EA022169B1 - Клетка насекомого, пригодная для продуцирования рекомбинантных парвовирусных векторов, и способ получения рекомбинантных парвовирусных вирионов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к продукции белков в клетках насекомых, в силу чего в бакуловирусных векторах используются повторные кодирующие последовательности. В частности, изобретение относится к продукции парвовирусных векторов, которые могут использоваться в генной терапии, и к увеличениям экспрессии вирусных белков Rep, которые увеличивают продуктивность парвовирусных векторов.

Description

Настоящее изобретение относится к областям медицины, молекулярной биологии и генной терапии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к клетке насекомого, пригодной для продуцирования рекомбинантных парвовирусных векторов, которые могут использоваться в генной терапии, и к способу получения рекобинантных парвовирусных вирионов.

Предпосылки создания изобретения

Бакуловирусная экспрессионная система широко известна для ее использования в качестве вектора для клонирования и экспрессии в эукариотических клетках (Κίη§, Ь.А. аиб К.И. Роккее, 1992. ТЬе Ьаси1оу1ти8 ехртеккюи 5ук1ет. СЬартаи аиб На11, ИиДеб Кшдбот; О'КеШу, И.К. е1 а1., 1992. Васи1оуиик Ехргеккюи УесЮгк: А ЬаЬота1огу Маииа1. №\ν Уогк: ν.Η. Ргеетаи). Достоинства бакуловирусной экспрессионной системы состоят, среди прочих, в том, что экспрессируемые белки являются почти всегда растворимыми, правильно свернутыми и биологически активными. Дополнительные достоинства включают высокие уровни экспрессии белков, более быструю продукцию, пригодность для экспрессии больших количеств и пригодность для крупномасштабной продукции. Однако при крупномасштабной или длительной продукции гетерологичных белков, используя бакуловирусную экспрессионную систему, в биореакторах с клетками насекомых основной помехой является нестабильность уровней экспрессии, также известная как эффект пассажей. Этот эффект, по крайней мере, отчасти обусловлен рекомбинацией между повторными гомологичными последовательностями в бакуловирусной ДНК.

Бакуловирусную экспрессионную систему также успешно использовали для продукции рекомбинантных векторов на основе аденоассоциированного вируса (ААУ) (ИтаЬе е1 а1., 2002, Нит. Оеие ТЬег., 13: 1935-1943; патент США № 6723551 и заявка на патент США И820040197895). ААУ может считаться одним из самых перспективных вирусных векторов для генной терапии человека. ААУ обладает способностью к эффективному инфицированию делящихся, а также неделящихся клеток человека, геном вируса ААУ интегрируется в один хромосомный сайт в геноме клетки-хозяина, и, что наиболее важно, даже хотя ААУ присутствует у многих людей, он никогда не ассоциировался с каким-либо заболеванием. Ввиду этих достоинств рекомбинантный аденоассоциированный вирус (гААУ) в настоящее время оценивают в клинических испытаниях генной терапии гемофилии В, злокачественной меланомы, муковисцидоза, гиперлипопротеинемии типа I и других заболеваний.

Для преодоления проблем с системами продукции ААУ в клетках млекопитающих ИтаЬе и др. (2002, выше) разработали систему продукции ААУ в клетках насекомых. Для продукции ААУ в клетках насекомых были необходимы некоторые модификации для достижения правильной стехиометрии трех капсидных белков ААУ (УР1, УР2 и УР3), которые обуславливаются комбинацией альтернативного использования двух акцепторных сайтов сплайсинга и субоптимального использования инициирующего кодона АСС для УР2, который не точно воспроизводится клетками насекомых. Для имитации правильной стехиометрии капсидных белков в клетках насекомых ИтаЬе и др. (2002, выше) используют конструкцию, которая транскрибируется в одну полицистронную мРНК, которая способна к экспрессии всех трех белков УР без необходимости сплайсинга и в которой самый левый (5') инициирующий кодон замещен субоптимальным инициирующим кодоном АСС. В заявке νθ 2007/046703 описывается дальнейшее увеличение инфективности продукции на основе продуцируемых в бакуловирусной экспрессионной системе рекомбинантных ААУ (гААУ) векторов путем оптимизации стехиометрии капсидных белков ААУ, продуцируемых в клетках млекопитающих.

Для экспрессии белков Кер ААУ в системе экспрессии ААУ в клетках насекомых, первоначально разработанной ИтаЬе и др. (2002, выше), используют рекомбинантную бакуловирусную конструкцию, которая содержит два независимых блока для экспрессии Кер (один для Кер78 и один для Кер52), при этом каждый из них находится под контролем отдельного промотора клеток насекомых, промоторов ΔΙΕ1 и Ро1Н соответственно.

Однако КоЫЬгеииег и др. (2005, Мо1. ТЬег., 12: 1217-1225; νθ 2005/072364) опубликовали данные о том, что бакуловирусная конструкция для экспрессии двух белков Кер, использованная ИтаЬе и др., страдает внутренней нестабильностью. Путем разъединения палиндромной установки двух генов Кер в первоначальном векторе ИтаЬе и конструирования двух отдельных бакуловирусных векторов для экспрессии Кер52 и Кер78 КоЫЬгеииег и др. (2005, выше) увеличили стабильность вектора при пассажах. Однако, несмотря на стойкую экспрессию Кер78 и Кер52 с двух независимых конструкций бакуловирус-Кер в клетках насекомых в пределах по крайней мере 5 пассажей, выход гААУ вектора в 5-10 раз ниже по сравнению с первоначальной конструкцией бакуловирус-Кер, разработанной ИтаЬе и др. (2002, выше).

В νθ 2007/148971 авторы настоящего изобретения значительно увеличили стабильность продукции гААУ вектора в клетках насекомых путем использования одной кодирующей последовательности для белков Кер78 и Кер52, причем для белка Кер78 используется субоптимальный инициирующий кодон, который отчасти пропускается осуществляющими поиск рибосомами для допущения происхождения инициации трансляции также правее (3') в инициирующем кодоне белка Кер52.

Однако все еще существует необходимость в дальнейших улучшениях крупномасштабной (промышленной) продукции гетерологичных белков, в том числе гААУ векторов, в клетках насекомых. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение средств и способов, которые делают

- 1 022169 возможной стабильную и с высоким выходом (крупномасштабную) продукцию гетерологичных белков и парвовирусных векторов.

Описание изобретения

Определения.

Используемый здесь термин функционально связанный относится к установлению функциональной связи полинуклеотидных (или полипептидных) элементов. Нуклеиновая кислота функционально связана, когда установлена ее функциональная связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, регулирующая транскрипцию последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанный означает, что связываемые последовательности ДНК обычно являются смежными и, если необходимо соединить две кодирующие белки области, смежными и находятся в рамке считывания.

Контролирующая экспрессию последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию нуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана. Контролирующая экспрессию последовательность функционально связана с нуклеотидной последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности. Таким образом, контролирующая экспрессию последовательность может включать промоторы, энхансеры, участки внутренней посадки рибосомы (ΙΚΕδ), терминаторы транскрипции, инициирующий кодон перед кодирующим белок геном, сигнал сплайсинга для интронов и стоп-кодоны. Предполагается, что термин контролирующая экспрессию последовательность включает, как минимум, последовательность, присутствие которой предназначено для оказания влияния на экспрессию, и может также включать дополнительные полезные компоненты. Например, контролирующими экспрессию последовательностями являются лидерные последовательности и последовательности партнеров по слиянию. Этот термин может также включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты из условия, чтобы нежелательные, возможные инициирующие кодоны в рамке и вне нее были удалены из последовательности. Он может также включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты из условия, чтобы были удалены нежелательные возможные сайты сплайсинга. Он включает последовательности или последовательности полиаденилирования (рА), которые управляют добавлением концевой последовательности поли-А, т.е. цепи содержащих аденин остатков, на З'-конец мРНК, последовательности, упоминаемые как последовательности поли-А. Она также предназначена для усиления стабильности мРНК. Контролирующие экспрессию последовательности, которые влияют на стабильность транскрипции и трансляции, например промоторы, а также последовательности, которые воздействуют на трансляцию, например последовательности Козак, известны в клетках насекомых. Контролирующие экспрессию последовательности могут обладать таким свойством в отношении модулирования нуклеотидной последовательности, с которой они функционально связаны, так что достигаются более низкие уровни экспрессии или более высокие уровни экспрессии.

Используемый здесь термин промотор или регулирующая транскрипцию последовательность относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует для контроля транскрипции одной или нескольких кодирующих последовательностей, находится относительно направления транскрипции выше сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности и структурно идентифицируется по присутствию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других последовательностей ДНК, включающих, но без ограничения, сайты связывания факторов транскрипции, сайты связывания белков-репрессоров и -активаторов и любые другие последовательности нуклеотидов, известные квалифицированному в данной области техники специалисту, оказывающие непосредственное или опосредованное действие на регулирование степени транскрипции с промотора. Конститутивным промотором является промотор, который является активным в большинстве тканей в наиболее физиологических и связанных с развитием условиях.

Индуцибельным промотором является промотор, который регулируется физиологически или в процессе развития, например, при использовании химического индуктора. Тканеспецифический промотор активен только в специфических типах тканей или клеток.

Термины в значительной степени идентичные, значительная идентичность, или по существу, схожие, или существенная схожесть означают, что две пептидные или две нуклеотидные последовательности после оптимального совмещения, например, с помощью программ ОАР или ΒΕδΤΡΙΤ с использованием параметров по умолчанию разделяют, по крайней мере, определенный процент идентичности последовательностей, определяемый здесь в другом месте. В ОАР используется алгоритм общего совмещения №еб1етаи и ^ии8сЬ для совмещения двух последовательностей в пределах их полной длины, максимизирующий число соответствий и минимизирующий число пропусков в последовательностях. Как правило, используемыми в ОАР параметрами по умолчанию являются штраф за создание пропуска в последовательности = 50 (нуклеотидов)/8 (белков) и штраф за расширение на каждый последующий пропуск в последовательности = 3 (нуклеотида)/2 (белка). Для нуклеотидов используемой по умолчанию матрицей замен является игедарбиа, а для белков используемой по умолчанию матрицей замен является В1о8ит62 (НешкоГГ & НешкоГГ. 1992, ΡΝΑδ 89, 915-919). Понятно, что когда говорят, что последователь- 2 022169 ности РНК, по существу, схожи или обладают определенной степенью идентичности последовательностей с последовательностями ДНК, тимин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (И) в последовательности РНК. Совмещения последовательностей с определением показателей идентичности последовательностей в процентах можно выполнить, используя компьютерные программы, такие как ОСО ^18сои81и Раскаде, версию 10.3, доступную от Лссе1ту8 1пс., 9685 §стаи1ои Коаб, §аи Эюдо. СА 92121-3752, США, или программный продукт с открытым исходным текстом ЕтЬо88 для \νίηύο\Υ8 (находящуюся в обращении версию 2.7.1-07). В альтернативном случае схожесть или идентичность в процентах можно определить при поиске на фоне баз данных, таком как РА8ТА, ВБА8Т и т.п.

Кодирующие парвовирусные белки Кер нуклеотидные последовательности настоящего изобретения можно также установить по их способности к гибридизации с нуклеотидными последовательностями 5>ЕС ГО N0: 1-4 соответственно, в умеренных или предпочтительно жестких условиях гибридизации. Жесткие условия гибридизации определяют здесь как условия, делающие возможной гибридизацию последовательности нуклеиновой кислоты по крайней мере из приблизительно 25, предпочтительно приблизительно 50 нуклеотидов, 75 или 100 или наиболее предпочтительно из приблизительно 200 или более нуклеотидов, при температуре, составляющей приблизительно 65°С, в растворе, содержащем приблизительно 1 М соль, предпочтительно 6х§§С, или любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу, и отмывку при 65°С в растворе, содержащем приблизительно 0,1 М соль или меньше, предпочтительно 0,2х§§С, или любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию проводят в течение ночи, т.е. в течение по крайней мере 10 ч, и предпочтительно отмывку проводят в течение по крайней мере 1 ч по крайней мере с двумя заменами раствора для отмывки. Эти условия будут обычно допускать специфическую гибридизацию последовательностей, идентичных приблизительно на 90% или больше.

Умеренные условия определяют здесь как условия, делающие возможной гибридизацию последовательностей нуклеиновых кислот по крайней мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно из приблизительно 200 или более нуклеотидов, при температуре, составляющей приблизительно 45°С, в растворе, содержащем приблизительно 1 М соль, предпочтительно 6х§§С, или любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу, и отмывку при комнатной температуре в растворе, содержащем приблизительно 1 М соль, предпочтительно 6х§§С, или любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию проводят в течение ночи, т.е. в течение по крайней мере 10 ч, и предпочтительно отмывку проводят в течение по крайней мере 1 ч по крайней мере с двумя заменами раствора для отмывки. Эти условия будут обычно допускать специфическую гибридизацию последовательностей, имеющих идентичность последовательностей вплоть до 50%. Квалифицированный в данной области техники специалист будет способен модифицировать эти условия гибридизации для того, чтобы специфическим образом идентифицировать последовательности с идентичностью, варьирующей между 50 и 90%.

Подробное описание изобретения

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к использованию парвовирусов животных, в частности депендовирусов, таких как АМУ инфекционных заболеваний человека или обезьян, и их компонентов (например, генома парвовируса животных) в качестве векторов для введения и/или экспрессии нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих. В частности, настоящее изобретение относится к увеличениям продуктивности таких парвовирусных векторов после продуцирования в клетках насекомых.

Вирусы семейства Ратуоушбае представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Ратуоушбае можно разделить на два подсемейства: Ратуоутиае, которое инфицирует позвоночных, и Эеи8оутиае, которое инфицирует насекомых. Члены подсемейства Ратуоушиае упоминаются здесь как парвовирусы и включают род Эереибоу1ги8. Как можно сделать вывод из названия их рода, члены Эереибоу1ги8 уникальны тем, что для эффективного инфицирования культуры клеток требуется их котрансфекция с вирусом-помощником, таким как аденовирус или герпесвирус. Род Эереибоу1ги8 включает ААУ, который обычно инфицирует людей (например, серотипы 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы быка, собаки, лошади и овцы). Дополнительная информацця о парвовирусах и других членах Ратуоушбае приведена в КеииеШ I., Веги8, Ратуоушбае: Тйе Уии8е8 аиб Тйеи Керйсабои, Сйар1ет 69 ш Пе1б8 Уио1оду (3гб Еб. 1996). Для удобства настоящее изобретение далее иллюстрируется и описывается здесь со ссылкой на ААУ. Однако предполагается, что настоящее изобретение не ограничивается ААУ, а может в равной степени применяться к другим парвовирусам.

Геномная организация всех известных серотипов ААУ является очень простой. Геном ААУ представляет собой линейную, одноцепочечную ДНК-молекулу, длина которой составляет менее приблизительно 5000 нуклеотидов. Инвертированные концевые повторы (1ТК) фланкируют уникальные нуклеотидные последовательности, кодирующие неструктурные, участвующие в репликации белки (Кер) и структурные белки (УР). Белки УР (УР1, -2 и -3) образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются

- 3 022169 самокомплементарными и упорядочены так, что может образовываться энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпильку. Эти шпилечные структуры функционируют в качестве начала репликации ДНК вируса, служа в качестве праймеров для клеточного комплекса ДНК-полимераза. После инфицирования клеток млекопитающих АЛУ дикого типа гены Кер (т.е. Кер78 и Кер52) экспрессируются с промотора Р5 и промотора Р19 соответственно, и оба белка Кер функционируют при репликации вирусного генома. Явление сплайсинга в ОКР Кер приводит к экспрессии фактически четырех белков Кер (т.е. Кер78, Кер68, Кер52 и Кер40). Однако было установлено, что не подвергнутая сплайсингу мРНК, кодирующая белки Кер78 и Кер52, в клетках млекопитающих достаточна для продукции вектора АЛУ. Также в клетках насекомых белки Кер78 и Кер52 достаточны для продукции вектора АЛУ.

Рекомбинантный парвовирусный или АЛУ вектор (или гААУ вектор) относится здесь к вектору, включающему одну или несколько представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес генов или трансгенов, которые фланкированы последовательностями инвертированных концевых повторов (1ТК) парвовируса или ААУ. Такие гААУ векторы могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы при их присутствии в хозяине-клетке насекомого, который экспрессирует продукты генов гер и сар ААУ (т.е. белки Кер и Сар (капсида) ААУ). При включении гААУ вектора в большую конструкцию нуклеиновой кислоты (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида или бакуловирус, используемый для клонирования или трансфекции) гААУ вектор обычно упоминается как провектор, который может быть спасен путем репликации и инкапсулирования при наличии у ААУ функций упаковки и необходимых хелперных функций.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к клетке насекомого. Клетка насекомого включает, по крайней мере, первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первую аминокислотную последовательность, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую аминокислотную последовательность. Предпочтительно каждая из первой и второй аминокислотных последовательностей включает общую аминокислотную последовательность по крайней мере из 50, 80, 100, 200, 300, 350 или 398 аминокислот, идентичных по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% между первой и второй аминокислотными последовательностями. В противоположность, нуклеотидные последовательности, кодирующие общие аминокислотные последовательности в первой и второй аминокислотных последовательностях (присутствующие в первой и второй нуклеотидных последовательностях соответственно) идентичны менее чем на 95, 90, 89, 88,4, 85, 80, 75, 70, 65, 60 или 55%.

