JP2012515533A - 診断、予後診断、および創薬ターゲットの同定のための単細胞遺伝子発現の方法 - Google Patents

診断、予後診断、および創薬ターゲットの同定のための単細胞遺伝子発現の方法 Download PDF

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Abstract

単細胞分析により得られた遺伝子のセットの発現を分析することによる、疾患の診断および予後診断のための方法を提供する。分類により、処置の最適化、ならびに、特定の治療で処置すべきかどうか、および、用量を最適化するための方法、処置の選択などの決定が可能となる。単細胞分析はまた、疾患状態の細胞の変異および/または経路を標的化する治療法の同定および開発も提供する。

Description

相互参照
本出願は、2009年1月20日に提出した米国特許仮出願第61/205,485号の恩典を主張し、上記仮出願は参照により本明細書中に組み入れられる。
政府の権利
本発明は、国立癌研究所（National Cancer Institute、米国）により支給された連邦補助金U54 CA 126524により政府支援下で行った。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
近年、遺伝子の発現パターンの分析により、多くの疾患の診断およびリスク層別化を改善するための方法が提供されている。例えば、網羅的遺伝子発現パターンの教師なし分析により、従来の診断方法に基づいて同種であると考えられてきた疾患において、遺伝子発現の広範囲に及ぶ差異により区別された、分子的に異なる癌のサブタイプが同定された。このような分子サブタイプは、多くの場合、様々な臨床転帰に関連する。網羅的遺伝子発現パターンはまた、臨床的挙動と相互に関連する特徴についても試験して、予後シグネチャー（prognostic signature）を作り出すことができる。
癌は、多くの疾患と同様に、多くの場合は、単一のはっきりとした原因の結果ではなく、むしろ、一見したところ類似する病理学的表現型を最終的に生じる、情報伝達経路の様々な異常によりそれぞれ引き起こされたいくつかの疾患と見なすことができる。癌性の細胞、前癌性の細胞、または同じ組織型の正常細胞と比較して転移の可能性が低い細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドの同定は、診断ツールの基礎を提供し、候補作用物質についての標的を提供することにより創薬を促進し、そしてさらには、処置する癌の型にさらに適合した癌治療のための治療標的を同定するために役立ち得る。
示差的に発現される遺伝子産物の同定もまた、複合疾患の進行および性質の理解を助け、例えば、転移性または炎症性の表現型の発症に関連する表現型の原因である遺伝的要因を同定するための鍵となる。様々な段階で、および様々な細胞型において示差的に発現される遺伝子産物の同定は、早期診断試験を提供し、なおかつ、治療標的となり得る。さらに、示差的に発現される遺伝子産物は、その活性（例えば、その発現、生物学的活性など）を調節する化学療法薬を同定するためのスクリーニングアッセイの基礎となり得る。
疾患の進行を停止させ、罹患率を低下させるために最も重要なことは疾患の早期診断である。遺伝子発現パターンを同定するための患者の試料の分析は、従来の治療と比較して副作用の減少をもたらし得る、より特異的で合理的な疾患の治療の基礎を提供する。なおさらに、病変が患者にとって危険性が低い（例えば、腫瘍が良性である）ことの確認により、不必要な治療を回避することができる。要するに、疾患に関連する細胞における遺伝子発現パターンの同定は、治療法、診断法、予後診断、セラメトリクス（therametrics）などの基礎を提供し得る。
別の例として、感染性疾患は組織および臓器に損傷を与え、これは特定の生物の罹患率および死亡率の原因となる。A型インフルエンザ感染の場合、入院や死亡の最も多い原因は肺組織の感染である。しかし、インフルエンザに感染するまさにその細胞、および傷ついた肺を修復する細胞は、単細胞レベルでは理解されていない。このような知識は、ウイルス感染を防ぐための新規の薬物、および罹患率を改善するための新しい処置などの、介入のための治療標的を同定するために役立ち得る。
多くの腫瘍は、その増殖および生存のために使用するシグナル伝達経路に関して異なり得る、癌細胞の混合集団を含む。これらの癌細胞は、特定の治療に対するそれらの反応に関して異なり、癌幹細胞の特定の集団の耐性は、細胞毒性の放射線治療および化学療法の後の再発の一因となる。このように、病院での処置の失敗は、癌細胞の特定の集団の治療に対する耐性が一部原因で起こり得る。
多くの場合に観察される、処置後すぐの腫瘍の最初の縮小は、腫瘍の塊を含む可能性がある癌細胞の1つの亜集団の相対的感度を反映し得るにすぎず、長期生存においては重要ではない場合がある。したがって、処置に対する反応の評価および予後診断のための最も重要な臨床的変数は、絶対的な腫瘍の大きさではなく、処置後に残っている癌細胞の特定の集団の絶対数であり得る。腫瘍内の癌細胞のこれらの異なる集団により使用されるシグナル伝達経路の差異を同定できれば、細胞の個々の集団を標的化する治療法を設計することができる。全ての集団を標的化することによって、個々の様々な集団に影響を与える薬物で処置することにより腫瘍を排除することができる。
別の例として、炎症性腸疾患は、腸の正常な構造の破壊を引き起こし、下痢、出血、および吸収不良などの問題を生じる。これらの問題は、胃の正常な粘膜内層の崩壊により引き起こされる。結腸の粘膜内層は、陰窩（crypt）からなり、ここには、杯細胞、幹細胞、および前駆細胞が陰窩の基部に存在し、一方、腸細胞と杯細胞を含む成熟細胞は、陰窩の上部にある。炎症性腸疾患について、どの細胞集団が損傷を受けるか、および傷ついた粘膜を修復するために必要なシグナル伝達経路は明らかではない。
少数の細胞を使用して疾患の病変内の細胞の数および表現型を正確に決定する方法が、炎症性腸疾患、感染症、癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、および感染症を含む多数の疾患の、予後診断、診断、特異的な治療法により標的化することができるシグナル伝達経路の同定のための大きな目的である。本発明は、この問題に取り組む。
単細胞遺伝子発現プロファイリングおよび/またはトランスクリプトーム解析の使用のための組成物および方法を提供する。本明細書中で提供する1つの方法は、不均質な固体腫瘍試料中の様々な細胞集団を同定する方法であり、上記方法は、腫瘍由来の個々の細胞を別個の位置に無作為に分配する工程;前記別個の位置の中の個別に分配した細胞の複数の遺伝子についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;およびクラスター分析を行って、1つまたは複数の異なる細胞集団を同定する工程を含む。一部の例では、個々の細胞は分配の前に富化させない。トランスクリプトーム解析は、少なくとも1000個の個々の細胞について同時に行うことができる。トランスクリプトーム解析は、核酸分析を使用して行うことができる。別個の位置は平面状の基質上に存在し得る。一部の態様では、無作為の分配をマイクロ流体システムの中で行う。トランスクリプトーム解析は、発現されたRNA、発現されていないRNA、またはこれらの両方を分析する工程を含み得る。トランスクリプトーム解析は全トランスクリプトーム解析であり得る。トランスクリプトーム解析は、1セットのプライマー対を使用してRNAを増幅する工程を含み得る。一部の態様では、上記プライマー対はネストプライマー（nested primer）ではない。トランスクリプトーム解析は、個々の細胞の全てまたはサブセットについて、同時または実質的にリアルタイムで行うことができる。1つまたは複数の細胞集団は、正常な幹細胞、正常な前駆細胞、正常な成熟細胞、炎症細胞、癌細胞、癌幹細胞、または非腫瘍形成性幹細胞であり得る。
さらに、被検体由来の不均質な腫瘍生検材料を分析する方法を、本明細書中で提供する。上記方法は、前記生検材料由来の細胞を別個の位置に無作為に分配する工程;前記個別に分配した細胞の少なくとも50種類の遺伝子についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;およびトランスクリプトームデータを使用して、腫瘍の1つまたは複数の特性を同定する工程を含む。上記実施する工程は、細胞型の事前の富化を伴わずに行うことができる。同定する特性は、癌細胞の有無、または数であり得る。同定する特性はまた、幹細胞、初期の前駆細胞、初期の分化した前駆細胞、後期の分化した前駆細胞、または成熟細胞の有無、あるいは数であってもよい。同定する特性はまた、1つまたは複数の前記細胞を排除することにおける治療薬の有効性であってもよい。同定する特性はまた、シグナル伝達経路、例えば、癌幹細胞、分化した癌細胞、成熟癌細胞に特異的な経路、またはこれらの組み合わせの活性であってもよい。本明細書中で開示する方法は、癌を有する被検体または癌の病期を診断するために上記特性を使用する工程をさらに含み得る。
本明細書中で開示する別の方法は、疾患状態の細胞が利用するシグナル伝達経路を同定する方法である。上記方法は、不均質な試料由来の細胞を無作為に分配する工程;分配した細胞についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;トランスクリプトーム解析を使用して、少なくとも1つの疾患状態の細胞を同定する工程;少なくとも1つの疾患状態の細胞のトランスクリプトーム解析を、（a）疾患状態ではない細胞;（b）異なる疾患状態の細胞;および（c）疾患状態の幹細胞のトランスクリプトームに対して比較する工程;ならびに、（i）疾患状態の細胞中、（ii）疾患状態の幹細胞中、および（iii）状況に応じて、異なる疾患状態の細胞中で発現されるが、疾患状態ではない細胞中では発現されないシグナル伝達経路を同定し、それにより、疾患状態の細胞が利用するシグナル伝達経路を同定する工程を含む。疾患状態は、癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患であり得る。一部の態様では、シグナル伝達経路は、上記疾患状態の細胞の生存に必要である。
本開示はまた、症状を有する被検体を診断するための方法を提供する。上記方法は、不均質な試料由来の細胞を無作為に分配する工程;分配した細胞について第1のトランスクリプトーム解析を実施する工程;トランスクリプトーム解析を使用して、少なくとも1つの疾患状態の細胞の第1のトランスクリプトーム解析を、疾患状態ではない細胞の第2のトランスクリプトーム解析に対して比較することにより、該少なくとも1つの疾患状態の細胞を同定し、それにより、上記被検体における疾患状態の細胞に関連する症状の有無を診断する工程を含む。疾患状態は、乳癌、結腸癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患であり得る。トランスクリプトーム解析は、発現されたRNA、発現されていないRNA、またはこれらの両方を分析することを含み得る。トランスクリプトーム解析は全トランスクリプトーム解析であり得る。
本明細書中で提供するさらに別の方法は、治療薬をスクリーニングするための方法である。上記方法は、疾患状態の細胞を有する第1の被検体を、1種類または複数の試験作用物質に曝露する工程;対象となる領域から被検体由来の不均質な腫瘍生検材料を得る工程;前記不均質な腫瘍生検材料由来の少なくとも1つの個々の細胞についてトランスクリプトーム解析を実施する工程（ここでは、上記生検材料は、1つまたは複数の疾患状態の細胞を含む）;および、トランスクリプトーム解析を、（i）疾患状態の細胞を有さない第2の被検体;または（ii）上記曝露する工程の前の第1の被検体のいずれかに由来するトランスクリプトームに対して比較する工程;ならびに、第2の被検体または曝露前の第1の被検体のトランスクリプトームとより類似している試験領域から、細胞のトランスクリプトームに影響を与える作用物質を同定する工程を含む。症状は、乳癌、結腸癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患であり得る。治療薬は、抗体または抗体断片、低分子、核酸（例えば、siRNA）、RNA、DNA、RNA-DNAキメラ、タンパク質、またはペプチドであり得る。
本開示はまた、疾患に対する治療薬の潜在的効果を決定する方法を提供する。上記方法は、疾患状態の細胞の第1の集団を個々の位置に分ける工程（ここでは、個々の位置は、個々の細胞を含む）;個々の細胞の少なくとも1つに由来する少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定し、それにより、疾患状態の発現シグネチャーを作製する工程;疾患状態の細胞の第2の集団を作用物質に曝露する工程;疾患状態の細胞の第2の集団を個々の位置に分ける工程（ここでは、個々の位置は個々の細胞を含む）;第2の集団に由来する少なくとも1つの個々の細胞由来の少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定する工程;および第2の集団に由来する個々の細胞由来の発現レベルを、疾患状態の発現シグネチャーに対して比較し、それにより、疾患に対する作用物質の効果を決定する工程を含む。上記曝露工程はインビボで行うことができる。一部の例では、第1の集団と第2の集団は、被検体、例えば、ヒトから単離される。疾患は、癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患であり得る。核酸またはタンパク質は、癌細胞のマーカー、癌幹細胞のマーカー、またはこれらの両方であり得る。発現レベルはmRNA発現レベルであり得る。一部の態様では、mRNA発現レベルの決定には、10種類またはそれ以上の核酸の発現または発現の欠如が含まれる。発現レベルはまた、タンパク質発現レベルであってもよい。上記分ける工程は、個々の細胞上に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体に細胞の集団を曝露することを含み得る。
さらに、治療薬に対する被検体の反応の見込みを決定する方法を、本明細書中で提供する。上記方法は、被検体由来の細胞の集団を個々の位置に分ける工程（ここでは、個々の位置は個々の細胞を含み、上記個々の細胞のうちの少なくとも1つが疾患状態の細胞である）;疾患状態の個々の細胞のうちの少なくとも1つに由来する少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定する工程（ここでは、上記核酸またはタンパク質は治療薬の標的である）;および、前記少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルに基づいて、被検体による反応の見込みを決定する工程を含む。発現レベルはmRNA発現レベルであり得る。一部の態様では、mRNA発現レベルの決定には、10種類またはそれ以上の核酸の発現または発現の欠如が含まれる。発現レベルはまた、タンパク質発現レベルであってもよい。上記分ける工程は、前記個々の細胞上に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体に前記細胞の集団を曝露することを含み得る。治療薬は抗癌剤であり得る。
本明細書中で詳述する別の方法は、個々の細胞からの遺伝子発現を利用する、予後診断方法または診断方法を提供する。上記方法は、不均質な試料由来の細胞を別々にアドレス可能な位置に分ける工程;個々の細胞を溶解し、そして得られる溶解物を少なくとも2つの部分に分割する工程;個々の細胞から、それらに由来するmRNAまたはcDNAを増幅する工程;溶解物の部分の一方から遺伝子発現プロファイルを決定する工程（ここでは、前記遺伝子発現プロファイルが亜集団の情報を提供する）;ならびに、標的の亜集団の中の少なくとも1つの細胞についてトランスクリプトーム解析を実施する工程を含む。一部の方法では、少なくとも102個、または少なくとも103個の個々の細胞を分析する。細胞は、少なくとも1つの細胞表面マーカーの発現について選別できる。本明細書中で開示する方法により分析される細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞であり得る。最初の試料は、106個未満の細胞または105個未満の細胞を含み得る。細胞は、CD34およびThy1のうちの少なくとも一方の発現について選別することができる。一部の態様では、少なくとも1種類または少なくとも5種類の造血幹細胞に関連する遺伝子の発現を決定する。トランスクリプトーム解析は全トランスクリプトーム解析である。
さらに、幹細胞を分類する方法を、本明細書中で提供する。上記方法は、（a）試料から幹細胞のトランスクリプトームプロファイルを得る工程;および（b）得られたトランスクリプトームプロファイルを、参照幹細胞のトランスクリプトームプロファイルと比較する工程を含む。トランスクリプトームプロファイルは、少なくとも約5種類の幹細胞に関連するタンパク質から得られたデータセットを含み得る。分析する幹細胞は、癌幹細胞、造血幹細胞、腸幹細胞、白血病幹細胞、または肺幹細胞であり得る。分析する試料には、癌、例えば、乳癌または結腸癌由来の細胞が含まれ得る。トランスクリプトームプロファイル分析はまた、以下のさらなる工程を含み得る:幹細胞の試料からmRNAを抽出する工程;幹細胞特異的配列に対応する1つまたは複数のmRNA種のレベルを定量化する工程;および前記1つまたは複数のmRNA種のレベルを、参照試料中の上記mRNA種のレベルと比較する工程。
トランスクリプトームに関するデータを収集する方法もまた、本明細書中で提供する。上記方法は、本明細書中に記載する方法のうちのいずれかを使用してトランスクリプトームに関するデータを収集する工程、および上記データをコンピュータに送信する工程を含む。コンピュータは、配列決定装置に接続することができる。トランスクリプトームに対応するデータを、送信後にさらに選別することができる。例えば、データは、コンピュータから抽出することができる、コンピュータで読み取り可能な媒体に記憶させることができる。データは、コンピュータから、離れた位置へ、例えば、インターネットを介して送信することができる。
本特許または出願は、色つきで作成した少なくとも1枚の図面を含む。色つきの図面を含む本特許または特許出願公報のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて当局により提供される。
