胞、组织和/或个体中的分子或序列。获得性和先天性疾病都可接受基因疗法。因此，AAV5基因疗法载体是指用于基因疗法用途的AAV5载体。

在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，来表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。

另外，不定冠词“一(a)”或“一(an)”所指的要素不排除存在一个以上所述要素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个所述要素。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常表示“至少一个”。

词语“约”或“大约”在与数值(约10，大约10)结合使用时，优选表示该值可以是给定值10，该给定值的上下10％。

发明详述

如所述，令人惊奇地发现，特别是对于AAV5基因疗法载体，具有特有的预先存在的抗AAV5抗体的人类患者可以被认为适合于进行治疗。这与普遍的看法相反，即针对特定血清型的预先存在的抗AAV抗体的存在会妨碍用该血清型进行的基因疗法治疗。不受理论的束缚，AAV5可以是这样的血清型，其与其他血清型相比，在人类群体中发现的特有的预先存在的抗AAV5抗体滴度相对较低。这可能是由于感染的途径，其在血清型之间可能有所不同，和/或可能伴有或不伴有辅助病毒的共感染。此外，AAV5与其他灵长类动物AAV血清型差异最大，并且在系统发育上与之分离，这也可能造成这种情况。不管本发明的根源是什么，它都允许大多数人类群体(如果不是全部的话)适合于使用基于AAV5血清型的基因疗法等进行治疗。这包括针对抗AAV5抗体呈阴性的人类群体的子集，以及还有发现针对抗AAV5抗体呈阳性的人类群体的子集，不包括(当前)极少量的已进行过AAV5基因疗法治疗等的人类群体的子集。在进行过AAV5基因疗法治疗的人类群体中，观察到如此高的抗AAV5抗体滴度(与特有的感染AAV5的人类相比约为10⁴或更高)，以至于据信这些不适合于用AAV5基因疗法载体等治疗。

因此，在本发明的第一方面，提供了用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类患者没有用确定抗AAV5抗体的测定来进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗。

已经对AAV5和其他AAV血清型的完整基因组进行了测序(Chiorini et al.1999，J.of Virology Vol.73，No.2，p1309-1319)，并且该核苷酸序列可在GenBank中获得(登录号AF085716；2015年2月23日)。理解的是，基于野生型AAV5的基因疗法载体至少包含AAV5衣壳蛋白，其包含对应于所述氨基酸序列序列或至少基本相同的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。与其基本相同，包括与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸序列相同性。图4中显示了可以确定与之序列相同性的AAV5衣壳VP1蛋白序列。这种序列可以是从系统发育角度看落入AAV5进化枝的天然存在的AAV病毒序列(例如，如图4所示)。

传统上，基于抗体对一种病毒之间与对另一种病毒之间相比缺乏交叉反应性来定义“血清型”。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)所致。在传统的定义下，血清型是指感兴趣的病毒已针对所有存在的和表征了中和活性的血清型的血清特异性进行测试，并且没有发现中和感兴趣的病毒的抗体。由于发现了更多天然存在的病毒分离株并生成了衣壳突变体，与任何目前存在的血清型可能有血清学差异或可能没有血清学差异。为了方便起见，AAV5血清型包括未表征为独特的血清型的具有衣壳序列修饰的AAV，其也可能构成AAV5血清型的亚组或变体。这样的变体通常具有实质的序列相同性。

根据本发明，也可以考虑非天然衣壳序列，例如暴露于血清(暴露于外界)的氨基酸序列可以衍生自一种血清型，而衣壳内未暴露的氨基酸序列可以来自其他血清型和/或允许更多变异。由于已知AAV5的晶体结构(例如，Govindasamy et al.J.Virol.Oct.2013，vol.87no.20；11187-11199)，未暴露的序列和例如在AAV5衣壳内部的序列可能被来自其他血清型的序列和/或允许更多序列变异的序列所替代。例如，VP2和VP3中不包含的VP1氨基酸序列位于内部。该序列可以例如来自血清型2，而VP2和VP3氨基酸序列可以完全基于AAV5(参见例如图5)。这样的AAV5基因疗法载体衣壳从血清型的观点和中和抗体的观点来说是与完全野生型衣壳无法区分的(参见WO2000028004和Urabe et al.J Virol，Feb.2006，Vol.80，No.4p.1874-1885)。这样的非天然衣壳序列是杂合序列，并且这样的杂合载体也被理解为根据本发明的AAV5基因疗法载体。此外，AAV5衣壳序列还可以具有一个或多个插入或取代的氨基酸，以增强载体的制备和/或效力，例如WO2015137802中所述，以及例如如图6所示。这样的微小修饰的AAV5衣壳也可以被认为是AAV5血清型的。

