CN108384803A - 一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法 - Google Patents

一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法，该质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。该特异序列对人源、小鼠和大鼠类序列miRNA序列的功能筛选，有较准确的对照参照组实验意义，转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，使实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，有效的筛选到理想的miRNA。

Description

一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建 方法
技术领域
本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，涉及一种在miRNA筛选过程中需要的一种绝对对照的对照组实验质粒。具体地说本发明涉及一种用于人源、小鼠、大鼠等筛选高效miRNA序列质粒的绝对对照组实验质粒。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20～24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70％的哺乳动物miRNA是位于TUs区(transcription,TUs)(Rodriguez etal,2004),且其中大部分是位于内含子区(Kim&Nam,2006)。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal,2000；Ruvkun et al,2001；Lee&Ambros,2001)。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系,研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。
目前现有技术中已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21～25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，该质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，该质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。
质粒转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，是实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，从而筛选到理想的miRNA。
miRNA干扰载体表达出的miRNA具有经过基因工程改良的murine miR-155骨架结构，其中靶向结合序列在图1中以粗体字标出，进一步剪切成熟后结合目标基因miRNA发挥干扰作用。
而本发明中构建的质粒因对人源、小鼠和大鼠等数据库中已公布的序列不存在同源，所以能作为人源、小鼠和大鼠等miRNA干扰的良好对照组实验。质粒针对靶基因miRNA的干扰载体，在转染效率>80％的前提下，对实验中的转录水平无明显干扰作用。
一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)预测一段21bp的序列，对人源、小鼠和大鼠的数据库用局部序列比对基本检索工具blast进行比对检索，找到大于90％特异与人源、小鼠和大鼠数据库的序列；
(2)筛选到预测的21bp序列进行合成构建，载体骨架选用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体；
(3)构建好质粒后进行转录后水平表达测试，细胞系选用较常规的HEK293进行干扰实验；
(4)收集细胞株进行Qpcr检测，检测结果显示对人源、小鼠和大鼠的目标蛋白无明显干扰作用，目标蛋白正常表达。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法，该质粒含有经过特异筛选的目标序列,目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。该特异序列与人源、小鼠、大鼠等数据库中已公布的序列，对人源、小鼠和大鼠类序列miRNA序列的功能筛选，有较准确的对照参照组实验意义，转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，使实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，有效的筛选到理想的miRNA。
附图说明
图1是靶向结合lacZ基因的miRNA结构图；其中左边为天然miR-155的结构，右边为pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达出的miRNA结构，含有一个发卡结构terminal loop和配对区域内部的internal loop。
图2是筛选到预测的21bp序列进行合成构建的结构图；其中载体骨架选用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。
一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，该质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，该质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。
质粒转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，是实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，从而筛选到理想的miRNA。miRNA干扰载体表达出的miRNA具有经过基因工程改良的murine miR-155骨架结构，其中靶向结合序列在图1中以粗体字标出，进一步剪切成熟后结合目标基因miRNA发挥干扰作用。