NOD/SCIDマウスに異種移植したヒトの結腸直腸癌組織（腫瘍＃4m6）から精製したヒトの「結腸直腸癌幹細胞」（EpCAMhigh）のリアルタイムPCRによる単細胞遺伝子発現分析。最初の実験（パネルA）では、16個の単細胞を、5種類の遺伝子の発現について分析し、それぞれの細胞-遺伝子の組み合わせについて27のレプリカを実行した。この実験では、個々の単細胞由来の各mRNA調製物を、反応マトリックスの連続する3行において使用し、最初の3列にプライマーを添加しなかったことを唯一の例外として、各遺伝子特異的プライマーセットを、連続する9列において使用する。各個々の細胞について遺伝子発現のレベルを、カラースケールを使用して3×9のブロックとして視覚化することができる。第2の実験（パネルB）では、同様のアプローチにしたがったが、ここでは、16個の単細胞を、16種類の遺伝子の発現について分析し、各細胞-遺伝子の組み合わせについて9のレプリカを実行した。この第2の場合には、個々の単細胞由来の各mRNA調製物を、反応マトリックスの連続する3行において使用し、各遺伝子特異的プライマーセットを、連続する3列において使用する。つまり、各個々の細胞についての遺伝子発現レベルは、カラースケールを使用して3×3のブロックとして視覚化できる。いずれの場合も、アッセイは、レプリカの各セットの中で高いレベルの再現性および一貫性を示す。 ヒトの「結腸直腸癌幹細胞」（EpCAMhigh/CD166＋細胞、異種移植片＃8m3由来）のリアルタイムPCRによる単細胞遺伝子発現分析。この図では、各行は単細胞を識別し、各列は異なる遺伝子を識別する。遺伝子発現の強度はカラーコードを使用して示す。ここでは、赤色が濃いほど強い強度を示し、緑色が濃いほど弱い強度を示す。この分析は、EpCAMhigh/CD166＋腫瘍細胞を、それらの転写レパートリーに基づいて異なるサブセットにさらに分割できることをはっきりと示す。最も重要なことは、結腸上皮（例えば、サイトケラチン20、CD66a/CEACAM1、炭酸アンヒドラーゼII、MUC2、Trefoilファミリー因子3）の最終分化マーカーをコードする遺伝子の、高レベルの協調的な同時発現を示す細胞のサブセットが、幹細胞機能に必要であることが知られている候補腸幹細胞マーカーまたは遺伝子（例えば、hTERT、LGR5、サバイビン）をコードする遺伝子を発現しないか、あるいは低レベルでしか発現しないこと、あるいはその逆もまた同様であることである。 図3A〜B。a:乳房腫瘍を有するNOD/SCIDマウスの肺細胞からのMTICs 11'ESA＋H2K-の精製。上のパネルは、H2K-Dapilviable系統をゲーティングし、下の左側のパネルは、下の右側のパネルへのCD2441'細胞のゲーティングを促進するために、ESA＋細胞をゲーティングした。b:MTICおよび非TICにおける、HIF1a、Snail2、Zeb2、E-カドヘリン、ビメンチン、VEGFC、CCR7、Lox、Cox2のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析。 原発性のTICとMTICを比較する、マイクロRNA（miR）レベルについてのリアルタイムPCR分析のCT値。 図5A〜5D。乳癌の非腫瘍形成性癌細胞マーカーとしてのCD66a。 数千のCNVについての18個の細胞試料のコピー数多形分析。いくつかは、ゲノムの不安定性に関連し得、多能性幹細胞の性質の変化を引き起こす。 単細胞分析デバイス、原理。 幹細胞関連遺伝子の発現の遺伝子セット富化分析。自己再生する正常なHSC、顆粒球/マクロファージ前駆細胞（GMP）由来の白血病幹細胞により発現されるが、自己再生しない正常なGMPによっては発現されない遺伝子を、乳癌幹細胞（CSC）およびそれらの非腫瘍形成性の子孫（NTG）において分析した。示すように、これらの遺伝子は、CSC遺伝子発現シグネチャーにおいて有意に大きな割合を占めていた。過剰発現された遺伝子のヒートマップを示す。 稀な細胞亜集団の単離のための「インシリコ」での選別の概略図。造血幹細胞などの細胞集団を、FACSにより、単細胞を含有するように96ウェルプレートに選別する。細胞を溶解し、溶解物を2つの部分に分割する。溶解物の一方の部分を1セットの遺伝子の発現について分析し、細胞を、表面タンパク質の発現ではなく転写に基づいて特性決定することができる。この情報を利用して、選択した溶解物および/または同様の細胞からプールした溶解物を、全トランスクリプトーム解析に供する。 コンピュータによるデータ収集、保存、および転送の図的記述。
詳細な説明
本発明の方法は、疾患の診断、特定の治療的介入に対する感受性、予後診断への適用、および新規の創薬ターゲットの同定のために、細胞集団の特性決定のための初代細胞の単細胞遺伝子発現プロファイリングを利用する。不均質な細胞試料を、空間的に分かれた単細胞に分割し、これらを状況に応じて、対象とする性質（表面マーカーを含む場合もある）について選別し、その後、溶解し、内容物を増幅し、対象とする遺伝子の発現について個別に分析する。このように分析した細胞を、個々の細胞の遺伝子シグネチャーにしたがって分類する。このような分類により、試験試料の細胞組成の正確な評価ができる。
診断目的のために単細胞を分析する従来の方法は、所定の型の細胞の数を計測するためのコールターカウンターおよびフローサイトメトリーの使用を含む。しかし、これらの測定は、通常、表面マーカーに対する抗体の使用に基づき、mRNAレベルでの遺伝子発現またはタンパク質の発現をアッセイするものではない。単細胞のPCR分析の先行例が存在するが、これらは、有用な診断情報を提供するには、または組織内の細胞の微妙なもしくは関連する亜集団を識別する能力を提供するには少なすぎる数の細胞および/または遺伝子について行われてきた。病理学者により使用される組織染色方法にも同様の欠点があり、病理学者による定性的判断に強く依存する。さらに、これらの測定は、少数のパラメーターを測定することに限定される。しかし、本発明の方法は、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、またはそれ以上の異なるパラメーターを測定することができる。ここでは、パラメーターには、mRNA発現、遺伝子発現、タンパク質発現が含まれ、さらに、mRNA、遺伝子、および/またはタンパク質の発現と組み合わせた細胞表面マーカーが含まれ得る。
本発明をさらに記載する前に、特定の態様のバリエーションが添付の特許請求の範囲内で行われてもよく、本発明が以下に記載される本発明の特定の態様に限定されるわけではないことが理解される。使用される用語は特定の態様を記載する目的のためのものであり、限定するようには意図されないこともまた理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲においては、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明瞭にそうでないことを示さない限り、複数の指示物を含む。
値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限の間にある各値（文脈が明瞭にそうでないことを示さない限り、下限の単位の10分の1まで）およびその記載されている範囲内にある任意の他の記載されている値または間にある値が、本発明の範囲に含まれるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、指定する範囲内にある任意の特定の除外限度を条件として、独立して、より狭い範囲に含まれてよく、これらもまた本発明の範囲に含まれる。指定する範囲が一方または両方の限度を含む場合、それら包含される限度の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に指定しなければ、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似するかまたは等価な任意の方法、デバイス、および材料も、本発明の実施または試験に使用できるが、説明のための方法、デバイス、および材料を本明細書中に記載する。
本明細書に記載する全ての刊行物は、上記刊行物中に記載されている発明の対象となる内容を記載し、開示するために、参照により本明細書に組み入れられる。上記内容は、本明細書中に記載される発明と組み合わせて使用され得る。
細胞の集団および亜集団への同定と分類
本開示は、細胞の集団および亜集団を同定すること、ならびに、疾患などの症状を診断する、予後診断する、および/もしくはその治療標的を同定するために集団および/または亜集団を使用する、分類方法に関する。疾患には、任意の種類の癌（固体腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、白血病を含むが、これらに限定されない）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患が含まれる。本開示はまた、本明細書中に記載する生物学的マーカーのいずれかの検出に有用な、抗体および核酸プローブ、または本明細書中の生物学的マーカーを調節する試薬などの、本発明の方法の実施において使用する試薬ならびにキットも提供する。上記方法はまた、特定の癌について適切な処置レベルを決定することもできる。
単細胞の単離
単細胞遺伝子発現プロファイリングは、疾患の診断または予後診断への適用、ならびに新規の創薬ターゲットを同定するための研究ツールを提供する。対照となる疾患としては、免疫介在性機能障害、癌などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の方法では、不均質な細胞混合物（例えば、腫瘍の針生検材料、炎症性病変の生検材料、滑液、脊椎穿刺など）を、空間的に分かれた単細胞になるように、例えば、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、マイクロ流体デバイス、またはスライドに、無作為または特定の順序で分割する。その後、細胞を溶解し、内容物を増幅し、対象となる遺伝子の発現について個別に分析する。このように分析した細胞を、個々の細胞の遺伝子シグネチャーにしたがって分類する。このような分類により、試験試料の細胞組成の正確な評価が可能となる。この評価については、例えば、腫瘍中の癌幹細胞の識別および数を決定することにおいて、T細胞、樹状細胞、B細胞などの数および特異性などの、免疫に関連する細胞の識別および数を決定することにおいて用途を見出すことができる。
一部の態様では、分析する細胞試料は一次試料であり、上記一次試料は新規に単離したもの、凍結したものなどでもよい。しかし、分析する細胞は培養した細胞であってもよい。通常、試料は不均質な細胞混合物であり、これには、複数の異なる細胞型、異なる集団、または異なる亜集団（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の細胞型、集団、あるいは亜集団）が含まれる。一部の態様では、試料は、固形腫瘍、白血病、リンパ腫などに由来する癌試料であり、これは生検材料（例えば、針生検材料など）、播種性腫瘍および白血病については血液試料などであり得る。試料は、診断前に得てもよいし、処置の過程その他で得てもよい。
組織からの細胞の単離のためには、適切な溶液を、分散または懸濁に使用することができる。そのような溶液は、一般的には、低濃度（一般的には、5mM〜25mM）の許容される緩衝液と組み合わせて、ウシ胎児血清または他の自然界に存在している因子が好都合に補充されている、平衡塩類溶液（例えば、通常の生理食塩水、PBS、Hank's平衡塩類溶液など）である。好都合な緩衝液としては、HEPES、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などが含まれる。分離した細胞は、細胞の生存性を維持している、通常は、収集管の底に血清のクッションを有している任意の適切な培地の中に収集することができる。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用することができる。上記培地としては、dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove's培地などが含まれ、多くの場合、ウシ胎児血清が補充される。
一部の態様では、試料中の細胞をマイクロアレイ上で分ける。例えば、高度に統合された生存細胞マイクロアレイシステム（highly integrated live-cell microarray system）は、それぞれが単細胞の大きさにちょうど合ったマイクロウェルを利用することができる（Tokimitsu et al.（2007）Cytometry Part A 71k 1003:1010;およびYamamura et al.（2005）Analytical Chemistry 77:8050（それぞれが参照により本明細書中に具体的に組み入れられる）を参照のこと）。FACSまたは他の選別によるような、対象とする細胞の事前の富化は任意であり、一部の態様では、試料由来の細胞を、事前の選別または富化を全く伴わずに、別個の位置に分割する。例えば、試料（例えば、血液試料、生検材料、固体腫瘍）由来の細胞を、異なる位置に個別に単離することができる。典型的には、固体の組織試料については、試料は、機械的に、化学的に、および/または酵素的に分けられる（例えば、トリプシンまたは超音波での処理による）。試料由来の細胞を、個々の細胞は、例えば、平面状の表面上のアドレス可能な位置に単離するための任意の細胞選別デバイス（例えば、マイクロ流体セルソーター）に配置することができる。平面状の表面は、刻み目、障壁、または個々の細胞の単離を確実に行うための他の特徴を有し得る。単離した細胞を、その後、本明細書中の方法にしたがって分析することができる。細胞を異なる位置に分けることが好ましい。ここでは、それぞれの位置は1個または0個の細胞を含む。
細胞を、分離前に、例えば、フローサイトメトリーにより選別してもよい。例えば、FACS選別または大きさの差異による選別を使用して、細胞表面上に存在する1種類または複数のマーカーにしたがって、対象とする細胞の最初の濃度を少なくとも1,000倍、10,000倍、100,000倍、またはそれ以上に増大させることができる。このような細胞を、対象とする集団または亜集団の特定のマーカーである細胞表面マーカーの有無にしたがって選別してもよい。
分析のために細胞を異なる位置に単離する場合、細胞を、フローサイトメトリー、顕微鏡などにより、マイクロ流体ソーターを用いて選別してもよい。微小組立蛍光活性化セルソーター（microfabricated fluorescence-activated cell sorter）は、Fu et al.（1999）Nature Biotechnology 17:1109、およびFu et al.（2002）Anal.Chem.74:2451-2457（それぞれが、参照により本明細書中に具体的に組み込まれている）に記載されている。試料は、多層ソフトリソグラフィを使用して統合型微小組立セルソーター（integrated microfabricated cell sorter）を用いて選別することができる。この統合型セルソーターには、調整された自動様式で細胞の選別を行うための、蠕動ポンプ、ダンパー、スイッチバルブ、ならびに入力ウェル（input well）および出力ウェル（output well）を含む様々なマイクロ流体機能が組み込まれ得る。この統合型セルソーター上の作動弁の活動容積（active volume）は1pL程度の少量であり得、光検知容積は、100fL程度の少量であり得る。従来のFACS機器と比較して、マイクロ流体FACSは、より高い感度、交差汚染がないこと、および低コストを提供する。
さらなる分析および/または操作のために、個々の細胞を、異なる位置（例えば、96ウェルプレートまたはマイクロアレイアドレス）に単離することができる。例えば、造血幹細胞（HSC）を含む細胞集団を、成熟細胞からHSCを区別することができる抗体を利用してFACS分析により選別する。細胞を96ウェルプレートに選別し、適切な方法により溶解し、溶解物を、qPCR、マイクロアレイ分析、および/または配列決定により分析する。
単細胞の単離のためのデバイスとして、マイクロ流体セルソーターが含まれる。上記マイクロ流体セルソーターは、細胞の破片から生存している細胞を単離し、単細胞懸濁液から細胞を選別する。マイクロ流体デバイスは、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、またはそれ以上の異なる表面マーカーからの蛍光シグナル（例えば、標的集団または亜集団のマーカーに対する標識した抗体）と組み合わせて使用することができ、そして、これらを、これに続く遺伝的研究のために個々のビンに入れる。細胞懸濁液を得るための腫瘍もしくは細胞培養物の消化、および蛍光表面マーカーでの細胞の染色などの他の上流の工程を、このシステムに組み込むことができる。分析する細胞の数は試料の不均一性と、試料中の対象となる細胞の予想される頻度に依存する。通常は、少なくとも約102個の細胞を分析し、少なくとも約103個、少なくとも5×103個、少なくとも約104個、少なくとも約105個、少なくとも約106個、少なくとも約107個、少なくとも約108個、少なくとも約109個、少なくとも約1010個、少なくとも約1011個、少なくとも約1012個、少なくとも約1013個、少なくとも約1014個、少なくとも約1015個、またはそれ以上の細胞を分析する。
一部の例では、単細胞分析デバイス（SCAD）はモジュール式であり、統合した全自動様式で以下の工程を実行することができる:（1）組織の消化。組織をデバイスの入力ポート（input port）に入れる。適切な酵素をデバイスに投入し、循環させて（flowed）、細胞懸濁液を得るために細胞外マトリックスの消化を行う。（2）例えば、消化した試料懸濁液をマイクロ流体「メタマテリアル」（これは、粒子の大きさにしたがって流体の流動を分けることができる）に循環させることによる、破片からの生存している細胞の分離。（3）染色。濾過した単細胞懸濁液を、状況に応じて、適切な表面マーカーを使用して、マイクロ流体デバイスのコンパートメントの中で染色する。5種類までの異なるマーカーでの染色が、高純度の癌細胞の集団を得る際には有用であり得る。（4）選別。染色した単細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスの次のコンパートメントへと循環させて、癌細胞を残りの細胞から選別する。ソーターの様々な態様を実施例に記載する。
発現プロファイリング
選別した細胞を、細胞のゲノム（RNA、DNA）および/またはタンパク質組成の分析を行うために、個別に溶解することができる。例えば、mRNAを、oligo-dTビーズのカラム上に捕捉し、ビーズ上で逆転写し、チップから切り離すように処理し、マクロウェルに移すことができる。DNAまたはRNAを分析前に事前に増幅してもよい。事前の増幅は、全ゲノムまたはトランスクリプトーム、あるいはそれらの一部（例えば、対象となる遺伝子/転写物）の事前の増幅であり得る。ポリヌクレオチド試料は、（例えば、qRT-PCRによる）分析、および発現プロファイルの決定のためにチップに移動させることができる。
用語「発現プロファイル」は、発現されたタンパク質および/または発現された核酸を含む広い意味で使用する。核酸試料には、個々の細胞の表現型の決定要因となる対象となる遺伝子についての発現情報を含み得る、複数の異なる核酸または異なる核酸の集団が含まれる。核酸試料としては、RNAまたはDNA核酸（例えば、mRNA、cRNA、cDNAなど）が含まれる。発現プロファイルは、2つの試料の間での示差的な遺伝子発現を決定するための任意の好都合な手法（例えば、mRNA、標識したmRNA、増幅したmRNA、cRNAなどの定量的ハイブリダイゼーション、定量的PCRなど）により作製することができる。被検体または患者の試料（例えば、細胞またはそのコレクション、例えば、組織）をアッセイする。試料は、当該技術分野において公知であるように、任意の従来の方法により収集する。さらに、腫瘍試料を収集し、正常細胞と異常細胞（diseased cell）との間で死亡の差異を生じる治療の相対的効果を決定するために試験することができる。対象となる遺伝子/タンパク質は、本明細書中で提供する遺伝子/タンパク質を含む、予測的であることが明らかになっている遺伝子/タンパク質である。ここでは、発現プロファイルには、列挙する遺伝子/タンパク質のうちの5種類、10種類、20種類、25種類、50種類、100種類、またはそれ以上（全てを含む）についての発現データが含まれ得る。
試料は、当該技術分野において公知であるいくつかの異なる方法、例えば、単細胞からのmRNAの単離により、調製することができ、ここで、単離したmRNAは、示差的発現の分野で公知のように、cDNA、cRNAなどの調製のために増幅するか利用する場合と同様に使用される（例えば、Marcus,et al.,Anal.Chem.（2006）;78（9）:3084-89を参照のこと）。試料は、被検体から採取した任意の組織（例えば、病変または腫瘍組織）から調製することができる。試料の分析は、任意の目的（例えば、診断、予後診断、分類、治療の追跡および/または開発）のために使用することができる。細胞を、分析前に培養してもよい。
発現プロファイルは、任意の従来のプロトコールを使用して最初の核酸試料から作製してもよい。示差的な遺伝子発現分析の分野で利用されているものなどの、発現プロファイルを作製するための様々な異なる様式が知られているが、発現プロファイルを作製するための1つの代表的な、好都合なタイプのプロトコールは、定量的PCR（QPCR、またはQT-PCR）である。例えば、Valera,et al.,J.Neurooncol.（2007）85（l）:1-10に記載されているような、QPCRを行うために利用できる任意の方法論を利用することができる。
アッセイしている試料から発現プロファイルを得た後、発現プロファイルを、参照または対照プロファイルと比較して、診断、予後診断、薬物の効果の分析、または他の所望する分析を行うことができる。参照または対照プロファイルは提供されるか、または経験的方法により得られる場合もある。得られた発現プロファイルを1つの参照/対照プロファイルと比較して、アッセイしている細胞/組織の表現型に関する情報を得ることができる。あるいは、得られた発現プロファイルを2つ以上の異なる参照/対照プロファイルと比較して、アッセイした細胞/組織の表現型に関するより深い情報を得ることができる。例えば、得られた発現プロファイルを、陽性参照プロファイルおよび陰性参照プロファイルと比較して、細胞/組織が対象となる表現型を有しているかどうかに関する確認情報を得ることができる。