理解的是，根据本发明的AAV5载体或AAV5基因疗法载体涉及AAV5载体衣壳，其涵盖具有包含在AAV反向重复(其可以是AAV5 ITR，但不必需是)之间的感兴趣的基因的载体基因组。因此，根据本发明的AAV5载体是用于递送其有效载荷，具有转基因(例如对人类有益的转基因)的载体基因组至其靶细胞(例如肝细胞或心肌细胞)的递送载剂。因此，可以认为AAV5载体是用于人类的医学治疗的，所述人类例如患有由于转基因的递送而可能得到改善的疾病的人类患者。如实施例中所示，转基因可以是FIX或其变体，例如Padua突变体，但是转基因不以任何方式限制，并且如本文所述，本发明中可以考虑其他转基因。同样，在另一实施方案中，人类患者可以是男性人类患者。

在另一个实施方案中，提供了AAV5基因疗法载体，其用于人类的医学治疗用途，其中抗AAV5抗体的状态未知(例如未确定)，并且其中在所述医学治疗之前所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗。如所述，在这种患者中可能不需要测试针对AAV5的抗体的存在。如实施例部分中所示，就血清中TAb或NAb的存在而言，约30％的人类群体显示出阳性。由于可能不需要测试血清中的TAb或NAb，适合于治疗的群体数量大大增加，此外由于无需在可以着手治疗之前进行NAb或Tab测定，使得治疗和选择适合的患者更加方便。所有可能需要的就是知道人类患者之前是否曾进行过AAV5基因疗法治疗。可以预期的是，用AAV基因疗法治疗进行的先前治疗可能不仅限于AAV5，而还可以包括用其他血清型例如血清型8的治疗。对于此类对象，可以考虑包括如实施例部分描述的NAb或Tab测定或测试，以确定血清中的NAb或TAb滴度保持在未经治疗的人类患者中观察到的范围内。

在另一个实施方案中，提供了AAV5基因疗法载体，其用于人类的医学治疗用途，其中所述人类患者用确定抗AAV5抗体的测定来进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗，所述人类具有对应于在人类群体中所观察到的抗AAV5抗体水平的至多第95个百分点的抗AAV5抗体水平。在该实施方案中，可能受益于基因疗法治疗的人类患者用抗AAV5抗体测定来预筛选。如实施例部分所示，在人类群体中观察到的抗AAV5抗体的水平的范围，即观察到的抗AAV5抗体水平的范围是从约0或约1至约10000。

本文中的第n个百分点通常定义为人类群体的比例n％，其处于具有通过Nab测定或Tab测定(例如实施例所述)确定的抗AAV5抗体水平的从0％到n％的分布内。例如，当群体中的人类患者(不是在进行AAV5载体治疗之前)具有如实施例所述通过Nab测定来确定的抗AAV5抗体水平时，在整个群体中检测到的抗AAV5抗体水平为最多10000，因为其据估计将包括约100％的人类群体。可能优选当人类患者具有最高为第95个百分点的抗AAV5抗体水平时，治疗该人类患者，这对应于实例中所述的测定来确定的NAb水平为最多4500。可能优选当人类患者具有最高为第93个百分点或第90个百分点的抗AAV5抗体水平时治疗该人类患者，这对应于实例中所述的测定来确定的NAb水平分别为最多3000或1000(见图3)。根据另一实施方案，可能优选当人类患者具有最高为第99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、80、或70个百分点的抗AAV5抗体水平时，治疗该人类患者。虽然如此，可以预计，大多数的群体，如果不是全部，无论抗AAV5抗体滴度如何都适合于治疗。如实施例部分中所示，任何抗AAV5抗体测定都足够，即NAb测定或TAb测定等可用于确定人类群体的抗体滴度，以确定第95个百分点、第93个百分点或第90个百分点。选定的人类群体保持不变，而滴度的实际值可能会变化(实例中NAb测定最高为10,000，TAb测定最高为5)。这是因为观察到的滴度的值仅仅是一个数值，其只有放在群体中滴度角度来看时才具有相关性。理解的是，在任何情况下，如在实施例部分中所述，在群体中确定的抗AAV5抗体滴度水平涉及至少50个人类的人类群体。

因此，在另一个实施方案中，提供了AAV5基因疗法载体，其用于人类的医学治疗用途，其中所述人类用确定抗AAV5抗体的测定来进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗，所述人类具有的如实施例中所述的NAb ELISA测定所确定的抗AAV5抗体水平对应于在人类群体中所观察到的至多第95个百分点的抗AAV5抗体水平。根据另一实施方案，可能优选当人类患者具有的抗AAV5抗体水平高达第99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、80、或70个百分点时治疗该人类患者。

理解的是，根据本发明，现在先前会被认为不适合于用AAV5治疗的人类群体的亚群现在会被认为适合于用AAV5基因疗法载体治疗，尽管其在抗AAV5抗体测定中测试呈阳性。因此，在另一个实施方案中，提供了AAV5基因疗法载体，其用于人类的医学治疗用途，其中所述人类经测试抗AAV5抗体呈阳性，并且其中所述人类先前未用AAV5等治疗。

