CN111206097A - 一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用 - Google Patents

一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用，所述标志物包括印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9。本发明的四种印迹基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9与肺癌预后具有显著的相关性，印记基因Dcn是肺癌预后最为灵敏和特异的、先于临床病理学特征的标志物，根据四种印记基因的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积，有助于构建肺癌预后分型模型，个体化预测肺癌患者的五年生存期，为肺癌患者提供准确、有用的预后信息。

Description

一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及基因诊断技术领域，涉及一种肿瘤预后标志物、肿瘤预后分型模型及其应用，具体涉及一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用。
背景技术
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。据世界卫生组织(WHO)统计，2012年全球新增肺癌病例182万例，死亡159万例，中国新诊断肺癌病例73.3万例，死亡61.0万例(World Cancer Report 2014)，肺癌占男性发病率和死亡率的第一位，女性发病率的第二位和死亡率的第一位。肺癌患者的生存率与癌症的进展程度密切相关，I期肺癌患者的5年生存率可达70-90％，而IV期肺癌患者的5年生存率不超过10％，因此肺癌的早期诊断和早期治疗是挽救肺癌患者生命的关键。目前针对特定驱动基因突变的靶向治疗效果较好，但是仍然有超过60％的患者没有明确的基因突变可以作为药物靶点，只能不断尝试不同的化疗药物，观察疗效后再决定继续治疗还是更换药物。有一部分发展较快的肺癌患者，可能由于没有及时使用有效的化疗药物而延误了治疗。因此，急需一种能够在癌症早期就能判断病人预后的分子标志物，筛选出预后较差、肺癌进展较快的病人，及时使用效果更好的化疗药物，对挽救病人生命具有重要作用。
基因组印记是表观遗传学中的一种基因调控方式，其特点是通过对特定亲代的等位基因进行甲基化修饰，使基因只有一个等位基因表达，而另一个等位基因陷入基因沉默状态，该种类的基因被称为印迹(记)基因。印迹缺失是指印迹基因去甲基化，导致处于沉默状态的等位基因被激活并且开始表达的一种表观遗传现象。大量研究表明，印迹缺失普遍存在于各类癌症中，并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失比例极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，采用特定的分子检测技术对细胞的异常状态进行分析。
由于印迹基因的功能涵盖细胞信号传递、细胞周期调控、细胞内外物质运输、细胞外基质形成等多方面，所以在不同的癌症中印迹基因的作用有所不同，表达量也相差巨大，故而形成了不同的敏感性和特异性，对肿瘤发生发展过程中的浸润和转移及预后具有显著影响。
基于上述原因，目前的肺癌预后尚无典型的诊断标志物，解析细胞层面上分子标记物的变化，有利于为肺癌患者提供更加精确的预诊和诊断信息。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用，所述标志物与肺癌预后显著相关，构建的肺癌预后分型模型有利于为肺癌患者提供准确、有用的预后信息。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肺癌预后标志物，所述标志物包括印记基因Dcn。
本发明中，印记基因Dcn与肺癌预后具有显著的相关性，即使在接受早期治疗、分化良好的病例中，Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积高显示肺癌患者预后差，五年生存率小于10％，印记基因Dcn是肺癌预后最为灵敏和特异的、先于临床病理学特征的标志物。
优选地，所述标志物还包括印记基因Peg10、Snrpn/Snurf或Trappc9中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述标志物包括印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9。
本发明中，四种印迹基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9与肺癌预后具有显著的相关性，根据四种印记基因的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积，有助于构建肺癌预后分型模型，个体化预测肺癌患者的五年生存期，为肺癌患者提供准确、有用的预后信息。
本发明中，对已知5年生存率信息的155例石蜡包埋肺癌组织样本采用原位杂交方法进行回顾性分析，发现在五年生存率小于10％的肺癌组织样本中，所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1.5％；
在五年生存率小于25％的肺癌患者组织样本中，所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％；
在五年生存率小于35％的肺癌患者组织样本中，所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于2％；
在五年生存率大于60％的肺癌患者组织样本中，所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于2％；
在五年生存率为100％的肺癌患者组织样本中，所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0。
优选地，所述标志物通过肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)影响肺癌预后。
第二方面，本发明提供了一种肺癌预后分型模型，所述分型模型采用如第一方面所述的标志物进行预后分型。
优选地，所述分型模型包括A型、B型、C型、D型和E型；
A型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1.5％；
B型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％；
C型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于2％；