Как правило, первая и вторая аминокислотные последовательности будут гетерологичны клетке насекомого. Предпочтительно по крайней мере одна из общих аминокислотных последовательностей в первой и второй аминокислотных последовательностях является встречающейся в природе аминокислотной последовательностью. Более предпочтительно, когда по крайней мере одна из первой и второй аминокислотных последовательностей является встречающейся в природе аминокислотной последовательностью. Наиболее предпочтительно, когда как первая, так и вторая аминокислотные последовательности являются встречающими в природе аминокислотными последовательностями.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, имеет смещение частот использования кодонов в сторону улучшения для клетки насекомого по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности. Здесь предполагается, что, где бы не приводилась ссылка на смещение частот использования кодонов для клетки насекомого, оно включает смещение частот использования кодонов для клетки насекомого, инфицированной бакуловирусом, включающее, в частности, смещение частот использования кодонов для клетки, инфицированной множеством нуклеополиэдровирусов (вирусов ядерного полиэдроза) Аи1одгарПа саПГогшса (АсМИРУ). Частоты использования кодонов первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность, предпочтительно адаптируют или оптимизируют к частотам использования кодонов в хозяине-клетке насекомого. Адаптивность нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность, к частотам использования кодонов в клетке-хозяине можно представить в виде индекса адаптации кодонов (СА1). Предпочтительно частоты использования кодонов адаптируют к клетке насекомого, в которой присутствуют первая и вторая нуклеотидные последовательности. Обычно она будет представлять собой клетку рода 8робор1ега, более предпочтительно клетку §робор!ега Ггид1регба. Следовательно, частоты использования кодонов предпочтительно адаптируют к §робор!ега Ггидрегба или к клетке, инфицированной вирусом ядерного полиэдроза Аи1одгарПа саПГогшса (АсМИРУ). Индекс адаптации кодонов определяют здесь как показатель относительной адаптивности частот использования кодонов в гене к частотам использования кодонов в высокой степени экспрессируемых генов. Относительная адаптивность каждого кодона представляет собой отношение частоты использования каждого кодона к частоте использования самого распространенного кодона для одной и той же аминокислоты. Индекс СА1 определяют как среднее геометрическое этих значений относительных адаптивностей. Несмысловые кодоны и стоп-кодоны (зависящие от генетического кода) исключают. Значения СА1 находятся в диапазоне от 0 до 1, при этом большие величины означают большую долю наиболее распространенных кодонов (смот- 4 022169 ри, ЗНагр аиб Ы, 1987, ЫисЫс Аабк КекеагсЬ 15: 1281-1295; также смотри Кат е! а1., Сеие. 1997, 199: 293-301; /иг Медебе е! а1., 1оигиа1 оГ Уно1оду, 2000, 74: 2628-2635). В предпочтительной клетке насекомого разница между СА1 нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой и второй нуклеотидных последовательностях, составляет по крайней мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8. Кроме того, предпочтительно, когда СА1 нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, составляет по крайней мере 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0.

Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, является кодирующая последовательность, в которой по крайней мере 50, 75, 90, 95, 98 или 99% и предпочтительно все не часто встречающиеся кодоны или менее часто встречающиеся кодоны замещены часто встречающимся кодоном, кодирующим ту же самую аминокислоту, намеченным в табл. 1 или 2. Здесь предполагается, что часто встречающимся кодоном является наиболее часто используемый кодон, кодирующий каждый конкретный аминокислотный остаток в высокой степени экспрессируемых генах 8робор!ега Ггид1регба, представленный в табл. 1, или в высокой степени экспрессируемых генах клеток, инфицированных ΜΝΡν Аи!одгарЬа саШогтса, представленный в табл. 2. Все кодоны, отличные от часто встречающихся кодонов, и менее часто встречающиеся кодоны являются не часто встречающимися кодонами. Не часто встречающиеся кодоны включают вторые наиболее частые кодоны, под которыми подразумеваются кодоны, имеющие частоту, кроме самой высокой частоты в табл. 1 или 2. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, имеет непрерывный участок по крайней мере из 25, 50, 100, 200 или 300 кодонов, все из которых являются часто встречающимися кодонами. Кодирующую последовательность можно дополнительно адаптировать для увеличения экспрессии в хозяине-клетке насекомого с помощью способов, описанных в АО 2004/059556, и с помощью изменения процента СрС в кодирующей последовательности, как описано в АО 2006/015789. Предполагается, что результатом таких дополнительных адаптаций является то, что не все кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, будут часто встречающимися кодонами.

В предпочтительном варианте клетки насекомого все кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, являются часто встречающимися кодонами в соответствии с (или любой из двух) табл. 1 или 2. Более предпочтительно в такой клетке насекомого все кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности, являются вторыми наиболее частыми кодонами в соответствии с (или любой из двух) табл. 1 или 2, в силу чего предполагается, что, если в первой нуклеотидной последовательности часто встречающимися кодонами являются кодоны в соответствии с табл. 1, вторыми наиболее частными кодонами во второй нуклеотидной последовательности являются кодоны также в соответствии с табл. 1, или, если в первой нуклеотидной последовательности часто встречающимися кодонами являются кодоны в соответствии с табл. 2, вторыми наиболее частными кодонами во второй нуклеотидной последовательности являются кодоны также в соответствии с табл. 2.

Оптимизацию кодонов можно выполнить на основе частот использования кодонов в организме 8робор!ега Ггидрегба, которые можно найти в базе данных, касающихся частот использования кодонов (смотри, например, 1Шр://\у\у\у.ка/и5а.ог.)р/собоп). В распоряжении квалифицированного специалиста находятся подходящие компьютерные программы для оптимизации кодонов (смотри, например, 1ауага_) е! а1., 2005, №с1. Аабк Кек., 33(9): 3011-3016 и в Интернете). В альтернативном случае оптимизацию можно выполнить вручную, используя ту же базу данных, касающихся частот использования кодонов.

В одном варианте клетки насекомого настоящего изобретения по крайней мере 50, 60, 80, 90 или 100% кодонов в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности, изменяют по сравнению с соответствующим кодоном в первой нуклеотидной последовательности для максимизации содержания АТ или СС во второй нуклеотидной последовательности.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения различие в нуклеотидной последовательности между первой и второй нуклеотидными последовательностями, кодирующими общие аминокислотные последовательности, максимизируют (т.е. минимизируют идентичность нуклеотидных последовательностей) с помощью одного или нескольких изменений: а) изменения неоднозначности кодонов первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность; Ь) изменения неоднозначности кодонов второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность; с) изменения процента СС в первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность; и б) изменения процента СС во второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, связанный с клеткой насеко- 5 022169 мого, относится к продукции парвовирусных белков в клетках насекомых настоящего изобретения. В частности, парвовирусные белки продуцируют в клетках насекомых в соединении с продукцией рекомбинантных парвовирусных векторов, более предпочтительно рекомбинантных векторов на основе парвовирусов животных и наиболее предпочтительно рекомбинантных АЛУ векторов. Следовательно, в этом предпочтительном варианте клеток насекомых настоящего изобретения первая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер52 или 40, а вторая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер78 или 68. Однако предполагается, что в настоящее изобретение прямо включены варианты осуществления, в которых первая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер78 или 68, а вторая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер52 или 40. Для удобства в вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Вер52 или 40, будет использоваться в качестве первой нуклеотидной последовательности, а нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Вер78 или 68, будет использоваться в качестве второй нуклеотидной последовательности, но реверсирование этих вариантов осуществления прямо включено в настоящее изобретение. Общие аминокислотные последовательности, кодируемые первой и второй нуклеотидными последовательностями, включают аминокислотные последовательности, по крайней мере, от второй аминокислоты до самой С-концевой аминокислоты парвовирусного белка Вер52 или 40 или состоят из таких последовательностей. Предпочтительно общие аминокислотные последовательности включают аминокислотные последовательности от первой аминокислоты до самой С-концевой аминокислоты парвовирусного белка Вер52 или 40 или состоят из таких последовательностей. Идентичности между парвовирусными общими аминокислотными последовательностями являются идентичностями, определенными выше для общих аминокислотных последовательностей. Предпочтительно в клетке насекомого парвовирусными белками Вер являются белки Вер аденоассоциированного вируса (АЛУ). Более предпочтительно парвовирусными белками Вер, кодируемыми первой и второй нуклеотидными последовательностями, являются белки Вер одного и того же серотипа.

Под нуклеотидной последовательностью, кодирующей парвовирусные белки Вер, здесь подразумевается нуклеотидная последовательность, кодирующая неструктурные белки Вер, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусных векторов в клетках насекомых, такие как белки Вер78 или Вер68 и Вер52 или Вер40. Предпочтительно нуклеотидная последовательность парвовируса животных происходит из депендовируса, более предпочтительно из аденоассоциированного вируса (ААУ) человека или обезьяны и наиболее предпочтительно из АЛУ, который обычно инфицирует людей (например, серотипов 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипов 1 и 4). Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей белки Вер парвовируса животных, приведен в 8ЕО ГО N0: 7, которая представляет часть геномной последовательности АЛУ серотипа 2, кодирующую белки Вер. Кодирующая Вер78 последовательность включает нуклеотиды 11-1878, а кодирующая Вер52 последовательность включает нуклеотиды 683-1876, также представленные отдельно в 8Е0 ГО N0: 1 и 5. Предполагается, что точная молекулярная масса белков Вер78 и Вер52, а также точные положения кодонов инициации трансляции могут различаться между различными парвовирусами. Однако квалифицированный специалист будет знать, как определить соответствующее положение в нуклеотидной последовательности из парвовирусов, отличных от ААУ-2.

Таким образом, (первую) нуклеотидную последовательность, кодирующую парвовирусный белок Вер52, можно также определить как нуклеотидную последовательность:

a) которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая идентична по крайней мере на 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 6;

b) которая идентична по крайней мере на 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% нуклеотидной последовательности любой из 8Е0 ГО N0: 1-5 и 10;

c) комплементарная цепь которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты а) или Ь);

ά) последовательность которой отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты с) вследствие вырожденности генетического кода.

Таким образом, (вторую) нуклеотидную последовательность, кодирующую парвовирусный белок Вер78, можно также определить как нуклеотидную последовательность:

a) которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая идентична по крайней мере на 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 8;

b) которая идентична по крайней мере на 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% нуклеотидной последовательности с 11 до 1876 положения 8Е0 ГО N0: 7;

c) комплементарная цепь которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты а) или Ь);

ά) последовательность которой отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты

- 6 022169

с) вследствие вырожденности генетического кода.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует белки Кер парвовирусов животных, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусных векторов в клетках насекомых.

Различные модификации первой и второй кодирующих нуклеотидных последовательностей, определенных выше, включающих, например, последовательности парвовирусов дикого типа, для надлежащей экспрессии в клетках насекомых успешно выполняют путем применения широко известных методов генетической инженерии, таких как методы, описанные, например, в §ашЬтоок апй Кивве11 (2001) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬота1оту Мапиа1 (3^гй еййюп), Со1й 8рттд НагЬог ЬаЬогаЮгу. Со1й 8рттд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргевв, Ыете Уогк. Квалифицированному специалисту известны различные дополнительные модификации кодирующих областей, которые могли бы увеличить выход кодируемых белков. Эти модификации находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В клетках насекомых настоящего изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности являются предпочтительно частью конструкции нуклеиновой кислоты. Клетка насекомого может содержать две отдельные конструкции нуклеиновых кислот, одну для каждой из первой и второй нуклеотидных последовательностей, или клетка насекомого может содержать один тип конструкции нуклеиновой кислоты, включающей как первую, так и вторую нуклеотидные последовательности.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей первую и/или вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую первую и вторую аминокислотные последовательности соответственно, которые включают общую аминокислотную последовательность, определенную выше. Предпочтительно первая и/или вторая нуклеотидные последовательности в конструкции кодируют парвовирусные белки Кер, определенные выше. Предпочтительно в конструкции нуклеотидные последовательности, кодирующие первую и вторую аминокислотные последовательности, функционально связаны с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого. Эти контролирующие экспрессию последовательности будут, по крайней мере, включать промотор, который активен в клетках насекомых. Для осуществления на практике настоящего изобретения можно использовать известные квалифицированному в данной области техники специалисту методы экспрессии чужеродных генов в хозяевах-клетках насекомых. Методология молекулярного конструирования и экспрессии полипептидов в клетках насекомых приведена, например, в §итшег5 апй 8тйЬ, 1986, А Мапиа1 о! Мейюйв Гог Васи1оупив УесЮг апй 1пвес1 СиНиге Ртосейитев, Техав Адпси11ига1 Е.\рептеп1а1 5>1аОоп Ви11. Ыо. 7555, Со11еде 81а1юп, Тех.; Ьискоте, 1991, 1п Ргокор е1 а1., С1оп1пд апй Ехртеввюп о! Не1ето1одоив Сепев ш 1пвес1 Се11в νίΐΠ Васи1оу1тив Уес1отв' КесотЬшап! ΌΝΑ ТесНпо1оду апй АррПсаПопв, 97-152; Кшд, Ь.А. апй Κ.Ό. Роввее, 1992, ТНе Ьаси1оу1тив ехртеввюп вув!ет, СНартап апй На11, ИпНей Ктдйот; О'КеШу, Ό.Κ., Ь.К. МШег, У.А. Ьискоте, 1992, ВасШоуиив Ехртеввюп Уес1огв: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Νον Уогк; \У.Н. Ртеетап апй КюЬатйвоп, С.Э., 1995, Васи1оу1тив Ехртеввюп Рго1осо1в, МеШойв ш Мо1еси1аг Вю1оду, уо1ите 39; в патенте № 4745051; заявках И8 2003148506 и \УО 03/074714. Подходящие для транскрипции первой и второй нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения промоторы включают, например, промоторы полиэдрина (Ро1Н), р10, р35, 1Е-1 или ΔΙΕ-1 и дополнительные промоторы, описанные в приведенных выше ссылках. Поскольку известно, что в клетках млекопитающих экспрессия Кер78 в меньшей степени по сравнению с экспрессией Кер52 благоприятствует высоким выходам векторов (Ы е1 а1., 1997, 1. У1то1., 71: 5236-5243; Сптт е1 а1., 1998, Нит. Сепе ТНег., 9, 2745-2760), предпочтительно для управления экспрессией белка Кер78 или 68 используют промотор, который слабее промотора, используемого для экспрессии белка Кер52 или 40. Например, для экспрессии белка Кер52 или 40 можно использовать более сильный промотор полиэдрина, а для управления экспрессией белка Кер78 или 68 можно выбрать промотор ΔΕ1, промотор, который намного слабее промотора Ро1Н. Предпочтительно выбор промоторов для белка Кер52 или 40 и белка Кер78 или 68 соответственно является таковым, чтобы в клетке насекомого продуцировались Кер78/68 и Кер52/40 в молярном соотношении в диапазоне от 1:10 до 10:1, от 1:5 до 5:1 или от 1:3 до 3:1, предпочтительно через приблизительно 20-40 ч после инфицирования, более предпочтительно через приблизительно 30-40 ч после инфицирования, используя бакуловирусную экспрессию. Молярное соотношение Кер78 и Кер52 можно определить посредством вестерн-блоттинга, предпочтительно используя моноклональное антитело, узнающее эпитоп, общий для Кер78/68 и Кер52/40, или используя, например, мышиное антитело против Кер (303.9, Ргодеп, Германия, в разведении 1:50).

Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты для экспрессии первой и второй нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения в клетках насекомых представляет собой совместимый с клеткой насекомого вектор. Предполагается, что совместимый с клеткой насекомого вектор или вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную к эффективной трансформации или трансфекции насекомого или клетки насекомого. Приводимые в качестве примеров биологические векторы включают плазмиды, линейные молекулы нуклеиновых кислот и рекомбинантные вирусы. Можно использовать любой вектор, если он совместим с клеткой насекомого. Вектор может интегрироваться в геном клеток насекомых, но вектор может быть также эписомным. Присутствие вектора в клетке насекомого необязательно является постоянным, и также включены временные эписомные векторы. Вектор можно ввести с помощью любого известного способа, например с помощью химической обработки

- 7 022169 клеток, электропорации или инфицирования. В предпочтительном варианте осуществления вектором является бакуловирус, вирусный вектор или плазмида. В более предпочтительном варианте осуществления вектором является бакуловирус, т.е. конструкцией является бакуловирусный вектор. Бакуловирусные векторы и способы их применения описываются в упоминаемых выше ссылках на молекулярное конструирование клеток насекомых.

Конструкции нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут, кроме того, включать контролирующую экспрессию последовательность, включающую девятую нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 9 или нуклеотидную последовательность, в значительной степени гомологичную 8ЕЦ ГО N0: 9, 3' от инициирующих кодонов нуклеотидной последовательности, кодирующей первую и/или вторую аминокислотные последовательности. Последовательностью со значительной идентичностью нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 9, которая будет содействовать увеличению экспрессии первой и/или второй аминокислотных последовательностей, является, например, последовательность, которая идентична по крайней мере на 60, 70, 80 или 90% девятой нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 9.

Клеткой насекомого может быть любая клетка, которая подходит для продукции гетерологичных белков. Предпочтительно клетка насекомого допускает репликацию бакуловирусных векторов и может сохраняться в культуре. Более предпочтительно клетка насекомого допускает репликацию рекомбинантных парвовирусных векторов, включающих гААУ векторы. Например, используемая линия клеток может происходить из линий клеток 8ройор1ега Ггищрсгйа. ОгоюрНПа или линий клеток комаров, например линий клеток, происходящих из Лебек а1Ьор1с1и5. Предпочтительными клетками насекомых или линиями клеток являются клетки видов насекомых, которые восприимчивы к инфицированию бакуловирусами, включающие, например, 8е301, 8еГ2Н2109, 8еИСК1, 8Г9, 8Г900+, 8Г21, ВТГ-Т№5В1-4, МО-1, Тп368, Н/Ат1, На2302, Н/2Е5, НщН Шуе (Гпуйтодеп, СА, США) и ехрге83Р+® (патент США № 6103526, Рго1еш Зшепсез Согр., СТ, США).

Предпочтительной клеткой насекомого в соответствии с настоящим изобретением является клетка насекомого для продукции рекомбинантных парвовирусных векторов. Помимо описанных выше первой и второй нуклеотидных последовательностей или конструкций нуклеиновых кислот, включающих первую и вторую нуклеотидные последовательности, клетка насекомого дополнительно включает:

a) третью нуклеотидную последовательность, включающую по крайней мере одну нуклеотидную последовательность инвертированного концевого повтора (ГТК) парвовируса;

b) четвертую нуклеотидную последовательность, включающую кодирующие белки Сар парвовируса последовательности, функционально связанные с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого.