在不同的实施方案中，如在当前实施方案中一样，显示出AAV5抗体水平在特有的、未治疗的人类群体中允许有效的AAV5基因疗法治疗，本发明还可以允许治疗已经进行过用AAV基因疗法治疗(即用AAV5)的人类患者。例如，本领域已知可以降低血液中抗体水平并由此也降低抗AAV5抗体水平的手段和方法。这种其中将抗体从血液中去除的血液的体外治疗可用于降低血液中的抗AAV5抗体滴度，以达到与特有的暴露(即在特有的、未经治疗的人类群体中)所观察到的水平相同。这样的方法在本领域中是已知的，并且可以包括例如血浆除去术(plasmapheresis)(Chicoine et al.，Mol Ther 2014，vol.22no.2338-347)。因此，可用于降低血液中的抗体(包括抗AAV5抗体)的任何方法可用于本发明中，以将抗AAV5抗体滴度降低至这样的程度，所述程度使得因为之前进行过基于AAV5的基因疗法治疗而之前不适合于治疗的人类患者获得如在特有的人类群体中观察到的抗AAV-5抗体滴度，并且可以进行基于AAV5的基因疗法。

在本发明的另一方面，上述的所述AAV5基因疗法载体以对应于至少10¹¹衣壳/kg体重的剂量施用。理解的是，我们做出的关于抗AAV5抗体的存在的观察可能是剂量依赖性的。换句话说，以所使用的剂量，抗AAV5抗体的浓度和/或量不损害转导。为了获得例如有意义的转基因表达水平而在治疗中施用给人类患者的AAV5基因疗法载体的量远远超过血液中存在的抗AAV5抗体。从这个角度来看，可能认为不存在上限。但是，可以考虑的上限是对应于至多10¹⁶衣壳/kg体重的剂量。理解的是，剂量可以设定为每位患者的剂量或每血液体积的剂量。基于平均体重为约85kg和平均血液体积为5L，至少10¹²衣壳/kg体重的剂量翻译过来为每位患者约10¹⁴衣壳或约10¹³衣壳/L的患者的血液体积。因此，无论考虑的剂量范围如何，可以基于这些参数容易地重新计算这些剂量。优选地，所述剂量对应于至少1×10¹²衣壳/kg体重、至少5×10¹²衣壳/kg体重、或至少1×10¹³衣壳/kg体重。在实施例部分中使用的剂量为约5×10¹³衣壳/kg体重和约2×10¹⁴衣壳/kg体重。AAV衣壳颗粒滴度的AAV定量是容易确定的，并且在本领域熟知(例如Kohlbrenner et al.，Hum Gene Ther Meth.June2012，Vol.23，No.3：198-203；Grimm et al.，Gene Ther.，Vol.6，Nr.7，p，1322-1330，1999)。

选择的剂量也可以基于基因组拷贝。基因组拷贝是指AAV5制剂中所含载体基因组的量。通过使用定量载体基因组序列的qPCR，可以容易地确定AAV5载体制剂的gc滴度。优选地，所述AAV5基因疗法载体以对应于至少5×10¹¹gc/kg体重的剂量使用。基于平均体重为约85公斤和平均血液体积为5L，至少5×10¹¹衣壳/kg体重的剂量翻译过来为每位患者约5×10¹²gc或约10¹²gc/L的患者的血液体积。因此，无论考虑的剂量范围如何，可以基于这些参数容易地重新计算这些剂量。选择的剂量可以是至少1×10¹²gc/kg体重、至少2×10¹²gc/kg体重、或4×10¹²gc/kg体重。在实施例部分中使用的剂量为约5×10¹²gc/kg体重和约2×10¹³gc/kg体重。尽管可能不存在上限，可以将其设定为相当于与至多10¹⁵gc/kg体重对应的剂量。

如所述，根据本发明的AAV5基因疗法载体是用于医学治疗用途。包含在根据本发明的AAV病毒载体中的转基因可能不是本发明的限制。然而，优选地，并且根据实例，治疗基因编码人类因子IX，如Nathwani et al.N Engl J Med 2011；365(25)：2357-65和Nathwaniet al.B.N Engl J Med 2014；371(21)：1994-200所述，并且可以包括其变体，例如在WO2010029178、WO1999003496、WO2015086406和WO2010012451中描述的，其通过引用整体并入本文。特别地，在实施例部分中已经表明，在人类患者中，用编码FIX的AAV5载体可以获得治疗上有意义的量的蛋白质。这在例如A型血友病或B型血友病的治疗中可能是有用的。

因此，相应地，根据本发明，用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，所述AAV5基因疗法载体用于治疗B型血友病，血浆中获得的转基因FIX蛋白的量可以在约0.02微克/ml至约5ug/ml的范围之间。可选的，当所述AAV5基因疗法载体用于治疗具有严重表型的B型血友病患者时，在治疗后获得中度或轻度表型或甚至在健康个体中观察到的表型。B型血友病可分为三类，每类的特征在于存在不同的FIX血浆浓度。在严重的B型血友病中，FIX活性的血浆水平低于正常的1％；在中度形式中，水平在1％至5％之间；在轻度形式中，在正常水平的5％至25％之间。有具有中等的FIX活性水平的健康的携带者个体在正常的25％至50％之间，但许多携带者可以具有甚至超过50％的水平。