D型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于2％；
E型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0；
其中，所述A型的五年生存率小于10％，所述B型的五年生存率为10％～25％，所述C型的五年生存率为25％～35％，所述D型的五年生存率大于60％，所述E型的五年生存率为100％。
本发明中，采用印记基因的总表达量(TE)与拷贝数异常表达量(CNV)的乘积作为分型模型的参数，原因在于发明人发现在大多数预后差的病例中TE和CNV均具有较高的数值，但是在一些预后好的病例中存在低TE高CNV的情况，因此单独的TE值或CNV值均无法显著区分预后好和预后差的病例，为提高分型模型的准确性，采用TE×CNV作为模型参数。
优选地，所述印记基因的总表达量和拷贝数异常表达量的计算公式为：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
拷贝数异常表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核数量；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核数量；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核数量；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核数量。
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的分型模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)在已知五年生存率信息的样本中采用印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf或Trappc9的探针进行原位杂交；
(2)显微镜下计数a、b、c和d，根据印记基因总表达量与拷贝数异常表达量的计算公式计算样本中印记基因Peg10、Dcn、Snrpn/Snurf或Trappc9的总表达量和拷贝数异常表达量，得到总表达量和拷贝数异常表达量的乘积；
(3)采用学生t检测对印记基因的总表达量和拷贝数异常表达量的乘积进行差异性分析，构建得到所述分型模型。
优选地，步骤(1)所述样本包括石蜡包埋肺癌组织样本、支气管镜活检样本、支气管刷检样本、肺穿刺活检样本、肺泡灌洗液样本、胸水样本或痰液样本中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，采用的155例石蜡包埋肺癌组织样本中包括49例预后良好的病例和106例预后不良的病例，预后良好的比例达到31.6％，稍高于非小细胞肺癌(NSCLC)的平均五年生存率23％，预后良好的比例与大样本统计情况基本一致，保证模型构建不偏离真实情况。
优选地，步骤(2)所述显微镜下计数细胞的数量为400×物镜下1000～3000个/印记基因/样本。
优选地，步骤(2)所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核数量；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核数量；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核数量；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核数量。
第四方面，本发明提供了一种肺癌预后分型方法，所述分型方法采用如第二方面所述的分型模型对肺癌患者组织样本进行分型，预测肺癌患者的五年生存率。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)在待测样本中采用印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf或Trappc9的探针进行原位杂交；
(2’)显微镜下计数a、b、c和d，根据印记基因总表达量与拷贝数异常表达量的计算公式计算样本中印记基因Peg10、Dcn、Snrpn/Snurf或Trappc9的总表达量和拷贝数异常表达量，得到总表达量和拷贝数异常表达量的乘积；
(3’)根据如第二方面所述的分型模型对肺癌患者组织样本进行分型。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的标志物和/或如第二方面所述的分型模型在制备肺癌预后诊断试剂和/或肺癌预后治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供了一种肺癌预后诊断试剂，所述诊断试剂包括如第一方面所述的标志物的探针。
优选地，所述探针靶向标志物印记基因的内含子。
第七方面，本发明提供了一种肺癌预后诊断试剂盒，所述试剂盒包括如第六方面所述的诊断试剂。
优选地，所述试剂盒还包括原位杂交试剂。
优选地，所述原位杂交试剂包括二甲苯、过氧化氢、显色剂或苏木素中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供了一种肺癌预后治疗药物，所述治疗药物包括印记基因Dcn的sgRNA。
优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：ATAAAATATGAAGCTGATCT；
SEQ ID NO:2：TAGTAAGGGCACTATTTCAT。
优选地，所述治疗药物还包括Cas9蛋白。
优选地，所述治疗药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9与肺癌预后具有显著的相关性，其中，印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积高显示肺癌患者预后差，五年生存率小于10％，印记基因Dcn是肺癌预后最为灵敏和特异的、先于临床病理学特征的标志物；
(2)本发明根据四种印记基因的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积，构建的肺癌预后分型模型，可以准确对肺癌样本进行预后分型，有助于个体化预测肺癌患者的五年生存期，对用药选择具有指导作用，有望减少术后的复发和转移；
(3)本发明分析，印记基因Dcn的拷贝数异常表达可能通过CAF导致预后变差。
附图说明
图1为本发明实施例一中印记基因在预后好和预后差的样本中的表达情况；
图2为本发明实施例二中的预后好和预后差的样本四个印记基因的表达情况比较；
图3为本发明实施例三中的预后分型模型示意图；
图4为本发明实施例三中的五种分型中预后好和预后差的样本比例；