Предполагается, что в контексте настоящего изобретения по крайней мере одна нуклеотидная последовательность ГТК парвовируса означает палиндромную последовательность, включающую почти полностью комплементарные, симметрично расположенные последовательности, также упоминаемые как участки А, В и С. ГТК функционирует в качестве начала репликации, сайта, играющего цисрегуляторную роль в репликации, т.е. являющегося сайтом распознавания действующими в трансположении белками, участвующими в репликации, такими как, например, Кер78 (или Кер68), которые распознают палиндром и специфические последовательности внутри палиндрома. Одним исключением из симметрии последовательности ГТК является участок Ό ГТК. Он является уникальным (не имеющим комплемента внутри одного ГТК). Разрыв одноцепочечной ДНК происходит в месте соединения участков А и Ό. Оно является участком, в котором инициируется синтез новой ДНК. Участок Ό обычно располагается с одной стороны палиндрома и задает направленность стадии репликации нуклеиновой кислоты. Парвовирус, реплицирующийся в клетке млекопитающего, обычно имеет две последовательности ГТК. Однако можно сконструировать ГТК так, чтобы сайты связывания находились на обеих цепях участков А, а участки Ό располагались симметрично, по одному с каждой стороны палиндрома. На матрице (например, плазмиде) в виде двухцепочечной кольцевой ДНК репликация ДНК, выполняемая с помощью Кер78 или Кер68, затем осуществляется в обоих направлениях, и один ГТК является достаточным для репликации парвовирусного кольцевого вектора. Таким образом, в контексте настоящего изобретения можно использовать одну нуклеотидную последовательность ГТК. Предпочтительно, однако, когда используют две или даже другое число обычных ГТК. Наиболее предпочтительно, когда используют две последовательности ГТК. Предпочтительной парвовирусной ГТК является ААУ ГТК. С целью безопасности может быть желательным конструирование рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, который не способен к дальнейшему размножению после первоначального введения в клетку в присутствии второго ААУ. Такой механизм безопасности для ограничения нежелательного размножения вектора в реципиенте может быть обеспечен путем использования гААУ с химерными ГТК, как описано в И82003148506. Число конструкций нуклеиновых кислот, используемых в клетке насекомого для продукции рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, не ограничивается в настоящем изобретении. Например, для продукции гААУ в клетках насекомых в соответствии со способами настоящего изобретения можно использовать одну, две, три, четыре, пять или более отдельных конструкций. При использовании пяти конструкций одна конструкция кодирует УР1 ААУ, другая конструкция кодирует УР2 ААУ, еще

- 8 022169 одна конструкция кодирует УР3 АЛУ, еще одна конструкция кодирует белок Кер, определенный выше, а пятая конструкция включает по крайней мере один 1ТК АЛУ. При использовании менее пяти конструкций конструкции могут включать различные комбинации по крайней мере из одного 1ТК АЛУ и последовательностей, кодирующих УР1, УР2, УР3 или белок Кер.

Предпочтительно, когда используют две, три или четыре конструкции. При использовании двух конструкций предпочтительно, когда клетка насекомого включает (А) первую конструкцию нуклеиновой кислоты для экспрессии определенных выше белков Кер, дополнительно включающую четвертую нуклеотидную последовательность, определенную в Ь) выше (включающую кодирующие белки Сар парвовируса последовательности, функционально связанные по крайней мере с одной контролирующей экспрессию последовательностью для экспрессии в клетке насекомого; смотри также ниже); и (В) третью конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую третью нуклеотидную последовательность, определенную в а) выше (включающую по крайней мере одну нуклеотидную последовательность 1ТК парвовируса/ААУ). При использовании трех конструкций предпочтительно, когда используют конфигурацию, одинаковую с используемой для двух конструкций конфигураций, за исключением того, что отдельные конструкции используют для экспрессии капсидных белков и для экспрессии белков Кер. При использовании четырех конструкций предпочтительно, когда используют конфигурацию, одинаковую с используемой для трех конструкций конфигураций, за исключением того, что отдельные конструкции используют для экспрессии белков Кер78/68 и для экспрессии белков Кер52/40. Последовательности в каждой конструкции могут располагаться в любом порядке относительно друг друга. Например, если одна конструкция включает повторы 1ТК и включающие ОКР нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР, ОКР УР может иметь в конструкции такое месторасположение, что при репликации ДНК между последовательностями 1ТК ОКР УР реплицируется или не реплицируется. Ради другого примера кодирующие Кер последовательности и/или включающие ОКР нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР, могут располагаться в конструкции в любом порядке. Предполагается, что третья, четвертая и дальнейшие конструкции нуклеиновых кислот также предпочтительно являются совместимыми с клеткой насекомого векторами, предпочтительно бакуловирусными векторами, описанными выше. В альтернативном случае в клетке насекомого настоящего изобретения одна или несколько из первой нуклеотидной последовательности, третьей нуклеотидной последовательности, четвертой нуклеотидной последовательности и пятой нуклеотидной последовательности и необязательных дальнейших нуклеотидных последовательностей могут быть устойчиво интегрированы в геном клетки насекомого. Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники знает, как осуществить устойчивое включение нуклеотидной последовательности в геном насекомого и как идентифицировать клетку, имеющую в геноме такую нуклеотидную последовательность. Включению в геном может содействовать, например, использование вектора, включающего нуклеотидную последовательность, в высокой степени гомологичную областям генома насекомого. Использование специфических последовательностей, таких как транспозоны, является другим способом включения нуклеотидной последовательности в геном.

Здесь предполагается, что в настоящем изобретении четвертая нуклеотидная последовательность, включающая кодирующие белки капсида (Сар) парвовируса последовательности, включает последовательности, кодирующие каждый из трех капсидных белков парвовируса, УР1, -2 и -3. Четвертая нуклеотидная последовательность, включающая кодирующие капсидные белки последовательности, может присутствовать в различных формах. Например, могут использоваться отдельные кодирующие последовательности для каждого из капсидных белков УР1, -2 и -3, в силу чего каждая кодирующая последовательность функционально связана с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого. Однако более предпочтительно, когда четвертая нуклеотидная последовательность включает одну открытую рамку считывания, кодирующую все три капсидных белка парвовируса животных (ААУ) УР1, -2 и -3, причем кодон инициации трансляции капсидного белка УР1 является субоптимальным инициирующим кодоном, который не является АТС, как, например, описано ИгаЬе и др. (2002, выше) и в \УО 2007/046703. Субоптимальный инициирующий кодон для капсидного белка УР1 можно выбрать из АСС, ТТС, СТС и СТС, из которых СТС и СТС являются наиболее предпочтительными. Четвертая нуклеотидная последовательность для экспрессии капсидных белков может, кроме того, включать по крайней мере одну из модификаций, описанных в \УО 2007/046703.

Квалифицированному специалисту известны различные дополнительные модификации кодирующих УР областей, которые могли бы увеличить выход УР и вириона или обладать другими желательными эффектами, такими как измененный тропизм, или уменьшать антигенность вириона. Эти модификации находятся в пределах объема настоящего изобретения. Предпочтительно нуклеотидная последовательность настоящего изобретения, кодирующая парвовирусные капсидные белки, функционально связана с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого, которые будут, по крайней мере, включать промотор, который активен в клетках насекомых. Такие контролирующие последовательности и дополнительные методы и материалы (например, векторы) для экспрессии парвовирусных капсидных белков в хозяевах-клетках насекомых уже описаны выше для белков Кер.

- 9 022169

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения третья нуклеотидная последовательность, присутствующая в клетках насекомых настоящего изобретения, т.е. последовательность, включающая по крайней мере один ΙΤΚ парвовируса (АЛУ), дополнительно включает по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес продукт гена, в силу чего по крайней мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, становится включенной в геном рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, продуцируемого в клетке насекомого. Предпочтительно по крайней мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, является последовательностью для экспрессии в клетке млекопитающего. Предпочтительно третья нуклеотидная последовательность включает две нуклеотидные последовательности ΙΤΚ парвовируса (АЛУ), при этом по крайней мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, располагается между двумя нуклеотидными последовательностями ΙΤΚ парвовируса (ААУ). Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена (для экспрессии в клетке млекопитающего), будет включаться в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, продуцируемый в клетке насекомого, если она располагается между двумя обычными ΙΤΚ или располагается с одной из двух сторон ΙΤΚ, сконструированного с двумя участками Ό.

Определенная здесь выше третья нуклеотидная последовательность может, таким образом, включать нуклеотидную последовательность, кодирующую по крайней мере один представляющий интерес продукт гена, для экспрессии в клетке млекопитающего, расположенную так, что она будет включаться в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, реплицируемый в клетке насекомого. Любая нуклеотидная последовательность может быть включена для последующей экспрессии в клетке млекопитающего, трансфецированной рекомбинантным парвовирусным (гААУ) вектором, продуцированным в соответствии с настоящим изобретением. Нуклеотидная последовательность может, например, кодировать белок, она может экспрессировать агент для интерференции РНК, т.е. молекулу РНК, которая способна к интерференции РНК, такую как малая шпилечная РНК или малая интерферирующая РНК. Малая интерферирующая РНК означает малую интерферирующую РНК, которая представляет собой двухцепочечную РНК небольшой длины, которая не является токсичной в клетках млекопитающих (Е1Ьа8Й1г с1 а1., 2001, Ыа1иге 411: 494-498; Сар1еп е! а1., 2001, Ргос. Νηΐΐ. Асаб. δει., ША. 98: 9742-9747). В предпочтительном варианте осуществления третья нуклеотидная последовательность может включать две нуклеотидные последовательности, и каждая из них кодирует один представляющий интерес продукт гена для экспрессии в клетке млекопитающего. Каждая из двух нуклеотидных последовательностей, кодирующая представляющий интерес продукт гена, расположена так, что она будет включаться в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, реплицируемый в клетке насекомого.

Представляющий интерес продукт гена для экспрессии в клетке млекопитающего может быть терапевтическим генным продуктом. Терапевтический генный продукт может быть полипептидом или молекулой РНК (малой интерферирующей РНК) или другим продуктом гена, который после экспрессии в целевой клетке обеспечивает желательный терапевтический эффект, такой как, например, удаление нежелательной активности, например удаление инфицированной клетки, или комплементация генетического дефекта, например, вызывающего недостаток ферментативной активности. Примеры полипептидных продуктов генов включают СРЕК, фактор ΙΧ, липопротеинлипазу (ЬРЬ, предпочтительно ЬРЬ δ447Χ; смотри \УО 01/00220), аполипопротеин А1, уридиндифосфат-глюкуронозилтрансферазу (υΟΤ), относящийся к ГТФазам регуляторный взаимодействующий белок при пигментной дегенерации сетчатки (КР-ОКТР) и цитокины или интерлейкины, подобные, например, ΙΠ-10, порфобилиноген-дезаминазу (ΡΒΟΌ) и аланин-глиоксилат-аминотрансферазу.

Альтернативно или дополнительно, в качестве третьего продукта гена определенная здесь выше третья нуклеотидная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который служит в качестве маркерных белков для оценки трансформации клетки и экспрессии в ней. Подходящими для этой цели маркерными белками являются, например, флуоресцентный белок ОРК и гены селектируемых маркеров: тимидинкиназы ΗδΥ (для отбора с использованием среды ΗАΤ), бактериальной гигромицин В-фосфотрансферазы (для отбора с использованием гигромицина В), Τη5-аминогликозид-фосфотрансферазы (для отбора с использованием О418) и дигидрофолатредуктазы (ИНРК) (для отбора с использованием метотрексата), СЭ20, ген фактора роста нервов с низкой аффинностью. Источники получения этих маркерных генов и способы их применения предоставлены в δηιιΦίΌοΚ апб Ки88е1 (2001) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬотаФту Мапиа1 (3гб ебйюп), Со1б δρτίη^ НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б δρηπβ НагЬог ЬаЬотаФту Рте88, №\ν Уотк. Кроме того, определенная здесь выше третья нуклеотидная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который может служить в качестве надежного механизма, позволяющего излечить субъектов от клеток, трансдуцированных рекомбинантным парвовирусным (гААУ) вектором настоящего изобретения, если это считается необходимым. Такая нуклеотидная последовательность, часто упоминаемая как ген самоубийства, кодирует белок, который способен к превращению пролекарства в токсическое вещество, которое способно вызывать гибель трансгенных клеток, в которых экспрессируется белок. Подходящие примеры таких генов самоубийства включают, например, ген цитозин-дезаминазы Е. сой

- 10 022169 или один из генов тимидинкиназ из вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса ветряной оспы, при этом в качестве пролекарства может использоваться ганцикловир для вызова гибели трансгенных клеток у субъекта (смотри, например, С1а1т е! а1., 1987, АийшкгоЪ. Адеп!8 СЬето!Ьег. 31: 844-849). В другом варианте осуществления одним из представляющих интерес продуктов генов может быть белок ААУ, в частности белок Кер, такой как Кер78 или Кер68, или его функциональный фрагмент. Нуклеотидная последовательность, кодирующая Кер78 и/или Кер68, если она присутствует в геноме рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора настоящего изобретения и экспрессируется в клетке млекопитающего, трансдуцированной этим вектором, допускает интеграцию рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора в геном трансдуцированной клетки млекопитающего. Экспрессия Кер78 и/или Кер68 в гААУ-трансдуцированной или -инфицированной клетке млекопитающего может обеспечить преимущество некоторым применениям рекомбинантного парвовирусного (тААУ) вектора путем дозволения долгосрочной или постоянной экспрессии любого другого представляющего интерес продукта гена, введенного в клетку с помощью вектора.

В рекомбинантных парвовирусных (гААУ) векторах настоящего изобретения по крайней мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, для экспрессии в клетке млекопитающего предпочтительно функционально связана по крайней мере с одной совместимой с клеткой млекопитающего контролирующей экспрессию последовательностью, например промотором. Множество таких промоторов известно в данной области техники (смотри §атЪтоок апб Ки88е1, 2001, выше). Могут использоваться конститутивные промоторы, которые более или менее экспрессируются во многих типах клетках, такие как промотор СМУ. Однако более предпочтительными будут промоторы, которые являются индуцибельными, тканеспецифическими, специфичными в отношении типа клеток или специфичными для клеточного цикла. Например, для специфичной для печени экспрессии промотор можно выбрать из промотора αΐ-антитрипсина (ААТ), промотора связывающегося с гормоном щитовидной железы глобулина, промотора альбумина, промотора ЬР8 (связывающегося с тироксином глобулина), гибридного промотора НСК-АроС11, гибридного промотора НСК-ЬААТ, промотора ААТ, объединенного с энхансерным элементом гена альбумина мыши (Еа1Ъ) и промотора аполипопротеина Е. Другие примеры включают промотор Е2Р для опухолевоспецифической и, в частности, специфической в отношении опухолей из клеток нервной системы экспрессии (Рагг е! а1., 1997, Ыа1. Меб., 3: 1145-1149) или промотор 1Ь-2 для использования в мононуклеарных клетках крови (НадепЪаидк е! а1., 1997, 1. Ехр. Меб., 185: 2101-2110).

ААУ может инфицировать ряд клеток млекопитающих; смотри, например, Тта18сШп и др. (1985, Мо1. Се11 Бю1. 5: 3251-3260) и Опннн и др. (1999, Нит. Оепе ТЬег. 10: 2445-2450). Однако трансдукция ААУ синовиальных фибробластов человека является значительно более эффективной, чем аналогичных клеток мыши (1епшп§8 е! а1., Ат1ЬгШ8 Ке8., 3:1 (2001)), а тропность ААУ к клеткам отличается среди серотипов; смотри, например, Эа\зб8оп и др. (2000, Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δοί. И8А, 97: 3428-3432), которые обсуждают различия среди ААУ2, ААУ4 и ААУ5 в отношении тропизма к клеткам ЦНС млекопитающих и эффективности трансдукции.

Последовательности ААУ, которые могут использоваться в настоящем изобретении для продукции рекомбинантных ААУ векторов в клетках насекомых, могут происходить из генома любого серотипа ААУ. Как правило, серотипы ААУ имеют геномные последовательности со значительной гомологией на аминокислотном уровне и уровне нуклеиновой кислоты, обуславливают идентичный ряд генетических функций, обеспечивают вирионы, которые, по существу, физически и функционально эквиваленты, и реплицируются и собираются с помощью практически идентичных механизмов. Ради геномной последовательности различных серотипов ААУ и обзора геномных сходств смотри, например, входящий номер в ОепВапк - И89790, входящий номер в ОепБапк - 101901, входящий номер в ОепБапк - АР043303, входящий номер в ОепБапк - АР085716, СЬ1опш е! а1. (1997, 1. Уи., 71: 6823-6833); δπν;·ΐ8ΐ;·ιν;·ι е! а1. (1983, 1. Ук., 45: 555-564); СЬ1опт е! а1. (1999, 1. Ук, 73: 1309-1319); Кибебде е! а1. (1998, 1. Ук, 72: 309-319); Уи е! а1. (2000, 1. Ук, 74: 8635-8647). Серотипы 1, 2, 3, 4 и 5 ААУ являются предпочтительным источником нуклеотидных последовательностей ААУ для использования в контексте настоящего изобретения. Предпочтительно последовательности 1ТК ААУ для использования в контексте настоящего изобретения происходят из ААУ1, ААУ2 и/или ААУ4. Также кодирующие Кер (Кер78/68 и Кер52/40) последовательности предпочтительно происходят из ААУ1, ААУ2 и/или ААУ4. Последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3, для использования в контексте настоящего изобретения могут, однако, быть получены из любого из 42 известных серотипов, более предпочтительно из ААУ1, ААУ2, ААУ3, ААУ4, ААУ5, ААУ6, ААУ7, ААУ8 или ААУ9 или вновь разработанных ААУ-подобных частиц, полученных, например, с использованием методов перетасовки капсидных белков и библиотек капсидных белков ААУ.

Последовательности Кер и 1ТК ААУ являются особенно консервативными среди большинства серотипов. Белки Кер78 различных серотипов ААУ, например, идентичны более чем на 89%, и идентичность нуклеотидных последовательностей в целом на геномом уровне между ААУ2, ААУ3А, ААУ3Б и ААУ6 составляет приблизительно 82% (Ваи!е1-8сЬаа1 е! а1., 1999, 1. Уко1., 73(2): 939-947). Кроме того, известно, что последовательности Кер и 1ТК многих серотипов ААУ служат эффективными встречными

- 11 022169 комплементами (т.е. функционально заменяют) для соответствующих последовательностей из других серотипов при продукции частиц АЛУ в клетках млекопитающих. В заявке И8200314850б публикуются данные о том, что последовательности Вер и 1ТВ АЛУ также являются эффективными встречными комплементами для других последовательностей Вер и ΙΤΒ АЛУ в клетках насекомых.

