CN101638656A - 一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为mi R－486、miR30d、miR－1或miR－499中的一种或多种。该标志物可用于制备非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒或治疗非小细胞肺癌的药物。

Description

一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用

发明领域

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。

背景技术

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤，肺癌的主要病理类型包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80～85％，位居全球范围内肿瘤发病率和死亡率的首位，目前全球范围内新发肺癌患者每年已经超过100万例。2002年全球共有135万例肺癌新发病例，118万人因肺癌而死亡。近年来，我国肺癌发病和死亡一直呈上升趋势，2002年我国男性肺癌的发病率为42.4/10万，女性为19.0/10万，高于世界的平均水平并接近发达的工业化国家水平。2000年我国肺癌死亡率在40岁及以上人群中达到了71.5/10万人年，远远高于肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌，而成为恶性肿瘤的首位死因。因此，肺癌是威胁全球及我国居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。

非小细胞肺癌主要包括鳞癌(squamous cell cancer，SCC)和腺癌(adenocarcinoma，AC)，目前非小细胞肺癌的治疗主要根据肺癌的临床分期来进行，对I、II、IIIA期主要以手术切除为主，淋巴转移显著者，于手术前可辅以化疗或放疗。

尽管近年来肺癌的诊断水平和治疗水平不断提高，但非小细胞肺癌的预后仍然较差，5年生存率在发展中国家不足9％，在美国也不到15％，因此对肺癌患者预后情况进行预测，并采取针对性的个体化治疗是提高治疗效果的关键。尽管肺癌预后的判断依据依然是临床分期和病理组织学类型，然而，具有同样临床特征的肺癌患者的预后情况却可能有很大的差异，仅仅利用当前的临床分期系统对肺癌患者的预后情况进行预测是远远不够的。我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对不同特征的肺癌患者，尤其是早期患者的预后辅佐诊断和死亡风险评估，并对其采取科学的个体化治疗方案，这将有助于改善生存质量，延长患者的生存时间。

MicroRNAs(即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，进化上具有高度保守性，可在转录后水平上对基因表达进行调节，并参与哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。自发现参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，也就是所有基因的30％，但随着研究的深入，越来越多的miRNAs被发现，这个比例还在不断上升之中。近来，miRNA与肿瘤的关系越来越成为研究的重点，已经发现若干miRNAs通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌等的发病和预后高度相关。有学者提出了“癌microRNAs”(OncomiRs)的观点，即认为miRNAs的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。

最近的研究发现血清/血浆中存在上百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。这一发现令人振奋，血清miRNAs作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。

然而，目前还没有关于血清/血浆miRNAs用于肺癌预后辅助判断、危险度评价等方面的报道，若能筛选出肺癌预后特异或异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，对我国肺癌的诊治现状必将是一次有力的推动，另外，研究这些异常表达的miRNAs对于肺癌细胞迁移、转移能力的影响等，还有助于发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物。

本发明的另一个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。

本发明还有一个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备非小细胞肺癌预后辅助诊断、动态监测的试剂盒以及在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

本发明再有一个目的是提供用于非小细胞肺癌预后判断和治疗的诊断试剂盒及药物。

发明人通过分离和研究不同预后情况的I-IIIa期NSCLC患者血清/血浆中的miRNAs，寻找一组与NSCLC预后高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的肺癌的预后诊断和个体化治疗辅助决策试剂盒，通过体外细胞实验，研究筛选出的miRNAs对于肺癌细胞迁移、转移能力的影响，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中的一种或多种。

所述的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中二种以上的组合；优选miR-1与miR-499组合，或者miR-486与miR30d组合；进一步优选miR-486、miR30d、miR-1以及miR-499构成的组合。

所述的血清/血浆miRNA标志物在制备非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

miR-1或miR-499在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用；miR-486或miR-30d高表达患者中，抑制miR-486或miR-30d表达在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用。抑制miR-486或miR-30d表达可采用miR-486或miR-30d表达抑制剂(miRNA抑制物可从市场上购买得到)，或者其他抑制miR-486或miR-30d表达的方法。

