JP6839094B2 - RNAiで誘発されるハンチンチン遺伝子抑制 - Google Patents
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Description
1. 第1のRNA配列及び第2のRNA配列を含む二本鎖RNAであって、
第1のRNA配列及び第2のRNA配列とは実質的に相補性であり、第1のRNA配列は少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有し、配列番号1と実質的に相補性である二本鎖RNA。
miR155に基づいてmiRNAスキャフォールドベクターを創るために、図1に示されたHTT中の選択された標的配列と完全に相補性の21ヌクレオチドの(bp)配列を、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Invitrogen社、Carlsbad、カリフォルニア州)のpri-mir-155骨格中に埋め込むと、pVD-CMV-miHTT-155が生じた(発現カセット配列の例は、図2Cに描かれ、発現されたRNAに含まれるpre-miRNA及びpri-miRNA配列は図2B及び図2Fに、それぞれ描かれている)。pri-mir-155の構造は、Invitrogen社により提供された使用説明書(BLOCK-iT、Pol II miR RNAi発現ベクターキット、バージョンE、6月22日、2007年、25-0857)に基づいて、pcDNA6.2-GW/emGFP-mir155のBsalサイトで合成二本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより設計した。miHtt構造によりコードされる全ての人工pre-miRNAの構造を、Mfoldソフトウェア(Nucleic Acids Res. 31(13)、3406〜15頁、(2003年)、mfoldバージョン3.5を使用して、オンラインで利用可能、http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold)を使用して検証した。配列番号5と対応する配列を担持するpre-miRNA-155スキャフォールドの予測される構造を図2Bに示す。選択された第1の配列として配列番号5を有するpri-miRNA-155スキャフォールドのための発現構造をコードするDNA配列を図2C(配列番号17)に列挙するが、この構造はmiH12及びその標的H12にも相当する。他の20種の選択された標的配列について、それらの配列は図1に描かれた標的配列と完全に相補性であるように設計される。図2Bに描かれた同じ構造的特徴を有するmiRNAスキャフォールド、即ち該スキャフォールドに埋め込まれた第2のRNA配列は、選択された第1のRNA配列が完全に相補性である配列に対応するが、中心に2個のヌクレオチド欠失を有する。同様に対照として、スクランブルされたRNA配列を第1のRNA配列として使用して、上のように、第2のRNA配列は、ベクターpVD-CMV-miScr-155を創るために設計した。該構築物は、インビトロ及びインビボでmiRNA発現及び形質導入の可視化の両方を可能にするためにGFPを含有した。
完全なHTTエクソン1の配列を含有するpsiCheck-2構造LucHTTを設計して、Promega社(siCHECK(商標)ベクター、C8011、Promega社、Benelux b.v.、Leiden、オランダ)により提供された使用説明書に従ってクローニングした。LucHTTは、配列番号1及び配列番号2中に存在するそのフランキング配列を含む(図1Bを参照されたい)。LucH12_451aレポーターは、pVD-CAG-miH12-451及びpVD-PGK-miH12-451により発現されるべく設計された第2のRNA配列と相補性の配列を含む。全ての構築物の配列を決定して正しい配列を検証した。全てのmiRNAスキャフォールド及びsiRNAのノックダウンの効力をインビトロで、特異的ルシフェラーゼレポーターで決定した。Hek293T細胞にmiHttを該ルシフェラーゼレポーターと1:1の比(miR-155、PGK-miH12-451)、又は1:10の比で共トランスフェクトした(CAG-miH12-451、即ち該CAGプロモーターは非常に強い)。ウミシイタケルシフェラーゼのノックダウンをトランスフェクション後(p.t)48時間に測定し、ホタルを内部対照として測定した。miScrを陰性対照として使用して100%とした。