同样，可以预期治疗有效量的其他感兴趣的基因很好地在本领域技术人员的能力范围之内。因此，预期本发明是对任何转基因有用的。本领域技术人员可以选择其他用于在病毒载体中递送给患者用于基因疗法的合适的转基因。这些治疗性核酸序列通常编码产物(例如蛋白质或RNA)，用于在患者体内或离体施用和表达来治疗遗传或非遗传的遗传缺陷，例如通过取代或纠正缺陷，来治疗表观遗传病症或疾病，或来治疗与基因产物失调有关的病况。执行基因疗法所期望的此类治疗基因包括但不限于用于治疗家族性高胆固醇血症或家族性合并高脂血症的极低密度脂蛋白受体基因(VLDL-R)、用于治疗囊性纤维化的囊性纤维化跨膜调节蛋白基因(CFTR)、用于治疗Duchenne肌营养不良症的DMD Becker等位基因，以及本领域技术人员可以容易地选择以治疗特定病症或疾病的许多其他基因。在一个优选的实施方案中，rAAV载体包含编码治疗性蛋白，或RNA例如miRNA的转基因。优选地，所述治疗性蛋白选自由以下组成的组：因子IX(优选人类因子IX)、因子VIII(优选人类因子VIII)、脂蛋白脂肪酶(LPL；包括突变体例如LPL^S447X；参见WO 01/00220A2)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)、囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)、Duchenne肌营养不良症(DMD)Becker等位基因、hypoxyluria(AGXT)、N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(NaGlu)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、S100A1(也称为S100钙结合蛋白A1，在人类中由S100A1基因编码)。在一个优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是因子IX，更优选地是人类因子IX。

可选地，或与前述实施方案中的任一个组合，在优选的实施方案中，基因疗法是用于治疗、预防、治愈和/或逆转病况或疾病，优选所谓的孤儿疾病(orphan disease)，其在本文中理解为是一种影响小比例的群体(例如1,500名人类的群体中不到1名人类)的威胁生命、慢性衰弱和/或得不到充分治疗的罕见疾病。通常，孤儿疾病是遗传疾病，并因此即使没有立即出现症状，也是终身疾病。在一个优选的实施方案中，这种病况或疾病选自由以下组成的组：脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)、B型血友病、急性间歇性卟啉症(AIP)、Sanfilippo B综合征、帕金森氏病(PD)、充血性心力衰竭(CHF)、A型血友病、亨廷顿病、Duchenne肌营养不良症(DMD)、莱伯先天性黑矇、X连锁严重合并免疫缺陷(SCID)、腺苷脱氨酶缺乏症严重合并免疫缺陷(ADA-SCID)、肾上腺脑白质营养不良症(adrenoleukodystrophy)、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性白血病、囊性纤维化、镰状细胞病、I型高脂蛋白血症、地中海贫血、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、癫痫病、弗里德里希共济失调、范科尼贫血、贝敦氏症(Batten disease)、湿性AMD、阿尔法抗胰蛋白酶1、庞贝病(Pompe disease)、SMA-1、耐药性非小细胞肺癌、GM1神经节苷脂贮积病(gangliosidosis)、色素性视网膜炎、纯合子家族性高胆固醇血症、溶酶体贮积病、铜或铁蓄积性疾病(例如威尔逊氏病或Menkes病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、hypoxyluria、高雪氏病、赫尔勒氏病(Hurler′s disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和视网膜退行性疾病(retinaldegenerative disease)(例如RPE65缺乏症、无脉络膜症(choroideremia))。

在另一个实施方案中，所述AAV5基因疗法载体是用于根据本发明的人类的医学治疗用途，其中所述用途包括施用进血流中，例如将AAV5基因疗法载体施用进血流中。血液可以含有抗AAV5抗体，并且特别地考虑了经由血流的递送途径，例如经由血管内输注或注射。经由血流的递送允许将AAV5载体递送至靶组织。这种向靶组织的递送可以通过全身性递送发生。本发明不限于施用进血流中。实际上，可以考虑的常规和药学上可接受的施用途径包括直接递送至靶器官、组织或部位(例如肝脏或CNS)、鼻内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服和其他亲本(parental)施用途径。然而，可以考虑的优选靶组织是肝脏。因此，最优选地，AAV5基因疗法载体通过经由血流的施用途径将其转基因递送至肝脏。如所述，以足够的量施用AAV5病毒载体以转染期望的细胞并提供足够水平的转导和所选转基因的表达以提供治疗性益处，而没有过度的不利影响或具有可由医学领域技术人员确定的医学上可接受的生理学效应。如果需要，也可以组合施用途径。rAAV载体(即AAV5基因疗法载体)的剂量将主要取决于这样的因素，例如所治疗的病况、所选基因、患者的年龄、体重和健康状况，并因此在患者之间可能有所不同。