所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为：

miR-486的引物为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；miR30d的引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；miR-1的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-499的引物为SEQID No.25和SEQ ID No.26。

上述的任意一对或多对血清/血浆miRNA标志物的引物在制备非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒中的应用。

一种非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆miRNA中miR-486、miR30d、miR-1或miR-499一种或多种miRNA的引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有下列任意一对或多对血清/血浆miRNA标志物的引物：miR-486的引物为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；miR30d的引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；miR-1的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-499的引物为SEQID No.25和SEQ ID No.26。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析：选择不同预后情况的NSCLC患者检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析不同人群血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。(3)筛选疾病特异血清/血浆miRNAs：对已筛选的血清/血浆差异表达miRNAs在大样本人群中进行定量分析验证，确定不同预后情况的NSCLC患者特异性血清/血浆miRNAs，能够特异性指示NSCLC发展和预后的动态变化。(4)血清/血浆miRNA诊断试剂盒的研制：根据不同预后情况的NSCLC特异血清/血浆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒，实现NSCLC预后监测和有效的个体化治疗目的。(5)通过体外细胞试验，研究筛选出的miRNA高/低表达对于肺癌细胞迁移能力的影响，发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料和随访资料等(这些资料可用于评价预后，并控制疾病分期、患者年龄等因素对于预后的影响)，并采用了RT-PCR方法、Real-time PCR方法、Solexa测序技术和体外细胞迁移能力检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)新发I-IIIa期腺癌和鳞状细胞癌

(2)均经过手术及术后辅助化疗

(3)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗

本研究共招募得到303例符合标准的样本进行研究。

2.Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到～5μg RNA/50ml血清或血浆。

3.Solexa测序

(1)总RNA进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子

(2)将链接引物(adaptor prime)酶联在小RNA分子的3′与5′端

(3)进行RT-PCR反应后并进行测序

(4)数据分析与处理

4.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法

(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；

(2)设计引物；

(3)加入荧光探针进行PCR反应；

(4)检测并比较不同预后情况的早期NSCLC患者血清/血浆样本中微小核糖核酸的量的变化。

5.qRT-PCR产物的测序验证

(1)利用4种miRNAs(miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499)的反向引物逆转录获得相应的cDNA模板；

(2)利用正向引物和通用反向引物(URP)对四种cDNA模板进行扩增；

(3)将获得的扩增产物克隆到pMD^TM18-T载体(TaKaRa，Japan)中；

(4)利用BcaBEST测序引物M13-47和RV-M(TaKaRa，Japan)进行测序。

6.细胞培养

(1)人肺癌细胞系95-C和95-D购自于ATCC(USA)，95-D为高侵袭力细胞，95-C为低侵袭力细胞；

(2)培养液为含有10％胎牛血清的RPMI 1640。

7.4种miRNAs表达质粒的构建

(1)通过PCR反应从DNA模板扩增获得4种miRNAs(miR-486，miR-30d，miR-1and miR-499)的pri-miRNAs；

(2)将获得的4种pri-miRNAs序列通过XbaI和KpnI双酶切克隆入pcDNA3.1质粒中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，构建表达载体(pcDNA-miR-1、pcDNA-miR-499、pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)；

(3)所有该研究中的构建结果都通过测序等方法证实其真实性。

8.瞬时转染和细胞迁移实验

(1)共包括两套转染体系，转染细胞系为95-C和95-D，转染试剂为Lipofect 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)；