差分値（すなわち、2つのプロファイル間での発現の差異）の決定または分析は、任意の従来の方法論を使用して行うことができ、ここで、例えば、発現プロファイルのデジタル画像を比較することによる、発現データのデータベースを比較することによるなどの様々な方法論が、アレイの分野の当業者に公知である。発現プロファイルを比較する方法を記載している特許としては、米国特許第6,308,170号および同第6,228,575号（これらの開示は参照により本明細書中に組み入れられる）が含まれるが、これらに限定されない。発現プロファイルを比較する方法はまた、本明細書中にも記載する。
次に、統計分析工程を、遺伝子のセットの加重コントリビューション（weighted contribution）を得るために行うことができる。例えば、最近傍縮みセントロイド分析（nearest shrunken centroid）を、Tibshirani et al.（2002）P.N.A.S.99:6567-6572に記載されているように適用して、それぞれのクラスについてのセントロイドを算出し、その後、クラス内標準偏差により正規化した所定の発現プロファイルとそれぞれのセントロイドとの間で平均平方距離を算出してもよい。
分類は確率的に定義することができる。ここでは、カットオフを経験的に導いてよい。本発明の1つの態様においては、約0.4の確率を、鎮静期の患者と誘導された状態の患者（induced patient）とを区別するために使用することができる。より通常は、約0.5の確率、および約0.6またはそれ以上の確率を利用することができる。「高い」確率は、少なくとも約0.75、少なくとも約0.7、少なくとも約0.6、または少なくとも約0.5であり得る。「低い」確率は、約0.25以下、0.3以下、または0.4以下であり得る。多くの態様においては、アッセイしている細胞/組織についての上記のように得られた情報を、宿主、被検体、または患者を対象となる治療法で処置すべきかどうかを予測するために、そしてそれにおける用量を最適化するために利用する。
細胞集団および亜集団の特性決定
本発明のいくつかの態様において、例えば、乳癌および結腸癌を含むがこれらに限定されない上皮癌を用いる場合には、癌幹細胞マーカー（例えば、CD66a）の発現による癌幹細胞の特性決定により、CSCを同定することが可能である。自己再生能力と分化能力の両方を有する腫瘍形成性癌細胞の亜集団が存在する。これらの腫瘍形成性細胞は、腫瘍の維持に関与しており、また、腫瘍形成性ではない、異常な分化を示す多数の子孫を生じ、これにより癌幹細胞の基準を満たしている。本発明のマーカーを示差的に発現している癌細胞の亜集団には、腫瘍形成能力がある。本明細書中に示すように、癌幹細胞のマーカーの発現が陽性の細胞集団においては、不均質性が存在し、例えばここでは、CD66細胞について陰性である（CD66-）細胞には、癌幹細胞（腫瘍形成性）が多く含まれ、一方、CD66a＋細胞は腫瘍形成性ではない。集団におけるこのような不均質性の検出により、亜集団を決定することが可能となる。
当業者は、複数の配列（遺伝子、転写物、および/またはタンパク質を示している）を分析できることを理解する。そのような配列は、試料中の細胞の表現型の決定および/または差別化を可能にする。
マーカー、またはマーカーパネルは、試料中の標的集団または亜集団の多数の局面（例えば、組織供給源（例えば、神経か上皮か）、または疾患状態（例えば、癌性か非癌性か）に基づいて選択することができる。細胞集団（例えば、正常細胞由来の癌幹細胞）を区別するために有用な他の配列を、標的集団の中での遺伝子の変化（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）の検出による方法などの、本明細書中に記載する方法を使用して決定することができる。
1つの集団を別の集団と区別する際に有用な核酸は、集団間で比較して、アップレギュレートされていても、またダウンレギュレートされていてもよい。例えば、いくつかの核酸の発現は、正常な細胞に対して癌において、分化した細胞に対して幹細胞において、そして分化した癌細胞に対して癌幹細胞において、アップレギュレーションされるか、あるいはダウンレギュレーションされる。場合によっては、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを、より大きな集団の中で亜集団を区別するために使用することができる。例えば、いくつかの核酸は、正常細胞中でしか発現されないか、正常細胞中および癌細胞中で発現されるか、または癌幹細胞中のみで発現される。
核酸は、別の集団または亜集団、発現レベルが既知である特定の核酸、または標準的な発現レベルと比較して、アップレギュレートされても、またダウンレギュレートされてもよい。あるいは、多数の遺伝子の発現を分析する場合は、平均を引き算し、それぞれの遺伝子について個別に標準偏差で割り算し、そして平均からの偏位度に基づいて数値を割り当てることにより、ヒートマップを作製することができる。例えば、＋/-1の値は、平均から2.5〜3標準偏差を示し得る。このような分析は、「＋/-3」の範囲にある遺伝子を、様々な型の集団をクラスター化するために使用できるように、さらに改良することができる（例えば、クラスター化アルゴリズムによりそれらを判別できるように、癌に「＋3」の値を付与し、正常組織には「-3」の値を付与する）。アップレギュレートされた遺伝子を「＋」値としてもよい。
一部の例では、示差的に発現される核酸の組み合わせを、特定の集団または亜集団についてのプロファイルとして使用することができる。上記プロファイルには、任意の数の示差的に発現される核酸および/またはタンパク質、例えば、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、25種類、30種類、35種類、40種類、45種類、50種類、もしくはそれ以上の核酸および/またはタンパク質が含まれ得る。一部の例では、標的集団または亜集団を同定するために利用する核酸は、標的集団および非標的集団、または非標的亜集団の中で同様に発現され得る。このような同様に発現される核酸は、一般的には、標的集団または亜集団を同定するための他の示差的に発現される核酸と組み合わせて利用される。
本明細書中に記載する方法を、任意の供給源（例えば、生検材料、正常組織、固体腫瘍など）由来の不均質な細胞集団を分析するために使用することができる。このような方法は、標的細胞、癌、または他の幹細胞の存在について、任意の細胞集団（例えば、より大きな不均質な集団または亜集団の中の標的集団、不均質な集団または亜集団）、あるいは不均質な集団全体を単離し、分析するために使用することができる。
生物学的マーカーの発見
本明細書中に開示する方法により、細胞集団または亜集団（例えば、正常細胞、癌細胞、疾患状態の細胞）に関連する新しいマーカーを決定することが可能である。マーカーには、DNA、RNA、およびタンパク質を含むがこれらに限定されないあらゆる生物学的マーカーが含まれ得る。一部の例では、細胞集団のマーカーは、所定の細胞の中では通常発現されない遺伝子またはmRNAである（例えば、前駆細胞による幹細胞遺伝子の発現、または細胞が発現する差別化マーカー、または差別化マーカーもまた発現する細胞による増殖遺伝子の発現）。典型的には、2種類以上のマーカー、例えば、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、30種類、40種類、50種類、60種類、70種類、80種類、90種類、100種類、200種類、300種類、400種類、500種類、600種類、700種類、800種類、900種類、1000種類、またはそれ以上のマーカーを評価する。マーカーが、発現されたRNAである場合は、トランスクリプトームの任意の部分から全トランスクリプトームまで（全トランスクリプトームを含む）を決定することができる。
特定の標的細胞集団または亜集団における核酸の発現パターンの分析は、標的集団または亜集団を他のものと区別する新しい生物学的マーカーの同定につながり得る。例えば、特有の表面マーカータンパク質が標的集団または亜集団の中で発現される場合は、（例えば、FACSにより）同じ個体もしくは他の個体においてその集団または亜集団の細胞を単離および/または同定することにおける使用のためにそのマーカーに結合する抗体を開発することができる。集団または亜集団特異的生物学的マーカーの同定には、細胞集団または亜集団上に特定のマーカーが存在しないことが含まれ、これが陰性選択を可能にする。集団または亜集団におけるマーカーの存在は、本明細書中に記載する方法を使用して決定することができ、細胞集団を定義するために使用することができる。分析する細胞集団または亜集団中のmRNAは、特定の遺伝子が正常な細胞と癌細胞とで示差的に発現されることを示している。示差的な発現には、転写レベルの上昇もしくは低下、転写されないこと、および/または発現調節の変化（例えば、刺激に反応した異なる発現パターン）が含まれ得る。細胞集団または亜集団のマーカーとなるmRNAあるいは他のマーカーにはまた、その細胞集団または亜集団（例えば、癌細胞および癌幹細胞、しかし正常細胞ではない）中に存在する変異が含まれ得る。当業者は、このようなマーカーが、試験した1つの個体由来の細胞集団を示し得る、および/または多くの個体についてのマーカーを示し得ることを理解する。一部の例では、発現されたmRNAはタンパク質に翻訳され、これを多様なタンパク質検出方法のうちの任意のもの（例えば、免疫アッセイ、ウェスタンブロットなど）により検出することができる。
検出することができる他のマーカーとして、マイクロRNAが含まれる。一部の例では、特定のマイクロRNAの発現が、類似する細胞集団と比較して、約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、もしくはそれ以上増大しているか、または低下している場合に、マイクロRNAの発現レベルは、細胞集団についてのマーカーとなる。
細胞集団および亜集団におけるトランスクリプトームの決定
本発明の方法のいずれか（例えば、集団からの細胞のFACS分離、続く部分的転写分析）により単離した細胞に関するさらなる情報を得るために、細胞をさらに分析することが有効であり得る。一部の例では、（例えば、事前の富化を伴うかまたは伴わない個々の細胞の単離により）試料から単離した個々の細胞を溶解し、対象となる核酸（例えば、ゲノムDNA、mRNAなど）を収集する。本明細書中に記載するように、単離した細胞をそれらの発現プロファイルにおいて類似性を示すグループ（例えば、癌幹細胞対非幹細胞）にカテゴリー分類するために、遺伝子または遺伝子パネルの転写分析を利用できる。理論に束縛されることは望ましくないが、そのような情報は、遺伝子としての機能の差異を示唆し、細胞がその機能と密接に関係していることを記載し得る。一旦細胞を、類似する細胞のグループ（例えば、類似するまたは同じ転写プロファイルを示している細胞）に整理すれば、個々の細胞由来の溶解物および/または類似する細胞由来のプールされた核酸を含有する溶解物を、トランスクリプトームレベルでさらに分析することができる。場合によっては、溶解物（例えば、単細胞または類似する細胞のプール）を、それぞれの細胞および/または類似する細胞のプールのトランスクリプトームの一部を定義するための方法論（例えば、ハイスループット配列決定）に供する。個々の細胞からの結果を、他の類似する細胞からの結果と比較するおよび/または組み合わせることにより、個々の細胞からのトランスクリプトーム情報を集団レベルで分析することができる。類似する細胞のプールからのトランスクリプトーム情報もまた、そのようなプールの転写特性を定義するために使用することができる。
任意の細胞集団（例えば、幹細胞を含む細胞集団）をそのような様式で研究することができる。一部の態様では、細胞には、胚幹細胞、成体幹細胞（癌幹細胞、造血幹細胞（HSC）、および間充織幹細胞を含むがこれらに限定されない）、ならびに誘導された多能性幹細胞を含む幹細胞が含まれる。一般的には、細胞集団は不均質な集団（例えば、臨床検体）である。より大きな細胞集団の中の対象となる亜集団は、任意の関連する基準（例えば、表面タンパク質の発現）にしたがって本明細書中の任意の方法（例えば、FACS選別）により単離することができる。一部の態様では、そのように選別した細胞を、それぞれの選別した集団が10個またはそれ未満の細胞、5個またはそれ未満の細胞、4個の細胞、3個の細胞、2個の細胞、または1個の細胞を含むように、コンパートメントに入れる。
一部の態様では、細胞を溶解し、2以上の部分に分ける。溶解物の1つの部分を、より大きな不均質な集団の中の亜集団を検出および/または差別化するためにさらに分析する（例えば、発現を検出するための遺伝子パネルの分析）。対象となる亜集団（例えば、造血幹細胞）の中にあることが示された細胞由来の溶解物をさらに分析する。個々の細胞由来の溶解物、または類似する細胞由来のプールされた溶解物を分析することができる。「類似する細胞」集団の決定は、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、15種類、20種類、25種類、30種類、35種類、40種類、45種類、50種類、55種類、60種類、65種類、70種類、75種類、80種類、85種類、90種類、100種類、200種類、300種類、400種類、500種類、600種類、700種類、800種類、900種類、1000種類、またはそれ以上の遺伝子の発現における類似性に基づいて行うことができる。
対象となる細胞および細胞集団または亜集団をさらに分析することができる。細胞集団または亜集団には、もとの試料の一部を構成する細胞（例えば、もとの試料の1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、またはそれ以上を占める細胞）が含まれ得る。本明細書中に記載する方法を使用して、単離した集団または亜集団の51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％が、標的集団または亜集団のメンバーではない細胞を含まないように、対象となる細胞集団または亜集団を、不均質な試料から単離することができる。溶解物を、もとの集団から単離した細胞から調製する場合は、類似する細胞の集団の研究を、類似する細胞に由来する溶解物をプールすることにより行うことができる。
細胞、集団、および/または亜集団のさらなる分析には、全トランスクリプトーム解析が含まれ得る。一部の例では、溶解物は、分析のために増幅することができるmRNAを含むか（例えば、cDNA）、または直接分析される（例えば、mRNA配列決定、マイクロアレイ分析）。mRNAの増幅は、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、インビトロでの転写、ライゲーション-PCR cDNA増幅）により行うことができる。一部の態様では、mRNA増幅を、マイクロ流体デバイスの中で、またはマイクロ流体デバイスを使用して行うことができる。全トランスクリプトーム解析は、Illumina（RNA-Seq）およびHelicos（Digital Gene Expression、すなわち「DGE」）から市販されているものなどの配列決定プラットフォームにより行うことができる。一部の態様では、対象となるポリヌクレオチドを配列決定する。標的核酸は、例えば、Sanger型配列決定を使用する従来のゲル電気泳動に基づく方法により配列決定してよい。あるいは、配列決定は、いくつかの「次世代」法の使用により行ってもよい。このような「次世代」配列決定法としては、以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない:（1）Margulies et al.,Nature（2005）437:376-380（2005）;および米国特許第7,244,559号;同第7,335,762号;同第7,211,390号;同第7,244,567号;同第7,264,929号;同第7,323,305号に記載されている方法ならびに装置を含むが、これらに限定されるわけではない、454/Roche Lifesciencesにより販売されているもの;（2）米国特許出願番号11/167046号および米国特許第7501245号;同第7491498号;同第7,276,720号、および米国特許出願公開番号US20090061439号;同第US20080087826号;同第US20060286566号;同第US20060024711号;同第US20060024678号;同第US20080213770号;および同第US20080103058号に記載されているような、Helicos BioSciences Corporation（Cambridge,MA）により販売されているもの;（3）Applied Biosystemsにより販売されているもの（例えば、SOLiD sequencing）;（4）Dover Systemsにより販売されているもの（例えば、Polonator G.007 sequencing）;（5）米国特許第5,750,341号;同第6,306,597号;および同第5,969,119号に記載されているような、Illuminaにより販売されているもの;ならびに、（6）米国特許第7,462,452号;同第7,476,504号;同第7,405,281号;同第7,170,050号;同第7,462,468号;同第7,476,503号;同第7,315,019号;同第7,302,146号;同第7,313,308号;および米国特許出願公開番号US20090029385号;同第US20090068655号;同第US20090024331号;および同第US20080206764に記載されているものなどの、Pacific Biosciencesにより販売されているもの。全ての参考文献は、参照により本明細書中に組み入れられる。このような方法および装置を、本明細書中では例として提供し、これらは限定と解釈されるべきではない。
全トランスクリプトーム解析を、以下を含むがこれらに限定されない様々な細胞の亜集団のさらなる特性決定を可能にする、複数の理由から行うことができる:（1）亜集団の特有の生物学的性質および/またはそれらの発生を制御している転写因子を明らかにすることができる遺伝子の活性を検出する工程;（2）（例えば、FACS選別により）亜集団を精製するために使用することができる表面マーカーを位置決定するおよび/または特性決定する工程;ならびに、（3）亜集団を集団全体から区別する（例えば、癌幹細胞対正常組織）、疾患に対する潜在的な創薬ターゲットとして、細胞遺伝子および/もしくは遺伝子産物を検出するおよび/または特性決定する工程。
集団および/または亜集団の（例えば、トランスクリプトーム解析による）分析により、亜集団に属する細胞を単離するための技術の改良を可能にすることができる。例えば、上記方法により亜集団特異的表面抗原を明らかにする場合は、任意の利用できる抗体合成方法により開発した抗体を使用して、不均質な集団（例えば、患者試料）からそのような細胞を単離することができる。さらに、他の集団（例えば、同じ患者または異なる患者由来の試料）から細胞を同定するために使用することができる遺伝子発現パネルを開発するために、トランスクリプトームプロファイルを使用することができる。
診断法および予後診断
本発明は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、および感染症を含む任意の症状についての予防、処置、検出、または研究における用途を見出し得る。癌の例としては、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、脳癌、肺癌、乳癌、骨肉腫、および皮膚癌が含まれる。炎症症状の例としては、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎が含まれる。自己免疫疾患の例としては、クローン病、紅斑性狼瘡、およびグレーヴス病が含まれる。例えば、本発明は、以下の予防、処置、検出、または研究における用途を見出す:肛門癌、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝臓癌、および直腸癌などの消化管癌;陰茎癌、前立腺癌、および精巣癌などの泌尿生殖器癌;卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮癌、卵管癌、膣癌、および外陰癌などの婦人科癌;下咽頭癌、咽頭癌、口腔咽頭癌、口唇癌、口腔癌（mouth and oral cancer）、唾液腺の癌、消化管癌、および副鼻腔癌などの頭頸部癌;転移性の癌;肉腫;皮膚癌;膀胱癌、腎臓癌、および尿道癌を含む尿路癌;甲状腺癌、下垂体癌、および副腎癌、および膵島の癌などの内分泌系の癌;ならびに小児癌。