图5(A)为预后Dcn高表达、预后差的样本中CAF标志物的表达情况，图5(B)为Dcn不表达、预后好的样本中CAF标志物的表达情况，图5(C)为未敲除Dcn基因的细胞系中CAF标志物的表达情况，图5(D)为敲除Dcn基因后细胞系中CAF标志物的表达情况。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1样本的印记检测
本发明的研究样本包括155例已知5年生存率信息(2010-2014年)、并经过病理验证的石蜡包埋(FFPE)非小细胞肺癌(NSCLC)组织样本。
本实施例对训练集样本进行回顾性分析，采用印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9的原位杂交探针原位杂交检测样本细胞核中印记基因的表达位点，具体包括以下步骤：
(1)将FFPE样本进行细胞切片(10μm)后置于带正电的玻片上，室温下干燥过夜；
(2)采用RNAscope 2.5HD检测试剂盒(ACD)处理样本，首先在二甲苯中进行脱蜡处理，采用过氧化氢封闭样本中的内源性过氧化物酶后，在缓冲液(retrieval buffer)中孵育一段时间，采用RNAscope Protease Plus Reagent(ACD)增强样本通透性并暴露RNA分子；
(3)根据印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9的内含子序列设计原位杂交探针，进行原位杂交，探针由Advanced Cell Diagnostics公司提供；
(4)加入显色剂Fast Red(ACD)进行信号的放大和检测，苏木素染色后显微镜下观察印记基因的表达情况。
结果如图1所示，在预后差的病例中，印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9均具有较高的总表达量，且存在有大量的拷贝数异常情况；而在预后好的病例中，印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9基本不表达。
实施例2数据收集和统计分析
400×物镜下计数细胞核内不存在标记、印记基因没有表达的细胞核数量(a)，细胞核内存在一个红色/棕色标记、印记基因存在的细胞核数量(b)，细胞核内存在两个红色/棕色标记、印记基因缺失的细胞核数量(c)，和细胞核内存在两个以上红色/棕色标记、印记基因拷贝数异常的细胞核数量(d)，400×物镜下计数细胞的个数为2000个/印记基因/样本；
根据公式计算印记基因的总表达量(TE)和拷贝数异常表达量(CNV)，得到TE×CNV的值；
总表达量(TE)＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
拷贝数异常表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
利用学生t检测方法(student’s t-test)在预后好(good prognosis)和预后差(poor prognosis)的病例间，对TE×CNV进行差异性分析。
分析发现，如图2所示，在预后差的病例中，Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9的表达量、尤其是Dcn和Snrpn/Snurf的表达量均显著升高(p<0.05)，印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9可以作为肺癌预后的标志物。
实施例3分型模型的建立
采用四种印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9的TE×CNV值，将训练集病例进行分型，构建得到如图3所示的肺癌预后分型模型，包括五个类型A型、B型、C型、D型和E型；
A型(五年生存率小于10％)：印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1.5％。
B型(五年生存率为10％～25％)：印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％；
C型(五年生存率为25％～35％)：印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于2％；
D型(五年生存率大于60％)：印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于2％；
E型(五年生存率为100％)：印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％。
图4为155例样本的分型情况。
实施例4印记基因Dcn与CAF的关系探究
将实施例1的训练集样本进行原位杂交后，立即进行免疫组化染色。
组织切片在柠檬酸钠溶液中煮沸1h，在2％BSA中封闭30min；
采用兔抗α-SMA抗体(Cell Signaling Technology)和兔抗FAP抗体(Abcam)检测肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)的标志物α-SMA(α-smoothmuscle actin)和FAP(fibroblast activation protein)，同时采用兔抗CD31(BBI lifescience)检测CAF的阴性标志物CD31；
采用兔抗decorin抗体(BBI life science)检测印迹基因Dcn的表达蛋白decorin；
所有抗体采用2％BSA稀释后与样本在4℃下孵育过夜，PBS洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗(BBI life science)，室温孵育20min后用PBS洗涤；
加入显色剂DAB(BBI life science)进行信号检测，显微镜下观察。
如图5(A)所示，在A型样本中，Dcn高表达的基质区CAF标志物同样高表达，如图5(B)所示，在E型样本中，Dcn不表达，CAF标志物表达量很低；
通过CRIPSR/Cas9技术，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的印记基因Dcn特异性sgRNA敲除间充质干细胞HPM中的印记基因Dcn，如图5(C)和图5(D)所示，发现HPM中的α-SMA和FAP的表达量显著下降。
由此说明，印记基因Dcn的拷贝数异常表达可能通过CAF导致预后变差。
综上所述，本发明的印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf和Trappc9与肺癌预后具有显著的相关性，其中，印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积高显示肺癌患者预后差，五年生存率小于10％，印记基因Dcn是肺癌预后最为灵敏和特异的、先于临床病理学特征的标志物；根据四种印记基因的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积，构建的肺癌预后分型模型，可以准确对肺癌样本进行预后分型，有助于个体化预测肺癌患者的五年生存期，对用药选择具有指导作用；本发明分析，印记基因Dcn的拷贝数异常表达可能通过CAF导致预后变差。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 立森印迹诊断技术（无锡）有限公司