(2)保护性miRNAs(miR-1或miR-499)化学合成的前体miRNAs(pre-miRNAs)或者上述实验方法7构建的表达载体(pcDNA-miR-1或pcDNA-miR-499)分别转染入高侵袭性细胞系(95-D)中，高危险性miRNAs(miR-486或miR-30d)化学合成的前体miRNAs(pre-miRNAs)或上述实验方法7构建的表达载体(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分别转染入低侵袭性细胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌细胞系中高表达，反义miR-30d  序列(miR-30di，序列：5’-CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA-3’)也被瞬时转染入95-C肺癌细胞；

(3)转染24小时后，转染后细胞(5×10⁴)被转入24孔板的小室中，每孔孔径大小尺寸约8um(Millipore Corp.MA)，人工培养7小时；

(4)转染细胞的迁移能力通过Chemotactic分析法检测，在磷酸盐缓冲液中彻底清洗滤膜器，迁移到小室底部的细胞被95％的甲醇固定20分钟，利用0.4％的台盼蓝染色20分钟，最后在光学显微镜下拍片成像并读取细胞数；

(5)研究中设立阴性对照(NC)，即由一个对照miRNA前体或者空pcDNA3.1载体转染入细胞中后获得的迁移细胞计数，研究中其他每种miRNA的相对迁移能力均与NC相比获得。每种细胞系均通过三平行检测结果并且至少重复3次。

9.诊断试剂盒制备方法

Solexa方法确定预后良好和预后较差的NSCLC患者中有拷贝差异的miRNA，通过qRT-PCR技术筛选在预后良好和预后较差状态下表达量和差异程度大的一组血清/血浆微小核糖核酸，作为NSCLC辅助治疗决策的指标。最后筛选出的对应预后良好和预后较差的血清/血浆miRNA组成诊断试剂盒(miR-486、miR30d、miR-1和miR-499)。诊断试剂盒包括这些血清/血浆微小核糖核酸的一对或多对引物，探针，以及Taq酶、dNTP等试剂。

10.统计分析方法

运用χ²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征、吸烟、组织类型、分期和miRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。生存时间用死亡时间或末次随访时间减去首诊时间获得。Kaplan-Meier方法和log-rank检验用于计算血清/血浆miRNA平均表达水平与生存时间的关系。单因素或者多因素Cox比例风险回归模型用于计算风险率(Hazard Risk，HR)以及它们的95％可信区间。定义那些死亡HR小于1且高表达的miRNAs为保护性miRNAs；定义那些死亡HR大于1且高表达的miRNAs为危险性miRNAs。

我们在探索性样本人群(60例)的研究中发现有4个miRNAs与患者生存情况有显著关联。4种miRNAs的不同表达水平以四分位数表示：Q1表示miRNA表达水平小于等于25百分位数，Q2表示miRNA表达水平大于25百分位数且小于等于50百分位数，Q3表示miRNA表达水平大于50百分位数且小于等于75百分位数，Q4表示miRNA表达水平大于75百分位数。我们将其余243例NSCLC患者随机的分配到Training(测试)组和Testing(验证)组，以miRNA表达水平的中位数为截点将Training组中的患者分为高危险组和低危险组。将Training组中确定的每种miRNA和危险miRNA分类的界限值直接应用于Testing组和总的303例样本中，进而观察本研究结果的稳定程度。

为了进一步研究这四种miRNAs构成的综合指征用于预后评价的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每种miRNA与预后的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们以Training组研究样本的回归系数为权重，根据每种miRNA的表达情况给每个病人确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.969×miR-486的表达水平)+(0.973×miR-30d的表达水平)+(-0.650×miR-1的表达水平)+(-0.815×miR-499的表达水平)。从Training组获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于Testing组和总的303例样本人群中。

所以的统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v.9.1.3)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述303例符合条件的NSCLC患者中，选择30位最后一次随访时生存期超过30个月的存活病人作为“长期生存”组，另外选择30位生存时间小于25个月的已死亡病人作为“短期生存”组，两组间疾病临床分期和吸烟情况精确匹配，均进行手术和术后辅助化疗，组织类型也不存在差异，除了生存情况和生存时间外基本均衡可比。我们将这两组人群作为探索性样本经Solexa测序试验获得相关结果。