試料中の個々の細胞の最初の分類、およびその分類に基づく、適切な治療、用量、治療法などの選択による、治療を最適化するための方法もまた提供する。これは、望ましくない毒性を最小限にしながら、望ましくない標的細胞に対する抗増殖処置の送達間の差異を最適化する。上記処置は、望ましくない毒性を最小限にし、一方で、有効な抗増殖活性を提供する処置を選択することにより最適化する。処置は、試料中の細胞の1つのサブセットにのみ影響を与えるように選択することができる。場合によっては、試料中の細胞のうちの約5％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.2％未満、約0.1％未満、約0.05％未満、約0.02％未満、約0.01％未満、またはそれより少ない細胞に影響を与える治療を選択する。
症状についてのシグネチャーは、1つの症状の存在を示す単細胞中の1種類または複数の遺伝子あるいはタンパク質の発現パターンを意味し得る。癌幹細胞のシグネチャーは、その発現が癌幹細胞の表現型の指標となる、1種類または複数の遺伝子および/またはタンパク質の発現パターンを意味し得る。自己免疫細胞または炎症細胞のシグネチャーは、その発現が自己免疫細胞または炎症細胞のシグネチャーの指標となる遺伝子および/またはタンパク質を意味する。シグネチャーは、データセットの全てまたは一部から得ることができ、通常、シグネチャーには、少なくとも約5種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約10種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約15種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約20種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約25種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約50種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約75種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約100種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約150種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約200種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約300種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約400種類の遺伝子および/またはタンパク質、少なくとも約500種類の遺伝子および/またはタンパク質、あるいは、それ以上の遺伝子および/またはタンパク質による、遺伝子および/またはタンパク質の発現情報が含まれる。データのサブセットを使用する場合は、上記サブセットには、アップレギュレートされた遺伝子が含まれる場合があり、ダウンレギュレートされた遺伝子が含まれる場合があり、また、これらの組み合わせが含まれる場合もある。
臨床応用のための患者の試料の分析
以下の記述は癌幹細胞に焦点をあてるが、本明細書中に記載する方法を使用して、任意の組織の正常細胞（例えば、正常な幹細胞、正常な前駆細胞、および正常な成熟細胞）、ウイルスに感染した細胞、炎症細胞、前駆細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性細胞、非腫瘍形成性細胞、癌幹細胞、および分化した癌細胞）、疾患状態の細胞（例えば、癌細胞、炎症性腸疾患細胞、潰瘍性大腸炎細胞など）、微生物（細菌、真菌、原生生物）細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の細胞集団を単離および/または分析することができる。したがって、癌幹細胞（CSC）を使用して提供する詳細は、任意の疾患状態または症状について行うことができる分析の例示である。
本発明のいくつかの態様においては、患者試料中のCSCの数を、癌細胞の総数と比較して決定することができる。例えば、生検試料由来の細胞を、癌細胞の指標となる1種類または複数のmRNAおよび/あるいはタンパク質の発現について単離および分析し、CSCの表現型を示す細胞を定量化する。あるいは、CSCの特定の集団または亜集団について収集したデータを、上記集団または亜集団についての親和性（例えば、抗体）スクリーニングを行うために使用することができ、そのような親和性スクリーニングを使用して細胞の数を定量化することができる。典型的には、CSCの割合（％）が大きいほど、癌の表現型を有する細胞の継続的な自己再生能力を示す。患者試料中のCSCの定量化を、陽性および/または陰性参照試料（例えば、血液試料などの患者試料、寛解患者の試料など）と比較することができる。一部の態様では、CSCの定量化は、処置の過程の間に行い、この場合、癌細胞の数と、CSCであるそのような細胞の割合（％）を、治療の過程の前、間、および経過観察として、定量化する。望ましくは、癌幹細胞を標的とする治療は、患者の試料中のCSCの総数および/または割合（％）の減少を生じる。
CSCは、特定のマーカーに関するそれらの表現型により、および/またはそれらの機能的表現型により同定することができる。一部の態様では、CSCを、対象となるマーカーに特異的な試薬と細胞を結合させることにより、同定および/または単離する。分析する細胞は生存細胞であってもよく、また、固定した細胞もしくは包埋した細胞であってもよい。
患者試料中のCSCの存在もまた、癌（例えば、白血病、乳癌、前立腺癌）の病期の指標となり得る。加えて、CSCの検出を使用して、治療に対する反応をモニターし、予後診断に役立てることができる。CSCの存在は、幹細胞の表現型を有している細胞を定量化することにより決定することができる。細胞表面の表現型を決定することに加えて、「幹細胞」特性を有する試料中の細胞を定量化することが有用であり得る。これは、インビボ（例えば、異種移植モデル）における自己再生能力、腫瘍を生じる能力などの機能的基準により決定することができる。
本発明の方法で使用する臨床試料は、様々な供給源、特に血液から得ることができるが、場合によっては、骨髄液、リンパ液、脳脊髄液、滑液などの試料を使用してもよい。試料としては、生検材料、または細胞を含有する他の臨床検体を含むことができる。いくつかの試料には、固体腫瘍またはその一部が含まれる。細胞の塊をアッセイする場合は、そのような塊を、当該技術分野で公知の任意の適切な手法（例えば、酵素消化、物理的分離）により分離させることができる。そのような試料は、遠心分離、懸濁分離、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パニング、FACS、Hypaqueを用いる遠心分離などにより、分析の前に分離することができ、通常、単核細胞画分（PBMC）を使用する。この様式で、試料（例えば、固体腫瘍）由来の個々の細胞を、本明細書中で記載するように、示差的な遺伝子発現および/またはトランスクリプトーム解析について分析することができる。
一旦試料が得られたら、これを直接使用することができ、凍結することができ、また、短時間適切な培地の中で維持することもできる。細胞を維持するために様々な培地を使用することができる。試料は、任意の好都合な手法（例えば、生検、採血、静脈穿刺など）により得ることができる。一部の態様では、試料には、少なくとも約102個の細胞、より通常は、少なくとも約103個、104個、105個、またはそれ以上の細胞が含まれる。典型的には、試料はヒト患者に由来するが、動物モデル（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、霊長類など）の使用も見出し得る。
適切な溶液を、細胞試料の分散または懸濁に使用することができる。そのような溶液は、一般的には、低濃度（一般的には、5mM〜25mM）の許容される緩衝液と組み合わせて、ウシ胎児血清または他の自然界に存在している因子が好都合に補充されている、平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、PBS、Hank's平衡塩類溶液など）である。好都合な緩衝液としては、HEPES、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などが含まれる。
細胞染色の分析は、従来法を使用して行うことができる。正確な計数を提供する技術としては、蛍光活性化セルソーターが含まれる。これは、様々な程度の精巧さを有することができ、例えば、複数のカラーチャンネル、低角度光散乱検出チャンネルおよび鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる。死細胞と会合する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を利用することにより、細胞を、死細胞に対して選択することができる。
親和性試薬は、上記に示した細胞表面分子の特異的受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチド-MHC抗原とT細胞受容体の対（ペプチドリガンドと受容体、エフェクターと受容体分子など）を使用することができる。抗体とT細胞受容体は、モノクローナルであっても、またポリクローナルであってもよく、トランスジェニック動物、免疫化した動物、ヒトまたは動物の不死化B細胞、抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターでトランスフェクトした細胞などにより産生され得る。特異的結合メンバーとしての使用のための抗体の調製およびそれらの適格性の詳細は、当業者に周知である。
1つのアプローチは、親和性試薬としての抗体の使用である。好都合には、これらの抗体を、分離に使用する標識と結合させることができる。特定の細胞型の分離を容易にすることを可能にするための標識としては、磁気ビーズ（これは、直接の分離を可能にする）、ビオチン（これは、支持体に結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて除去することができる）、蛍光色素（これは、蛍光活性化セルソーターとともに使用することができる）などを含むがこれに限定されない当該技術分野で公知の任意の標識が含まれる。使用が見出される蛍光色素としては、フィコビリタンパク質（例えば、フィコエリスリンおよびアロフィコシアニン）、フルオレセイン、およびテキサスレッドが含まれる。多くの場合、各マーカーについて独立した選別ができるように、抗体それぞれを異なる蛍光色素で標識する。
抗体を細胞の懸濁液に添加し、利用できる細胞表面抗原に結合させるために十分な時間インキュベートすることができる。このインキュベーションは、通常、少なくとも約5分、通常は、約30分未満である。分離効率が抗体の不足により限定されないように、反応混合物中に十分な濃度の抗体を有することが望まれる。適切な濃度は滴定により決定する。細胞を分離する培地は、細胞の生存性を維持する任意の培地である。利用できる1つの培地は、0.1％〜0.5％のBSAを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水である。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用することができる。これには、ウシ胎児血清、BSA、HSAなどが添加されていることが多い、Dulbecco's Modified Eagle Medium（dMEM）、Hank's Basic Salt Solution（HESS）、Dulbecco'sリン酸塩緩衝化生理食塩水（dPBS）、RPMI、Iscove's培地、5mMのEDTAを含むPBSなどが含まれる。標識した細胞を、その後、先に記載したように、細胞表面マーカーの発現について定量化することができる。
患者試料から得た示差的な前駆細胞の分析（progenitor analysis）と参照の示差的な前駆細胞の分析との比較は、適切な推論プロトコール、AIシステム、統計比較などの使用により行うことができる。正常細胞、同様の疾患組織由来の細胞などに由来する、参照の示差的な前駆細胞の分析との比較により、疾患の病期の指標を得ることができる。参照の示差的な前駆細胞の分析のデータベースを蓄積することができる。具体的に対象とする1つの分析は、例えば、慢性白血病または疾患の前白血病期において、疾患の加速を初期段階で観察するために、患者を追跡する。本発明の方法は、臨床症候の発症前の加速化現象の検出をもたらし、したがって、早期の治療的介入（例えば、化学療法の開始、化学療法の用量の増大、化学療法薬の選択の変更など）を可能にする。
腫瘍の分類と患者の層化
最初の分類による、およびその情報に基づいた適切な治療、用量、治療法などの選択による、治療を最適化するための方法もまた提供する。これは、望ましくない毒性を最小限にしながら、望ましくない標的細胞に対する抗増殖処置の送達間の差異を最適化する。上記処置は、望ましくない毒性を最小限にし、一方で、有効な抗増殖活性を提供する処置の選択により最適化する。
1つの態様において、本開示は、病変（例えば、腫瘍病巣、免疫疾患試料など）を分類し、それにより、単細胞（CSCを含む）遺伝子発現シグネチャーにしたがって患者をグループ分けする、すなわち「階層化する」方法を提供する。例えば、癌幹細胞を高い割合で含むと分類された腫瘍は、転移および死亡についてより高い危険性があり、これにより、より良性の型の腫瘍よりも積極的に処置することができる。このように、患者試料中に存在する集団または亜集団の分析を、疾患の状態を特性決定する、処置レジメンをモニターする、および/または治療アプローチを開発するために利用することができる。
臨床試験のために、潜在患者のプールの中の各患者の試料を上記のように分類することができる。次に、同様に分類した病変を有する患者を、同種患者の集団が望まれる、治療薬の研究または臨床試験への参加について、選択することができる。患者の分類はまた、不均質な患者集団において治療薬の効果を評価する際にも使用することができる。このように、疾患の分類のための、個々の発現プロファイルの集団のプロファイルに対する比較により、特定の患者または患者集団（すなわち、同じ型の癌を有している患者の1つのグループ）について安全であり、有効であると予想される薬物または他の治療レジメンの選択あるいは設計が可能となる。分類は、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、20種類、25種類、30種類、35種類、40種類、45種類、50種類、もしくはそれ以上の核酸および/またはタンパク質の発現（あるいは発現がないこと）に基づいて行うことができる。
診断、予後診断、治療の評価（セラメトリクス）、および障害の管理
本明細書中に記載する分類方法、ならびにそれらの遺伝子産物および対応する遺伝子および遺伝子産物は、疾患の経路（例えば、発癌経路、炎症経路など）の間の最初の変化を検出する、ならびに/または様々な治療法および予防的介入の有効性をモニターすると考えられる、遺伝的あるいは生物化学的マーカー（例えば、血液または組織中のもの）としての具体的な対象である。
病期診断は、患者の癌性の状態がどの程度進行しているかを記載するために医師が使用するプロセスである。病期診断は、医師が予後を決定する、処置を計画する、およびそのような処置の結果を評価をする際に役立つ。病期診断システムは、癌の型により様々であるが、一般的には、以下の「TNM」システムを含む:Tにより示される腫瘍の型;Nにより示される、癌がリンパ節のすぐ近くに転移しているかどうか;およびMにより示される、癌が体のより遠位部分に転移しているかどうか。一般的に、癌が原発性の病変の領域中でのみ検出可能であり、いずれのリンパ節にも拡散していない場合は、ステージIと呼ばれる。最も近いリンパ節にのみ拡散していれば、ステージIIと呼ばれる。ステージIIIでは、癌は一般的に、原発性の病変の部位に近い近位のリンパ節に拡散している。肝臓、骨、脳、または他の部位などの体の遠位部分に拡散した癌は、ステージIVと呼ばれ、最も進行した病期である。
本明細書中に記載する方法は、癌の攻撃力（例えば、転移の可能性）、ならびに体の様々な領域における存在を同定することによって、病期診断プロセスの微調整を容易にすることができる。したがって、転移の可能性が高い癌を示しているとの分類を有するステージIIの癌は、境界上のステージIIの腫瘍を、病期IIIの腫瘍に変更するために使用され得、このことはより積極的な治療を正当化する。逆に、より低い転移可能性を示しているポリヌクレオチドの存在は、腫瘍のより控えめな病期診断を可能にする。
例えば、ステージIIの患者由来の乳癌生検材料を、本明細書中に記載する方法により分析する。乳癌は、患者の細胞から決定した発現プロファイルに応じて、高い転移可能性があると分類される場合がある。このように、処置を行う医師は、さらなる分類を行わない場合と比べて、そのような情報を使用して患者をより積極的に処置することができる。特定のマーカーの発現の決定もまた、薬物療法における潜在的な標的（例えば、創薬ターゲットを発現している患者に由来する腫瘍形成性細胞）についての情報を提供することができる。
治療法の開発および同定
本明細書中に記載する方法および組成物を、新しい治療薬の開発もしくは同定、および/または既存の治療法の改良に利用することができる。例えば、単細胞分析を使用して、標的細胞集団（例えば、癌幹細胞、癌幹細胞と分化した癌細胞、または分化した癌細胞）についての発現プロファイルを分析し、治療薬の潜在的な標的を検出することができる。潜在的な標的としては、特定の生物学的マーカーおよび誤制御されている経路が含まれるが、これらに限定されない。対象とする標的には、対象とする細胞集団に特異的なマーカーまたは経路が含まれ得る。
1つの例においては、処置のために標的化することができる新規の生物学的マーカーを検出するために、標的集団または亜集団の細胞を、本明細書中に記載するように核酸の発現について分析することができる。例えば、癌幹細胞および/または分化した癌細胞の中でしか発現されない特定の細胞表面分子を、潜在的な治療薬（例えば、表面分子に対して特異性を有する抗体または他の結合部分（毒素または他のそのようなエフェクターと結合する可能性がある））の標的として研究することができる。他の例においては、標的細胞集団を、疾患プロセスに関与している経路の誤調節（例えば、癌細胞における細胞周期機構の制御の喪失）について分析することができる。経路には、遺伝子発現の活性化因子および/またはリプレッサー、特定の遺伝子または遺伝子のセットの発現、ならびにさらに複雑な網羅的経路を含むことができるが、これらに限定されない。そのような誤調節を標的化する治療薬は、標的細胞に関連する核酸の発現を変化させるように標的細胞に影響を及ぼす可能性があり得る。治療薬により誘導された発現の変化は、核酸のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを生じ得る。一部の例では、細胞および/または被検体の、1種類もしくは複数の治療薬での処置により、疾患状態ではない細胞における発現を模倣する核酸の発現が生じ得る（例えば、処置により、非癌性の細胞のものと類似する、細胞周期関連遺伝子の発現が生じる）。
本明細書中に記載する方法および組成物を使用して、1種類または複数の核酸の発現の変化について標的細胞集団を分析することができる。新規のおよび/または改良された治療薬の開発は、標的細胞集団（例えば、結腸癌幹細胞、乳癌細胞など）を分析して、「正常な」細胞と比較して変化した発現プロファイルを示す核酸を決定することを含み得る。そのような細胞を、標的集団の単離した細胞を候補作用物質に曝露すること、そして曝露後の遺伝子の発現の変化について試験することにより、これらおよび/または他の核酸の発現に対する効果について、潜在的な治療薬をスクリーニングするために利用することができる。