<120> 一种肺癌预后标志物、肺癌预后分型模型及其应用
<130> 20191120
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ataaaatatg aagctgatct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tagtaagggc actatttcat 20

Claims (10)

1.一种肺癌预后标志物，其特征在于，所述标志物包括印记基因Dcn。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括印记基因Peg10、Snrpn/Snurf或Trappc9中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述标志物通过CAF影响肺癌预后。
3.一种肺癌预后分型模型，其特征在于，所述分型模型采用如权利要求1或2所述的标志物进行预后分型。
4.根据权利要求3所述的分型模型，其特征在于，所述分型模型包括A型、B型、C型、D型和E型；
A型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1.5％；
B型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于1％；
C型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积不小于2％；
D型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于1.5％，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％或Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积大于0且小于1％，且Trappc9的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积小于2％；
E型：所述印记基因Dcn的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，Peg10的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0，且Snrpn/Snurf的总表达量与拷贝数异常表达量的乘积等于0；
其中，所述A型的五年生存率小于10％，所述B型的五年生存率为10％～25％，所述C型的五年生存率为25％～35％，所述D型的五年生存率大于60％，所述E型的五年生存率为100％。
5.根据权利要求3或4所述的分型模型，其特征在于，所述印记基因的总表达量和拷贝数异常表达量的计算公式为：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
拷贝数异常表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核数量；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核数量；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核数量；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核数量。
6.一种如权利要求3-5任一项所述的分型模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)在已知五年生存率信息的样本中采用印记基因Dcn、Peg10、Snrpn/Snurf或Trappc9的探针进行原位杂交；
(2)显微镜下计数a、b、c和d，根据印记基因总表达量与拷贝数异常表达量的计算公式计算样本中印记基因Peg10、Dcn、Snrpn/Snurf或Trappc9的总表达量和拷贝数异常表达量，得到总表达量和拷贝数异常表达量的乘积；
(3)采用学生t检测对印记基因的总表达量和拷贝数异常表达量的乘积进行差异性分析，构建得到所述分型模型；
优选地，步骤(1)所述样本包括石蜡包埋肺癌组织样本、支气管镜活检样本、支气管刷检样本、肺穿刺活检样本、肺泡灌洗液样本、胸水样本或痰液样本中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述显微镜下计数细胞的数量为400×物镜下1000～3000个/印记基因/样本；
优选地，步骤(2)所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核数量；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核数量；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核数量；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核数量。
7.一种如权利要求1或2所述的标志物和/或如权利要求3-5任一项所述的分型模型在制备肺癌预后诊断试剂和/或肺癌预后治疗药物中的应用。
8.一种肺癌预后诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括如权利要求1或2所述的标志物的探针；
优选地，所述探针靶向标志物印记基因的内含子。
9.一种肺癌预后诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求8所述的诊断试剂；
优选地，所述试剂盒还包括原位杂交试剂；
优选地，所述原位杂交试剂包括二甲苯、过氧化氢、显色剂或苏木素中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种肺癌预后治疗药物，其特征在于，所述治疗药物包括印记基因Dcn的sgRNA；
优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
优选地，所述治疗药物还包括Cas9蛋白；
优选地，所述治疗药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
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