根据本发明用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体优选是在昆虫细胞中产生的AAV5基因疗法载体。不受理论的束缚，由于当在昆虫细胞中产生时AAV衣壳可能与在哺乳动物细胞中产生的AAV衣壳不同，该产生方法可以在与AAV载体相关的免疫谱中起作用。这种差异可能是关于糖基化或其他翻译后修饰。此外，基于哺乳动物细胞的制备可能具有以下缺点：将rep和cap表达构建体包含在施用于患者的AAV衣壳中，导致rep和cap表达构建体(尽管以非常低的量)转移至人类对象。从免疫的角度来看，AAV rep和cap在人类患者中的表达可能是有害的，特别是在人类患者对于抗AAV5抗体的测试会呈阳性的情况下。因此，可能优选的是，将要施用于人类患者的AAV5病毒载体是在昆虫细胞中产生的。基于昆虫细胞的制备已被很好地建立，并且包括但不限于如WO2007046703、WO2007148971、WO2009014445、WO2009104964、WO03042361、WO2008024998、WO2010114948中所述的手段和方法，其通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，提供了一种用于确定适合于用AAV5基因疗法载体进行医学治疗的人类患者的方法，包括以下步骤：

-提供来自人类患者的血清样品；

-确定抗AAV5抗体的滴度；

-其中如果用如实施例中所述的总抗AAV5抗体(TAb)测定来确定的总抗AAV5抗体滴度的值在0.02-5的范围内，则可以认为患者适合于进行医学治疗。

任选地，所述方法随后包括以下步骤：

-向适合的人类患者施用AAV5基因疗法载体。

理解的是，以上关于与AAV5基因疗法因子的医学用途有关的实施方案所描述的任何边界和界限也适用于本文所述的任何方法，例如用于递送AAV5基因疗法载体的方法或用于确定适合性。优选地，如实施例中所述所述总抗AAV5抗体滴度具有用总抗AAV5抗体(TAb)确定的0.02-4、0.02-3或0.02-2的范围内的值。

在另一个实施方案中，用于确定适合于用AAV5基因疗法载体进行医学治疗的人类患者的方法，包括以下步骤：

-提供来自人类患者的血清样品；

-确定抗AAV5抗体的滴度；

-其中，如果用如实施例中所述的中和抗AAV5抗体(NAb)测定来确定的中和抗AAV5抗体滴度的值在3-10,000的范围内，则可以认为患者适合于进行医学治疗。

任选地，所述方法随后包括以下步骤：

-向适合的人类患者施用AAV5基因疗法载体。

优选地，所述抗AAV5抗体滴度具有如实施例中所述用中和抗AAV5抗体(NAb)确定的3-5,000、3-3,000或3-1,000的范围内的值。

理解的是，上述适合性标准不是可用于选择AAV5基因疗法治疗的唯一标准。因此，当人类患者符合所有其他标准时，抗AAV5抗体标准将确定该人类患者的适合性。

在另一个实施方案中，提供了一种治疗人类的方法，该方法包括向有此需要的人类施用有效量的AAV5基因疗法载体；

其中所述人类患者没有用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选；

并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗。

在又一个实施方案中，提供了一种治疗人类的方法，该方法包括向有此需要的人类施用有效量的AAV5基因疗法载体；

其中所述人类患者用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选；

其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗；

并且其中所述人类具有的抗AAV5抗体水平对应于在人类群体中观察到的抗AAV5抗体水平的至多第95个百分点。

在另一个实施方案中，提供了一种将基因递送至人类的方法，该方法包括向有此需要的人类施用有效量的AAV5基因疗法载体；

其中所述人类用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选；

其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗；

并且其中所述人类具有的抗AAV5抗体水平对应于在人类群体中观察到的抗AAV5抗体水平的至多第95个百分点。

在另一个实施方案中，提供了一种将基因递送至人类的方法，该方法包括向有此需要的人类施用有效量的AAV5基因疗法载体；

其中所述人类患者没有用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选；

其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过AAV5基因疗法载体的医学治疗。

可选地，或与前述实施方案中的任一个组合，在一个优选的实施方案中，AAV5载体组合物还包含药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂。可以将带有治疗基因的rAAV载体施用于患者，优选将其悬浮在生物学上相容的溶液或药学上可接受的递送载剂中。合适的载剂包括无菌盐水。为此目的，可以使用已知是药学上可接受的载体并且本领域技术人员熟知的其他水性和非水性等渗无菌注射溶液以及水性和非水性无菌混悬剂。如上所述，将病毒载体以足够的量施用于人类患者，以转染期望的细胞并提供足够水平的转导和所选转基因的表达，以提供治疗性益处，而没有过度的副作用或具有可由医学领域技术人员确定的医学上可接受的生理学效应。