本明細書中に開示する方法はまた、遺伝子発現、経路の機能（例えば、細胞周期、TERT経路、酸化的ストレス経路）、および/または細胞の型もしくは形態を含むがこれらに限定されない、特定の細胞の表現型に影響を与える化合物の作用を分析するためにも利用することができる。このように、そのような表現型の特性に影響を与える化合物を、治療薬としての化合物の能力を分析することに加えて、またはその代わりに分析することができる。例えば、1種類または複数の試験化合物に曝露した標的集団（例えば、正常な結腸細胞、正常な乳房細胞、癌細胞、幹細胞、癌幹細胞など）における遺伝子発現の変化の分析を、遺伝子発現または他の所望される表現型（例えば、マーカーの発現、細胞の生存性）に対する試験化合物の作用を分析するために行うことができる。そのような分析は、複数の目的（例えば、細胞周期の研究、または既知のもしくは不明な経路の分析）に有用であり得る。
潜在的な治療的価値について分析する作用物質は、任意の化合物、低分子、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、または治療上の用途に適している他の作用物質であり得る。標的集団の単離した細胞を、潜在的な治療薬のライブラリー（例えば、抗体ライブラリー、低分子ライブラリー）に曝露して、遺伝子発現および/または細胞の生存性に対する作用を決定することができる。場合によっては、候補治療薬は、対象となる細胞集団を特異的に標的化する。例えば、単細胞分析の際に、標的細胞（例えば、癌幹細胞および/または分化した癌細胞）中に存在する変異の存在が明らかになれば、候補治療薬をその変異に対して標的化することができる。一部の例では、処置した細胞を、対象となる1種類または複数の遺伝子の発現に対する候補治療薬の効果、および/あるいはトランスクリプトームに対する効果を決定するために、単細胞分析に曝露することができる。
本発明の他の態様においては、作用物質を、標的集団または亜集団上に存在する1種類のマーカーまたはマーカーの組み合わせに特異的に結合させることにより、疾患状態の細胞集団または亜集団に対して標的化する。一部の態様では、作用物質には、細胞傷害性部分に対して結合させてもよい1種類のマーカーまたはマーカーの組み合わせに特異的な抗体あるいはその抗原結合誘導体が含まれる。このようなアプローチを使用して、患者において標的集団または亜集団を枯渇させる（例えば、癌幹細胞集団を枯渇させる）ことができる。
治療薬のスクリーニングアッセイ
1種類のマーカーまたはマーカーの組み合わせを発現している細胞（例えば、疾患状態の細胞）もまた、分化した癌細胞および/または癌幹細胞に作用する因子および化学療法薬を検出するためのインビトロアッセイならびにスクリーニングに有用である。具体的に対象とするものは、ヒトの細胞に作用する作用物質についてのスクリーニングアッセイである。多種多様なアッセイをこの目的のために使用することができ、これには、タンパク質の結合についての免疫アッセイ、細胞の増殖、分化、および機能的活性の決定;因子の生産などが含まれる（例えば、Balis,（2002）J.Nat'l Cancer Inst.94:2;78を参照のこと）。他の態様においては、本発明の1種類のマーカーまたはマーカーの組み合わせに対応する単離したポリペプチドが、薬物スクリーニングアッセイに有用である。
生物学的に活性な作用物質、抗増殖薬物などについてのスクリーニングアッセイにおいては、1種類のマーカーまたは標的細胞組成物を、対象となる作用物質と接触させ、上記作用物質の効果を、細胞に対する出力パラメーター（例えば、マーカーの発現、細胞の生存性など）;あるいは、ポリペプチドの酵素活性もしくは受容体活性に対する結合効力または効果をモニターすることにより評価する。例えば、「癌幹細胞」の発現プロファイルを有することが公知である乳癌細胞組成物を試験作用物質に曝露し、曝露した細胞を、本明細書中に記載するように個別に分析して、上記試験作用物質が、処理していない細胞と比較して発現プロファイルを変化させたかどうかを決定する。本明細書中に記載するか、または本明細書中に記載する方法により産生した任意の単離した細胞集団は、新規に単離したもの、培養したもの、遺伝的に変化させたものなどである。細胞は、例えば、別々の培養物に分け、サイトカインまたはそれらの組み合わせの存在下あるいは非存在下で、例えば、薬物を用いてあるいは薬物を用いることなく、異なる条件下で増殖させた、クローン培養物の環境により誘導した変異体であり得る。反応のタイミングを含む、細胞が作用物質（例えば、ペプチド、siRNA、低分子など）、特に、薬理作用のある物質に反応する様式は、細胞の生理学的状態の重要な反映である。
パラメーターは、細胞の定量化可能な成分、特に、例えば、ハイスループットシステムにおいて正確に測定することができる成分である。パラメーターは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質、またはそれらの立体配置もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機もしくは無機分子、核酸（例えば、mRNA、DNAなど）を含む任意の細胞成分あるいは細胞生成物、あるいは、そのような細胞成分に由来する部分またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、1つの態様においては、本明細書中に記載するように単離した細胞を、1種類または複数の作用物質と接触させ、対象となる核酸の発現レベルを決定する。例えば、細胞が疾患状態ではない細胞とより類似する発現パターンを示す場合は、検出した核酸の発現を変化させる作用物質を、治療効果についてさらに分析することができる。ほとんどのパラメーター（例えば、mRNAまたはタンパク質の発現）は、定量的読み出しを提供するが、場合によっては、半定量的または定性的結果も許容可能である。読み出しには、1つの決定された値が含まれる場合があり、また、平均、中央値、または偏差などが含まれる場合もある。パラメーターの読み出し値の範囲が、多数回の同じアッセイにより各パラメーターについて得られることが特徴的である。ばらつきが予想され、試験パラメーターのセットそれぞれについて値の範囲が、単一の値を得るために使用される一般的な統計学的方法とともに標準的な統計学的方法を使用して得られる。
スクリーニングの対象となる作用物質には、多数の化学的クラス、有機金属分子を含み得る主要な有機分子、遺伝子配列などを含む既知の化合物および不明な化合物が含まれる。本発明の1つの重要な態様は候補薬物を評価することであり、これには毒性試験などが含まれる。
複合体の生物学的作用物質に加えて、候補作用物質には、構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む有機分子が含まれ、典型的には、少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、多くの場合は、少なくとも2つの官能性化学基が含まれる。上記候補作用物質は、1つまたは複数の上記官能基で置換した、環状の炭素、もしくは複素環構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含み得る。候補作用物質はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはそれらの組み合わせを含む生物学的分子の中からも見出すことができる。一部の例では、試験化合物は公知の機能（例えば、酸化的ストレスの緩和）を有し得るが、明らかにはなっていない機構を通じて作用するか、または明らかにはなっていない標的に対して作用する可能性もある。
薬理学的活性のある薬物、遺伝的活性のある分子などが含まれる。対象となる化合物としては、化学療法薬、ホルモン、またはホルモンアンタゴニストなどが含まれる。本発明に適している薬学的作用物質の例は、以下に記載されているものである:"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Goodman and Gilman,McGraw-Hill,New York,New York,（1996）,第9版,以下のセクション:Water,Salts and Ions;Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism;Drugs Affecting Gastrointestinal Function;Chemotherapy of Microbial Diseases;Chemotherapy of Neoplastic Diseases;Drugs Acting on Blood-Forming organs;Hormones and Hormone Antagonists;Vitamins,Dermatology;およびToxicology（全て参照により本明細書中に組み入れられる）。毒素、ならびに、生物兵器剤および化学兵器剤もまた含まれる。例えば、Somani,S.M.（編）, "Chemical Warfare Agents",Academic Press,New York,1992を参照のこと。
試験化合物には、上記分子のクラスの全てが含まれ、さらに、含有量が明らかではない試料も含まれ得る。植物、真菌、細菌、原生生物、または動物などの天然の供給源由来の自然界に存在している化合物の複雑な混合物が対象である。多くの試料は、溶液中に化合物を含有するであろうが、適切な溶媒中に溶解させることができる固体試料もまたアッセイすることができる。対象となる試料としては、環境試料（例えば、地下水、海水、採鉱廃棄物など）、生物学的試料（例えば、農作物から調製した溶解物、組織試料など）;製造試料（manufacturing sample）（例えば、医薬の調製の際の経時変化）;ならびに、分析のために調製した化合物のライブラリーなど（例えば、潜在的な治療的価値について評価している化合物、すなわち、薬物候補）が含まれる。
試料または化合物にはまた、さらなる成分（例えば、イオン強度、pH、全タンパク質濃度などに影響を与える成分）も含まれ得る。加えて、試料は、少なくとも部分的な画分または濃度が得られるように処理してもよい。生物学的試料は、その化合物の分解を少なくするように注意を払うのであれば、例えば、窒素下で保存することができ、凍結することができ、またはそれらを組み合わせることもできる。使用する試料の量は、測定可能な検出ができるために十分な量であり、例えば、約0.1ml〜1mlの生物学的試料が十分であり得る。
候補作用物質を含む化合物は、合成化合物または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、多数の手法が、生物学的分子を含む多種多様な有機化合物の無作為および定方向合成に利用できる。これには、無作為化したオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーを利用できるか、あるいはそれらを容易に生産できる。さらに、天然のまたは合成により生産したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生物化学的手法により容易に修飾することができ、そして組み合わせライブラリーを得るために使用することができる。既知の薬理学的作用がある物質を、構造アナログを得るために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向または無作為の化学的修飾に供してもよい。
少なくとも1種類、通常は複数の細胞試料に作用物質を添加することにより、生物学的活性について該作用物質をスクリーニングする。これは、通常は、上記作用物質を含まない細胞と組み合わせて行う。上記作用物質に反応したパラメーターの変化を測定し、結果を、参照培養物（例えば、上記作用物質の存在下および非存在下のもの、他の作用物質を用いて得られたものなど）との比較により評価する。
作用物質は、溶液中で、または容易に溶解する形態で、培養下の細胞の培地に添加することができる。作用物質は、連続的、間欠的、または持続的に、フロースルーシステム（flow-through system）に添加することができ、あるいは、化合物のボーラスを別の静止した溶液に対して一度にまたは除々に添加することもできる。フロースルーシステムにおいては、生理学的に中性の溶液と、試験化合物を添加した同じ溶液の、2種類の流体を使用する。第1の流体を、細胞上を通過させ、続いて第2の流体を通過させる。1溶液法（single solution method）では、試験化合物のボーラスを、細胞を取り囲む培地に対して添加する。培養培地の成分の全濃度はボーラスの添加によって、またはフロースルー法における2つの溶液の間で、有意に変わってはならない。
いくつかの作用物質の処方物には、処方物全体に有意な影響を及ぼす可能性がある、保存剤などのさらなる成分は含まれない。したがって、そのような処方物は、実質的に、生物学的活性のある化合物と生理学的に許容される担体（例えば、水、エタノール、DMSOなど）からなる。しかし、化合物が、溶媒を含まない液体である場合は、処方物は、実質的に化合物自体からなってもよい。
様々な濃度に対する様々な反応を得るために、様々な作用物質濃度を用いて複数のアッセイを並行して行うことができる。当該技術分野で公知であるように、作用物質の有効濃度の決定には、典型的には、1:10、または他の対数スケールでの希釈により得られる濃度範囲を使用する。濃度は、必要に応じて、第2の希釈系列を用いてさらに改良することができる。典型的には、これらの濃度のうちの1つ、すなわち、ゼロ濃度、またはその作用物質の検出レベル未満、または表現型における検出可能な変化を生じない作用物質の濃度もしくはそれ未満は、陰性コントロールとして役立つ。
選択したマーカーの存在を定量化するために、様々な方法を利用できる。存在する分子の量を測定するための好都合な方法は、蛍光、発光、放射活性、酵素活性などであり得る検出可能な部分を有する分子、特に、パラメーターに対する高親和性での結合に特異的な分子を標識することである。蛍光成分は、実質的に任意の生物学的分子、構造、または細胞型を標識するために容易に利用できる。
免疫蛍光成分は、特異的タンパク質に結合するだけではなく、特異的な立体構造、切断産物、リン酸化などの部位修飾に結合するようにもできる。個々のペプチドおよびタンパク質を、例えば、細胞の内側で緑色蛍光タンパク質キメラとしてそれらを発現させることにより、自己蛍光を発するように操作することができる（概要については、Jones et.al.(1999)Trends Biotechnol.17（12）:477-81を参照のこと）。このように、抗体を、それらの構造の一部として蛍光色素を提供するように遺伝子修飾することができる。選択した標識に応じて、パラメーターを、放射免疫アッセイ法（RIA）または酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、均一酵素免疫アッセイ法、および関連する非酵素的技術などの免疫アッセイ技術を使用し、蛍光標識以外を使用して測定することができる。核酸、特にメッセンジャーRNAの定量化もまた、パラメーターとしての関心対象である。これらは、核酸ヌクレオチドの配列に依存するハイブリダイゼーション技術により測定することができる。このような技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応法ならびに遺伝子アレイ技術が含まれる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.編,John Wiley & Sons,New York,NY,2000;Freeman at al.（1999）Biotechniques 26（l）:112-225;Kawamoto at al.（1999）Genome Res 9（12）:1305-12;およびChen et al.（1998）Genomics 51（3）:313-24を参照のこと。
発現プロファイルのデータベースとデータ分析
癌幹細胞および他の細胞型の遺伝子発現プロファイルのデータベース、ならびにそれらの使用も提供する。このようなデータベースは、典型的には、様々な細胞の亜集団（例えば、癌幹細胞、癌の非幹細胞、癌細胞に対する正常な対応物、疾患状態の細胞（例えば、炎症性腸細胞、潰瘍性大腸炎細胞）、ウイルスに感染した細胞、初期の前駆細胞、初期の分化した前駆細胞、後期の分化した前駆細胞、および成熟細胞）に由来する発現プロファイルが含まれる。発現プロファイルおよびそのデータベースは、それらの使用を容易にするために、様々な媒体中に提供することができる。「媒体」は、本発明の発現プロファイル情報を含む製品を意味する。本発明のデータベースは、コンピュータ可読媒体、（例えば、コンピュータにより直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体）上に記録することができる。そのような媒体としては、磁気記憶媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ;光学記憶媒体（例えば、CD-ROM）;電子記憶媒体（例えば、RAMおよびROM）;ならびに、これらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気/光学記憶媒体）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、現在知られているコンピュータ可読媒体のうちの任意のものが、本発明のデータベース情報の記録を含む製造物を作製するためにどのように使用できるかを容易に理解できる。「記録した」とは、当該技術分野で公知であるように、任意のそのような方法を使用してコンピュータ可読媒体上に情報を記憶するためのプロセスを意味する。記憶した情報にアクセスするために使用する手段に基づいて、任意の好都合なデータ記憶構造を選択することができる。様々なデータ処理プログラムおよび形式（例えば、言語処理テキストファイル、データベース形式など）を、記憶のために使用することができる。
本明細書中で使用する場合は、「コンピュータベースのシステム」とは、本発明の情報を分析するために使用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を意味する。本発明のコンピュータベースのシステムの最小のハードウェアには、中央演算処理装置（CPU）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段が含まれる。当業者は、現在利用可能なコンピュータベースのシステムのどれが、本発明での使用に適しているかを、容易に理解することができる。データ記憶手段には、上記のような本発明の情報の記録を含む任意の製造品、またはそのような製造品にアクセスすることができるメモリアクセス手段が含まれ得る。
入力手段および出力手段のための種々の構造フォーマットを、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために使用することができる。このような提示は、当業者に、試験発現プロファイルに含まれる類似性のランク付けを提供し、そして類似性の程度を同定する。
データのセットの分析のための様々な方法を利用することができる。1つの態様においては、発現データを、変換および正規化する。例えば、それぞれの遺伝子についての発現データをセンタリングする（centering）手段により（全てのアレイにわたるその遺伝子の平均強度により所定のアレイ上のそれぞれの遺伝子についての強度の測定値を割り算することにより）、比を得る。（2）その後、得られた比を対数変換し（基数2）、（3）その後、アレイ全体、次いで、遺伝子全体の発現データについて中央値をセンタリングする。
cDNAマイクロアレイデータについて、参照チャンネルにおける局所的なバックグラウンド蛍光シグナルよりも少なくとも1.5倍大きい蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを有する遺伝子を、適切に測定されているとみなす。遺伝子を、それぞれのデータセット内の平均値によりセンタリングし、平均連結クラスター化を行う。
目盛つきのアプローチもまた、データ分析を行うために採用することができる。例えば、遺伝子の発現値のピアソン相関は、各CSCについてのシグネチャーを反映する定量的スコアを提供し得る。相関値が大きいほど、試料は、参照CSCの表現型に似ている。同様の相関を、正常細胞、前駆細胞、自己免疫の表現型の細胞、炎症の表現型の細胞、感染した細胞、分化した癌細胞、正常な幹細胞、正常な成熟細胞などを含む、任意の細胞型について行うことができる。負の相関値は、逆の性質を示す。分類のための閾値は、臨床的な目的に応じてゼロよりも上または下に動かすことができる。例えば、最初の再発事象として転移を予測するための感度および特異性は、0.05の増分で相関スコアについて-1〜＋1の間の各閾値について計算することができ、転移の予測についての所望の感度（例えば、80％、90％、95％など）をもたらす閾値を選択することができる。