根据Solexa测序方法，本发明人检测到在“长期生存”组和“短期生存”组的早期NSCLC患者血清中存在差异表达的微小核糖核酸包括：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、miR-15a、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27、miR-28-3p、miR-29a、miR-30a、miR-33a、miR-92a、miR-93、miR-99a、miR-100、miR-101、miR-29b、miR-103、miR-107、miR-192、miR-197、miR-199a-3p、miR-148a、miR-30d、miR-139-3p、miR-7、miR-10a、miR-10b、miR-181a、miR-181b、miR-210、miR-219、miR-221、miR-222、miR-199b-3p、let-7g、let-7i、miR-1、miR-15b、miR-23b、miR-27b、miR-122、miR-124、miR-128、miR-130a、miR-133a、miR-142、miR-143、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-9、miR-125a、miR-146a、miR-150、miR-184、miR-185、miR-193a、miR-206、miR-320a、miR-29c、miR-34c、miR-99b、miR-130b、miR-30e、miR-375、miR-378、miR-382、miR-340、miR-342、miR-342-3p、miR-323-3p、miR-151-3p、miR-148b、miR-324-3p、miR-339、miR-133b、miR-423、miR-423-3p、miR-486、miR-146b、miR-499。

根据上述Solexa结果，选择满足下列条件的miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证：1)在两组NSCLC患者中倍数差异达5倍的miRNAs作为本发明中初步筛查的血清生物标志物；2)这些miRNAs至少在一组NSCLC患者(“长期生存”组或“短期生存”组)中的拷贝数大于50以提高检测效率。

满足上述条件的miRNAs包括：miR-486，miR-22，miR-30d，miR-21，miR-26b，let7i，miR-378，miR-1，miR-206，miR-146b和miR-499。qRT-PCR结果发现在60例探索性样本中，有4个miRNAs(miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499)在两组患者中的表达情况存在显著性差异。

多因素Cox回归分析结果表明，这4个miRNAs的表达水平均与早期NSCLC患者死亡风险存在着计量-反应关系：两个为危险因素(miR-486和miR-30d，高表达对预后不利)，两个为保护因素(miR-1和miR-499，高表达预后较好)。具有4种miRNAs不同表达水平(以四分位数表示)的患者之间的中位生存期存在显著的统计学差异。

根据上述结果，将这4个与NSCLC预后相关的miRNAs在另外243例NSCLC患者中进一步的验证。我们采用随机数字方法将243例NSCLC患者随机的分配到Training(测试)组和Testing(验证)组。在Training组队列人群中我们发现血清高表达miR-486，miR-30d和低表达miR-1和miR-499均与NSCLC预后不良相关联。在Testing组队列人群中进行验证的结果与Training组相类似。将所有303例研究样本的结果整合，我们同样得到与Training组一致的结果。血清/血浆高表达危险型miRNAs和低表达保护型miRNAs的病人的中位生存期显著缩短，这4个miRNAs的效应相互独立。

我们通过危险度评分方法进一步分析这4个标志物综合与NSCLC预后的关系。我们根据Training组队列人群的上述危险分值中位数作为界值将Training组划分成高危险组和低危险组，结果发现高危险组的病人与低危险组的病人相比，其中位生存期时间较短，死亡风险增加了9.74倍。相同的危险分值计算方法和界值的应用于Testing队列组以及所有的303例病例中，得到的结果均与Training组获得的结果相一致。逐步Cox回归分析结果也表明，4个miRNAs及其组合均与NSCLC的预后独立相关。