实施例

研究设计和参与者

进行了一项多国性、非盲的(open-label)、剂量递增1/2期研究，其中包括患有严重B型血友病(FIX＜1IU/dL)或中度严重B型血友病(FIX≤2IU/dL)的成年男性，他们需要：1)连续的FIX预防，或2)按需FIX，并且每年出血≥4次或具有血友病性关节炎。该试验的更多详细信息可以在NIH Clinicaltrials.gov网站上找到(NCT02396342)。该研究得到每个中心的Institutional Review Board/Institutional Ethics Committee的批准。所有参与者均提供了书面知情同意书。该试验是根据Declaration of Helsinki和theprinciples of Good Clinical Practice进行的。

掺入有在肝特异性启动子LP1的控制下的密码子优化的野生型hFIX基因的AAV5载体(Nathwani et al.N Engl J Med 2011；365(25)：2357-65和Nathwani et al.B.N EnglJ Med 2014；371(21)：1994-2004)被用于研究中。使用杆状病毒表达系统按照GoodManufacturing Practices制备载体。使用qPCR确定载体基因组拷贝滴度(gc)。衣壳与gc的比率为约10，即衣壳的量为基因组拷贝的量的约十倍。衣壳滴度可以通过具有紫外吸收检测的高效液相色谱排阻色谱法(HPL-SEC)来确定。该方法基于SEC柱，选择其是由于它将AAV颗粒与较小的基质组分分离的能力。在该方法中，使用具有已知总颗粒浓度的AAV载体制剂生成校准曲线。在校准曲线中，将注射的总颗粒的量针对响应数据作图。使用返回的AAV峰面积和校准曲线，通过插值的手段计算注射的样品颗粒的量。AAV5载体以单次、30分钟、外周静脉内输注来施用。在两个连续的、剂量递增的队列中对参与者进行治疗：队列1(n＝5，参与者1-5)接受5x10¹²gc/kg，以及队列2(n＝5，参与者6-10)为2x10¹³gc/kg。队列1由平均年龄为69岁(35-72)以及平均体重为84.5kg(71.2-89.1)的成年男性组成，队列2由平均年龄为35岁(33-46)以及平均体重为84.0kg(71.4-96.0)的成年男性组成。功效结果测量包括FIX血浆活性测量。此外，从对象获得血清用于中和AAV5抗体滴度(NAb滴度)和总AAV5抗体滴度(TAb)分析。

来自健康供体的对照血清从SeraLab(West Sussex，UK)商业上获得。下面列出了关于这些血清提供的所有信息。

表1.健康供体

中和AAV5抗体(NAb)滴度

基于使用携带转基因荧光素酶的AAV5(AAV5-luc)和人类胚胎肾细胞系HEK293T(ATCC 11.268)的高度敏感的体外测定，评估人类血清中NAb的测量。通过添加荧光素类似物揭示转基因表达。

所用材料：

-HEK293T细胞(HEK293T/ATCC 11.268)

-含酚红的DMEM(Gibco，REF#31966)/10％FBS(Greiner，REF#758093)/1％PenStrep(Gibco，REF#15140)

-不含酚红的DMEM(Gibco，REF#21063)/1％Pen-Strep(Gibco，REF#15140)

-1xPBS-/-(Gibco，REF#14190)

-1x胰蛋白酶EDTA(Gibco，REF#25200)

-聚-L-赖氨酸(PLL)溶液(2.5％)(Sigma-Aldrich，REF#8920-100)

-96孔平底黑色培养板(costar，REF#3916)

-透明96孔平底平板(corning，REF#3596)

-ONE-Glo萤光素酶测定系统(Promega，REF#E6120)

-Glo裂解缓冲液，1x(Promega，REF#E2661)

-AAV5-CMV-luc(例如使用来自PKO的AAV5-CMV-73 QlucHtt，滴度：4e13gc/ml)

基本上，通过在DMEM(含酚红/10％FBS和1％P/S(青霉素/链霉素))中以浓度为0.5x10⁵个细胞/孔加入100μl/孔的HEK293T细胞，将细胞接种到黑色96孔板和透明96孔板中。将细胞孵育过夜。

第二天，在培养基(不含酚红的DMEM/1％PS/10％FBS)中在透明的96孔板上制备血浆的连续稀释物。加入病毒后(见下文)，这里获得的最终血浆稀释度为2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024。