エクソン1を標的とするmiH1-miH21構造の中で、miH12が最強のルシフェラーゼレポーターのノックダウンを誘発し、75〜80%減少させた(図3A)。H12を標的とするsiRNA、即ち配列番号1は、全て同様なノックダウン効率を有することが示され、用量を増加するとより強いノックダウンを示した。19及び21個の塩基対のSiRNAは、試験された他のsiRNAと比較して若干強い阻害を示した。pVD-CMV-miHTT-155から発現されたRNAの次世代の配列決定(NGS)分析を実施して、miRNAスキャフォールドの一部であるべく設計された第1のRNA及び第2のRNA配列に対応するガイド鎖及びパッセンジャー鎖における優先(preference)を示した(例えば図2B(7)を参照されたい)。pVD-CAG-miH12-451及びpVD-PGK-miH12-451は、LucHTT及びLucH12_451aの両方を標的とすることについて試験した。CAG構造及びPGK構造は両方とも配列特異的阻害を示したが(図4A)、Lucレポーターは、該構造の第2のRNA配列に完全に相補性の配列を含んでおり低下しなかった。
pVD-CMV-miHTT-155からの発現構造CMV-miH12-155を、AAV5ベクター骨格及びバキュロウイルス産生系を使用して産生されたAAV5中でクローニングした。対照としてCMV-miScr-155もAAV5骨格中に組み込んで陰性対照として役立てた。脳への形質導入の効率をモニターするために、該発現カセットはGFPを含有した(図5A)。AAV-5ベクターは、標的配列の配列番号1(即ち、73回のCAG反復を有する完全なHTTエクソン1の配列)及び配列番号2中に存在するそれらのフランキング配列(図1Bを参照されたい)を含むルシフェラーゼレポーター構造、Luc73QHTTを担持する。Balb/6マウス(N5)の線条体内に、2μlのAAV5-Luc73QHtt/SNP(3.6×1012gc/ml)及びAAV5-miScr(1.8×1013gc/ml)又はAAV5-miH12(1.8×1013gc/ml)を1:5の比で共注射した。別の群には、AAV5-Luc73QHtt/SNP及びPBSを注射した。ルシフェラーゼ発現を、注射の2、4、及び6週間後にMSによりモニターした。注射後1週間で、すでにmiScr及びLuc19QHtt/wtのみの動物と比較して、miH12によるLuc19QHtt/wtの明確なノックダウンがあった(図7b及び図7c)。経時的なルシフェラーゼレポーター発現において有意の低下を示す傾向が示され、発現は対照群と比較して、脳において、殆ど検出不可能であり(miH12 #1及び#2)、CMV-miH12-155によるHTT標的の強いノックダウンが示された。実験の終末では、CMV-miH12-155群におけるLuc73QHtt/SNPの蛍光は、miScrと比較して約1桁低かった。
AAV5-CMV-miH12-155をLV-171-82QHDラットモデルで試験した(Drouetら、2009年、Ann Neurol. 2009年3月;65(3):276〜85頁)。該モデルは、SNPC/Tを含有するエクソン67のフラグメントに連結した82回のCAG反復を有するHTT変異体フラグメントの第1の171アミノ酸の線条体の過剰発現に基づく。HDラットにAAV5-CMV-miH12-155又は対照のAAV5-CMV-miScr-155を注射した(図6A)。ラットの線条体内にLV-171-82Qを注射して1週間後にAAV5-CMV-miH12-155又はAAV5-CMV-miScr-155を注射した。AAV5-CMV-miH12-155の神経保護効果を、初期及び後期の時点でHDラット脳切片の組織染色(DARP32、EM48、GFP及びIba1)に基づいて決定した(図6B、図6C及び図6D、注射後2週間)。DARP32病変(図6B、上のパネル)は、神経変性を示し、脳切片で白色斑点として観察することができる。パネルは、AAV5-CMV-miH12-155ラットの脳切片には、ニューロンの死が少なく、それ故白色斑点がないことを明確に示す。脳切片を、スライド上で小さい褐色の小斑点として見られる突然変異体HTT凝集塊を求めて染色した(EM48、図6B)。AAV5-CMV-miH12-155を注射されたHDラットでは、対照群と比較して、神経変性及び突然変異体HTT凝集塊は明らかに少なかった(図6B、中央及び下のパネル)。同様な結果が、注射後8週間の後期の時点でも得られた(データ掲載せず)。GFP組織検査(褐色染色)の結果は、本研究で使用された全てのベクターで、効率的な線条体の形質導入を示した(図6C)。それに加えて、Iba1染色に基づいて、注射後8週間で免疫応答は殆ど検出されなかった(図6D)。