此外，为了研究这四种miRNAs在调控肺癌细胞迁移过程中的作用，我们将保护性miRNAs(miR-1或miR-499)前体或表达载体(pcDNA-miR-1或pcDNA-miR-499)分别转染入高侵袭性肺癌细胞系(95-D)中，将高危险性miRNAs(miR-486或miR-30d)前体或表达载体(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分别转染入低侵袭性肺癌细胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌细胞系中高表达，所以反义miR-30d序列(miR-30di，序列：5’CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA)也被瞬时转染入95-C肺癌细胞。结果发现与对照(NC)相比，转染了保护性miRNAs和miR-30di的肺癌细胞的迁移能力明显下降，而转染了高危险性miRNAs的肺癌细胞迁移能力明显增强。表达载体转染实验的结果与之类似，证明：miR-1和miR-499高表达抑制肺癌细胞迁移活性，而miR-486和miR-30d高表达促进肺癌细胞的迁移。

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于NSCLC辅助诊断和疗效监测的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499的引物探针和其他检测试剂。

具体而言，这4种miRNA单独及其组合，或者这4种miRNA的引物的单独及其组合构成的相关诊断试剂盒有助于NSCLC患者预后辅助判断和动态监测，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度减缓NSCLC进展，避免不恰当的治疗，改善生活质量和延长存活时间。miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499对于肺癌细胞迁移能力的影响表明这四种miRNA具有小分子药物的应用价值。

本申请中“血清/血浆”中的“/”表示“和”及“或”的关系。

本发明有益效果：

本发明提供的血清/血浆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)标志物作为NSCLC预后辅助判断和治疗决策的标志物的优越性在于：

(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发将为NSCLC的优化治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)血清/血浆miRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于NSCLC患者的预后判断、疗效评价及对病情发展的动态监测，有助于了解NSCLC患者疾病进展情况，反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密、多阶段的验证和评价体系，本发明人初期采用Solexa全基因组测序技术对血清/血浆miRNAs的进行直接测序以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了多阶段验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

(4)miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499对于肺癌细胞迁移能力的影响表明这四种miRNA不但可以作为标志物，本身可以改变肺癌细胞的迁移、转移能力，具有小分子药物的应用价值。

本发明通过控制临床分期、手术、化疗等影响预后的因素，研究血清/血浆miRNA在非小细胞肺癌个性化辅助治疗决策方面的重大应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于肺癌细胞迁移、转移能力的影响，揭示其治疗价值。因此，本发明获得了肺癌预后特异性血清/血浆miRNAs表达数据库和特异性标志物，尤其是早期患者预后诊断试剂盒，可作为个性化治疗的辅助决策依据，并为干预这些miRNAs达到控制肺癌转移和迁移提供了数据支持；通过血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肺癌的个性化治疗和动态监测更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为寻求个体化治疗方案以及后期临床应用效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供帮助。

附图说明

图1：显示4种miRNAs与NSCLC患者预后情况的Kaplan-Meier曲线估计。

A.Training组(120例病人)；B.Testing组(123例病人)；C.全体研究样本(303例病人)。A、B、C图显示的研究结果顺序依次为miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499(参考表2，表5和表7)。

图2：显示303例NSCLC患者危险度评分分析结果。

上图显示危险度分值分布情况；中图显示NSCLC患者生存状态和生存时间；下图显示NSCLC患者miRNA表达情况，横轴表示病人，纵轴表示miRNA。

图3.显示体外miRNA表达情况改变肺癌细胞的迁移。

上图显示95-D细胞系的迁移试验；下图显示95-C细胞系的迁移试验。

分别与NC(对照miRNA前体或者空pcDNA3.1载体)相比，均显著降低(95-D细胞，miR-499或miR-1)或增加(95-C细胞，miR-486，miR-30d或反义的miR-30di)肺癌细胞的迁移能力^*p＜0.05.^**p＜0.01。migration assay：迁移实验；precursor：前体miRNA；vector：表达载体。纵坐标：迁移细胞数。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2003月7月开始至今从江苏省肿瘤医院和南京医科大学第一附属医院收集了大量的NSCLC患者血清样品，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了303例符合下列标准的样本作为Solexa测序和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：