而本发明中构建的质粒因对人源、小鼠和大鼠等数据库中已公布的序列不存在同源，所以能作为人源、小鼠和大鼠等miRNA干扰的良好对照组实验。质粒针对靶基因miRNA的干扰载体，在转染效率>80％的前提下，对实验中的转录水平无明显干扰作用。
一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)预测一段21bp的序列，对人源、小鼠和大鼠的数据库用局部序列比对基本检索工具blast进行比对检索，找到大于90％特异与人源、小鼠和大鼠数据库的序列；
(2)筛选到预测的21bp序列进行合成构建，载体骨架选用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体；
(3)构建好质粒后进行转录后水平表达测试，细胞系选用较常规的HEK293进行干扰实验；
(4)收集细胞株进行Qpcr检测，检测结果显示对人源、小鼠和大鼠的目标蛋白无明显干扰作用，目标蛋白正常表达。
本发明的构建方法具体包括两个阶段：第一阶段miRNA干扰特异对照质粒的构建和第二阶段干扰载体在HEK293细胞中的干扰评价。
阶段1：miRNA干扰特异对照质粒的构建：
一、材料和方法：
(一)材料：合成的oligos(BiOligo)；BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi ExpressionVector Kit with EmGFP(Life)；DH5alpha感受态细胞；T4DNA ligase(1U/μl)(NEB)。
(二)方法：根据基因序列设计并合成多对互补oligo DNA，oligo设计方法及架构见图1。
二、干扰载体构建：
将多对oligo各自退火成双链。然后用载体构建试剂盒BLOCK-iTTM Pol II miRRNAi Expression Vector Kit with EmGFP(Life公司)进行重组克隆，将多对双链的miRNAoligo各自插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建多个miRNA质粒，转化入感受态细胞DH5α。
退火和连接的具体方法如下：
(a)oligo退火：将多对合成好的oligo用ddH2O溶解成100μM，互补单链各取5μl两两混合，建立表一的体系，将多份oligo混合物在95℃加热5min，然后放置室温自然冷却20min，形成双链oligo。
表一：miRNA oligo退火体系
100μM top strand oligo 5μl
100μM bottom strand oligo 5μl
10×oligo annealing buffer 2μl
ddH2O 8μl
Total volume 20μl
(b)连接：将退火的双链oligo继续稀释成10nM浓度，按表二给出体系在室温连接30min。
表二：酶连接体系
5×ligation buffer 4μl
pcDNA6.2-GW/EmGFP 2μl
ds oligo(10nM) 4μl
T4 DNA ligase(1U/μl) 1μl
ddH2O 9μl
Total volume 20μl
(c)转化：将上述连接反应转化DH5 alpha感受态细胞。
三、每个转化平板分别挑取3个克隆，用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。验证无误后扩增质粒备用。
阶段2：干扰载体在HEK293细胞中的干扰评价
一、材料和方法：
(一)材料：靶细胞:HEK293(Life)；DMEM+10％胎牛血清(Gibco)；lipofectamine2000(Life)；OptiMEM培养液(Life)；0.05％Trypsin(Life)；干扰质粒(BiOligo制备)；高表达载体质粒；HQ高纯度质粒抽提试剂盒(天根生物)；Trizol(Life)；逆转录试剂盒(Life)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD)；荧光显微镜(Olympus)；氯仿；无水乙醇；RNase H(Life)；CO2培养箱(Thermo)。
(二)方法：
1、干扰载体和高表达载体的制备：
(1)分别接种干扰质粒(壮观霉素抗性)和高表达载体(氨苄青霉素抗性)菌液至5ml的含有抗生素的LB培养液中，37度摇床(220rpm)过夜；
(2)用HQ高纯度质粒抽提试剂盒制备质粒。
2、干扰载体和高表达载体瞬时共转染靶细胞：
2.1、将状态良好，处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔5×105个细胞接种于六孔板的每个孔中；
2.2、培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率80％左右时，进行转染实验；
2.3、用无血清Opti-MEM轻洗细胞两次，加入1.5ml Opti-MEM；
2.4、分别用250ul Opti-MEM稀释3ug干扰正对照质粒以及本次构建的对照质粒，轻轻混匀，并加入1ug的高表达载体；
2.5、用250ul Opti-MEM稀释10ul lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温孵育5min；
2.6、轻轻混合已稀释质粒(2.4)和lipofectamine 2000稀释液(2.5)，室温放置20min；
2.7、将每管500ul脂质体-质粒复合物慢慢加入到各细胞孔中，轻轻混匀；
样品名称 转染质粒
靶细胞+MR1 MR1+高表达载体
靶细胞+MR2 MR2+高表达载体
靶细胞+MR_nega1(某已商业化的已知序列) MR_nega1+高表达载体
靶细胞+MR_nega2 MR_nega2+高表达载体
靶细胞+MR_nega3 MR_nega3+高表达载体
靶细胞 无转染对照
2.8、在37℃，5％的CO2的培养箱中培养4-6h后，换上完全培养液，不含抗生素，放置在37℃，5％的CO2的培养箱中继续培养过夜；
2.9、如质粒含有荧光蛋白基因，则第二天观察是否有荧光表达。
3、通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果：
3.1、细胞样品总RNA的提取：
(a)细胞瞬时转染48h后，轻轻吸净培养液，用PBS轻洗两遍，每孔细胞样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全部裂解，室温放置5min；.