Известно, что белки УР АЛУ определяют тропность вириона АЛУ к клеткам. Кодирующие белки УР последовательности значительно менее консервативны, чем гены и белки Вер среди различных серотипов АЛУ. Способность последовательностей Вер и ΙΤΒ служить встречными комплементами для соответствующих последовательностей других серотипов допускает продукцию псевдотиповых частиц гААУ, включающих капсидные белки одного серотипа (например, ААУ1) и последовательности Вер и/или 1ТВ другого серотипа АЛУ (например, ААУ2). Такие псевдотиповые частицы гААУ являются частью настоящего изобретения.

Модифицированные последовательности АЛУ можно также использовать в контексте настоящего изобретения, например, для продукции гААУ векторов в клетках насекомых. Такие модифицированные последовательности, например, включают последовательности, идентичные по крайней мере приблизительно на 70%, по крайней мере приблизительно на 75%, по крайней мере приблизительно на 80%, по крайней мере приблизительно на 85%, по крайней мере приблизительно на 90%, по крайней мере приблизительно на 95% или более на уровне нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности (например, последовательность, идентичная на уровне нуклеотидной последовательности приблизительно на 75-99%) последовательностям 1ТВ, Вер или УР АЛУ дикого типа. Последовательности 1ТВ, Вер или УР ААУ1, ААУ2, ААУ3, ААУ4, ААУ5, ААУб, ААУ7, ААУ8 или ААУ9 можно использовать вместо последовательностей 1ТВ, Вер или УР АЛУ дикого типа.

Схожий во многих отношениях с другими серотипами АЛУ серотип ААУ5 отличается от других серотипов АЛУ человека и обезьяны больше, чем другие известные серотипы человека и обезьяны. Ввиду этого продукция гААУ5 может отличаться от продукции других серотипов в клетках насекомых. Если способы настоящего изобретения используются для продукции гААУ5, предпочтительно, чтобы в случае одной или более конструкций, включающих в совокупности в случае более одной конструкции нуклеотидную последовательность, включающую 1ТВ ААУ5, нуклеотидная последовательность включала последовательность, кодирующую Вер ААУ5 (т.е. чтобы нуклеотидная последовательность включала Вер78 ААУ5). Такие последовательности 1ТВ и Вер можно модифицировать согласно требованиям для получения эффективной продукции гААУ5 или псевдотиповых гААУ5 векторов в клетках насекомых. Например, можно модифицировать инициирующий кодон последовательностей Вер, можно модифицировать или элиминировать сайты сплайсинга УР и/или можно модифицировать инициирующий кодон УР1 и близлежащие нуклеотиды для увеличения продукции гААУ5 векторов в клетке насекомого.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу продукции рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вириона (включающего определенный выше рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор) в клетке насекомого. Предпочтительно способ включает стадии (а) культивирования определенной здесь выше клетки насекомого в таких условиях, что продуцируется рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, и (Ь) выделения рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора. Здесь предполагается, что продуцируемый этим способом рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор предпочтительно представляет собой инфекционный парвовирусный или ААУ-вирион, который включает нуклеиновые кислоты рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора. Условия выращивания клеток насекомых в культуре и продукция гетерологичных продуктов в клетках насекомых в культуре широко известны в данной области техники и описываются, например, в приведенных выше ссылках на молекулярное конструирование клеток насекомых (смотри, например, АО 2007/046703).

Предпочтительно способ, кроме того, включает стадию очистки по сродству рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора (включающих его вирионов), используя антитело против АЛУ, предпочтительно иммобилизованное антитело. Антитело против АЛУ предпочтительно является моноклональным антителом. Особенно подходящим антителом является одноцепочечное антитело семейства верблюдовых или его фрагмент, например, получаемых из верблюдов или лам (смотри, например, Миу1бегтап8, 2001, Вю1есЬпо1., 74: 277-302). Предпочтительно антителом для очистки по сродству гААУ является антитело, которые специфически связывается с эпитопом капсидного белка ААУ, в силу чего предпочтительно эпитопом является эпитоп, который присутствует в капсидном белке более чем одного серотипа ААУ. Например, можно индуцировать или отобрать антитело на основе специфического связывания с капсидом ААУ2, но в то же самое время оно может также специфически связываться с капсидами ААУ1, ААУ3 и ААУ5.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей первую и вторую нуклеотидные последовательности, определенные здесь выше.

В отличном аспекте настоящее изобретение относится к способу продукции рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вириона (включающего определенный выше рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор) в клетке насекомого. Предпочтительно способ включает стадии (а) культивирования определенной здесь выше клетки насекомого в таких условиях, что продуцируется рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, причем клетка насекомого включает по крайней мере одну конструкцию нук- 12 022169 леиновой кислоты для экспрессии парвовирусных белков Вер78/68 и Вер52/40 (такую как, например, конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую первую и вторую нуклеотидные последовательности, определенные здесь выше) и, кроме того, включает третью и четвертую нуклеотидные последовательности, определенные здесь выше, и где конструкция(и) нуклеиновой кислоты для экспрессии парвовирусных белков Вер78/68 и Вер52/40 дает уровень экспрессии Вер52/40 в клетке насекомого, который превышает уровень экспрессии Вер78/68 на молярной основе; и (Ь) выделения рекомбинантного парвовирусного (тААУ) вектора. Предпочтительно в способе молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68 в клетке насекомого превышает 10:1, предпочтительно оно составляет по крайней мере 11:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 или 60:1. Превышающее 10:1 молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68 в клетке насекомого предпочтительно приводит к большей доли полноценных вирионов (т.е. включающих геном тААУ) по отношению к пустым вирионам (смотри, например, фиг. 8). Однако слишком высокое молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68 может приводить к меньшему титру продуцируемых тААУ, определяемому по числу копий генов. Поэтому в одном варианте осуществления молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68 составляет менее чем 100:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1 или 20:1. Молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68 можно определить посредством вестернблоттинга, как описано в \νϋ 2007/148971, предпочтительно используя моноклональное антитело, которое узнает эпитоп, общий для Вер78/68 и Вер52/40, или используя антитело, описанное в νθ 2007/148971. Предпочтительно минимальное молярное соотношение белков Вер52/40 и Вер78/68, указанное выше, достигается через приблизительно 20-40 ч после инфицирования, более предпочтительно через приблизительно 30-40 ч после инфицирования, используя бакуловирусную или схожую экспрессионную систему.

Существуют различные способы увеличения относительного уровня экспрессии белков Вер52/40 по сравнению с белком Вер78/68. В случае использования одного транскрипционного блока для экспрессии белков и Вер78/68, и Вер52/40 последовательность, кодирующую белки Вер78/68 и Вер52/40, можно адаптировать следующим образом для получения молярного соотношения белков Вер52/40 и Вер78/68 в клетке насекомого, превышающего 10:1:

a) кодон инициации трансляции белка Вер78/68 можно преобразовать в субоптимальный инициирующий кодон и/или его субоптимальное окружение, как описано в νθ 2007/148971;

b) исключением одной или более или всех (9) последовательностей АТО, которые встречаются между началами трансляции генов Вер78/68 и Вер52/40, соответственно предпочтительно с помощью изокодонных замен в нуклеотидной последовательности. Это успешно выполнено, например, в кодирующей Вер последовательности рУЭ189. описанной в примере 3 и в 8ЕО ГО N0: 11;

c) оптимизацией окружения кодона инициации трансляции белка Вер52/40 в соответствии с оптимальным окружением инициирующего кодона 5'-NNNNNNАυОА а/с/д N-3' для эффективной инициации трансляции в клетках чешуекрылых (как описано Сйаид е1 а1., 1999, У1то1оду, 259: 369-383);

ά) включением контролирующей экспрессию последовательности, включающей девятую нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО N0: 9 или нуклеотидную последовательность, в значительной степени гомологичную 8ЕО ГО N0: 9, 5' от инициирующих кодонов белка Вер52/40;

е) смещением частот использования кодонов в части последовательности, кодирующей белок Вер52/40, в сторону улучшения для экспрессии в клетках насекомых (как описано выше);

ί) изменением частот использования кодонов в части кодирующей последовательности между началами трансляции белков Вер78/68 и Вер52/40, вследствие чего она становится менее адаптированной к экспрессии в клетках насекомых (как описано выше).

Комбинации способов а)-£) включены в настоящее изобретение и в предпочтительном варианте осуществления а) объединяют по крайней мере с одним из способов Ь)-£).

Альтернативно и/или дополнительно, для экспрессии белка Вер52/40 можно использовать второй транскрипционный блок. Экспрессию белка Вер52/40 с этого второго транскрипционного блока можно увеличить с помощью одного или более следующих способов:

a) использование промотора для блока для транскрипции Вер52/40, более сильного по сравнению с промотором для блока для Вер78/68 (смотри ниже);

b) увеличение числа копий блока для транскрипции Вер52/40 по сравнению с числом копий блока для Вер78/68;

c) смещение частот использования кодонов в последовательности, кодирующей белок Вер52/40, в сторону улучшения для экспрессии в клетках насекомых (как описано выше, например, 8ЕО ГО N0: 2 или 10);

ά) оптимизация окружения кодона инициации трансляции белка Вер52/40 в соответствии с оптимальным окружением инициирующего кодона 5'-НН\ПНЛАиОА а/с/д N-3' для эффективной инициации трансляции в клетках чешуекрылых (как описано Сйаид е1 а1., выше);

е) включение контролирующей экспрессию последовательности, включающей девятую нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 или нуклеотидную последовательность, в значительной степени гомологичную 8Е0 ГО N0: 9, 5' от инициирующих кодонов белка Вер52/40.

Примером конструкции, в которой для экспрессии белков Вер78/68 и Вер52/40 используются два

- 13 022169 отдельных транскрипционных блока, является конструкция рУО183, описанная здесь в примерах 2 и 3. Конструкции нуклеиновых кислот для использования в способе продукции рекомбинантного парвовирусного вириона (и получения уровня экспрессии Кер52/40 в клетке насекомого, превышающего уровень экспрессии Кер78/68 на молярной основе) являются дальнейшим аспектом настоящего изобретения.

Здесь предполагается, что рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, продуцируемый указанным способом, предпочтительно является парвовирусным или ААУ-вирионом, который включает нуклеиновые кислоты рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора. Условия выращивания клеток насекомых в культуре и продукция гетерологичных продуктов в клетках насекомых в культуре широко известны в данной области техники и описываются, например, в приведенных выше ссылках на молекулярное конструирование клеток насекомых (смотри также νθ 2007/046703). Предпочтительно способ, кроме того, включает стадию очистки по сродству рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора (включающих его вирионов), используя антитело против ААУ, описанное выше.

Первый промотор, являющийся таким же сильным, как и второй промотор, или сильнее него для использования в настоящем изобретении можно определить следующим образом. Силу промотора можно определить по экспрессии, которую получают в условиях, используемых в способе настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления первый промотор или второй промотор выбирают из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10, промотора основного белка, индуцибельного промотора, или промотора беИаЕ1, или промотора Е1, или промотора любого другого позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Более предпочтительно, когда первый промотор выбирают из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10 или промотора основного белка, а вторым промотором является промотор беЬаЕ1, или промотор Е1, или промотор любого другого раннего или позднего бакуловирусного гена. Предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор р10, а вторым промотором является промотор Ро1Н или промотор 4хН§р27 ЕсКЕ+минимальный Н§р70. В другом варианте осуществления первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор 4хН§р27 ЕсКЕ+минимальный Н§р70, а вторым промотором является промотор Ро1Н. В еще одном варианте осуществления первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор р10, беЬаЕ1 или Е1. В еще одном варианте осуществления первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор беЬаЕ1 или Е1. В еще одном варианте осуществления первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор р10, а вторым промотором является промотор беЬаЕ1 или Е1. В еще одном варианте осуществления первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор Ро1Н и вторым промотором является Ро1Н. Наиболее предпочтительно, когда первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является промотор Ро1Н, а вторым промотором является беЬаЕ1.

Подразумевается, что энхансерный элемент или энхансер определяет последовательность, усиливающую активность промотора (т.е. увеличивающую степень транскрипции последовательности, расположенной 3' от промотора), которая не обладает, в противоположность промотору, промоторной активностью и может, как правило, функционировать независимо от ее местонахождения относительно промотора (т.е. 5' или 3' от промотора). Энхансерные элементы широко известны в данной области техники. Не ограничивающие примеры энхансерных элементов (или их частей), которые могли бы использоваться в настоящем изобретении, включают энхансеры бакуловируса и энхансерные элементы, обнаруживаемые в клетках насекомых. Предпочтительно, чтобы энхансерные элементы увеличивали в клетке экспрессию мРНК с гена, с промотором которого они функционально связаны по крайней мере на 25%, более предпочтительно по крайней мере на 50%, даже более предпочтительно по крайней мере на 100% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 200% по сравнению с экспрессией мРНК с гена в отсутствие энхансерного элемента. Экспрессию мРНК можно определить, например, с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Предпочтительным здесь является использование энхансерного элемента для усиления экспрессии парвовирусного белка Кер. Таким образом, в дальнейшем предпочтительном варианте осуществления первая экспрессионная кассета включает по крайней мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по крайней мере один реагирующий на экдизон элемент. Предпочтительно энхансерный элемент выбирают из группы, состоящей из Ьг1, Ьг2, Ьг3, Ьг4 и Ьг5.

В этом документе и в его формуле изобретения глагол включать или его спряжения используется в его неограниченном смысле со значением, что следующие за этим словом объекты включены, но не исключаются объекты, прямо не упомянутые. Кроме того, ссылка на элемент с использованием неопределенного артикля а или ап не исключает возможность того, что представлено более одного элемента, если только в контексте не настаивается на одном или только одном из элементов. Следовательно, неопределенный артикль а или ап, как правило, означает по крайней мере один.

Все приведенные в описании настоящего изобретения ссылки на патенты и литературные ссылки тем самым полностью включены посредством ссылки.

- 14 022169

Следующие примеры предлагаются только для иллюстративных целей и, как предполагается, не ограничивают никоим образом объем настоящего изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1 - физическая карта рУЭ183.

Фиг. 2 - соотношение чисел геномных копий гена ОКР 1629 и гена Кер в образцах бакуловирусов, отобранных при различных пассажах бакуловирусной конструкции Вас.РВЭ§ЬК (ИтаЬе е1 а1., 2002, Нит Сепе ТНег.. 13(16): 1935-1943). Число геномных копий определяли с помощью количественной ПЦР (кПЦР).

Фиг. 3 - соотношение чисел геномных копий гена ОКР 1629 и гена Кер в образцах бакуловирусов, отобранных при различных пассажах бакуловирусной конструкции рУЭ183 настоящего изобретения. Число геномных копий определяли с помощью кПЦР.

Фиг. 4 - продукция гААУ с использованием Вас.УЭ183. Понижение продукции вызвано уменьшением количества присутствующих бакуловирусов.

Фиг. 5 - кПЦР для определения числа копий ОКР в зависимости от пассажей Вас.УЭ183.

Фиг. 6 - проанализированная с помощью вестерн-блоттинга экспрессия Кер для нескольких пассажей Вас.УЭ183. 88 означает конструкцию Вас.УЭ88, которая упоминается как КЕР-АСС/РБС в \УО 2007/148971, которую используют в качестве контроля. Степень экспрессии Кер связана с концентрацией Вас.УЭ183.

Фиг. 7 - кПЦР с использованием неочищенной клеточной массы от продукций тЛЛУ1 при использовании трех различных конструкций для белков Кер: УЭ88, УЭ183 и УЭ189. 5:1:1 относится к пропорции различных бакуловирусов, используемых при продукции, 5 относится к Вас.УЭ88, ВасУЭ183 или Вас.УЭ189, первая 1 относится к Вас.УЭ88 (содержащему ген капсидного белка ААУ1), а вторая 1 относится к бакуловирусу, содержащему 1ТК-конструкцию, Вас.УЭ43.

Фиг. 8 - неочищенную клеточную массу от трех различных продукций гААУ1 подвергали очистке в колонке Ь1ата, специфичной для капсида ААУ, и в очищенных партиях определяли число копий генома и всех частиц гААУ. Деление числа всех частиц гААУ на определенное с помощью кПЦР число копий дает в результате упоминаемое здесь соотношение числа всех вирионов гААУ и числа полноценных вирионов гААУ. 5:1:1 относится к пропорции различных бакуловирусов, используемых при продукции, 5 относится к Вас.УЭ88, ВасУЭ183 или Вас.УЭ189, первая 1 относится к Вас.УЭ88 (содержащему ген капсидного белка ААУ), а вторая 1 относится к бакуловирусу, содержащему 1ТК-конструкцию, Вас.УЭ43.

Фиг. 9 - вестерн-блоттинг для анализа Кер. Образцы отбирали при нескольких пассажах бакуловируса Вас.УЭ88 или Вас.УЭ189 и выполняли вестерн-блоттинг. Количество Кер52 относительно количества Кер78 неизменно больше в случае Вас.УЭ189.

Фиг. 10 - вестерн-блоттинг для анализа Кер. Образцы отбирали при нескольких пассажах размножения бакуловируса Вас.УЭ183 и выполняли вестерн-блоттинг для анализа Кер. Количество Кер52 относительно количества Кер78 намного больше в случае Вас.УЭ183, чем в случае Вас.УЭ189 и Вас.УЭ88.

Примеры

1. Пример 1.

1.1. Материалы и методы.

1.1.1. Бакуловирусная плазмидная конструкция.

рРВЭБЬК (ИтаЬе е1 а1., 2002, выше) является экспрессионным вектором рРа81ВасЭиа1 (1пуйтодеп), включающим 2 отдельные экспрессионные кассеты для белков Кер78 и Кер52 ААУ2, в силу чего экспрессией белков Кер52 управляет промотор ро1Н, а экспрессия белка Кер78 происходит с промотора ΔΙΕ. Эту конструкцию субклонировали в рР§С10, совместимую с СепеХргекк Васи1оК1Т (Рго1е1п Баепсек Сотротайоп) плазмиду.

Кодирующую Кер52 последовательность дикого типа в кассете для экспрессии Кер52 замещают оптимизированной в отношении кодонов Кер52-кодирующей последовательностью 8ΕΟ ГО N0: 2 с получением рР§С10Кер-52СЭ.

Кодирующую Кер52 последовательность дикого типа в кассете для экспрессии Кер78 рРБС10Кер52СЭ замещают оптимизированной в отношении АТ Кер52-кодирующей последовательностью 8ΕΟ ГО N0: 3 с получением рР§С10Кер-52СЭ/78АТ.