有意性の順序（significance ordering）を得るために、有意と決定された仮説のうち本当は帰無仮説に属するものの個数比（false discovery rate；FDR）を決定することができる。最初に、非類似度値の帰無分布（null distribution）のセットを作成する。1つの態様においては、観察されたプロファイルの値の順序を変えて、見こみ外の（out of chance）得られた相関係数の分布の並びを作製し、それにより、相関係数の帰無分布の適切なセットを作製する（Tusher et al.（2001）PNAS 98,5118-21（参照により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。帰無分布のセットは、以下により得る:利用できる全てのプロファイルについて各プロファイルの値の順序を変えること;全てのプロファイルについてペアワイズ相関係数（pairwise correlation coefficient）を計算すること;この順列について相関係数の確率密度関数を計算すること;および、この手順をN回繰り返すこと。ここでは、Nは大きな数であり、通常は300である。N分布を使用して、特定の有意水準で実験により観察した相似値の分布から得られる、その（相似）値を上回る相関係数値の数の適切な測定値（平均、中央値など）を計算する。
FDRは、予想される誤った有意な相関関係（falsely significant correlation）（無作為化したデータのセットの中のこの選択したピアソン相関よりも大きい相関係数から推定する）の数の、経験的データにおけるこの選択したピアソン相関よりも大きい相関関係（有意な相関関係）の数に対する比である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間での相関にも適応することができる。
上記分布を使用して、有意性について信頼度を選択する。これを使用して、偶然得られた結果を上回る相関係数の最も低い値を決定する。この方法を使用して、正の相関関係、負の相関関係、またはこれらの両方についての閾値を得る。この閾値を使用して、ユーザーは、観察したペアワイズ相関係数の値をフィルタリングし、閾値を超えないものを除外することができる。なおさらに、偽陽性の割合の推定を、所定の閾値について得ることができる。個々の「無作為相関」分布のそれぞれについて、どれほど多くの観察がその閾値範囲外にあるかを見出すことができる。この手順は、数の並び（sequence of count）を提供する。この並びの平均と標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数とその標準偏差を提供する。
データを、教師なし階層化クラスタリングして、プロファイル間の関係を明らかにすることができる。例えば、ピアソン相関をクラスタリングメトリック（clustering metric）として利用する、階層化クラスタリングを行うことができる。例えば、多次元尺度構成法を使用する相関マトリックスのクラスター化は、機能的相同性、類似性、および相違点の視覚化を促進する。多次元尺度構成法（MDS）は、一次元、二次元、または三次元に応用することができる。
本分析は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはこれらの組み合わせにおいて実施することができる。1つの態様において、機械で読み取ることができるデータによりコード化されたデータ記憶物質を含有する媒体である、機械で読み取ることができる記憶媒体を提供する。これは、上記データを使用するための指示でプログラムされた機械を使用すると、本発明のデータセットおよびデータ比較のいずれかを表示することができる。そのようなデータは、創薬、細胞成分の間での相互作用の分析などの様々な目的のために使用することができる。一部の態様においては、本発明は、プログラム可能なコンピュータで実行されるコンピュータプログラムにおいて実現される。上記プログラム可能なコンピュータは、処理装置、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリ、ならびに/記憶エレメント）、少なくとも1つの入力デバイスおよび少なくとも1つの出力デバイスを含む。プログラムコードを、上記機能を実行するために入力データに適用し、出力情報を作製する。出力情報は、1つまたは複数の出力デバイスに、公知の様式で送られる。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または従来のデザインのワークステーションであり得る。
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するために、高級言語またはオブジェクト指向プログラミング言語で実行され得る。しかし、プログラムは、もし必要であれば、アセンブリ言語または機械言語で実行されてもよい。いずれにせよ、言語は、コンパイラ言語であっても、また、インタープリタ言語であってもよい。このようなコンピュータプログラムは、それぞれ、記憶媒体または記憶デバイス（例えば、ROMまたは磁気ディスク）上に保存され得る。記憶媒体または記憶デバイスは、本明細書中に記載する上記の手順を実施するために、コンピュータにより上記記憶媒体または記憶デバイスが読み込まれる際に、コンピュータの構成および動作のために、汎用または専用の目的のプログラム可能なコンピュータによって読み込まれる。本システムは、コンピュータプログラムによって構成されるコンピュータ可読記憶媒体として実行されることも考えられ得る。この場合、そのように構成された記憶媒体は、本明細書中に記載する機能を実施するための特定のおよび予め定義された様式でコンピュータを動作させる。
入力手段および出力手段のための種々の構造フォーマットを、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために使用することができる。出力手段についての1つのフォーマットは、信頼できるプロファイルに対して様々な程度の類似性を有するデータセットを試験する。このような提示は、当業者に、その試験パターンに含まれる類似性のランク付けを提供し、そして類似性の程度を同定する。
データの記憶および伝送
さらに、本明細書中に開示する方法により収集した配列および他のデータを、コンピュータにより記憶するおよび/または伝送する方法を、本明細書中で提供する。ソフトウェアおよび記憶デバイスを含むがこれらに限定されない任意のコンピュータまたはコンピュータ付属品を、本発明を実施するために利用することができる。配列または他のデータ（例えば、トランスクリプトームデータ）を、ユーザーが直接または間接的のいずれかでコンピュータに入力することができる。さらに、DNAを配列決定する、またはDNAを分析する、またはトランスクリプトームデータを分析するために使用することができる任意のデバイスを、データをコンピュータおよび/またはコンピュータと適合する記憶デバイスに転送できるように、コンピュータに接続することができる。データは、コンピュータまたは好適な記憶デバイス（例えば、CD）上に記憶することができる。データはまた、1つのコンピュータから別のコンピュータに、またはデータ収集ポイントに、当該技術分野で周知の方法（例えば、インターネット、普通郵便、航空郵便）により送信することもできる。このように、本明細書中に記載する方法により収集したデータは、任意のポイントまたは地理的位置に収集することができ、そして、任意の他の地理的位置に送信することができる。
例示的な方法を図10に示す。この例においては、ユーザーが試料を配列決定装置に入れる。コンピュータに接続した配列決定装置により、データを収集および/または分析する。コンピュータ上のソフトウェアにより、データ収集および/または分析ができる。データを記憶し、表示し（モニターまたは他の類似するデバイスにより）、かつ/または別の位置に送信することができる。図10に示すように、コンピュータを、遠隔地のユーザー（例えば、医師、科学者、または分析者）が利用する携帯型のデバイスにデータを伝送するために利用するインターネットに接続する。データを伝送前に記憶および/または分析できることが理解されている。一部の態様では、生データを収集し、そのデータを分析および/または記憶する遠隔地のユーザーに送信することができる。伝送は、図10に示すように、インターネットを通じて行うことができるが、衛星または他の接続により行うこともできる。あるいは、データは、コンピュータ可読媒体（例えば、CD、メモリ記憶デバイス）上に記憶させることができ、そして上記媒体を、エンドユーザーに（例えば、郵便で）送ることができる。遠隔地のユーザーは、建物、市、州、国、または大陸を含むがこれらに限定されない、同じあるいは異なる地理的位置にいることができる。
試薬およびキット
上記方法の1つまたは複数を実施するための試薬およびそのキットもまた提供する。本発明の試薬およびそのキットは大きなばらつきがある。対象となる試薬としては、表現型の決定要因となる遺伝子の上記発現プロファイルの作製に使用するために特別に設計した試薬が含まれる。例えば、試薬には、標的集団または亜集団において示差的に発現されることが知られている遺伝子に対するプライマーのセットが含まれ得る（例えば、腫瘍形成性の乳癌細胞を検出するための試薬には、CD49f、CD24、および/またはEPCAMを伸張し、発現を検出するためのプライマーならびにプローブが含まれ得る）。
標的細胞集団および亜集団の発現プロファイルを作製するために特別に調整される試薬の1つのタイプは、定量的PCRおよび他の定量化方法において使用するための、そのような遺伝子を選択的に増幅するように設計した遺伝子特異的プライマーのコレクションである。遺伝子特異的プライマー、およびそれらを使用するための方法は、米国特許第5,994,076号（その開示は参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。具体的に対象となるものは、少なくとも5種類の遺伝子、多くの場合は、これらの遺伝子のうちの複数のもの、例えば、少なくとも10種類、15種類、20種類、30種類、40種類、50種類、60種類、70種類、80種類、90種類、100種類、200種類、300種類、400種類、500種類、600種類、700種類、800種類、900種類、1000種類の遺伝子またはそれ以上についてのプライマーを含む、遺伝子特異的プライマーのコレクションである。上記遺伝子特異的プライマーのコレクションには、標的集団または亜集団に関連する遺伝子についてのプライマー（例えば、変異、公知の誤調節が行われている遺伝子など）だけを含めることができ、また、さらなる遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子、対照）についてのプライマーが含まれる場合もある。
本発明のキットには、上記遺伝子特異的プライマーのコレクションが含まれ得る。このキットにはさらに、1つまたは複数の表現型の統計分析のためのソフトウェアパッケージが含まれ得、感受性の確率を計算するための参照データベースが含まれる場合もある。上記キットには、以下のような、様々な方法において利用される試薬が含まれ得る:標的核酸を作製するためのプライマー、dNTPおよび/またはrNTP（予め混合されているか、別々の状態であるかのいずれかであり得る）、1種類もしくは複数の独自に標識されたdNTPおよび/またはrNTP（例えば、ビオチニル化されたか、またはCy3もしくはCy5タグがつけられたdNTP）、異なる散乱スペクトルを有する金もしくは銀粒子、または他の合成後標識試薬（例えば、蛍光色素の化学活性のある誘導体）、酵素（例えば、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼなど）、様々な緩衝媒体（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液）、既製のプローブアレイ、スピンカラムなどの標識したプローブ精製試薬および成分、シグナル生成および検出試薬（例えば、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体、化学蛍光物質または化学発光物質）など。
上記成分に加えて、本発明のキットにはさらに、本発明の方法を実行するための説明書が含まれ得る。これらの説明書は、様々な形態で本発明のキットの中に存在し得、1つまたは複数の説明書がキットの中に存在し得る。これらの説明書が存在し得る1つの形態は、適切な媒体または基板上にプリントされた情報（例えば、キットのパッケージングの中の、添付文書の中の、情報が印刷された1枚または複数の紙）としてである。なお別の手段は、その上に情報が記録されている、コンピュータ可読媒体（例えば、ディスク、CDなど）であろう。存在し得るなお別の手段は、遠隔地で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手法がキットの中に存在し得る。
上記分析方法は、本発明の様々な態様を実行するために、コンピュータにより実行可能な指示のプログラムとして具体化され得る。上記技術のいずれかを、コンピュータまたは他の情報家電またはデジタルデバイスにロードしたソフトウェアコンポーネントにより実行することができる。そのようなことが可能であれば、コンピュータ、器具、またはデバイスを、その後、上記様式で複数の遺伝子に関連する値のセットの分析に役立てるために、または、そのような関連する値を比較するために、上記技術を実行することができる。上記ソフトウェアコンポーネントは、固定媒体からロードすることができ、また、インターネットもしくは他のタイプのコンピュータネットワークなどの通信媒体を通じてアクセスすることができる。上記特徴は、そのようなプログラムを実行する1つまたは複数のコンピュータにより行われ得る1つまたは複数のコンピュータプログラムにおいて具体化される。
以下の実施例は、説明のために提供し、限定のために提供するものではない。
実施例1:単細胞中での遺伝子発現の分析
マウスの乳房CSCのかなりの割合に、比較的低レベルのROSが含まれており、それにより、これらの細胞が、それらのNTC対応物と比較して増強されたROS防御レベルを発現し得るとの仮説を立てた。
単細胞遺伝子発現分析
単細胞遺伝子発現実験のために、本発明者らは、qPCR Dynamic Arrayマイクロ流体チップ（Fluidigm）を使用した。単一のMMTV-Wnt-1 Thy1＋CD24＋Lin-CSC-富化細胞（TG）と"Not Thy1＋CD24＋"Lin"非腫瘍形成性（NTG）細胞を、FACSにより、PCRミックス（CellsDirect,Invitrogen）とRNase Inhibitor（Superaseln,Invitrogen）を含有する96ウェルプレートに選別した。低張溶解（hypotonic lysis）後、本発明者らは、RT-qPCR酵素（SuperScript III RT/Platinum Taq,Invitrogen）と、対象となる遺伝子（Gclm-Mm00514996＿m1、Gss-Mm00515065＿m1、Foxol-Mm00490672＿m1、Foxo4-Mm00840140＿g1、H ifla Mm00468875＿m1、Epas1-Mm00438717＿m1）についての低濃度の分析物（プライマー/プローブ）のプールを含有する混合物を添加した。逆転写（5O℃で15分間、95℃で2分間）、続いて、22回のPCRサイクル（各サイクル:95℃で15秒間、60℃で4分間）の事前の増幅を行った。全RNAである対照についても同時に行った。それぞれ1つの細胞に由来する得られた増幅cDNAを、Taqman qPCRミックス（Applied Biosystems）とともにチップ試料吸入口に挿入した。個々の分析物（プライマー/プローブ）をチップアッセイ吸入口（それぞれについて2つのレプリカ）に挿入した。チップを、チップローダー（Nanoflex,Fluidigm）の中で1時間ロードし、その後、ヒートサイクル（thermocycling）と蛍光の定量化のためにリーダー（Biomark,Fluidigm）に移した。低品質の遺伝子分析物を除くために、本発明者らは、qPCR曲線が非指数的増大を示した遺伝子分析物を除外した。低品質の細胞（例えば、死滅した細胞）を除去するために、本発明者らは、ハウスキーピング遺伝子であるActb（β-アクチン）およびHprt1（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ1）を発現していなかった細胞を除外した。これにより、全部で7枚のチップの実行による248の細胞（109の腫瘍形成性と139の非腫瘍形成性）からなる単細胞遺伝子発現データセットを得た。2つの試料のKolmogorov-Smirnov（K-S）統計値を計算して、2つの集団の中で遺伝子が示差的に発現されていたかどうかを試験した。本発明者らは、試料の標識の順序を変え（すなわち、TG対NTG）、そして実際のK-S統計値を、順序を変えることにより導いた帰無分布における統計値と比較することによりp値を得た。上記p値をさらに、多重仮説検定用に調整するためにBonferroni補正により補正した。実施例2「単細胞遺伝子発現分析」に基づく新規の方法である、SINCE-PCRを使用した、ヒトの「結腸直腸癌幹細胞」（Co-CSC）の分析と定量化。
SINCE-PCR法により、これまではできなかった純度および解像度で、ヒトの結腸直腸癌組織における「癌幹細胞」の同定、特性決定、および定量化が可能となる。腫瘍形成性であり得るか、または癌源細胞（tumor-initiating cell）であり得る癌幹細胞は、免疫不全マウスに移植すると腫瘍を形成する能力を有し得る癌細胞の亜集団である。癌幹細胞集団は、現在、乳癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、および結腸癌において同定されている。「癌幹細胞」の正確な機能の決定および定量化は、ヒトの癌の診断、予後診断、分類、および治療標的化についてのいくつかの重要な暗示を有する。
本発明者らは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムPCR）による単細胞遺伝子発現分析に基づく、ヒトの結腸直腸癌組織中の「癌幹細胞」の同定、分析、および定量化のための新規の方法を記載する。本発明者らは、同じ腫瘍組織内の異なる癌細胞のサブセットを同定するための「シグネチャー」としてその協調的かつ示差的な発現を使用することができる新規の遺伝子セットを同定した。この新規の遺伝子のセットには、全ての上皮細胞に共通するハウスキーピング遺伝子（EpCAM、β-アクチン、GAPDH）、幹細胞のバイオロジーに関連する遺伝子（hTERT、LGR5、サバイビン）、および異なる細胞系統に関連する組織特異的分化経路に関与している遺伝子（炭酸アンヒドラーゼII、MUC2、Trefoilファミリー因子3）、および正常な結腸上皮の分化の段階に関与している遺伝子（サイトケラチン20、CD66a/CEACAM1）が含まれる。この遺伝子のセットの発現パターンに基づいて、ヒトの結腸直腸癌組織から精製し、単細胞として個別に分析した上皮細胞を、より進行した分化の段階またはあまり進行していない分化の段階に対応する異なるグループ（例えば、ヒトの結腸陰窩の上部にある最終分化した細胞対ヒトの結腸陰窩の底部にあるより未成熟な細胞）に、および結腸上皮の異なる分化系統（例えば、杯細胞、腸細胞、未成熟細胞）に、「分類し」、クラスター化することができる。個々のグループを、集団全体に対する割合（％）として定量化することができる。本発明者らは、生物学的組織の細胞組成の分析のためのこのアプローチと方法論を、「SINCE-PCR」（Single Cell Expression-Polymerase Chain Reaction；単細胞発現-ポリメラーゼ連鎖反応）と命名した。
本発明者らの発見は、いくつかの観察に基づく。新しく採取した固体腫瘍組織から直接フローサイトメトリーにより富化させたヒトの「結腸直腸癌幹細胞」は、単細胞レベルで、再現可能な方法で、そして確実に分析することができる（図1）。
ヒトの結腸癌異種移植片において、リアルタイムPCRによる単細胞遺伝子発現分析は、「結腸直腸癌幹細胞」集団を多く含むことが知られているEpCAM-/CD44＋癌細胞とEpCAM-/VCD166＋癌細胞の両方を、さらに、幹細胞のバイオロジーおよび分化のプロセスに関与している異なるグループの遺伝子の協調的かつ示差的な発現を特徴とする様々な細胞のサブセットにさらに分けることができることを示す。最も興味深いのは、公知の結腸上皮最終分化マーカー（例えば、サイトケラチン20、CD66a/CEACAM1炭酸アンヒドラーゼII、MUC2、Trefoilファミリー因子3）をコードする遺伝子についてより高いレベルを示す細胞のサブセットが、候補である腸幹細胞マーカーをコードする遺伝子、または幹細胞機能に不可欠であることが知られている遺伝子（例えば、hTERT、LGR5、サバイビン）の発現を示さないか、あるいは低い発現しか示さないこと、およびその逆もまた同様であることである。このことは、EpCAM/CD44＋/CD166＋癌細胞に、分化の様々な段階の特徴である異なる細胞のサブセットが含まれることを示唆する（図2）。