1、新发I-IIIa期腺癌和鳞状细胞癌；

2、均经过手术及术后辅助化疗；

3、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗。

并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料和随访资料等情况。

实施例2血清/血浆中微小核糖核酸的Solexa测序实验

在上述303例符合条件的NSCLC患者中，选择30位最后一次随访时生存期超过30个月(34.6-61.8个月，平均49.54个月)的存活病人作为“长期生存”组，另外选择30位生存时间小于25个月(2.0-22.5个月，平均9.54个月)的已死亡病人作为“短期生存”组，两组间疾病临床分期和吸烟情况精确匹配，均进行手术和术后辅助化疗，组织类型也不存在差异，除了生存情况和生存时间外基本均衡可比(见表5)。将这两组人群作为探索性样本经Solexa测序试验获得相关结果。具体步骤为：

1、分别取“长期生存”组和“短期生存”组患者的血清50ml，加入等体积的Trizol试剂；

2、相分离：室温放置15min，然后按0.2ml氯仿/1ml Trizol试剂的体积比加入氯仿，震荡15s，室温15min，12,000g，4℃，离心15min；

3、将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；

4、RNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，按0.5ml异丙醇/1ml Trizol试剂体积加入异丙醇，-20℃保存60min，12,000g，4℃，离心60min；

5、用1ml Trizol试剂重悬沉淀，将悬液转移到新的1.5ml的离心管中；

6、重复2，4步(第四步离心改为15min)；

7、RNA洗涤：去掉上清，加入75％乙醇，12,000g，4℃离心5min；

8、测量浓度：通常能得到～5μg RNA/50ml血清；

9、总RNA进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；

10、将链接引物(adaptor prime)酶联在小RNA分子的3′与5′端；

11、进行RT-PCR反应后并进行测序；

12、数据分析与处理：在“长期生存”组和“短期生存”组NSCLC患者中运用Solexa测序方法发现的血清差异表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。

实施例3探索性样本血清中微小核糖核酸的qRT-PCR实验

根据上述Solexa结果，选择满足下列条件的miRNA用qRT-PCR方法进一步的验证：1)在两组NSCLC患者中倍数差异达5倍的miRNAs作为本发明中初步筛查的血清生物标志物，2)这些miRNAs中至少在一组NSCLC患者(“长期生存”组或“短期生存”组)中的拷贝数大于50以提高检测效率。满足上述条件的miRNAs包括：miR-486，miR-22，miR-30d，miR-21，miR-26b，let7i，miR-378，miR-1，miR-206，miR-146b和miR-499。此外，两个let-7家族成员(let-7a和let-7g)虽然仅存在两倍差异，但是已有研究报道这两个miRNAs与肺癌预后相关联，因此也包含在我们的研究中。根据所选miRNAs设计逆转录和q-PCR的引物(详见表4)。用表4所提供的引物对“长期生存”组和“短期生存”组患者的血清进行miRNA的qRT-PCR检验。

(1)制备cDNA样品：a)取500μl血清；b)加等体积的水饱和酚，振荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清；c)上清+1/2体积(250μl)苯酚+1/2体积(250μl)氯仿，振荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清；d)加与上清等体积的氯仿震荡混匀，4℃，13200rpm离心3分钟，取上清作为RNA样品；e)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl10mM dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl RNase抑制剂(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μl miRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

(2)q-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，0.2μl 10μM正向引物一种，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合物(Takara公司)，2μl10×PCR缓冲液，13.5μlH₂O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程2-ΔG表示，其中ΔG＝C_T group1-C_T group2，我们在每个检测版中加入六平行的一个共用的健康人对照标本作为参照，计算相对表达量。

qRT-PCR结果发现在60例探索性样本中，有4个miRNAs(miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499)在两组患者中的表达情况存在显著性差异，见表1。