Кодирующую Кер52 последовательность дикого типа в кассете для экспрессии Кер78 рРБС10Кер52СЭ замещают оптимизированной в отношении СС Кер52-кодирующей последовательностью 8Ε0 ГО N0: 4 с получением рР§С10Кер-52СЭ/78СС.

1.1.2. Продукция рекомбинантных бакуловирусов.

Рекомбинантные бакуловирусы, происходящие из множества вирусов ядерного полиэдроза АнЮдтарЬа саПГогшса (АсМ№У), продуцируют, используя СепеХргекк Васи1оК1Т (Рто1еш Бшепсек Согрогайоп). Трансфекцию выполняют следующим образом: в круглодонной пробирке на 14 мл 200 мкл среды СКАСЕ смешивают с 6 мкл селлфектина (1пуйтодеп) и в эппендорфной пробирке 200 мкл среды СКАСЕ смешивают с 50 мкл вирусной ДНК (Рто1еш Бшепсек) и 2 мкг плазмиды для переноса (КЕР). Содержимое эппендорфной пробирки добавляют в пробирку и осторожно перемешивают. После инкубационного пе- 15 022169 риода, составляющего 30 мин, при комнатной температуре 1300 мкл среды ОВАСЕ добавляют в смесь для трансфекции. Клетки насекомых в Т25-флаконе промывают средой ОВАСЕ и смесь для трансфекции добавляют по каплям на слой клеток. После инкубации в течение 6 ч при 28°С осторожно добавляют сыворотку 8Ε900ΙΙ, дополненную 10% ЕВ8, и Т25-флакон помещают в термостат при 28°С на 5 дней, после чего рекомбинантные бакуловирусы собирают.

1.2. Результаты.

Эффективность вновь сконструированных рР8С10Вер.

рР8С10Вер-52СИ, рР8С10Вер-52СИ/78АТ и рР8С10Вер-52СИ/78ОС сравнивают с исходными Верконструкциями рЕВИ8ЬВ ИгаЬе е! а1. (2002, выше). Все четыре конструкции последовательно пассируют до пассажа 5. Эксперименты, касающиеся продукции рекомбинантного ААУ1, проводят с использованием Вер-конструкций пассажей 2, 3, 4 и 5 в комбинации с бакуловирусом, содержащим кассету с репортерным геном между 1ТВ ААУ (ААУ-РРЬ) для экспрессии в клетках млекопитающих, и бакуловирусом, содержащим кассету с ААУ1-Сар (ААУ-Сар) для экспрессии в клетках насекомых, соответственно пассажа 2, 3, 4 и 5. Используемые здесь рекомбинантные бакуловирусы ААУ-РРЬ и ААУ-Сар описываются в \У0 2007/046703. Выходы продукции ААУ1-РРЬ определяют с помощью кПЦР. Исходный бакуловирус, разработанный ИгаЬе е! а1., 2002 (исходный ВЕР/Вас-Ю-Вас), дает в результате быстрое снижение продукции ААУ в пределах 5 пассажей. Однако бакуловирус с блоками для экспрессии ВЕР рР8С10Вер52СИ, рР8С10Вер-52СИ/78АТ и рР8С10Вер-52СИ/78ОС дает в результате стабильную продукцию ААУ в пределах по крайней мере 5 пассажей. Следовательно, воспроизводимые выходы продукции ААУ-РРЬ в пределах нескольких пассажей (например, 2-5) получают только, используя бакуловирусы, содержащие конструкции рР8С10Вер-52СИ, рР8С10Вер-52СИ/78АТ и рР8С10Вер-52СИ/78ОС.

2. Пример 2.

Ранее сообщалось, что бакуловирусные экспрессионные векторы, содержащие 2 отдельные кассеты для экспрессии белков Вер78 и Вер52 ААУ, генетически нестабильны в бакуловирусах (смотри, например, \У0 2007/148971 и КоЫЬгеипег е! а1., 2005, Мо1. ТЬег., 12(6): 1217-1225). Теперь авторы настоящего изобретения задались целью применить оптимизацию в отношении частот использования кодонов (в отношении частот использования кодонов во множестве вирусов ядерного полиэдроза АиЮдгарЬа саПГогп1са (АсМИРУ)) для только кодирующей Вер52 последовательности, но некодирующей Вер78 последовательности, чтобы внести достаточные различия между ранее идентичными частями кодирующих Вер52 и Вер78 последовательностей для уменьшения явлений рекомбинации. Теперь демонстрируется, что это в действительности было достигнуто.

2.1. Клонирование.

Плазмиду, содержащую первоначальные две кассеты для экспрессии Вер в плазмиде рР8С10 (Рго!еш 8шепсе8 Согрогайоп), рУИ42 модифицировали. рУИ42 содержит ген Вер78, управляемый промотором йеИаЕ1, и ген гер52, управляемый промотором Ро1Н, как в исходной конструкции рРВИ8ЬВ (ИгаЬе е! а1., 2002, Нит. Оепе ТЬег., 13(16): 1935-1943). Кодирующую Вер52 последовательность в рУИ42 замещали синтетической кодирующей Вер52 последовательностью, частоты использования кодонов которой были адаптированы к частотам использования кодонов во множестве вирусов ядерного полиэдроза Ан1одгарЬа саПГогшса (АсМПРУ) (смотри табл. 2 и Ьир:/Лу\у\у.ка/и5а.ог.|р/соЬоп/сщЬ1п/8Ьо№сойоп.сд1?8рес1е8=46015). Эта оптимизированная в отношении кодонов АсМЖУ кодирующая Вер52 последовательность изображена в 8ЕО ГО N0: 10. Физическая карта результирующей плазмиды рУИ183, включающей оптимизированную в отношении кодонов АсМНРУ кодирующую Вер52 последовательность, управляемую промотором Ро1Н, и кодирующую Вер78 ААУ2 последовательность дикого типа, управляемую промотором йеЬаЕ1, продемонстрирована на фиг. 1.

2.2. Результаты.

Клон рекомбинантного бакуловируса был получен с использованием плазмиды рУИ183, и полученный клон пассировали 10 раз для анализа его генетической стабильности. Генетическую стабильность конструкции анализировали с помощью кПЦР для определения числа копий генома бакуловируса и гена Вер52, вестерн-блоттинга и по эффективности бакуловируса в отношении продукции гААУ. Для сравнения в то же самое время пассировали до пассажа 7 исходный бакуловирус Вас.УИ42. В \У0 2007/148971 также ранее приведена информация о стабильности Вас.УИ42 (или Вас.ЕВИ8ЬВ) (упоминаемого как первоначальный ВЕР/Вас-!о-Вас).

2.2.1. кПЦР.

Стабильность определяли с помощью кПЦР на геномах бакуловирусов. Число копий гена, необходимого для репликации бакуловируса и используемого при продукции Вас.УИ183 из рУИ183 путем рекомбинации в 0ВЕ1629 и 0ВЕ603 между рУИ183 и каркасом бакуловируса от Рго!ет 8аепсе5, 0РР1629 (0КР), определяли с помощью кПЦР и число копий генов Вер также определяли с помощью кПЦР. Соотношение этих 2 генов должно оставаться одинаковым в течение последующих пассажей бакуловируса. На фиг. 2 для сравнения демонстрируется, что Вас.ЕВИ8ЬВ является довольно нестабильным. На фиг. 3 демонстрируется, что Вас.УИ183 является значительно более стабильным. Авторы настоящего изобретения отмечают, что эффективность 2 наборов праймеров, используемых в кПЦР, необязательно является равной, поэтому можно получить соотношение, отличное от 1. Однако более важным показателем ста- 16 022169 бильности является сохранение соотношения на относительно постоянном значении на протяжении множества пассажей. Пассаж 3 Вас.РВОЗЬК уже является субоптимальным, поскольку соотношение составляет приблизительно 0,25 и только уменьшается. Для Вас.УЭ183 соотношение вначале составляет приблизительно 0,3, но оно колеблется вокруг этого значения, что указывает на стабильную ситуацию. Результатом делеций в геноме бакуловируса является бакуловирус, который растет быстрее бакуловируса, имеющего полноразмерный геном, поэтому, когда происходит делеция, эти клоны будут перерастать другие. Изменения в способе кПЦР могут приводить к колебаниям, наблюдаемым на фиг. 3.

2.2.2. Продукция гААУ.

На фиг. 4 демонстрируется продукция гААУ с использованием стабильной конструкции Вас.УЭ183. Понижение продукции при пассажах с большими порядковыми номерами вызвано уменьшением количества бакуловирусов, использованных при продукции гААУ (смотри фиг. 5). На фиг. 5 демонстрируется кПЦР для определения числа копий ОКР Вас.УЭ183, которое напрямую связано с количеством бакуловирусов, присутствующих в образце. Число бакуловирусов, использованных при продукции гААУ, коррелирует с количеством продуцированных гААУ.

2.2.3. Вестерн-блоттинг для анализа Кер.

На фиг. 6 демонстрируется экспрессия белка Кер во время пассажей Вас.УЭ183, анализируемая с помощью вестерн-блоттинга.

3. Пример 3.

Определяли эффект уровня экспрессии Кер52 на два показателя продукции гААУ. В частности, определяли эффект уровня экспрессии Кер52 относительно уровня экспрессии белка Кер78 на 1) уровень продукции гААУ, выраженный в виде числа копий генома на 1 мл неочищенной клеточной массы, и 2) соотношение числа всех вирионов гААУ и числа полноценных вирионов гААУ (полноценными вирионами гААУ являются вирионы, включающие копию генома гААУ). Сравнивали эти показатели для трех различных Кер-конструкций гААУ, каждая из которых приводит к различным уровням экспрессии Кер52 и различным соотношениям между уровнями Кер52 и Кер78. Тремя конструкциями были рУЭ88 (упоминаемая как КЕР-АСС/Р8С в \УО 2007/148971), рУЭ183 (описанная здесь в примере 2) и рУО189 (смотри ниже).

3.1. Конструирование рУЭ189.

Конструкцию рУЭ189 реконструировали путем удаления 9 последовательностей АТС между началами трансляции генов Кер78 и Кер52 и замены кодона инициации трансляции Кер78 - АСС на СТС; см. последовательность ниже. Ва§ес1еаг (Ьейеи, Нидерланды) синтезировал новый ген и клонировал его в рУЭ88, замещая существующий ген Кер, с получением рУЭ189. Нуклеотидная последовательность Керкодирующей последовательности в рУЭ189 изображена в §ЕЦ ГО N0: 11.

3.2. Продукция гААУ.

Бакуловирусы получали с использованием конструкций УЭ88, УЭ183 и УЭ189 и их использовали для продукции гААУ1. Результатом сравнения конструкций УЭ88, УЭ183 и УЭ189 при продукции гААУ явилась большая продукция гААУ (число копий генома), определяемая с помощью кПЦР в неочищенной клеточной массе. На фиг. 7 демонстрируется, что стандартная Кер-конструкция УЭ88, которая дает в результате наименьшее количество Кер52 (фиг. 9), приводит к продукции 4х10¹⁰ копий генома/мл, измеряемой в неочищенной клеточной массе. УЭ189, которая дает в результате немного большее количество Кер52 (фиг. 9), приводит к измеряемой в неочищенной клеточной массе продукции гААУ, составляющей приблизительно 9,5х10¹⁰ копий генома/мл. УЭ183, которая дает в результате явно большее количество Кер52 (фиг. 10), приводит к измеряемой в неочищенной клеточной массе продукции гААУ, составляющей приблизительно 6х 10¹⁰ копий генома/мл.

Очень важным качественным показателем является соотношение числа всех вирионов гААУ и числа полноценных вирионов гААУ в партии. На фиг. 8 демонстрируется, что наибольшее соотношение числа всех вирионов гААУ и числа полноценных вирионов гААУ получают при использовании конструкции УЭ183, для которой демонстрируется наибольшее количество Кер52 относительно количества Кер78 при сравнении с конструкциями Вас.УЭ189 и Вас.УЭ88 на фиг. 9.

- 17 022169

3.3. Дополнительные конструкции.

Следующие конструкции конструировали, проверяли, и они являются частью настоящего изобретения.

Конструкции	Промотор(ы)	Инициирующие кодоны и кодирующие последовательности?
1) ν088	ΡοΙΗ	АСС-78---------------АТС-52------------*
2) νυΐ89	ΡοΙΗ	СТС-78-аВд'з удаленные последовательности- АТС-52------------*
3) νϋ183	Зе1Ра Ε1	АТС-78---------------------------------* + АТС—52---5Еф 10 N0: 10------------*
4) ν0196	ΡοΙΗ	СТС-78---------------АТС-52------------*
5) ν0197	ΡοΙΗ	АСС-78-аСд’з удаленные последовательности- АТС-52------------*
6) νϋ197/52	Ρ10 ΡοΙΗ	АСС-78 удаленные последовательности-АТС-52-- ---,-----,* + АТС—52 5Е0 10 N0: 10·--------
7) ν0169/52	Ρ10 ΡοΙΗ	СТС-78 удаленные последовательности-АТС-52-- ----------* + атС-52 5ЕС ΙΟ ΝΟ: 10--------
8) νθ183/10	Ρ10 ΡοΙΗ	АТС-78---------------------------------* + АТС-52 —-3Εΰ ΙΟ ΝΟ: 10— -------*
9) УЕ197/52сд	ΡοΙΗ	АСС-78-асд'а удаленные последовательности- АТС-52-ЗЕС 10 N0; 10*

1, 2, 4, 5, 8 и 9 имеют один транскрипционный блок для экспрессии белков Кер78 и Кер52. 3, 6 и 7 имеют два транскрипционных блока для экспрессии белков Кер78 и Кер52.

Приблизительная оценка количеств белков Кер78 и Кер52 и их соотношений для различных конструкций во время продукции 1ААУ (Кер78:Кер52):

78	52
1)	1	: 1
2)	1,5	:2
3)	1	:20
	5	:0,25
5>	1	: 5
6)	0,5	:30
7}	0,75	: 30
8>	5	:20
9)	1	: 10

Таблица 1

Частоты использования кодонов в §робор!ега £гид1регба на основе 127 кодирующих последовательностей (33098 кодонов)

Группы символов: [триплет] [частота: на тысячу] ([число])

ТТТ	9,7 {	320)	тст	10, 5 (	347)	ТАТ	Ю,1(	334)	ТСТ	6, 9 (	227)
ттс	26,9(	889)	тсс	13,0(	430)	ТАС	24,4(	807)	ТСС	12,4(	409)
ТТА	7, 0 (	233)	ТСА	9, 9 (	329)	ТАА	2,5 (	83)	ТСА	0,6 (	21)
ТТС	16,2(	536)	ТСС	7,2 (	237)	ТАС	0,7(	23)	тес	12,7(	420)
стт	9, 9 {	327)	сст	14,3(	472)	САТ	8, 7 (	289)	сст	15, 9 (	525)
СТС	17,0(	564)	ссс	13,7 (	453)	САС	16,2 (	535)	ссс	15, 1 (	500)
СТА	6,8(	226)	ССА	13,4(	445)	САА	16,2(	535)	ССА	5,3 (	175)
СТС	24,5(	810)	ссс	7,7(	255)	САС	21,8(	723)	ссс	3,6 (	118)
АТТ	15, 5 (	512)	АСТ	13,6(	451)	ААТ	12,8(	424)	АСТ	8,1(	267)
АТС	28, 9 (	958)	АСС	17,2 (	569)	ААС	27,8(	921)	АСС	Ю,7(	354)
АТА	7,6(	253)	АСА	11,91	393)	ААА	26,7 (	883)	АСА	11,8 (	392)
АТС	27, 3 (	902)	АСС	8,8 (	290)	ААС	53, 1 (	1757)	АСС	13,5 (	446)
СТТ	14,7(	488)	ССТ	26,3(	872)	САТ	21,8(	723)	ест	22,0 (	728)
СТС	20,4(	676)	ССС	21,1 (	697)	САС	32,3(	1070)	ссс	19,9(	659)
СТА	12,3(	406)	ССА	12,4(	411)	САА	27,2 (	901)	ССА	18,2 (	603)
СТС	24,8(	822)	ССС	12,2(	404)	САС	34,1(	1128)	ссс	4,3(	141)

Кодирующие триплеты, включающие СС, - 50,58%, 1-я буква СС - 53,42%, 2-я буква СС - 39,40%, 3-я буква СС - 58,93%.

- 18 022169

Таблица 2

Частоты использования кодонов во множестве вирусов ядерного полиэдроза Аи1одгарЬа саШогтса (АсМЛРУ) на основе

277 кодирующих последовательностей (77487 кодонов)

Группы символов: [триплет] [частота: на тысячу] ([число])

иии	37, 6(	2916)	иси	10,3 (	799)	или	22,2(	1721)	иси	11,2(	865)
иис	11,3 (	879)	исс	7,2 {	556)	САС	26, 1 1	2019)	исс	12,5(	967)
иид	20, 6 1	1594)	оса	7,2(	557)	илА	2,7(1	209)	иел	0,5(	38)
иис	34,3(	26591	исс	14, 2 (	1100}	иле	0,4 ( :	29}	исс	7,5 (	579)
сии	8,2 (	637)	сси	8,2 (	636}	САО	10,2(	789)	сси	8,1 (	630)
сис	7,2 (	555)	ССС	11,3(	879)	САС	12,8(	991)	ССС	13, 2 (	1024)
сил	8,2 (	632)	ССА	8, 0 (	621)	САА	26,6(	2063}	ССА	7,4 (	576)
сос	13, 0 (	1007)	ССС	12, 7 (	985)	САС	11,5(	892)	ССС	3, 9 (	304}
лии	31,2 (	2416)	леи	12, 4 (	962)	ААС	34,5(	2671)	асу	10, 3 (	800)
лис	14,3 (	1111)	АСС	13,5(	1043)	ААС	44,3(	3433)	АСС	16,1(	1251)
АСА	19, 7 (	1527)	АСА	12,4 (	961}	ААА	52,4 (	4057)	АСА	9, 7 (	748)
лис	26, 7 (	2071)	АСС	18,5 (	1434)	ААС	18,3 (	1418)	АСС	4, 0 <	309)
сии	16,5(	1277)	сси	11,0 (	850)	САС	25,4 (	1968)	сси	7, 8 (	603)
сис	11,7(	904}	ССС	15,4 (	1196)	САС	33,3 (	2619)	ССС	16,1 (	1251)
сил	12,6(	973}	ССА	10,0(	771)	САА	37,2 (	2885)	ССА	7,0(	541)
сис	25,7 (	1990)	ССС	16,3(	1261)	САС	16,2 1	1253)	ССС	2, 9(	225)

Кодирующие триплеты, включающие ОС, - 41,86%, 1-я буква ОС - 43,60%, 2-я буква ОС 32,68%, 3-я буква ОС - 49,29%.