蛍光活性化細胞選別（FACS）により精製し、そして免疫不全NOD/SCIDマウスに再度注射した場合には、CD44＋/CD66a＋細胞およびCD44＋/CD66anewl"細胞は、最も高い腫瘍形成能力を有するものとしての性質を示すCD44＋/CD66aneglow集団とは実質的に異なる腫瘍形成性の性質を示す（表4）。これは、EpCAM＋/CD44＋細胞集団の中で、CD66a/CEACAMIなどの分化マーカーをコードする遺伝子の高レベルの発現を特徴とするこの細胞のサブセット（すなわち、より「成熟している」細胞のサブセット）が、多くの場合、腫瘍形成能力を比較的使い果たした状態にあることを示す。一方、CD66a/CEACAMIなどの分化マーカーの発現がないかまたは低レベルであることを特徴とする細胞のサブセット（すなわち、より「未熟な」細胞のサブセット）は、「結腸直腸癌幹細胞」含有量が多い。
（表１）EpCAMおよび/またはCD44と組み合わせたCD66a/CEACAMIの発現に基づく、ヒトの結腸癌細胞の腫瘍形成性の性質
Figure 2012515533
a それぞれの実験について、癌細胞の精製のための供給源として使用した腫瘍の異種移植片のインビボでの連続継代を、以下のように説明する:m1は、原発性の腫瘍の生着により得た1次腫瘍を示す。m2は、m1の生着により得た2次腫瘍を示す。m3は、m2の生着により得た3次腫瘍を示す。以下、段階的である。原発性は、外科検体から直接採取した原発性腫瘍を示す。
b 選別した集団は全て、系統マーカーについて陰性である（Linneg）と考える。系統マーカーには、NOD/SCIDマウスにおいて確立されたヒト腫瘍異種移植片の場合においては、マウスCD45およびマウスH2-Kdが含まれ、原発性ヒト腫瘍の場合には、ヒトCD3およびCD45が含まれる（この場合、EpCAMを、陽性の上皮選択マーカーとする）。
c 腫瘍生着は、以下のように説明する:得られた腫瘍の数/注射回数;5カ月間の経過観察後に腫瘍の塊が見られなければ、腫瘍生着は失敗とみなす。
実施例2:肺転移を有するヒトの乳癌異種移植モデルの作製と画像化
患者由来の乳癌検体（塊またはTIC）を、NOD-SCIDマウスの乳房脂肪パッドに同所移植した。6つの異種移植腫瘍モデルを作製した（1つのER＋、1つのHer2＋、および4つのトリプルネガティブER-PR-Her2-）。トリプルネガティブの異種移植片の4つ全てが、IHC染色（すなわち、H＆E、増殖マーカーKi67、およびビメンチン（Vim）での染色）により明らかである、自発的な肺への微小転移巣を生じた。これらのデータは、免疫不全マウスに移植すると、乳房腫瘍細胞すなわちTICは、マウスの微小環境に適応でき、ヒト腫瘍の増殖と、自発的な肺転移を伴う進行を繰り返すことを示唆した。
マウスでのヒトの乳癌および転移の動的な半定量的画像化を容易にするために、移植の4日後に、乳房TICに、pHRuKFGレンチウイルス（感染多重度50）を介してホタルルシフェラーゼ-EGFP融合遺伝子を形質導入した。原発部位では、TICを、弱い生物学的発光シグナルにより検出できた。1カ月後、原発性腫瘍（L4およびR2乳房脂肪パッドで）と肺転移の両方をSmall Animal Imaging Center of StanfordでXenogen IVIS 200システムにより検出し、画像化した。本発明者らは、腫瘍の大きさまたは細胞の数が、シグナル強度と十分に相互関係があることを観察した。転移を有する異種移植腫瘍の発生と生物学的発光の画像化は、本発明者らに、この提案におけるインビボでのヒト乳癌中のMTICのmiRNA機能の確認の実現可能性をもたらす。
実施例3:ヒトの乳房MTICのマイクロアレイおよびリアルタイムPCR分析
ヒトの乳房の原発性癌源細胞（TIC）または転移性TIC（MTIC）（CD44＋CD24-/lowESA＋lineage-）を、乳癌の原発部位または胸水から単離した。肺転移（lung mets）を異種移植モデルにおいて検出したら、肺をブレンザイム（blenzyme）（Roche）で分離させ、MTIC集団（CD44＋CD24-/lowESA＋H2K-、図8a）を精製するために、マウスH2K、ならびにヒトCD44、CD24、およびESAで細胞を染色した。MTIC集団は、200〜1000個の選別した細胞を用いた場合には、マウスの乳房脂肪パッドへの移植後、5/8の割合で、同所性腫瘍を増殖する。
マイクロアレイ分析とリアルタイムPCRにより示すように、Snail、Zeb2、ビメンチン、E-カドヘリン、Lox、Cox2、VEGFなどを含む、HIF1αとHIF1に調節される標的遺伝子は、非腫瘍形成性の腫瘍細胞と比較して、MTICにおいて示差的に発現されていた（図8B）。HIF1α、ビメンチン、およびCD44の共局在を、免疫組織化学染色により確認した。
実施例4:マイクロRNA分析
マイクロRNAスクリーニングにより、もとの乳癌幹細胞および肺から単離した転移性癌細胞の示差的な発現プロファイルを同定した。例えば、原発性の乳房TICにおける発現よりも、肺MTICにおいて、miR-10aの発現はより高く、そしてmiR-490、miR-199aなどのレベルはより低かった。図4の3連のリアルタイムPCRにより示す、原発性TICに対する肺MTICの平均CT値の比較:miR-1Oa（-7.9）、miR-490（＋3.0）、およびmiR-199a（＋12.9）。NR3を、内部対照として使用した。データは、乳癌の原発性TICよりもMTICにおいて、miR-1Oaは27'9倍アップレギュレートされ、そしてmiR-199aは212-9倍ダウンレギュレートされたことを示した。
実施例5:乳癌の非腫瘍形成性癌細胞マーカーとしてのCD66a
乳癌細胞を、CD44とCD66aに基づいて選別し、一方、細胞の大部分はCD244bwであった。その後、細胞を、NOD/SCIDマウスの乳房脂肪パッド上に移植し、腫瘍の増殖をモニターした。CD44/CD66a-細胞は、図5に示すように、生物学的発光の画像化により、より高い移植率、ならびにより早い増殖速度を示した。CD66＋細胞は、より低い腫瘍増殖速度と、腫瘍増殖速度の遅れを示し、腫瘍の大きさははるかに小さく、CD66-由来の腫瘍と比較してきわめてよく似たフロープロファイル（flow profile）を示した。
図5aにおいて、フロープロファイルを、CD44およびCD66aマーカーに基づいて示す。CD66-CD44＋細胞およびCD66＋CD44＋細胞を、インビボでの腫瘍形成性アッセイのために選別した（100個の細胞または1000個の細胞を、NOD/SLIDマウスの乳房脂肪パッドのZidまたは41hに移植した）。10bが示すように、100個のCD66-細胞由来の8つの移植のうちの5つが腫瘍に成長したが、100個のCD66＋細胞由来のものは8つのうちの2つしか成長しなかった。1000個の細胞については、CD66-細胞を注射した8つのうちの8つが成長したが、CD66＋細胞による8つのうちの3つしか腫瘍に成長しなかった。触知可能な腫瘍の増殖速度を比較すると、CD66＋細胞ははるかに遅く、CD66-細胞から生じたものよりも大きさが小さかった（図5c）。図5dでは、100KのCD66-CD44＋細胞またはCD66＋CD44＋細胞を、注射前にホタルルシフェラーゼ-EGFPレンチウイルスに感染させた。CD66＋細胞による生物学的発光シグナルは、開始時（13日目）のCD66-細胞の生物学的発光シグナルよりも高かった。しかし、1カ月または2カ月後、CD66-細胞は、顕性の生物学的発光シグナルを示し、最終的には触知できる腫瘍に成長した（68日目）。
実施例6:癌幹細胞を同定し、頻度を測定するために使用する遺伝子リストの最適化
正常な幹細胞および癌幹細胞の両方を同定するためにこの時点で使用したほとんどのマーカーは、不可欠な幹細胞機能とは関連しない。それらの発現は、単離される時点で幹細胞が存在している特定の微小環境に関連する。したがって、幹細胞を同定するために使用する一般的なマーカーの有用性は、それらを収集した部位により様々であり得る。
本発明者らのアプローチは、重要な幹細胞機能のマーカーを同定することであった。幹細胞の典型的な性質は自己再生性であるので、本発明者らは、再生経路に努力を集中させた。本発明者らは、正常なHSC、前駆細胞から発生した白血病幹細胞、およびヒトの上皮癌幹細胞により高度に発現されるが、個々のそれぞれの組織中の自己再生しない細胞によっては発現されない多数の遺伝子を同定した。先の結果に記載したこのゲノミクス分析は、これまでに幹細胞の自己再生と関連付けられたいくつかの遺伝子を同定した。同様に、本発明者らは、乳癌幹細胞と非腫瘍形成性の癌細胞により示差的に発現される候補マイクロRNAを同定した。証拠は、これらの遺伝子およびマイクロRNAのうちのいくつかが、重要な幹細胞機能を有すること、これらの遺伝子の機能はまた、hESCおよびiPSCの自己再生ならびに維持にも重要であることを示している。
腫瘍細胞集団中での癌幹細胞の頻度を測定することができるデバイスを得るために、癌幹細胞を同定するために使用する遺伝子リストを最適化することが所望される。図1Bに示すように、本発明者らは、これについて大きな進展をもたらし、癌幹細胞マーカーとしてのテロメラーゼ、ならびに、自己再生のプロセスに関連するいくつかの遺伝子を同定した。上記テロメラーゼ成分TERTは、未成熟な表現型を有する結腸癌細胞の中でのみ発現される。さらに、TERTは、一部のhESC系統およびiPSC系統の分化に伴い効率的にダウンレギュレートされない。
正常な結腸上皮細胞と癌性の結腸上皮細胞の両方を、陰窩細胞の成熟と自己再生に関連する遺伝子の発現について分析する。自己再生遺伝子のリストを、細胞が幹細胞であることの信頼度を最大にするために、TERTを超えて拡大する。本発明者らによる分析において同定した正常な幹細胞と癌幹細胞の遺伝子の発現を測定する。癌幹細胞は、増大に対する制限から免れた幹細胞またはそれらが受け得る有糸分裂の回数を制限するカウント機構（counting mechanism）から免れた前駆細胞のいずれかからおそらく生じ得るので、候補遺伝子は、正常なマウスHSC、前駆細胞に由来するマウスの白血病幹細胞、およびヒトの乳癌幹細胞により発現される遺伝子である。このリスト（これらは全て幹細胞の維持に関連する）において同定された最初の候補となる遺伝子には、BMI1、-IDI、IGFBP3、HOXファミリーメンバーであるH0XA3、H0XA5、MEIS1、ETS1、ETS2、RUNX2、およびSTAT3が含まれる。本発明者らは、これらの遺伝子のうちのどれが癌幹細胞の自己再生に関連しているかを確認する。これを行うために、本発明者らは、インビトロおよびインビボでの技術を使用して、癌幹細胞の自己再生における役割について、これらの候補遺伝子を体系的に試験する。
自己再生を調節する遺伝子の発現は、上皮細胞に特異的な遺伝子（ケラチンおよび腸のムチンなどの成熟マーカーを含む）の発現に関連する。これにより、分析中の細胞が、生検材料中に混入している正常細胞ではないことを確かめることができると考えられる。その発現が自己再生遺伝子BMI Iによりダウンレギュレートされる腫瘍サプレッサー遺伝子の変異は、初期の前駆細胞が自己再生することを可能にする。これらの遺伝子は、結腸癌において頻繁に変異し、これにより、自己再生する結腸癌幹細胞は、正常な幹細胞と初期の結腸前駆細胞の両方から生じると考えられる。なおさらに、腫瘍形成性の変異は、結腸癌細胞による遺伝子発現を変化させる。したがって、正常な結腸上皮幹細胞と、それらの悪性の対応物との間には、初期の陰窩細胞の成熟に関連する少なくともいくつかの遺伝子の発現に差異が存在し得る。これにより、これらの2つの自己再生する細胞集団を互いに区別することができる。
本発明者らは、癌幹細胞と非腫瘍形成性の癌細胞において示差的に発現される37のmiRNAを同定した。いくつかのmiRNAクラスターは、正常な組織幹細胞においてはダウンレギュレートされていたが、癌幹細胞においてはダウンレギュレートされていなかった。さらに、いくつかのmiRNA（例えば、miR-200cおよびmiR-183）の発現は、インビトロで胎生期癌細胞の増殖を抑制し、インビボでそれらの腫瘍形成能力をなくし、そしてインビトロでの乳癌細胞のクローン形成能を阻害した。これらのmiRNA、および本発明者らが同定した他のクラスターは、乳癌幹細胞と正常幹細胞のバイオロジーをつなぐ分子リンクを提供する。これらのマイクロRNAの発現（これらは、腫瘍形成性細胞の中で一貫してアップレギュレートされていたか、またはダウンレギュレートされていた）を、未分化の、および分化したhESC、ならびにiPSC由来の単細胞の中でプローブする。本質的に、未分化の細胞は、多能性幹細胞（例えば、TraおよびSSEAサブタイプ）とは異なる細胞表面マーカーにより選別され、miRNAの発現、再プレート効率、およびインビボでの集団パラメーター（胎生期癌、混合状態の胎生期癌/分化した細胞指数（％EC対分化したもの）、および分化した細胞に関するテラトーマアッセイの結果）について評価される。分化した幹細胞集団を、胚様体の産生により得、そして分化の28日後に、SSENTRAマーカーについての陽性および陰性選択により選別する。本発明者は、選別した集団中において、以下について単細胞を試験する:（1）癌幹細胞の指標となるマイクロRNAプロファイル、（2）遺伝子発現プロファイル（下記）、および（3）移植/テラトーマアッセイの結果。本発明者らは、これらの集団の中の「分化に対して耐性がある（resistant to differentiation）」細胞が、悪性の胎生期癌の誘導体を形成し、単細胞中で分化した細胞および未分化の細胞のマーカーを同時に発現するであろうと予想した。
実施例7:単細胞レベルでの遺伝子発現プロファイル
多能性細胞の集団においては、21日間の分化の後でもなお、本発明者らは、腫瘍形成性の重要なマーカー（例えば、TERT）をダウンレギュレートすることができない株を観察する（図6を参照のこと）。加えて、本発明者らは、本発明者らのiPSC系統のうちのおよそ50％が、分化した状態において、外因性および内因性の多分化能のマーカーの両方をダウンレギュレートすることができないことを観察した。本質的に、これは、本発明者らが腫瘍形成性の傾向の結果を予測できる、分化と自己再生との間での「分子の闘い（molecular war）」を示唆している。本発明者らは、以下により、hESC細胞培養物およびiPSC細胞培養物中での悪性細胞の同定のために、遺伝子リストを最適化する:（1）未分化のhESCおよびIPSC、ならびに、ヒトの胎生期割球と比較して、EC（胎生期癌）細胞の中で過剰発現される遺伝子をアッセイすること、（2）（癌幹細胞の同定のための）Aim 1由来の遺伝子を含むように、遺伝子のリストを相互参照すること、そして、（3）分化した体細胞系統および生殖細胞系統の遺伝子を加えること（後者は、分化に耐性である多能性幹細胞中に留まる）。その後、本発明者らは、基礎となる単細胞の遺伝子発現に基づき、悪性である可能性にしたがって診断した亜集団の腫瘍形成能力を評価するために、免疫不全マウスのアッセイを使用する。
CNV分析。頻繁に観察される染色体の喪失および獲得を含む染色体変種は、多能性のヒト幹細胞集団における不安定性に関連する。しかし、多数の遺伝子座でコピー数を評価するための、より緻密な構造のハイスループットの方法に取り組んでいる研究はほとんどない。本発明者らは、別々に誘導した多能性幹細胞系統におけるゲノム全体でのCNV数の評価のために本発明者らの技術を調整することを提案する。CNVの変化は、サブ染色体（subchromosomal）の不安定性を反映すると考えられる。最初に、本発明者らは、本発明者らの研究室でこれまでに観察したものを含む、ゲノム全体について重複を認識する本発明者らの遺伝子/遺伝子座リストに加えるための特別のプローブセットを設計することができる（図6）。SCADは、その最初の設計において1000種類までのマーカーの分析に適応させることができる。CNV分析物は市販されており、hESCsIiPSCsにおけるゲノムの不安定性と相互に関連し得る。
実施例8:癌幹細胞を同定し、定量化するための自動デバイスの操作
細胞表面の表現型と遺伝子発現の組み合わせに基づいて、癌幹細胞を同定し、腫瘍におけるそれらの頻度を計算するように自動デバイスを設計する。本明細書中に記載する最適化したマーカー/遺伝子分析を使用して、同様のストラテジーを、単細胞における分化した状態のマーカーと未分化の状態のマーカーの同時発現に基づき、悪性である可能性がある細胞を同定するために使用する。このデバイスは、胚様体または腫瘍の針生検材料の単細胞懸濁液を作製し、細胞の亜集団（上皮細胞、分化した細胞、未分化の細胞）を単離し、その後、数百個または数千個の単細胞についてqRT-PCRを行い、腫瘍または多能性細胞の培養物の幹細胞含有量を測定する。このような完全自動デバイスは、癌幹細胞のフローサイトメトリーによる選別に現在必要である大変労力のかかる工程を排除し、癌幹細胞を定量化するPCRアッセイのための十分な癌細胞を単離するために、わずか100,000個未満の細胞しか必要としない、手動操作が全く不要な臨床診断ツールを可能にすると考えられる。マイクロ流体チップ技術に伴う自動操作、有効性、および低いコストは、個人に合わせた迅速な遺伝子診断を可能にすると考えられる。
このシステムの中心にあるのがマイクロ流体セルソーターである。このデバイスは、破片（壊死細胞および他の粒子）から生存細胞（上皮細胞もしくは培養した多能性細胞、またはそれらの産物）を単離し、5種類までの様々な表面マーカーによる蛍光シグナルを使用して単細胞懸濁液から細胞を選別し、そしてそれらをその後の遺伝的研究のために個々のビンに入れる。腫瘍または細胞培養物を消化して細胞懸濁液を得ること、および蛍光表面マーカーで細胞を染色することなどの他の上流の工程を、このシステムに組み込むことができる。このシステムを腫瘍の分析に使用する方法を本明細書中で説明する。生検材料が得られたら、医師は、このシステムの入力ポートに試料を入れる。取り扱いが簡単なコンピュータインターフェースを利用して、医師は、表面マーカーの数およびタイプ、必要なPCRサイクルの数などの、選別および遺伝的分析に必要なパラメーターを設定する。そして機械が、人による介入なしに残りの工程を実行する。先に記載した技術に基づくと、上記システムは、少なくとも30個の細胞/秒の選別処理が可能であると考えられる。
単細胞分析デバイス（SCAD）はモジュール式であり得（図7）、一体型の全自動の様式で以下の工程を実行する:（1）組織の消化:組織をデバイスの入力ポートに入れる。適切な酵素をデバイスに投入し、循環させて、細胞懸濁液を得るための細胞外マトリックスの消化を行う。（2）破片からの生存細胞の分離:上記懸濁液には、典型的には、10マイクロメートルから15マイクロメートルの平均サイズを有する生存細胞と、およそ5マイクロメートルの平均サイズを有する破片物質が含まれる。死滅した物質の量は、多くの場合、生存細胞と比較して、比較的多量であり、したがって、細胞の効率的な単離のために死滅した材料をフィルタリングして除去することが重要である。本発明者らは、マイクロ流体「メタマテリアル」に、消化した組織懸濁液を流すことによりこれを行う。マイクロ流体メタマテリアルは、粒子の大きさにしたがって流体の流れを分けることができる。（3）染色:フィルタリングした単細胞懸濁液を、マイクロ流体デバイスの異なるコンパートメントの中で、適切な表面マーカーを使用して染色する。5種類までの様々なマーカーでの染色が、癌細胞の高純度の集団を得る際には有用であり得る。（4）選別:染色した単細胞懸濁液を、マイクロ流体デバイスの次のコンパートメントへと循環させて、残りの細胞から癌細胞を選別する。ポアソン統計とモンテカルロシミュレーションは、99％の信頼度で癌幹細胞における2倍の変化を検出するための選別には、わずか2,000個〜20,000個の癌細胞しか必要でないことを示す。このような少数の細胞は、現在、フローサイトメトリーを使用して効率的に選別することはできない。なぜなら、FACSに必要な最初の試料の大きさは、およそ100万個の細胞であるからである。本発明者らは、細胞を無駄にすることなく、細胞懸濁液を気密状態の単離した小さい量の環境下で無制限に循環させるマイクロ流体ベースの選別を使用してこれを行う。