多因素Cox回归分析结果表明，这4个miRNAs的表达水平均与早期NSCLC患者死亡风险存在着计量-反应关系：两个为危险因素(miR-486和miR-30d，高表达死亡风险显著增加)，两个为保护因素(miR-1和miR-499，高表达死亡风险显著减少)。具有4种miRNAs不同表达水平(以四分位数表示)的患者之间的中位生存期存在显著的统计学差异，见表6。

实施例4血清中微小核糖核酸qRT-PCR实验的进一步研究

根据上述结果，将这4个与NSCLC预后相关的miRNAs在另外243例NSCLC患者中进一步的验证。我们采用随机数字方法将243例NSCLC患者随机的分配到Training组和Testing组，见表5。表达量检测方法参见实施例3。在Training组队列人群中我们发现血清高表达miR-486，miR-30d和低表达miR-1和miR-499均与NSCLC预后不良相关联，见表7，图1A。在Testing组队列人群中进行验证的结果与Training组相类似，见表7，图1B。将所有303例研究样本的结果整合，我们同样得到与Training组一致的结果，见图1C；血清/血浆高表达危险型miRNAs和低表达保护型miRNAs的病人的中位生存期显著缩短，见表2。逐步Cox回归分析结果也表明，4个miRNAs均与NSCLC的预后独立相关(见表8)。

实施例5利用危险度评分方法进一步分析4个微小核糖核酸与NSCLC预后

我们根据Training组队列人群的危险分值的中位数作为界值将Training组划分成高危险组和低危险组，结果发现高危险组的病人与低危险组的病人相比，其中位生存期时间较短，死亡风险增加了9.74(HR＝10.74)，见表3。相同的危险度评分计算方法和界值均应用于Testing队列组以及所有的303例病例中，得到的结果均与Training组获得的结果相一致，见表3。对于4个标志物的联合分析，如图2，危险度评分大于0.415的NSCLC患者(同时满足高表达miR-486，miR-30d和低表达miR-1，miR-499)倾向于较短的生存时间，显示综合考虑4个标志物有更好的辅助判断效果。

实施例6利用体外功能学试验研究4种miRNAs在调控肺癌细胞迁移过程中的作用

我们将保护性miRNAs(miR-1或miR-499)化学合成的前体(pre-miRNAs)或表达载体(pcDNA-miR-1或pcDNA-miR-499)分别转染入高侵袭性细胞系(95-D)中，将高危险性miRNAs(miR-486或miR-30d)化学合成的前体(pre-miRNAs)或表达载体(pcDNA-miR-486或pcDNA-miR-30d)分别转染入低侵袭性细胞系(95-C)中，由于miR-30d在95-C肺癌细胞系中高表达，反义miR-30d序列(miR-30di，序列：5’CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA)也被瞬时转染入95-C肺癌细胞。结果发现，分别与对照相比，转染了保护性miRNAs和miR-30di的肿瘤细胞的迁移能力明显下降，而转染了高危险性miRNAs的细胞迁移能力明显增强，见图3。另外，表达载体(pcDNA-miR-1或pcDNA-miR-499)转染入高侵袭性细胞系(95-D)的结果证实了上述的发现：miR-1和miR-499抑制细胞迁移活性，而miR-486和miR-30d促进肺癌细胞的迁移，见图3。研究发现的这4种miRNAs均可以影响细胞的迁移过程，而该过程是恶性肿瘤(包括NSCLC)进展的关键步骤之一，因此，该研究表明miR-1或miR-499可作为制备治疗NSCLC的药物，而在miR-486或miR-30d高表达患者中，抑制miR-486或miR-30d表达，如使用miR-30di也可以用于制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中。