H12配列と近似した先行技術からの標的配列をH12配列と比較した。siRNAスキャフォールド及びmiRNAスキャフォールドを構築して、上で記載したようにルシフェラーゼレポーター系を使用して、直接比較を実施した。結果を偏らせる不正確な効果を回避するために、低濃度のsiRNAを3連でトランスフェクトした(0.25nM)。完全に相補性のガイド鎖及びパッセンジャー鎖(G-C及びA-U塩基対)を有し、両鎖でUU-3'オーバーハングを有するsiRNAを作製した。スクランブルされたsiRNAを対照として使用し、対照と比較して値を測定した。H12 siRNAは、最強の阻害を示した(図8Aを参照されたい)。同様に、miRNAスキャフォールドを、miR-155に基づいて、上で記載したようにInvitrogen社の使用説明書に従って作製して、同様に直接比較した。R6.1標的配列及びR6.2標的配列と完全に相補性の19ヌクレオチド及び18ヌクレオチドをInvitrogen社からの操作されたmiR-155スキャフォールドのガイド配列中に置き換えることにより、R6.1スキャフォールド及びR6.2スキャフォールドを作製した。それ故、ダイサーによるpre-miRNA処理に依存して、処理されたR6ガイド鎖は、配列の末端でmiR-155スキャフォールドからのヌクレオチドを含有することもできる。miRNAスキャフォールドは、上で記載したように、miRNA構造とレポーターの間の異なる比(miRNAスキャフォールド構造:ルシフェラーゼレポーター)を使用してトランスフェクトした。スクランブルされたmiRNA構造を対照として使用して、値を対照と比較して測定した。図8Bは、1:1の比を示し、それに対して図8Cは1:10の比を示す。H12miRNAスキャフォールドは、最強の阻害を示した。H12は、siRNA及びmiRNAの両方について、特にインビボ適用に対して最も関係のあると考えられる低濃度で、著しく強い阻害を示した。
2 拡張されたsiRNA
3 siRNA
4 RISC複合体
5 pri-miRNA配列
6 pre-miRNA配列
7 成熟miRNA二重鎖
Claims (14)
- 第1のRNA配列及び第2のRNA配列を含む二本鎖RNAであって、第1のRNA配列及び第2のRNA配列が相補性であり、第1のRNA配列が少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有し、配列番号1と相補性である二本鎖RNAであって、
前記第1の鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7からなる群から選択される、二本鎖RNA。 - ハンチンチン遺伝子発現を減少することができる、請求項1に記載の二本鎖RNA。
- pre-miRNAスキャフォールド、pri-miRNAスキャフォールド、shRNA、又はsiRNA、好ましくはpre-miRNAスキャフォールドに含まれる、請求項1又は請求項2に記載の二本鎖RNA。
- 前記第1のRNA配列が、配列番号4、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の二本鎖RNA。
- 前記第1の鎖及び第2の鎖が、配列番号3と8;配列番号4と9;配列番号5と10;配列番号5と13;配列番号5と14;配列番号6と11;及び配列番号7と12の組合せからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の二本鎖RNA。
- miR-451a又はmiR-155から誘導されたpre-miRNAスキャフォールドに含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載の二本鎖RNA。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の二本鎖RNAをコードするDNA。
- 請求項1から7のいずれか一項に規定の二本鎖RNAをコードする発現カセット。
- PGKプロモーター、CMVプロモーター、神経特異的プロモーター又はCBAプロモーターを含む、請求項8に記載の発現カセット。
- 請求項8又は9に記載の発現カセットを含む遺伝子治療用ベクター。
- AAVベクター、好ましくは血清型5のAAVベクターである、請求項10に記載の遺伝子治療用ベクター。
- 請求項7に記載のDNA又は請求項8若しくは請求項9に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
- 医学的治療に使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の二本鎖RNA、請求項7に記載のDNA、請求項8若しくは請求項9に記載の発現カセット、又は、請求項10若しくは請求項11に記載の遺伝子治療用ベクターを含む組成物。
- ハンチントン病の治療で使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の二本鎖RNA、請求項7に記載のDNA、請求項8若しくは請求項9に記載の発現カセット、又は、請求項10若しくは請求項11に記載の遺伝子治療用ベクターを含む組成物。
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