通过将140μl培养基添加到指定的A2-A11孔(阴性对照孔)中来制备稀释物，并将70μl培养基添加到板的第3、4、5、6、7、8、9、10和11列的其余行以及添加到H2-H11行(阳性对照)。将血浆样品添加到孔B2、C2、D2、E2、F2、G2中(140μl/孔)，其导致第一次稀释：1.因此，在整个板上通过将70μl从第2列转移到第3列(稀释度2)、从第3列转移到第4列(4)、从第4列转移到第5列(8)、从第5列转移到第6列(16)、从第6列转移到第7列(32)、从第7列转移到第8列(64)、从第8列转移到第9列(128)、从第9列转移到第10列(256)、从第10列转移到第11列(512)，然后丢弃第11列中的70μl来进行血浆的连续稀释。在培养基(不含酚红的DMEM/1％PS/10％FBS)中以6x10⁹gc/ml制备AAV5-CMV-73QlucHtt。接下来将70μl/孔的6x10⁹gc/ml的AAV5(160)-CMV-73QlucHtt病毒稀释物添加到血浆稀释板中，不包括A2-A11孔(阴性对照)。将板小心地放置在平板振荡器上，以300rpm 2分钟。然后将板在4摄氏度下孵育1小时。

从前几天(用HEK293T细胞)制备的黑色96孔板中除去培养基，并通过从透明板以100μl/孔的体积吸取到带有Hek293T细胞的黑色板中来替换制备的血浆稀释液。将这些板在37℃孵育16-20小时。第二天，将细胞在室温平衡并除去培养基。将细胞用1X PBS-/-(100μl/孔)冲洗一次，然后将100μl/孔的Glo裂解缓冲液加入板中，并在室温孵育5分钟以允许发生裂解。此后，加入100μl/孔的来自ONE-Glo荧光素酶测定系统的试剂(试剂根据制备商的说明来制备)。至少3分钟后，使用GloMax Discover机器上的ONE-Glo Protocol测量平板。使用LabKey软件分析确定抗AAV5中和抗体的滴度，该软件分析计算扣除背景活性后对于每种血清稀释物的中和百分比，并然后将曲线拟合到中和谱。然后，使用该曲线针对选定的基准、曲线下面积(AUC)和误差估计值计算中和抗体滴度。四参数方法用于计算曲线拟合。LabKey计算IC50，即抗体抑制转导50％时的稀释度。LabKey还根据Johnson andByington，Techniques in HIV Research.New York，N.Y.：Stockton Press，1990：71-76计算“point-based”滴度。这是通过在目标中和百分比某一侧的两个重复之间线性插值来完成的。每次运行均包括阳性对照(无样品血清但有AAV5-LUC的孔)、阴性对照(仅具有培养基，无样品血清且无AAV5-LUC的孔)和阴性对照样品血清(热灭活的FBS)，以评估AAV5-LUC中和的特异性。当作为样品测量时，FBS不应具有抗AAV5中和特性。

抗AAV5抗体滴度

针对AAV5的总人类Ab的定量基于使用特异性衣壳来包被板的ELISA测定。使用蛋白A过氧化物酶揭示了特异性针对AAV5衣壳的总人类Ab的存在。将ELISA板(Nunc MaxiSorpplate.Ref：456537，Thermo Scientific)在碳酸盐缓冲液中用抗原(AAV5 cap)以100ng/孔包被，4℃过夜。第二天，将板用PBS tween-20(PBSt)洗涤三遍以消除其余的抗原，并用封闭液(PBS+3％FBS)封闭以防止非特异性结合。用200μL PBSt洗涤3次后，添加人类血清的PBSt稀释物，在100μL的最终体积中从1∶9开始，然后是1∶3的稀释系列。所有样品均一式两份进行测试。每个板中均包含无人类血清的阴性对照。将血清稀释物在37°孵育2小时。此后，除去血清，将板用PBSt洗涤3次，并将100μL在封闭溶液中以1∶10,000稀释的蛋白A过氧化物酶加入1小时。将板用PBSt洗涤3次，并用TMB底物显示反应，并在30分钟后用H₂SO₄ 2N终止。在酶标仪中于450nm读取吸光度。将总抗体滴度计算为吸光度比阴性对照高五倍的血清稀释度。

结果和讨论

两个队列中的人类患者均表现出FIX活性的有意义的改善，大多数人类患者通过将表型从严重改变为轻度而改善(表2)，导致大大减少或甚至不使用预防性施用FIX蛋白。在患者之间和在队列之间观察到的FIX活性水平之间观察到了变化。FIX活性水平中的变化与人类患者的NAb或TAb状态不相关。

先前报道的针对AAV5的Tab的盛行率(40％，Boutin et al.Hum Gene Ther.2010Jun 21(6)：704-712))与当前分析的结果大致相符(30％)。用基于荧光素酶的Nab测定获得的结果(见图1和图2)表明AAV5(中和)抗体的盛行率是相似的，因为在50个筛选的对照血清中有14个返回了阳性信号(28％)，与最近的研究一致(Li C et al.Gene Ther.2012Mar；19(3)：288-94)。基因疗法治疗之前从人类患者获得的血清的结果也与此相符，其中10个血清中有3个在NAb测定和Tab测定中均呈阳性(30％)。通过ELISA评估的总抗体与通过基于萤光素酶的测定评估的中和抗体密切相关，表明两种测定都检测到相同的实体(参见图2A)。