实施例7用于NSCLC预后辅助判断的微小核糖核酸试剂盒的制作

微小核糖核酸试剂盒的制作和操作流程是基于solexa测序技术和real-time PCR技术和核酸微阵列、杂交等技术。

试剂盒包括一批血清/血浆微小核糖核酸引物(包括下列引物中的一对或多对：miR-486的引物为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；miR30d的引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；miR-1的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-499的引物为SEQ IDNo.25和SEQ ID No.26)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水，荧光探针，RNA酶抑制剂，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，如可选用实施例3中相应实验采用的试剂中的一种或多种，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该趋势辅助判断NSCLC的预后情况或死亡风险，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

序列表

<110>南京医科大学

<120>一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用

<160>28

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-let-7a上游引物

<400>1

acactccagc tgggtgaggt agtaggttgt 30

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-let-7a下游引物

<400>2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaact atac 44

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-let-7g上游引物

<400>3

acactccagc tgggtgaggt agtagtttgt 30

<2l0>4

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-let-7g下游引物

<400>4

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaact gtac 44

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-let-7i上游引物

<400>5

acactccagc tgggtgaggt agtagtttgt 30

<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-let-7i下游引物

<400>6

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaaca gcac 44

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-1上游引物

<400>7

acactccagc tgggtggaat gtaaagaagt 30

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-1下游引物

<400>8

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagatac atac 44

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-21上游引物

<400>9

acactccagc tgggtagctt atcagactga 30

<210>10

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-21下游引物

<400>10

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcaa catc 44

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-22上游引物

<400>11

acactccagc tgggaagctg ccagttgaag 30

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-22下游引物

<400>12

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagacag ttct 44

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>hsa-miR-26b上游引物

<400>13

acactccagc tgggttcaag taattcagg 29

<210>14

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-26b下游引物

<400>14

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagacct atcc 44

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-30d上游引物

<400>15

acactccagc tgggtgtaaa catccccgac 30

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-30d下游引物

<400>16

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcttc cagt 44

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-146b上游引物

<400>17

acactccagc tgggtgagaa ctgaattcca 30

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-146b下游引物

<400>18

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagagcc tatg 44

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-206上游引物

<400>19

acactccagc tgggtggaat gtaaggaagt 30

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-206下游引物

<400>20

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagccac acac 44

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>hsa-miR-378上游引物

<400>21

acactccagc tgggactgga cttggagtc 29

<210>22

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-378下游引物

<400>22

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcctt ctga 44

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>hsa-miR-486上游引物

<400>23

acactccagc tgggtcctgt actgagctgc 30

<210>24

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-486下游引物

<400>24

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagctcg gggc 44

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>hsa-miR-499上游引物

<400>25

acactccagc tgggttaaga cttgcagtg 29

<210>26

<211>44

<212>DNA

<213>hsa-miR-499下游引物

<400>26

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaaac atca 44

<210>27

<211>16

<212>DNA

<213>通用反向引物(URP)

<400>27

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210>28

<211>22

<212>RNA

<213>miR-30di

<400>28

cuuccagucg gggauguuua ca 22

Claims (9)

1、一种与非小细胞肺癌预后相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中的一种或多种。

2、根据权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR-486、miR30d、miR-1或miR-499中二种以上的组合；优选miR-1与miR-499组合，或者miR-486与miR30d组合；进一步优选miR-486、miR30d、miR-1以及miR-499构成的组合。

3、权利要求1或2所述的血清/血浆miRNA标志物在制备非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

4、miR-1或miR-499在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用；在miR-486或miR-30d高表达患者中，抑制miR-486或miR-30d表达在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用。

5、权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为：

miR-486的引物为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；miR30d的引物为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；miR-1的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-499的引物为SEQID No.25和SEQ ID No.26。

6、权利要求5所述的任意一对或多对血清/血浆miRNA标志物的引物在制备非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒中的应用。

7、一种非小细胞肺癌预后辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有血清/血浆miRNA中miR-486、miR30d、miR-1或miR-499一种或多种miRNA的引物。

8、根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求5所述任意一对或多对血清/血浆miRNA标志物的引物。

9、根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。

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