(b)每管中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15秒，12000g，4℃离心10min。
(c)取上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，12000g，4℃离心10min。
(d)弃去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃离心10min。
(e)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10min。
注意：整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作；加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70％乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
3.2、反转录cDNA：
(a)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入如下组分得到Mix1；
Mix1
组分 体积 来源
Up to 5μg total RNA 5μl -
Primer(50uM oligio)(dt) 1μl Life
10mM dNTP Mix 1μl Life
DEPC-treated water 3μl Life
Total 10μl
(b)将Mix1 65℃水浴5min后，立即放置冰上2min；
(c)将如下组分加入到Mix1中，得到Mix2共20ul体系；
组分 体积 来源
10xRT butter 2μl Life
25mM Mg2+ 4μl Life
0.1M dTT 2μl Life
RNaseout 40U/μl 1μl Life
SuperScrip III RT(200U/μl) 1μl Life
Mix1 10μl 参考前步骤
Total 20μl
(d)50℃水浴50min后，85℃水浴5min，立即放置到冰上2min；
(e)每管Mix2中加入1μl的RNase H，37℃处理20min，所得到的cDNA保存在-20℃备用。
3.3、qPCR检测目的基因的表达情况：
通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(threshold cycle number.域值循环数)，采用△△Ct的方法进行相对定量。使用转染阴性干扰载体的样品(某已商业化的已知序列)作为对照样品，比较各瞬时转染干扰载体组样品的目的基因的表达量，并计算干扰效果。
△△ct＝(待测样品的目的基因的ct平均值-待测样本的内参基因的ct的平均值)-(对照样品的目的基因的ct的平均值-对照样本的内参基因的ct的平均值)。
基因的表达量F＝2-△△ct，目标基因的干扰效率为1-2-△△ct。
PCR体系中各组分的体积如下：
PCR反应条件：
Cycle Cycle Point
Hold@95℃ 2min
Cycling(40repeats) Step1@95℃,hold10secs
Step2@60℃,hold30secs
Step3@70℃,hold45secs,acquiring to Cycling
Melt(70-95℃),
实验结果和数据：
1、干扰载体瞬时转染HEK293细胞后24h，各组细胞同一视野荧光和可见光照片。
2、qPCR方法检测干扰载体对于靶基因的沉默效果。干扰效果评价：干扰载体和高表达干扰序列的载体共转染HEK293细胞，瞬时转染48h后收集样品qPCR检测目的基因的表达情况，实验结果表明本次构建的对照序列miRNA对目的序列无干扰作用，能够作为正对照的阴性对照标准品。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，其特征在于：所述质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，所述质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，所述质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。
2.根据权利要求1所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，其特征在于：所述质粒转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，是实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，从而筛选到理想的miRNA。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，其特征在于：miRNA干扰载体表达出的miRNA具有经过基因工程改良的骨架结构，其中靶向结合序列进一步剪切成熟后结合目标基因miRNA发挥干扰作用。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，其特征在于：所述质粒针对靶基因miRNA的干扰载体，在转染效率>80％的前提下，对实验中的转录水平无明显干扰作用。
5.根据权利要求1所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：
（1）预测一段21bp的序列，对人源、小鼠和大鼠的数据库用局部序列比对基本检索工具blast进行比对检索，找到大于90％特异与人源、小鼠和大鼠数据库的序列；
（2）筛选到预测的21bp序列进行合成构建，载体骨架选用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体；
（3）构建好质粒后进行转录后水平表达测试，细胞系选用较常规的HEK293进行干扰实验；
（4）收集细胞株进行Qpcr检测，检测结果显示对人源、小鼠和大鼠的目标蛋白无明显干扰作用，目标蛋白正常表达。
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WO2016102664A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Uniqure Ip B.V. Rnai induced huntingtin gene suppression

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