此外，还测试了后处理中和抗体滴度的存在，并发现其在约10⁶和以上的范围。因此，在未治疗的人类中发现的特有的获得的抗体滴度完全落在进行基于AAV5的基因疗法的人类患者中观察到的滴度的范围外。此外，具有预先存在AAV5 NAb的患者在施用具有免疫增强特征的AAV-FIX后表现出IgG的快速增加，而与不具有NAb的患者相反，其显示IgM快速且短暂的升高，然后在第一次暴露于抗原后IgG典型的增加。此外，在具有预先存在的Nab的治疗的患者中，没有ALT(丙氨酸转氨酶)升高或衣壳特异性T细胞活化的证据。因此，对具有特有的获得的预先存在的NAb的患者中施用基于AAV5的基因疗法是可以很好地耐受的，而不会ALT升高或T细胞活化。

总之，通过NAb测定或TAB测定在体外检测到的抗AAV5抗体的存在不是预测性的，也不指示减弱体内转导。AAV5 FIX基因转移导致的治疗前Nab的存在与治疗后FIX水平之间没有明显的相关性。引人注目的是，队列1中反应最强者(接受较低剂量的AAV5载体)也具有最高的检测到的NAb和TAb抗体水平。在健康群体中观察到的抗AAV5滴度范围表明，未进行AAV5基因疗法治疗的健康群体中的抗体水平不会减弱用AAV5在体内的转导。这是因为在健康群体中观察到的最高滴度接近在队列1的患者5中观察到的最高滴度的范围内。因此，认为在用AAV5基因疗法载体治疗之前，无需测试未治疗群体中抗AAV5抗体的存在与否是可行的。

序列表

<110> 优尼科IP有限公司

<120> 人类中AAV基因疗法的手段和方法

<130> P6069265PCT

<150> EP 17180601.1

<151> 2017-07-10

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 724

<212> PRT

<213> adeno-associated virus 5

<400> 1

Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu

1 5 10 15

Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly

35 40 45

Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val

50 55 60

Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp

85 90 95

Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn

100 105 110

Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe

115 120 125

Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile

130 135 140

Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser

145 150 155 160

Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln

165 170 175

Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr

180 185 190

Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala

195 200 205

Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp

210 215 220

Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro

225 230 235 240

Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp

245 250 255

Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

260 265 270

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val

290 295 300

Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr

305 310 315 320

Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp

325 330 335

Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys

340 345 350

Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr

355 360 365

Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser

370 375 380

Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn

385 390 395 400

Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser

405 410 415

Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp

420 425 430

Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln

435 440 445

Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp

450 455 460

Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly

465 470 475 480

Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu

485 490 495

Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr

500 505 510

Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile

515 520 525

Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu

530 535 540

Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg

545 550 555 560

Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser

565 570 575

Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro

580 585 590

Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp

595 600 605

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Thr Arg Pro Leu

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<211> 725

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 2

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130 135 140

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725

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<211> 725

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> ala insertion

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130 135 140

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145 150 155 160

Ser Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser

165 170 175

Gln Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp

180 185 190

Thr Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly

195 200 205

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225 230 235 240

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Leu Thr Arg Pro Leu

725

Claims (12)

1.一种用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类没有用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗。

2.一种用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类用确定抗AAV5抗体的测定进行预筛选，并且其中在所述医学治疗之前，所述人类未进行过用AAV5基因疗法载体的医学治疗，所述人类所具有的抗AAV5抗体水平对应于在人类群体中所观察到的抗AAV5抗体水平的至多第95个百分点。

3.根据权利要求3所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述人类针对抗AAV5抗体测试呈阳性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述AAV5基因疗法载体以对应于至少10¹²衣壳/kg的剂量施用。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述AAV5基因疗法载体以对应于至少10¹²gc/kg体重的剂量使用。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述AAV5基因疗法载体用于治疗选自由A型血友病或B型血友病组成的组的疾病。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述AAV5基因疗法载体用于治疗血友病，其中所述AAV5基因疗法载体编码FIX蛋白或其变体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述用途包括施用进血流中。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述用途包括将所述载体递送至肝脏。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于人类的医学治疗用途的AAV5基因疗法载体，其中所述AAV5基因疗法载体在昆虫细胞中产生。

11.一种用于确定适合于用AAV5基因疗法载体进行医学治疗的人类患者的方法，包括以下步骤：

-提供来自人类患者的血清样品；

-确定抗AAV5抗体的滴度；

-其中如果用如实施例中所述的总抗AAV5(Tab)测定来确定的总抗AAV5抗体滴度的值在0.02-5的范围内，则可以认为患者适合于进行医学治疗。

12.一种用于确定适合于用AAV5基因疗法载体进行医学治疗的人类患者的方法，包括以下步骤：

-提供来自人类患者的血清样品；

-确定抗AAV5抗体的滴度；

-其中如果如实施例中所述通过Nab测定用中和抗AAV5抗体测定来确定的抗AAV5抗体滴度的值在3-5000的范围内，则可以认为患者适合于进行医学治疗。

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