- 19 022169

Список последовательностей <110> АтзбепЗап Мо1еси1аг ТЬегареиПсз Β.ν.

<120> Бакуловирусные векторы, включающие повторные колирующие последовательности с дифференциальными неоднозначностями колонов <130 Р6016639РСТ <150 ЕР 07113257.5 <151> 2007-07-26 <150> 05 60/952,061 <151> 2007-07-26 <160> 11 <170> Патент в версии 3.3 <210> 1 <211> 1194 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2 <220>

<221> различный признак <223> дикий тип <400> 1

зъддадс^дд	Ъсдддсддсь	сд^ддасаад	дддаг^ассИ	сддадаадса	д^ддаЬссад	60
даддассадд	ссЪсаЪасаЕ.	сгссЫсааЪ	дсддссЬсса	ас£сдсддг.с	ссаааЬсаад	120
дсЬдссЪ^дд	асааСдсддд	ааада££31д	адссЪдасса	ааассдсссс	сдас^ассъд	180
дИдддссадс	адсссдЪдда	ддасэгСХсс	адсаассдда	Ъ^^а^ааааН	ЪЪЪддаас^а	240
аасдддСасд	аЪссссаат:а	Ьдсддс£Ссс	д£с£Ь£сСдд	даСдддссас	дааааад^Ьс	300
ддсаададда	асасса£с£д	дсгдъ^ддд	сс£дсаас£а	ссдддаадас	саасаЮдсд	360
даддссаСад	сссасасХдЪ	дссс^ЛсСае	ддд£дсд£аа	асЬддассаа	Сдадаас^^С.	420
сссЪЪсаасд	асЪдедесда	саадаеддед	а^сИддСддд	аддаддддаа	даЪдассдсс	480
аадд£.сдЪдд	адИсддссаа	адссаСЪсъс	ддаддаадса	аддедсдсд£	ддассадааа	540
£дсаадИсс1:	сддсссада!:	адасссдас1:	сссдЪдаЪсд	Ссасс1:ссаа	сассааса1:д	600
£дсдссд£да	ΐΐ-дасдддаа	сЪсаасдасс	СЛсдаасасс	адсадссдт	дсаадассдд	660
аЬдЪЪсаааЪ	£Лдаас£сас	ссдссдСсСд	даЪсаЪдасС	££дддаадд£	сассаадсад	720
даадюааад	асыеъессд	дЪдддсааад	даЪсасдЪдд	Г£даддъдда	дса£даа££с	780
гасд^саааа	адддЪддадС	саадаааада	сссдссссса	дСдасдсада	Ъа^аадИдад	840
сссааасддд	ГдсдсдадСс	адЪ^дсдсад	ссаЪсдасдЬ	садасдсдда	адс££сда£с	900
аас£асдсад	ассдсЬасса	ааасааа1:д£	сс1:сд£сасд	£дддса£даа	Сс£.даъдсСд	960
СМ;ссс£дса	дасааНдсда	дадаа£даа£	садааЪЪсаа	аЪаЪсЪдсМ:	сасХсасдда	1020

- 20 022169

садааадасР	дрррададрд сРРРсссдРд РсадааРсЬс аасссдЬРРс СдрсдОсааа	1080
ааддсдра!с	адааасрдрд срасаррсар сарарсардд даааддрдсс адасдсррдс	1140
асрдссрдсд	аРсРддРсаа рдрддаΐ11д дэРдасРдса РсРРРдааса аРаа	1194

<210 2 <211> 1194 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2 <220>

<221> различный признак <223> оптимизированный для 5Γ9 <400> 2

а£ддадс!дд	£ддд£Сддс£	ддЪддасаад	дд^а^сассЪ	ссдадаадса	д£дда£ссад	60
даддассадд	сСЪссИаса^	с£сс£Ъсаас	дсЪдсЪЪсса	ас!сссд£С.с	ссада^саад	120
дсСдс^сЪдд	асаасдсИдд	НаадаЪсаИд	£ссс£дасса	адассдс^сс	£дас£асс£д	180
дСдддЬсадс	адссСд1:дда	ддасаСсЬсс	£ссаассд£а	£сСасаадаС	ссСддадсИд	240
аасддХЛасд	асссСсадЪа	сдсЪдс^Ъсс	дЪдеессЪдд	д££дддсЪас	саадаадЫ:с	ЗСО
ддЪаадсдСа	асасса1:с11д	дсЪдЪ^сддЪ	ссЕдсСасса	ссддЪаадас	саасаИсдсИ	360
даддсЪаЕсд	съсасассдЪ	дссМЛс^ас	ддСГдсдСда	ас1:ддассаа	сдадаасигс	420
сс£££саасд	асЪдсдЪдда	саадаЪддЪд	аГсЪддГддд	аддадддЬаа	даСдассдсь	480
ааддЕддИдд	адИссдс^аа	ддс^аЪссЪд	ддИддЁЛсса	адд£дсд1дъ	ддассадаад	540
ЪдсаадИсс^	ссдсссадаи	сдасссСасс	ссЪдЪдаЪсд	£дассЕссаа	сассаасаид	600
ЪдсдсЪдИда	Ьсдасдд1;аа	с1:ссассасс	Шсдадсасс	адсадссЪсЪ	дсаддассд!	660
а£д££саад!	Ъсдадссдас	ссд^сдйсЬд	дассасдасЬ	ЪсддЪааддЪ	дассаадсад	120
дадд^даадд	асСЛс^Сссд	£Лдддс£аад	дассасд^дд	ЪддаддЬдда	дсасдадЪСс	780
сасд^даада	аддд^ддЬдс	£аадаадсдС	сс£дс£сс££	ссдасдс^да	саЬсСссдад	840
ссРаадсдЪд	ИдсдИдадСс	сдъддсъсад	ссгрссасс!	ссдасдс^да	ддсРИссаЪс	900
аасгасдс^д	ассди^асса	даасаад1:дс	Ссссд£сасд	едддъаъдаа	ссъдаЕдсИд	960
ИзсссИ^дсс	дИсад^дсда	дсдЁаЪдаас	садаасъсса	асассХдсиЪ	сасссасдд^	1020
садааддас£	дссиддадЪд	сс£сссЬд!:д	СссдадЪссс	адсс!д1:д£с	сдЪддЪдаад	1080
ааддсЪСасс	адаадс£д£д	сЪасагссас	сасагсаидд	дНааддЪдсс	ЪдасдсСЪдс	1140
ассдеъъдсд	ассгдд^даа	сдСддассИд	дасдас^дса	^сСЪсдадса	дЬаа	1194

<210> 3 <211> 1194 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2

- 21 022169 <220>

<221> различный признак <223> оптимизированный в отношении АТ <400 3

а^ддааълад	ЪаддаИддЪЪ	адгаданааа	ддаа^аасас	садаааааса	аЪдда^асаа	60
даадзЪсаад	са^саНаСаИ	аъсасъъааъ	дсадса1:саа	аСЛсаадаИс	асаааЪаааа	120
дсадса!£ад	а£аа£дсадд	ааааа£аа£д	Ссагсаасаа	ааасадсасс	адаЬ£аЬ£Ьа	180
д^аддасаас	аассадЪада	ада^аСаСса	Ъсааа^адаа	£а£а£аааа£	а£1адааЬ£а	240
ааЪдда1а£д	а^ссасааЪа	ЪдсадсаЪса	дгаЪЪМ^ад	да£дддсаас	аааааааЪ	300
ддааааадаа	а^асааНаЪд	диъа^съдда	ссадсаасаа	саддааааас	аааЬа^адса	360
даадсааЪад	сасаЪасадЪ	ассаЪГЛЪаъ	ддаЪдИдЪаа	аИ1:ддасааа	ЪдааааНЪШ:	420
ссаСМаасд	апдъдгада	ЪааааСддЪа	аЪаЪддСддд	аадааддааа	ааъдасадса	460
ааад£ад£ад	аа^садсааа	адсаа£а£Иа	ддадда£саа	аад^аададЬ	ада^сааааа	540
£д!:ааа£са£	садсасаааН	адаИссааса	ссадсааЪад	ЪаасаЪсааа	Иасааа£а£д	600
Ьд^дсадЪаа	Ьадасддааа	1Ссаасааса	тдаасаис	аасаассаЪ!	асаадаЪада	660
аЬд£ЪЪааа£	ЫдааНаас	аадаадаЪИа	да^сасдаъг	Ълддаааади	аасаааасаа	720
даад^аааад		аЪдддсаааа	даЪсаЪд^ад	£адаад£ада	асаЬдааМИ	7 80
£а£д£ааааа	ааддаддадс	аааааааада	ссадсасса1;	садаЪдсада	СаСаСсадаа	840
ссааааадад	Наададаа^с	адИадсасаа	ссаЪсаасаЪ	садаЪдсада	адсаЪсаа^а	900
аа£Ъа£дсад	аЪадаЪаЪса	аааЪааа^дъ	ЬсаадасаЪд	ЪаддааЬдаа	еьеааЪдЪЪа	960
«ЪссаСдЪа	дасааЬдИда	аадааъдааъ	сааааъссаа	а£аъасд££Ъ	ЬасасаЬдда	1020
сааааада£1;	дЪСЪадааъд	ИЕЪссадСа	СсадааСсас	аассадЪаЪс	адСадЪаааа	1080
ааадсаЬаъс	аааааССаСд	Ь^аЬаъасаи	са£а£ааСдд	даааадЕасс	адаСдса^дС	1140
асадсаСдЪд	аСЛЪадСааа	ЪдСадаСЬСа	даСда££д£а	сасс^дааса	аЬаа	1194

<210> 4 <211> 1194 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2 <220>

<221> различный признак <222> (1).. (1194) <223> Оптимизированный в отношении ОС

<400> 4
а£ддадс£дд	гддддрддсе	ддеддасаад	ддда£сасда	дсдадаадса	д^ддаСссад	60
даддассадд	сдадсЬасаС	садсьссаас	дсддсдадса	асадссддад	ссадаСсаад	120
дсддсдседд	асаасдсддд	даадаЬсаСд	здссЪдасда	адасддсдсс	ддасъассЪд	180

- 22 022169

дНддддсадс	адссддЬдда	ддасаНсадс	адсаассдда	НсЬасаадаЬ	ссЬддадсЬд	240
аасдддНасд	асссдсадНа	сдсддсдадс	днднЬссндд	ддндддсдас	даадаадННс	300
дддаадсдда	аеасдансПд	дсНдРНсддд	ссддсдасда	сддддаадас	даасаНсдсд	360
даддсдаНсд	сдсасасддн	дссдЬПсПас	ддудсдьда	асНддасдаа	сдадаасННс	420
ссдСНсаасд	асЬдсдСдда	саадаНддЬд	аРсРддСддд	аддаддддаа	даНдасддсд	430
ааддНддНдд	ададсдсдаа	ддсдаНссНд	ддддддадса	аддЬдсдддН	ддассадаад	540
Ндсаададса	дсдсдсадаь	едасссдасд	ссддндансд	Ндасдадсаа	сасдаасаНд	600
НдсдсддНда	Нсдасдддаа	садсасдасд	ЬЬсдадсасс	адсадссдсь	дсаддассдд	660
аНдННсаадН	гсдадсЬдас	дсддсддсНд	дассасдасН	ЬсдддааддН.	дасдаадсад	720
даддЬдаадд	асННсьНссд	дрдддсдаад	дассасдрдд	НддаддНдда	дсасдадНЬс	780
НасдЬдаада	аддддддддс	даадаадсдд	ссддсдссда	дсдасдсдда	сансадсдад	840
ссдаадсддд	Ндсдддадад	сдьддсдсад	ссдадсасда	дсдасдсдда	ддсдадсаЬс	900
аасЬасдсдд	ассддЬасса	даасаадСдс	адссддсасд	НддддаНдаа	ссНдаНдсЬд	960
нНсседЬдсс	ддеадНдсда	дсддаЬдаас	садаасадсэ	асаьсндснн	сасдсасддд	1020
садааддасН	дссЬддадНд	сННсссддНд	адсдададсс	адссддидад	сднддьдаад	1080
ааддсдНасс	адаадсндЬд	сНасаНссас	сасаНсаНдд	ддааддПдсс	ддасдсдрдс	1140
асддсдНдсд	ассНддНдаа	сдЬддассНд	дасдасНдса	НсСНсдадса	дЬаа	1194

<210 5 <211> 1194 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2

<220> <221> <222> <223>

Кодирующая белок

последовательность

<1) .. Кер5;

. (1194> >

<400>

5

аНд

дад

сНд

дьс

ддд

Сдд

СН.С

дьд

дас

аад

999

аЬЬ

асе

Сед

дад

аад

43

Мег

СЬи

Ьеи

УаЬ

61у

Тгр

Ьеи

Уэ1

Азр

Ьуз

СЬу

Ые

ТКг

Бег

СЬи

Ьуз

1

5

10

15

сад

Сдд

аНс

сад

дад

дас

сад

дсс

пса

Нас

аНс

НОС

нес

аан

дед

дсс

96

СЬп

Тгр

11е

СЬп

С1и

Азр

СЬп

А1а

Зег

Туг

1Ье

Зег

РЬе

Азп

АЬа

АЬа

20

25

30

Нсс

аас

ьсд

едд

Ссс

саа

аЬс

аад

дсь

дсс

пд

дас

аас

дед

дда

аад

144

Зег

Азп

Зег

Агд

5ег

СЬп

11е

Дуз

А1а

А1а

Ьеи

Азр

Азп

АЬа

СЬу

Ьуз

35

40

45

аПН

аНд

аде

егд

асе

ааа

асе

дсс

ссс

дас

Нас

сод

дед

ддс

сад

сад

192

Не

мен

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьуз

ТЬг

А1а

Рго

Азр

Туг

Ьеи

УаЬ

СЬу

СЬп

СЬп

50

55

60

- 23 022169

240

ссс Рго 65

дгд дад

дас Азр

аГГ Не

Гее Зег 70

аде 5ег

ааГ Азп

едд Агд

аГГ Не

ГаГ Туг 75

ааа Ьуз

аГС 11е

СГд Ьеи

даа С1и

сСа Ьеи 80

Уа!

С1и

аас

ддд

Гас

дас

ссс

саа

ГаГ

дед

дсб

Гее

дгс

ГГГ

еГд

дда

гдд

дсс

Азп

С1у

Туг

Азр

Рго

ст

Туг

А1а

А1а

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

С1у

Тгр

А1а

85

90

95

асд

ааа

аад

ГГс

ддс

аад

адд

аас

асе

аГс

гдд

еГд

ГГГ

ддд

ССГ

дса

ТЬг

Ьуз

Ьуз

РЬе

С1у

Ьуз

Агд

Азп

ТЬг

Пе

Тгр

Ьеи

РЬе

О1у

Рго

А1а

100

105

но

асб

асе

ддд

аад

асе

аас

аГс

дед

дад

дсс

ага

дсс

сас

асС

дгд

ссс

ТЬг

ТЬг

С1у

Ьуз

ТЬг

Азп

11е

А1а

01и

А1а

Пе

А1а

Н15

ТЬг

Уа!

Рго

115

120

125

66с

Гас

ддд

Где

дГа

аас

Ьдд

асе

ааб

дад

аас

ггг

ссс

СГС

аас

дас

РЬе

Туг

б1у

Суз

Уа!

Азп

Тгр

ТЬг

Аап

С1и

Азп

РЬе

Рго

РЬе

Азп

Азр

130

135

140

бдб

дГс

дас

аад

агд

дбд

аГс

Гдд

бдд

дад

дад

ддд

аад

аГд

асе

дсс

Суз

ν^ι

Азр

Ьуз

Мег

νβΐ

Не

Тгр

Тгр

С1и

С1и

С1у

Ьуз

Мег

ТЬг

А1а

145

150

155

160

аад

дГс

дгд

дад

Гсд

дсс

ааа

дсс

аГГ

сГс

дда

дда

аде

аад

дгд

еде

Ьуз

Уа1

Уа!

С1и

Зег

А1а

Ьуз

А1а

Не

Ьеи

С1у

О1у

Зег

Ьу5

Уа1

Агд

165

170

175

дбд

дас

сад

ааа

Где

аад

Гее

Гсд

дсс

сад

аГа

дас

сед

асГ

ссс

дгд

Уа1

А$р

С1п

Ьуз

Суз

Ьуз

Зег

Зег

А1а

ст

Не

Азр

Рго

ТЬг

Рго

Уа1

180

135

190

абс

дГс

асе

гее

аас

асе

аас

аГд

Где

дсс

дгд

ЭГГ

дас

ддд

аас

Гса

Не

Уа!

ТЬг

Зег

Азп

ТЬг

Азп

Мег

Суз

А1а

Уа1

Не

Азр

С1у

Азп

5ег

195

200

205

асд

асе

ПС

даа

сас

сад

сад

сед

ггд

саа

дас

едд

аГд

ГГС

ааа

ГГГ

ТЬг

ТЬг

РЬе

С1и

Нгз

С1п

01п

Рго

Ьеи

ет

Азр

Агд

МеГ

РЬе

Ьуз

РЬе

210

215

220

даа

сГс

асе

еде

едГ

еГд

даГ

саг

дас

ГГГ

ддд

аад

дгс

асе

аад

сад

С1и

Ьеи

ТЬг

Агд

Агд

Ьеи

Азр

нт

Азр

РЬе

С1у

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьуз

ст

225

230

235

240

даа

дгс

ааа

дас

ГГГ

ГГС

едд

Гдд

дса

аад

даГ

сас

дГд

дГГ

дад

дгд

С1и

Уа!

Ьуз

Азр

РЬе

РЬе

Агд

Тгр

А1а

Ьуз

Азр

ΗΪΞ

Уа1

Уа1

С1и

Уа1

245

250

255

«ад

саг

даа

ГГс

гас

дгс

ааа

аад

ддГ

дда

дсс

аад

ааа

ада

ссс

дсс

Й1и

Н25

С1и

РЬе

Туг

Уа1

ьуз

Ьуз

С1у

61у

А1а

Ьуз

Ьуз

Агд

Рго

А1а

260

265

270

ссс

адГ

дас

дса

даГ

аГа

адГ

дад

ссс

ааа

едд

дгд

еде

дад

Гса

дГГ

Рго

£ег

Азр

А1а

Азр

11е

Зег

С1и

Рго

Ьуз

Агд

Уа!

Агд

С1и

5ег

Уа1

275

280

285

дед

сад

сса

Сед

асд

Гса

дас

дед

даа

деГ

Гсд

асе

аас

гас

дса

дас

А1а

61п

Рго

Зег

ТЬг

5ег

Азр

А1а

С!и

А1а

Зег

Не

Азп

Туг

А1а

Азр

290

295

300

еде

гас

саа

азе

ааа

ГдГ

ГСГ

едГ

сас

дгд

ддс

асд

ааг

еГд

агд

сед

Агд

ТуГ

ст

Азп

Ьуз

Суз

Зег

Агд

ΗΪ3

Уа1

С1у

МеГ

Азп

Ьеи

МеГ

Ьеи

305

310

315

320

288

336

384

432

480

528

6

624

672

720

768

816

864

912

960

- 24 022169

ььь РЬе

ссс Рго

еде Суз

ада Агд

саа С1п 325

Ьдс Суз

дад С1и

ада Агд

аьд Ме£

ааъ Азп 330

сад С1п

аас Азп

Сса 5ег

ааС Азп

аСс Пе 335

Сдс Суз

1008

ььс

асЬ

сас

дда

сад

ааа

дас

Идг

рра

дад

рдс

НРС

ссс

дЬд

Сса

даа

1056

РНе

ТЬг

Шз

С1у

С1п

Ьуз

Азр

Суз

Ьеи

б!и

Суз

РНе

Рго

Уа1

5ег

С1и

340

345

350

ЬсР

саа

ссс

дГ.Г.

ЬсС

дЬс

<?1с

ааа

аад

дед

рас

сад

ааа

сРд

Сдс

Нас

1104

Зег

С1п

Рго

Уа1

Зег

Уа1

Уа1

Ьуз

Ьуз

А1а

Туг

С1п

Ьуз

Ьеи

Суз

Туг

355

360

365

аНР

саЬ

саЬ

аЬс

аЬд

дда

аад

дьд

сса

дас

дсС

Сдс

асС

дсс

Сдс

даР

1152

Не

ΗΪ5

Нхз

Не

Μθΐ

С1у

Ьуз

Уа1

Рго

Азр

А1а

Су5

ТНг

А1а

Суз

Азр

370

375

380

сбд

дьс

ааЬ

дед

да 6

ЬЬд

дар

дас

бде

аЬс

ίίί

даа

саа

Саа

1194

Ьеи

Уа1

Азп

Уа1

Азр

Ьеи

Азр

Азр

Суз

Пе

РНе

С1и

С1п

385 390 395 <210> 6 <211> 397 <212> Белок

<213> ,	ален оа с социиров ан ный	вирус 2
<400>	6
Мег. С1и 1	Ьеи Уа1 С1у Тгр Ьеи 5	Уа1 Азр Ьуз С1у 11е ТЬг Зег С1и Ьуз 10 15
С1п Тгр	11е С1п С1и Азр С1п 20	А1а Зег Туг 11е Зег РЬе Азп А1а А1а 25 30
£ег Азп	5ег Агд Зег С1п Не 35	Ьуз А1а А1а Ьеи Азр Азп А1а С1у Ьуз 40 45
11е Мер 50	5ег Ьеи ТНг Ьуз ТНг 55	А1а Рго Азр Туг Ьеи Уэ1 С1у 61п С1п 60
Рго Уа1 65	С1и Азр 11е Зег Зег 70	Азп Асд 11е Туг Ьуз 11е Ьеи С1и Ьеи 75 80
Азп С1у	Туг Азр Рго С1п Туг 85	А1а А1а Зег Уа1 РЬе Ьеи С1у Тгр А1а 90 95
ТЬг Ьуз	Ьуз РНе С1у Ьуз Агд 100	Азп ТЬг 11е Тгр Ьеи РЬе С1у Рго А1а 105 110
ТЬг ТЬг	С1у Ьуз ТНг Азп 11е 115	А1а С1и А1а 11е А1а ΗΪ3 ТЬг Уа1 Рго 120 125
РЬе Туг 130	С1у Суз Уа1 Азп Тгр 135	ТЬг Азп С1и Азп РЬе Рго РЬе Азп Агр 140

- 25 022169

- 26 022169 <210> 7 <211> 1876 <212> ДНК <213> аденоассоциированный вирус 2 <220>

<221> Кодирующая белок последовательность <222> (11)..(1876) <223> Нер78 <400> 7 сдсадссдсс абд ссд ддд ббб бас дад абб дбд абб эад дбс ссс аде 49

Меб Рго С1у ΡΪΊΟ Туг С1и Не Уа! Не Дув Уа1 Рго 5ег 15 10

дас Азр

СЕЕ Ьеи 15

дас Азр

дад С1и

саЕ Н1з

сЕд Ьеи

ссс Рго 20

ддс С1у

аЕЕ 11с

ЕсЕ 5ег

дас Азр

аде 5ег 25

ЕЕЕ РНе

дЕд Уа1

аас Азп

Едд Тгр

97

дЕд

дсс

дад

аад

даа

Едд

дад

ЕЕд

ссд

сса

даЕ

ЕсЕ

дас

аЕд

даЕ

сЕд

145

Уа1

А1а

С1и

Ьу5

О1и

Тгр

С1и

Ьеи

Рго

Рго

Аэр

Бег

Азр

МеЕ

Азр

Ьеи

30

35

40

45

ааЕ

сЕд

аЕЕ

дад

сад

дса

ссс

сЕд

асе

дЕд

дсс

дад

аад

сЕд

сад

сдс

193

Азп

Ьеи

Не

С1и

С1п

А1а

Рго

Ьеи

ТНг

Уа1

А1а

С1и

Ьуз

Ьеи

С1п

Агд

50

55

60

дас

ЕЕЕ

сЕд

асд

даа

бдд

сдс

сдЕ

дЕд

адЕ

аад

дсс

ссд

дад

дсс

сЕЕ

241

Азр

РНе

Ьеи

ТНг

<31и

Тгр

Агд

Агд

Уа1

5ег

Ьу$

А1а

Рго

С1и

А1а

Ьеи

65

70

75

ЕЕс

ЕЕЕ

дЕд

саа

ЕЕЕ

дад

аад

дда

дад

аде

Еас

ЕЕс

сас

аЕд

сас

дЕд

289

РЬе

РНе

7а1

С1п

РНе

С1и

Ьуз

О1у

С1и

5ег

Туг

РНе

Н1з

МеЕ

ΗΪ5

Уа1

80

85

90

СЕС

дЕд

даа

асе

асе

ддд

дЕд

ааа

Есс

аЕд

дЕЕ

ЕЕд

дда

сдЕ

ЕЕС

сЕд

337

Ьеи

Уа1

С1и

ТНг

ТНг

С1у

Уа1

Ьуз

5ег

МеЕ

Уа1

Ьеи

С1у

Агд

РНе

Ьеи

95

100

105

адЕ

сад

аЕЕ

сдс

даа

ааа

сЕд

аЕЕ

сад

ада

аЕЕ

Еас

сде

ддд

аЕс

дад

385

Зег

С1п

Пе

Агд

61и

Ьуз

Ьеи

Не

С1п

Агд

11е

Туг

Агд

С1 у

Не

С1и

110

115

120

125

ссд

асЕ

ЕЕд

сса

аас

бдд

ЕЕС

дед

дЕс

аса

аад

асе

ада

ааЕ

ддс

дсс

433

Рго

ТНг

Ьеи

Рго

Азп

Тгр

РНе

А1а

Уа1

ТНг

Ьуз

ТНг

Агд

Азп

С1у

А1а

130

135

140

дда

ддс

ддд

аас

аад

дбд

дЕд

даЕ

дад

Еде

Еас

аЕс

ссс

ааЕ

Еас

ЕЕд

481

С1у

С1у

С1у

Азп

Ьуз

Уа1

Уа1

А5р

С1и

Суз

Туг

Пе

Рго

Азп

Туг

Ьеи

145

150

155

СЕС

ссс

ааа

асе

сад

ссб

дад

сЕс

сад

бдд

дед

Едд

асЕ

ааЕ

аЕд

даа

529

Ьеи

Рго

Ьуз

ТНг

С1п

Рго

С1и

Ьеи

С1п

Тгр

А1а

Тгр

ТНг

Азп

МеЕ

С1и

160

165

170

сад

ЕаЕ

ЕЕа

аде

дсс

бдб

ЕЕд

ааЕ

СЕс

асд

дад

сдЕ

ааа

едд

ЕЕд

дбд

577

С1п

Туг

Ьеи

Зег

А1а

Сув

Ьеи

Азп

Ьеи

ТНг

б1и

Агд

Ьуз

Агд

Ее и

Уа1

175

180

185

дед

сад

саЕ

сЕд

асд

сас

дбд

Есд

сад

асд

сад

дад

сад

аас

ааа

дад

625

А1а

С1п

ΗΪ3

Ьеи

ТНг

ΗΪΞ

Уа!

Зег

С1п

ТНг

С1п

С1и

С1п

Азп

Ьуз

С1и

190

195

200

205

- 27 022169

673

ааб Азп

сад С1п

ааи Азп

ссс Рго

ааП Азп 210

ПСП Зег

дан Азр

дед А1а

сед Рго

днд Уа1 215

аПс Не

ада Агд

Пса Зег

ааа Ьуз

асН ТЬг 220

Пса 5ег

дсс

адд

Нас

аПд

дад

еНд

дне

ддд

Пдд

сНс

днд

дас

аад

ддч

аН Н

асе

А1а

Агд

Туг

МеП

С1и

Ьеи

ν$1

С1у

Тгр

Ьеи

νβΐ

Аэр

Ьуз

С1у

Не

ТЬг

225

230

235

Сед

дад

аад

сад

Пдд

аПс

сад

дад

дас

сад

дсс

Пса

Пас

аНс

Псе

ПНС

Зег

С1и

Ьуз

С1п

Тгр

Не

С1п

С1и

Азр

С1п

А1а

Зег

Туг

Не

Зег

РЬе

240

245

250

аас

дед

дсс

Псс

аас

Нед

едд

Псе

саа

аНс

аад

дсН

дсс

ппд

дас

аан

Азп

А1а

А1а

Зег

Агп

Зег

Агд

Зег

С1п

11е

Ьуз

А1а

А1а

Ьеи

Азр

Азп

255

260

265

дед

дда

аад

а ПН

аПд

аде

еНд

асН

ааа

асе

дсс

ссс

дас

Пас

сПд

днд

А1а

С1у

Ьуз

Не

МеП

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьуэ

ТЬг

А1а

Рго

Азр

Туг

Ьеи

νβΐ

270

275

280

285

ддс

сад

сад

ссс

дгд

дад

дас

аПП

Нее

аде

ааП

едд

анп

ПаН

ааа

аНН

С1у

С1п

С1п

Рго

Уа1

С1и

Азр

Не

Зег

Зег

Азп

Агд

Не

Туг

Ьу5

Не

290

295

300

ССд

даа

сПа

аас

ддд

нас

дан

ссс

саа

Пан

дед

дсН

Псе

дне

нпп

енд

Ьеи

Ии

Ьеи

Азп

Иу

Туг

Аэр

Рго

ехп

Туг

А1а

А1а

Зег

Оа1

РЬе

Ьеи

305

310

315

дда

Пдд

дсс

асд

ааа

аад

пне

ддс

аад

адд

аас

асе

апс

пдд

спд

пнн

С1у

Тгр

А1а

ТЬг

Ьуз

Ьуз

РЬе

С1у

Ьуз

Агд

Азп

ТЬг

Не

Тгр

Ьеи

рЬе

320

325

330

ддд

ссИ

дса

асн

асе

ддд

аад

асе

аас

анс

дед

дад

дсс

апа

дсс

сас

С1у

Рго

А1а

ТЬг

ТЬг

С1у

Ьуз

ТЬг

Азп

Не

А1а

С1и

А1а

11е

АЗ а

Нгз

335

340

345

асС

дПд

ссс

ПНС

пас

ддд

Ндс

дНа

аас

пдд

асе

аап

дад

аас

НПП

ССС

ТЬг

Уа1

Рго

РЬе

Туг

С1у

Суз

ν&1

Азп

Тгр

ТЬг

Азп

С1и

Азп

РЬе

Рго

350

355

360

365

16с

аас

дас

дне

дас

аад

аНд

днд

анс

пдд

пдд

дад

дад

ддд

аад

РЬе

Азп

Азр

Суз

Уа1

Азр

Ьуз

МеН

Уа1

Не

Тгр

Тгр

С1и

С1и

С1у

Ьуз

370

375

330

абд

асе

дсс

аад

дне

днд

дад

Нед

дсс

ааа

дсс

анп

сне

дда

дда

аде

Мес

ТЬг

А1а

Ьуз

Уа1

Уа1

С1и

Зег

А1а

Ьу5

ΑΪ а

Не

Ьеи

С1у

С1у

Зег

385

390

395

аад

дПд

еде

дьд

дас

сад

ааа

ндс

аад

Псе

Нед

дсс

сад

апа

дас

сед

Ьуз

νβΐ

Агд

Уа1

Азр

С1п

Ьуз

Суз

Ьуз

Зег

Зег

А1а

С1п

Не

Азр

Рго

400

405

410

асе

ссс

дЬд

аНс

дне

асе

Псе

аас

асе

аас

аНд

Ндс

дсс

днд

анн

дас

ТЬг

Рго

Уа1

Не

7а1

ТЬг

Зег

Азп

ТЬг

Азп

МеП

Суз

А1а

Уа1

Не

Азр

415

420

425

ддд

аас

пса

асд

асе

ННс

даа

сас

сад

сад

сед

ПНд

саа

дас

едд

аПд

С1у

Азп

Зег

ТЬг

ТЬг

РЬе

С1и

ΗΪ3

С1л

С1п

Рго

Ьеи

С1п

Азр

Агд

МеН

430

435

440

445

Ыс

ааа

ннп

даа

сне

асе

еде

едн

еНд

даП

сап

дас

нпн

ддд

аад

дне

РЬе

Ьуз

РЬе

С1и

Ьеи

ТЬг

Агд

Агд

Ьеи

Аар

Н13

Азр

РЬе

С1у

Ьуз

Уа1

450

455

460

721

769

817

865

913

961

1009

1057

1105

1153

1201

1249

1297

1345

1393

- 28 022169 асе аад сад даа дГс ааа дас ГГГ ГГс едд Гдд дса аэд даг сас дгд ТНг Ьуз 01п С1и Уа1 Ьуз Азр РНе РЬе Агд Тгр Д1а Ьув Азр Ηίε νβΐ

465 470 475

1441 дГГ дад дгд дад саГ даа ГГс Гас дгс ааа аад ддГ дда дсс аад ааа 7а1 С1и Уа1 С1и Ηίδ С1и РЬе Туг Уа1 Ьуз Ьуз С1у С1у А1а Ьуз Ьуз

480 485 490

1489 ада ссс дсс ссс адГ дас дса даг ага адГ дад ссс ааа едд дгд сдс Агд Рго А1а Рго Зег Азр А1а Азр Не 5ег С1и Рго Ьуз Агд Уа1 Агд

495 500 505

1537

дад

Гса

дГГ

дед

сад

сса

Гсд

асд

Гса

дас

дед

даа

дсГ

гсд

аГс

аас

1585

С1и

Бег

νβΐ

А1а

О1п

Рго

Бег

ТЬг

Зег

Аар

А1а

С1и

А1а

Бег

Не

Азп

510

515

520

525

Гас

дса

дас

адд

Гас

саа

аас

ааа

ГдГ

Ιοί

едг

сас

д^д

ддс

аГд

ааГ

1633

Туг

А1а

Азр

Агд

Туг

С1п

Азп

Ьуз

Суз

Бег

Агд

ΗΪΞ

νπ

С1у

Мег

Азп

530

535

540

1681 сГд агд сГд ГГГ ссс Где ада саа Где дад ада агд ааГ сад ааГ Гса Ьеи МеГ Ьеи РЬе Рго Суз Агд С1п Суз С1и Агд МеГ Азп 01 η Азп Зег

545 550 555

ааГ

аГс

Где

ГГс

асГ

сас

дда

сад

ааа

дас

ГдГ

ГГа

дад

Где

ггг

ссс

1729

Азп

Не

Суз

РЬе

ТЬг

Н1з

С1у

С1п

Ьуз

Азр

Суз

Ьеи

С1и

Суз

РЬе

Рго

560

565

570

дгд

Гса

даа

ГСГ

саа

ссс

дсс

ГсГ

дгс

дГс

ааа

аад

дед

гаг

сад

ааа

1777

Уа1

Бег

С1и

Бег

С1п

Рго

Уа1

Бег

Уа1

Ьуз

Ьуз

А1а

Туг

С1п

Ьуз

575

580

585

1825

сГд

Где

Гас

аГГ

саГ

саг

аГс

агд

дда

аад

дьд

сса

дас

дсГ

Где

асГ

Ьеи

Суз

Туг

Не

ΗΪ5

Шз

Пе

Мег

С1у

Ьуз

Уа1

Рго

Азр

А1а

Суз

ТЬг

590

595

600

605

дсс

где

даГ

сгд

дгс

аас

дгд

даг

СГд

даГ

дас

Где

аГс

ггг

даа

саа

А1а

Суз

Азр

Ьеи

Уа1

Азп

Уа1

Азр

Ьеи

Азр

Азр

Суз

11е

РЬе

С1и

С1п

610

615

620

1873

1876

<210>	8
<211>	621
<212>	Белок
<213>	аденоассоциированный
<400>	8
Мег Рго С1у РЬе Туг С1и Не

С1и Н±з Ьеи Рго С1у Не Зег Азр Зег РЬе Уа1 Азп Тгр Уа1 А1а С1и 20 25 30

Ьуз С1и Тгр С1и Ьеи Рго Рго Αερ Зег Азр МеГ Азр Ьеи Азп Ьеи Не 35 40 45

С1и С1п А1а Рго Ьеи ТЬг Уа1 А1а О1и Ьуз Ьеи С1п Агд Азр РЬе Ьеи 50 55 60

- 29 022169

ТЬг СЬи Тгр Агд Агд Уа1 Зег Ьуз АЬа Рго СЬи АЬа Ьеи РЬе РНе Уа! 65 70 75 80

СЬп РНе СЬи Ьуз С1у СЬи Зег Туг РНе НЬз МеЬ НЬз Уа1 Ьеи УаЬ СЬи 85 90 95

ТНг ТНг СЬу УаЬ Ьуз Зег Мес УаЬ Ьеи С1у Агд РНе Ьеи Зег С1п Не 100 105 110

Агд С1и Ьуз Ьеи Не С1н Агд 11е Туг Агд С1у Не СЬи Рго ТНг Ьеи 115 120 125

Рго Азп Тгр РНе А1а УаЬ ТНг Ьуз ТНг Агд Азп СЬу А1а С1у С1у СЬу 130 135 140

Азп Ьуз Уа1 Ή1 Азр СЬи Суз Туг 11е Рго Азп Туг Ьеи Ьеи Рго Ьуз 145 150 155 160

ТНг С1п Рго С1и Ьеи С1п Тгр АЬа Тгр ТНг Азп МеН С1и С1п Туг Ьеи 165 170 175

Зег А1а Суз Ьеи Азп Ьеи ТНг С1и Агд Ьуз Агд Ьеи Уа1 А1а С1п Шз 180 185 190

Ьеи ТНг ИЬз Уа1 Зег С1п ТНг С1п СЬи С1н Азп Ьуз С1и Азн С1п Азп 195 200 205

Рго Азп Зег Азр АЬа Рго Уа1 11е Агд Зег Ьуз ТНг Зег А1а Агд Туг 210 215 220

МеГ СЬи Ьеи Уа1 СЬу Тгр Ьеи УаЬ Азр Ьуз СЬу Не ТНг Зег С1и Ьуз 225 230 235 240

С1п Тгр 11е С1п СЬи Азр С1п АЬа Зег Туг Не Зег РНе Азп АЬа АЬа 245 250 255

Зег Азп Зег Агд Зег 01п 11е Ьуз А1а А1а Ьеи Азр Азп АЬа СЬу Ьуз 260 265 270

Не Меб Зег Ьеи ТНг Ьуз ТНг АЬа Рго Азр Туг Ьеи УаЬ СЬу С1п С1п 275 280 285

Рго Уа1 С1и Азр Не Зег Зег Азп Агд Не Туг Ьуз 11е Ьеи С1и Ьеи 290 295 300

Азп СЬу Туг Азр Рго С1п Туг А1а АЬа Зег Уа1 РНе Ьеи СЬу Тгр А1а 305 310 315 320

Зег С1п Рго Уа! Зег Уа! Уа! Ьуз Ьуз А1а Туг С1п Ьуз Ьеи Суз Туг 580 585 590

Не Ηί3 ΗΪ3 Ю МеЕ 51у Ьуз Уа1 Рго Лгу. А1а Суз ГЬг Д1а Суз Азр 595 600 605

Ьеи Уа1 Азп Уа1 Азр Ьеи Азр Азр Суз 11е РЬе С1и 01п 610 615 620

<210 9 <211> 9 <212> ДНК <213> аденоассониированный вирус 2 <400> 9 ссЕдЕЬаад

9

<210>	10
<211>	1194
<212>	ДНК
<21 О	аленоассоциированный вирус 2

<220 <221> различный признак <223> оптимизированная АсМИРУ кодирующая последовательность кер 52 <400 10

аИддааЪИдд	ЪсддСЪддЪТ	ддИддасаад	ддЪаЪЪассЪ	сддадаадса	аЪдда1;асаа	60
даада1:саад	ссхса^асаи	съсдъсЪаас	дсддса^сса	асьедсд^ад	ссааассааа	120
дс£дсс£Лдд	асааСдсддд	саадаСЪаИд	здссЪдасИа	ааассдсссс	сдасЬассИд	180
д^дддссадс	аасссдСдда	адасаЬМгсс	адсааЬсдса	СсСаСаадас	ί Г£ддад£1:а	240
аасддс£асд	аЮсЪСааЪа	СдсддсСЪсс	дГаСЛЪСЪдд	дсЕдддсдас	дааааадглт.	300
ддсаааадаа	асассаЪСИд	д£Ъд1:Ъ1.дда	сссдсаас1:а	сдддааааас	ааасаСадсд	360
даддсса^ад	сссасас^дь	асс£ £·ύΐΛβ£	ддсИдсдИЪа	асЪддассаа	ЪдадаасЪЬЬ	420
сса^Исаасд	асИдИдИсда	саадаъдд^ъ	аЪМддЪддд	аддааддсаа	ааИдассдсХ	480
ааад^сдедд	адГсддссаа	адеааЁСЬТа	ддаддсадса	аадЬдсдсдЬ	адассадааа	540
ГдсаааадсГ.	с^дсдсадаЪ	адасссдаса	ССддИдаИсд	Ъ^асаадсаа	сасдаасаТд	600
ГдсдссдЪда	ГЪдасддЪаа	сад^асдаса	М:сдаасасс	аасаассдСЪ	дсаадассда	660
аедггсаааъ	ъсдаа^сдас	дсдссдас^д	даисацдаъъ	ъ^ддсаадд^	аасаааасаа	720
даадссааад	асИгсЪт^сд	1;Сдддсааад	да^сасд^ид	££даад1:дда	асэ£даа1;Ь£	780
ЪасдСсаааа	ааддЪдд^дс	Ъаадаааада	сссдссссда	д1;да£дсада	тагаадгдад	840
сссааасдад	£дададаа£с	дд£Ьдсдсад	ссаадсасд!:	садаΐдсдда	адсСЪсдаЪа	900

- 32 022169

аасЬасдсад	ассдсгасса	ааасаааСд!	1с£сд1сасд	гаддса1даа	сНаасдчд	960
ГЛЪсссЬдса	дасаа^дцда	дадаа£даа£	садааЪад-Ьа	аГаПс£д£££	сас£.сасддс	1020
садааадаси	д£££адаа£д	сЪЪЪссддЪд	ЬсадааТс£.с	аасссд^гсс	Идг.сд£аааа	1080
ааддсдЪаЬс	ааааа'ЬйеЛд	сЪаЪаЪЛсаЬ	са’С.аЪ.саЪдд	даааад'Ьдсс	адаедсИЕдЕ	1140
ас£дсс1:дсд	аС.с£дд£Ъаа	£д£дда£ЪГ.д	да^дас^д^а	ЁсМЛдааса	аЪаа	Ί 194

<210> 11 <211> 1866

<212> ДНК <213> Искусственна <220> <223> Кодирующая Кер	последовательность ρνϋ!89
<400 11 сЪддсддддЪ	й-ССасдадаС	1дТда££аад	дЮсссадсд	асс1С.дасда	дсаСс^дссс	60
ддсаС1Ъсс.д	асадсССЛдС	даасСдддСд	дссдадаадд	ад^дддадсс	дссдссадаС	120
Сс£дас£Лдд	аСс^дааНсС.	да£Идадсад	дсассссСда	ссдЬддссда	даадсбдсад	180
сдсдасЪЪЬс	Ъдасддад^д	дсдссдИдИд	адоааддссс	сддаддсссС	ЁГСсО1д£д	24 0
сааЪЪЪдада	адддададад	с^асоссас	Озсасдсдс	1сдъддааас	сассдддд^д	300
ааа^ссИГад	ЪГТЪдддасд	си^сстдадъ	садаЪЪсдсд	ааааасИдаО	ТсададааСО	360
тассдсддда	Ъсдадссдас	СТЛдссааас	Сдд^Исдсдд	ъсасааадас	садааасддс	420
дссддаддсд	ддаасааддИ	ддСддасдад	ОдсТасаОсс	ссааЪЪасЪС	дсЬссссааа	480
асссадссЪд	адс1ссад1д	ддсдИддасЪ	ааОТПадаас	адта£££аад	сдсс^дИЛд	540
аагсгсасдд	адсдиааасд	дЬСддбддсд	садса^схда	сдсасдСдСс	дсадасдсад	600
дадсадааса	аададаасса	даа^сссааЪ	Ьс^дасдсдс	сддъдас.сад	ассаааааси	660
СсадссаддЕ.	асаЪддадсО	ддОсддд^дд	сСсдСддаса	аддддаОас	сисддадаад	720
садгддаЪсс	аддаддасса	ддсс1са£.ас	аЪсЪссЬпса	агдсддссос	саасСсдсдд	780
ЬсссаааЪса	аддс£дсс!Л	ддасаа!дсд	ддааадаШ:а	Сдадсс^дас	Ъаааассдсс	840
сссдас^асс	Сддг.дддсса	дсадсссд!д	даддасаЪТ!	ссадсааОсд	да^И^аЬааа	900
аиъссддаас	СааасдддЪа	сдатссссаа	ЬаСдсддсЪ!	ссдосИИс-	дддаЪдддсс	960
асдааааадЬ	£сддсаадад	даасассаЮ	сддс^д^стд	ддсс^дсаас	Сассдддаад	1020
ассааса^сд	еддаддссаО	адсссасаси	дИдссс!Ос1	асдддИдсдб	ааасОддасс	1080
аа£дадаас£	ъесссЧсаа	сдас£дЪд£с	дасаадаедд	бдаЮЁддИд	ддаддадддд	1140
аада^дассд	ссаадд1:сд1	ддадЪсддсс	азадссэ. Ыс	£сддаддаад	сааддСдсдс	1200
д1:ддассада	ааТдсаад^с	с£сддсссад	аСадасссда	сЮссдЪдат:	сдюасс^сс	1260
аасассааса	£д£дсдссдИ	даЪСдасддд	аасосаасда	сстсдааса	ссадсадссд	1320
ЪЪдсаадасс	ддасдслсаа	аЪЪГдаас^с	асссдссдЪс	Одда£са1да	сЪЪСдддаад	1380
дСсассаадс	аддаадтсаа	адасЪИЪЪс	сдд^дддсаа	аддаОсасд!	ддПдаддЬд	1440
дадсаЪдааЪ	£с£асдгсаа	ааадддгдда	дссаадаааа	дасссдсссс	садбдасдса	1500
даЪаЪаадЬд	адсссааасд	ддЪдсдсдад	ЪсадЪЪдсдс	адссэЪсдас	д^еадасдсд	1560
даадсМ:сда	ОсаасЪасдс	адасаддъас	саааасааа£	дПСССдбса	сд1дддсаСд	1620
ааЁс£да£дс	ЬдЬЬЬссссд	садасаа^дс	дададааЪда	а£садаа1Х:с	ааа£а£сЬдс	1680
ЬЪсасЬсасд	дасадааада	с£д£Ё£адад	ШШсссд	^дИсадааСс	тсаасссдИ;	1740
ЪсЪд^сд^са	ааааддсдСа	Ьсадааас1д	ГдсЪасаСЪс	а!саЪа£саЬ	дддааадд£д	1800
ссадасдс£1	дсасидсстд	сда£с£дд1:с	ааЪдЪддаЪЪ	ЪддаЪдасЪд	гатс1Ш1.даа	1860

сааЬаа 1866

- 33 022169

Claims (23)

1. Клетка насекомого, пригодная для продуцирования рекомбинантных парвовирусных векторов, включающая первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первую аминокислотную последовательность, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую аминокислотную последовательность, причем первая и вторая аминокислотные последовательности включают общую аминокислотную последовательность по крайней мере из 100 аминокислот по крайней мере с 90% аминокислотной идентичностью между первой и второй аминокислотными последовательностями, причем нуклеотидные последовательности, кодирующие общую аминокислотную последовательность в первой и второй аминокислотных последовательностях, идентичны менее чем на 90%, причем первая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер52 или 40, а вторая нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Вер78 или 68, причем общие аминокислотные последовательности включают аминокислотные последовательности от второй аминокислоты до самой С-концевой аминокислоты парвовирусного белка Вер52 или 40.

2. Клетка насекомого по п.1, в которой нуклеотидные последовательности, которые кодируют общую аминокислотную последовательность в первой и второй аминокислотных последовательностях, идентичны друг другу менее чем на 80%.

3. Клетка насекомого по п.1 или 2, в которой последовательности, соответствующие общей аминокислотной последовательности в первой и второй аминокислотных последовательностях, идентичны по крайней мере на 99%, предпочтительно на 100%.

4. Клетка насекомого по любому из предшествующих пунктов, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности, имеет смещение частот использования кодонов в сторону улучшения для клетки насекомого по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности, или в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности, имеет смещение частот использования кодонов в сторону улучшения для клетки насекомого по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой нуклеотидной последовательности.

5. Клетка насекомого по п.4, в которой разница между индексами адаптации кодонов нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в первой и второй нуклеотидных последовательностях, составляет по крайней мере 0,2.

6. Клетка насекомого по любому из предшествующих пунктов, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая общую аминокислотную последовательность в нуклеотидной последовательности со смещением частот использования кодонов в сторону улучшения, включает непрерывный участок по крайней мере из 25 кодонов, все из которых являются часто встречающимися кодонами в соответствии с табл. 1 или 2.

7. Клетка насекомого по п.6, в которой все кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в нуклеотидной последовательности со смещением частот использования кодонов в сторону улучшения, являются часто встречающимися кодонами в соответствии с табл. 1 или 2, и в которой предпочтительно все кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность в другой нуклеотидной последовательности, являются вторыми наиболее частыми кодонами в соответствии с табл. 1 или 2.

8. Клетка насекомого по любому из пп.1-6, в которой по крайней мере 50% кодонов в нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность во второй нуклеотидной последовательности, изменены по сравнению с соответствующим кодоном в первой нуклеотидной последовательности для максимизации содержания АТ или ОС во второй нуклеотидной последовательности.

9. Клетка насекомого по любому из предшествующих пунктов, в которой первая и вторая нуклеотидные последовательности являются частью конструкции, в которой каждая из первой и второй нуклеотидных последовательностей функционально связана с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого.

10. Клетка насекомого по п.9, в которой первая и вторая нуклеотидные последовательности являются частью одной конструкции.

11. Клетка насекомого по любому из пп.1-9, в которой парвовирусными белками Вер являются белки Вер аденоассоциированного вируса (ААУ).

12. Клетка насекомого по п.11, в которой парвовирусные белки Вер, кодируемые первой и второй нуклеотидными последовательностями, являются белками одного и того же серотипа.

13. Клетка насекомого по любому из пп.1-12, в которой первая нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Вер52, выбрана из группы, состоящей из:

а) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную

- 34 022169 последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична аминокислотной последовательности 5Ер ΙΌ N0: 6;

b) нуклеотидной последовательности, которая идентична по крайней мере на 50% любой из нуклеотидных последовательностей 5ЕР ΙΌ N0: 1-5 и 10;

c) нуклеотидной последовательности, комплементарная цепь которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты а) или Ь);

6) нуклеотидной последовательности, которая отличается от последовательности с) вследствие вырожденности генетического кода и в которой вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Кер78, выбрана из группы, состоящей из:

a) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична аминокислотной последовательности 5Ер ΙΌ N0: 8;

b) нуклеотидной последовательности, которая идентична по крайней мере на 50% нуклеотидной последовательности с 11 до 1876 положения 5ЕР ΙΌ N0: 7;

c) нуклеотидной последовательности, комплементарная цепь которой гибридизуется с нуклеотидной последовательностью а) или Ь);

6) нуклеотидной последовательности, которая отличается от последовательности с) вследствие вырожденности генетического кода.

14. Клетка насекомого по любому из пп. 1-13, дополнительно включающая:

a) третью нуклеотидную последовательность, включающую по крайней мере одну нуклеотидную последовательность инвертированного концевого повтора (1ТК) парвовируса;

b) четвертую нуклеотидную последовательность, включающую кодирующие капсидные белки парвовируса последовательности, функционально связанные с контролирующими экспрессию последовательностями для экспрессии в клетке насекомого.

15. Клетка насекомого по п.14, в которой одна или более из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотидных последовательностей являются частью конструкции нуклеиновой кислоты, которая представляет собой совместимый с клеткой насекомого вектор, предпочтительно бакуловирусный вектор.

16. Клетка насекомого по п. 14 или 15, в которой третья нуклеотидная последовательность дополнительно включает по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес продукт.

17. Клетка насекомого по п.16, в которой третья нуклеотидная последовательность включает две последовательности 1КТ парвовируса и в которой по крайней мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт, расположена между двумя нуклеотидными последовательностями 1КТ парвовируса.

18. Клетка насекомого по любому из пп.14-17, в которой по крайней мере одна из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотидных последовательностей устойчиво интегрирована в геном клетки насекомого.

19. Клетка насекомого по любому из пп. 14-18, в которой парвовирусом является ААУ.

20. Способ получения рекомбинантного парвовирусного вириона в клетке насекомого, включающий стадии:

(a) культивирования клетки насекомого по любому из пп.14-19 в условиях, обеспечивающих продуцирование рекомбинантного парвовирусного вириона;

(b) выделения рекомбинантного парвовирусного вириона.

21. Способ по п.20, дополнительно включающий стадию очистки по сродству вириона с использованием иммобилизованного антитела против парвовируса, предпочтительно одноцепочечного антитела семейства верблюдовых или его фрагмента.

22. Способ по п.20 или 21, в котором рекомбинантным парвовирусным вирионом является рекомбинантный ААУ-вирион.

23. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая первую и вторую нуклеотидные последовательности, раскрытые в любом из пп.1-13.

Фиг. 1

- 35 022169

1.00 3 ц. о.эо !θ 0-80 | 5 0.70 §1 0.60

0.50 $ ” 0.40

0.20

0.10

0.00

Отношение чисел геномных копий гена Рер/гена ОРР в зависимости от пассажей Вас.\Л}183

111111111

ПЗ П4 П5 П6 П7 П8 П9 П10 П11

Пассажи

Фиг. 3

Фиг. 5

Лэддер ПЗ П4 П5 П6 П7 Р8 П9 П10 П11 88

120 .Ϊ (

Фиг. 6

- 36 022169

Фиг. 7

Фиг. 8

Фиг. 9

- 37 022169

Вас.УО183

Маркер П2 ПЗ П4 П5

120 100 80 * 60 50 я» 40 30 * 20 •

Фиг. 10