フローベースのマイクロ流体セルソーター:細胞およそ50個/秒の処理能力を有するマイクロ流体セルソーターが実証されており、ここでは、細胞をレーザー光により高速で循環させ（Di Carlo et al.Lab Chip 2006;6:1445-1449を参照のこと）、散乱光を検出し、分析する。高速エレクトロニクスおよびより効率的な画像化機器により、処理能力の一桁の改善が可能であり、選別時間は短縮され10分未満となる。
並列ソーティング（Parallel sorting）:セルソーターを、個別にアドレスすることができるマイクロ流体チャンバーの2Dアレイ上に細胞を高密度で捕捉することに基づいて開発する（上記図7Bおよび7C）。細胞を、ソーターアレイに循環させ、微細加工したバスケット（microfabricated basket）により捕捉する。そのようなバスケットは、自由に流動している懸濁液において50％を上回る単細胞捕捉効率を有することがこれまでに明らかにされている（Di carlo et al.,前出）。全てのバスケットを満たした後、マイクロ流体バルブを閉め、アレイを、専用に設計した、コンピュータで制御する光を使用して、腫瘍形成性細胞を同定するために必要な5種類の蛍光色全てにおいて画像化する。この新しいチップはまた、位相差画像法も可能であり、これは、細胞の形態を研究するために有用であることが証明され得る。同定した腫瘍形成性の細胞を、溶解のために次のモジュールへと循環させ、一方、細胞の残りはチップの外へと循環させる。この新しいセルソーターは、極めて少ない最初の細胞数を用いて作業することができる。なぜなら、細胞を何度も循環させることができ、したがって無駄にしないと考えられるからである。現在のマイクロ流体チップ技術は、3×3cmの領域に、10,000個近いこれらのエレメントを配置することができる。これらは、Fluidigm Biomarkシステムにより使用されるものなどの、最新の撮像装置を使用して（一枚の画像の中で）迅速に問い合わせすることができる。このセルソーターは、細胞およそ30個/秒の処理能力を有する。フローベースのセルソーターとは対照的な並列ソーティングデバイスを使用することについての1つの利点は、選別とPCRの間の画像化を同じ撮像装置により行うことができる点であり、これにより、本発明者らは、蛍光および形態についてのデータを個々の細胞の遺伝的データに対して関連付けることができる。
細胞の溶解とmRNAの捕捉:選別した癌幹細胞を、個々のチャンバーの中での溶解のために、次のモジュールへと循環させる。mRNAを、オリゴ-dTビーズの列上に捕捉し、すでに示したように、ビーズ上で逆転写させ（Marcus et al.Anal Chem 2006;78:3084-3089）、そしてHeliscopeのために開発した新しい遺伝子配列決定プロトコールによりチップを処理する（processed off）か、または、巨視的なウェル（マイクロリットルの範囲）に移し、以下の本発明のプロトコールにしたがって遺伝子のセットを事前に増幅するための試薬と混合することができる。事前に増幅した試料を、qRT-PCRおよび真の癌幹細胞含有量の決定のために、Fluidigm Dynamicアレイチップに類似するモジュールに移す。
正常な乳房幹細胞および血液幹細胞、ならびに結腸癌幹細胞、頭頸部癌幹細胞、および乳癌幹細胞の分析に基づいて、本発明者らは、新規の単細胞分析物を同定した。これは、生検材料および培養した多能性幹細胞集団中で癌幹細胞を正確かつはっきりと同定し、カウントすることを初めて可能にする。原理の証明として、本発明者らは、このアッセイを単一の結腸癌細胞の分析に適用した。このために、本発明者らは、FACSを使用して、CD66＋CD44系列の結腸癌細胞を、2人の異なる患者から確立した初期継代の異種移植片から選別した。これらのマーカーは、腫瘍中の結腸癌幹細胞（CoCSC）のおよそ3倍から5倍の富化が可能である。本発明者らは、これらのマーカーを用いて単離した癌細胞が、CoCSCについて部分的に富化されたにすぎないのではないかとの疑いを持った。単細胞遺伝子発現分析と、その後の腫瘍形成性の研究は、実際のCD66＋CD44＋系列細胞が、CoCSCと非腫瘍形成性の細胞の混合物であること、そしてこのアッセイを使用して、生検検体中でのCoCSCの頻度をさらに正確に同定できることを示す。単細胞分析は、正常な結腸陰窩に類似した結腸癌細胞の階層化した発生途中の構造（hierarchical developmental structure）を明らかにする。注目すべきは、結腸腫瘍中のほとんどの未成熟細胞が、腫瘍の長期維持に重要なテロメラーゼ複合体の1つの構成要素であるTERTを発現することを本発明者らが見出したことである。正常な結腸幹細胞を示すLGR5の発現もまた、未成熟細胞に限定される。対照的に、成熟段階にある結腸陰窩細胞により発現される遺伝子（MUC2、'CK20、CA-2、および特に、CD66aを含む）は、未成熟細胞のマーカー（最も注目すべきはTERT）を同時発現していない細胞により発現されていた。これは、これらの細胞が、正常な成熟段階にある上皮陰窩細胞と同様に、活発な有糸分裂を受けるそれらの能力に限界があることを示唆する。実際、本発明者らは、CD66a＋（分化した結腸癌細胞）およびCD66a'''結腸癌細胞を免疫不全マウスに移植した。CD66a'細胞は腫瘍を形成した（6例の注入のうちの5例）が、CD66＋細胞は腫瘍を形成しなかった（5例の注入のうちの0例）。同様に、試験した2つのヒト乳癌腫瘍において、免疫不全マウスモデルで試験する際に、CD66ew細胞が癌幹細胞について富化された。これらの結果は、単細胞遺伝子発現分析により、生検材料および培養物中の癌幹細胞の同定ならびに定量化ができることを示す。
実施例9:血液および乳房上皮組織の両方において、正常幹細胞と癌幹細胞が共有する遺伝子発現シグネチャー
近年になって、癌幹細胞が異なる細胞コンパートメントから生じ得ることが明らかになった。一部は、おそらく、幹細胞のプールの増大についての制限がはずれた変異体幹細胞から生じる。他のものは、それらが受け得る有糸分裂の回数を通常制限するカウント機構を失った、より分化した初期前駆細胞から生じる。もちろん、幹細胞または前駆細胞から生じる癌幹細胞または白血病幹細胞のマーカーの多くは、異なる。しかし、起源となる細胞とは無関係に、幹細胞は、自己再生能力を保持する。本発明者らは、幹細胞コンパートメントまたは部分的に分化した子孫のいずれかから生じる癌幹細胞において自己再生を調節する経路のうちのいくつかを、両者が共有しており、そして正常なHSCも共有している可能性があると判断した。この仮説を試験するために、本発明者らは、正常なマウスHSCおよび前駆細胞から生じたマウスの白血病幹細胞（すなわち、自己再生する集団）により発現されるが、正常な前駆細胞（すなわち、自己再生しない集団）によっては発現されない遺伝子が、ヒトの乳癌幹細胞によっても発現されるが、それらの非腫瘍形成性の対応物によっては発現されないかどうかを分析した。注目すべきは、ヒトの癌幹細胞はこれらの遺伝子を過剰発現するが、それらの非腫瘍形成性の対応物は過剰発現しないことである（図8）。本発明者らはまた、他の潜在的な候補を同定するために、2つの他の遺伝子リストを作製した:（i）乳癌幹細胞および正常な乳房幹細胞により発現されるが、非腫瘍形成性の癌細胞または成熟した乳房上皮前駆細胞によっては発現されない遺伝子、（ii）正常なヒトHSCおよびヒトの乳癌幹細胞により発現されるが、ヒトの血液前駆細胞または非腫瘍形成性の乳房細胞によっては発現されない遺伝子。
これらの遺伝子の多くは、自己再生および癌に関連している。これらには、インスリン様成長因子結合パートナー（insulin growth factor binding partner）IGFBP3、HOXファミリーメンバーであるH0XA3、H0XA5、ME1S1、ならびに、ETS1、ETS2、RUNX2、およびSTAT3などの転写因子が含まれる。転写因子STAT3が真の癌幹細胞調節因子であるかどうかを試験した。STAT3は、ES細胞およびHSCの両方の維持において役割を担う。マウスの乳癌幹細胞およびヒトの乳癌幹細胞の両方のゲノミクス分析により、多くのSTAT3により活性化された転写物が、癌幹細胞により過剰発現されたことが明らかになった。次に、本発明者らが乳房腫瘍の免疫化学分析を試験すると、STAT3陽性である細胞は、癌の浸潤先端部（invasive edge）で濃縮される傾向があり、このタンパク質は、腫瘍の内部部分にある、より分化したように見える細胞の中では見られなかった。最後に、STAT3の低分子阻害剤が存在する。そのような阻害剤は、癌幹細胞モデルにおいて試験することができる。マウスの乳癌幹細胞のコロニー形成能力に対するSTAT3阻害剤ククルビタシンの作用を試験した。この阻害剤への24時間の短時間曝露により、コロニーの数は約50％減少した（p＜0.02、t検定）。これらの結果は、STAT3が少なくとも一部の乳癌幹細胞において重要な役割を担っていることを示唆する。
対象となる第2の遺伝子は、MEIS1である。MEIS1は、正常な血液幹細胞および乳房幹細胞、白血病幹細胞、ならびに、乳癌幹細胞により選択的に発現される。遺伝的研究により、MEIS1の発現が、正常な血液幹細胞とそれらの白血病の対応物の両方の自己再生と維持に絶対的に必要であることが示されている。MEIS1は、乳癌幹細胞の再生を調節することができる。
正常な幹細胞および癌幹細胞の両方により発現される特に興味深い候補遺伝子には、以下が含まれる:CAV1、GAS1、MAP4K4（キナーゼ）、MYLK（キナーゼ）、PTK2（キナーゼ）、DAPK1（キナーゼ）、LATS（キナーゼ）、FOSL2、AKT3（キナーゼ）、PTPRC（チロシンホスファターゼ）、MAFF（腫瘍遺伝子）、RRAS2（RASに関連する）、NFKB、ROBO1、IL6ST（STAT3を活性化する）、CR1M1、PLS3、SOX2、CXCL14、ETS1、ETS2、MEIS1、およびSTAT3、ならびにCD47。癌幹細胞により過剰発現されるが、正常な幹細胞によっては過剰発現されない興味深い候補遺伝子としては、RGS4、CAV2、MAF（腫瘍遺伝子）、WT1（腫瘍遺伝子）、SNAI2、FGFR2、MEIS2、101、103、ID4、およびFOXC1が含まれる。
実施例10:造血幹細胞の全トランスクリプトーム解析
この実施例では、本発明者らは、造血幹細胞のトランスクリプトーム解析を使用することを模索する。この態様の全体的概要を図9に示す。本実施例では、造血幹細胞を含むと疑われる細胞の集団を、試験被検体から単離する。その後、細胞集団を、既知の造血幹細胞のマーカー（例えば、CD34、Thy1など）に対する蛍光抗体に曝露することにより、細胞をFACS分析のために準備する。各ウェルが単細胞を2つ以上含まないように、細胞を96ウェルプレートに選別する。
単離した単細胞を溶解し、溶解物を2つの部分に分割する。第1の部分については、本質的に実施例1に記載したとおりに、発現レベルまたは発現の存在（例えば、CD34＋、CD19-、CD17-）のいずれかにより、HSCと非HSCとを区別することができる遺伝子の選択を使用して、リアルタイムPCRにより単細胞遺伝子発現分析を行う。集団内でHSCを同定した後、HSCであると同定された単細胞由来の溶解物をプールする。標準的な方法を使用して全mRNAを増幅することによりcDNAライブラリーを作製する。その後、このcDNAを、本明細書中に記載されるような任意の「次世代」法を使用して配列決定する。次いで、配列決定したトランスクリプトームを分析して、特有の遺伝子および/または表面マーカーが存在するかどうかを決定する。
HSCに特有の表面マーカーの同定の後、市販されている技術により、該表面マーカーに特異的に結合する抗体を調製する。上記抗体の特異性と有効性を確認する（例えば、単離したタンパク質および/または組み換えタンパク質に対する結合）。その後、抗体を蛍光成分で標識する。その後、新しく発見した表面抗原に対する抗体を使用して、FACS選別および/または分析を、（例えば、同じ被検体または異なる被検体に由来する）細胞の他の集団について行うことができる。
実施例11:治療薬の分析
この実施例では、候補治療薬の選択を行う。標的細胞（例えば、結腸癌幹細胞および結腸癌細胞（分化したもの）を、上記のように単細胞レベルで単離し、分析する。これまでに同定した標的細胞に特異的なマーカー（例えば、標的細胞特異的抗体および/または標的細胞特異的核酸の蛍光標識を使用するFACS分離）を使用して、生検検体から標的細胞を分離する。
標的細胞を、単細胞を含むアドレス可能な位置に分離する。その後、単離した細胞を、候補治療薬（例えば、抗体、毒素結合抗体、低分子）のライブラリーに曝露する。その後、細胞を収集し、遺伝子発現パターンおよび/または細胞の生存性について分析する。有効な候補治療薬は、細胞を死滅させるように標的化するものであり得る。あるいは、候補治療薬は、疾患状態ではない細胞由来の発現パターンと比較して、誤調節が行われる（例えば、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされる）ことが知られている遺伝子の発現を変化させ得る。候補治療薬への標的細胞の曝露により、正常な（すなわち、疾患状態にはない）細胞のパターンとより密接に類似している核酸の発現パターンの変化が生じ得る。標的細胞を死滅させるかまたは変化させることにおいて有望な候補治療薬を、その後、正常な細胞に曝露して、治療薬として使用できるそれらの可能性を決定する（例えば、候補作用物質が標的細胞および正常細胞を死滅させる場合には、これを有用な可能性のある作用物質から除外することができる）。

Claims (45)

  1. 以下の工程を含む、不均質な固体腫瘍試料中の異なる細胞集団を同定する方法:
    該腫瘍由来の個々の細胞を別個の位置に無作為に分配する工程;
    該別個の位置に個別に分配された細胞の複数の遺伝子についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;および
    クラスター分析を行って、1つまたは複数の異なる細胞集団を同定する工程。
  2. 前記分配する工程の前に個々の細胞を富化しない、請求項1記載の方法。
  3. トランスクリプトーム解析を少なくとも1000個の個々の細胞について同時に行う、請求項1記載の方法。
  4. 核酸分析を使用してトランスクリプトーム解析を行う、請求項1記載の方法。
  5. 別個の位置が平面状の基質上にある、請求項1記載の方法。
  6. 無作為に分配する工程をマイクロ流体システムの中で行う、請求項1記載の方法。
  7. トランスクリプトーム解析が、発現されたRNA、発現されていないRNA、またはそれらの両方を分析する工程を含む、請求項1記載の方法。
  8. トランスクリプトーム解析が全トランスクリプトーム解析である、請求項1記載の方法。
  9. トランスクリプトーム解析が、1セットのプライマー対を使用してRNAを増幅する工程を含む、請求項1記載の方法。
  10. プライマー対がネストプライマーではない、請求項9記載の方法。
  11. トランスクリプトーム解析を、個々の細胞の全てまたはサブセットについて同時に、あるいは実質的にリアルタイムで行う、請求項1記載の方法。
  12. 1つまたは複数の細胞集団が、正常な幹細胞、正常な前駆細胞、正常な成熟細胞、炎症細胞、癌細胞、癌幹細胞、または非腫瘍形成性幹細胞である、請求項1記載の方法。
  13. 以下の工程を含む、被検体由来の不均質な腫瘍生検材料を分析する方法:
    該生検材料由来の細胞を別個の位置に無作為に分配する工程;
    該個別に分配した細胞の少なくとも50種類の遺伝子についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;および
    トランスクリプトームデータを使用して、該腫瘍の1つまたは複数の特性を同定する工程。
  14. 前記実施する工程を、細胞型の事前の富化を伴わずに行う、請求項13記載の方法。
  15. 特性が、癌細胞の有無、または数である、請求項13記載の方法。
  16. 特性が、幹細胞、初期の前駆細胞、初期の分化した前駆細胞、後期の分化した前駆細胞、または成熟細胞の有無、あるいは数である、請求項13記載の方法。
  17. 特性が、1つまたは複数の前記細胞を排除することにおける治療薬の有効性である、請求項13記載の方法。
  18. 癌を有する被検体または癌の病期を診断するために前記特性を使用する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
  19. 特性がシグナル伝達経路の活性である、請求項13記載の方法。
  20. シグナル伝達経路が、癌幹細胞、分化した癌細胞、成熟癌細胞、またはそれらの組み合わせに特異的である、請求項19記載の方法。
  21. 以下の工程を含む、疾患状態の細胞が利用するシグナル伝達経路を同定する方法:
    不均質な試料由来の細胞を無作為に分配する工程;
    該分配した細胞についてトランスクリプトーム解析を実施する工程;
    トランスクリプトーム解析を使用して、少なくとも1つの疾患状態の細胞を同定する工程;
    該少なくとも1つの疾患状態の細胞の該トランスクリプトーム解析を、
    （a）疾患状態ではない細胞;
    （b）異なる疾患状態の細胞;および
    （c）疾患状態の幹細胞
    のトランスクリプトームと比較する工程;ならびに、
    （i）疾患状態の細胞中、（ii）疾患状態の幹細胞中、および（iii）状況に応じて、異なる疾患状態の細胞中で発現されるが、疾患状態ではない細胞中では発現されないシグナル伝達経路を同定し、それにより、疾患状態の細胞が利用するシグナル伝達経路を同定する工程。
  22. 疾患状態が、癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患である、請求項21記載の方法。
  23. シグナル伝達経路が、疾患状態の細胞の生存に必要である、請求項21記載の方法。
  24. 以下の工程を含む、症状を有する被検体を診断するための方法:
    不均質な試料由来の細胞を無作為に分配する工程;
    分配した細胞について第1のトランスクリプトーム解析を実施する工程;
    トランスクリプトーム解析を使用して、少なくとも1つの疾患状態の細胞の該第1のトランスクリプトーム解析を、疾患状態ではない細胞の第2のトランスクリプトーム解析と比較することにより該少なくとも1つの疾患状態の細胞を同定し、それにより、該被検体における該疾患状態の細胞に関連する症状の有無を診断する工程。
  25. 疾患状態が、乳癌、結腸癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患である、請求項24記載の方法。
  26. トランスクリプトーム解析が、発現されたRNA、発現されていないRNA、またはそれらの両方を分析する工程を含む、請求項21記載の方法。
  27. トランスクリプトーム解析が全トランスクリプトーム解析である、請求項21記載の方法。
  28. 疾患状態の細胞が乳癌幹細胞である、請求項21記載の方法。
  29. 以下の工程を含む、治療薬をスクリーニングするための方法:
    疾患状態の細胞を有する第1の被検体を、1種類または複数の試験作用物質に曝露する工程;
    対象となる領域から該被検体由来の不均質な腫瘍生検材料を得る工程;
    該不均質な腫瘍生検材料由来の少なくとも1つの個々の細胞についてトランスクリプトーム解析を実施する工程であって、該生検材料が、1つまたは複数の疾患状態の細胞を含む、工程;および、
    該トランスクリプトーム解析を、
    （i）疾患状態の細胞を有さない第2の被検体;または
    （ii）該曝露する工程の前の第1の被検体
    のいずれかに由来するトランスクリプトームと比較する工程;ならびに、
    該第2の被検体または曝露前の該第1の被検体のトランスクリプトームとより類似している試験領域から、細胞のトランスクリプトームに影響を与える作用物質を同定する工程。
  30. 以下の工程を含む、疾患に対する治療薬の潜在的効果を決定する方法:
    疾患状態の細胞の第1の集団を個々の位置に分ける工程であって、該個々の位置が個々の細胞を含む、工程;
    該個々の細胞の少なくとも1つに由来する少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定し、それにより、疾患状態の発現シグネチャーを作製する工程;
    疾患状態の細胞の第2の集団を作用物質に曝露する工程;
    該疾患状態の細胞の第2の集団を個々の位置に分ける工程であって、該個々の位置が個々の細胞を含む、工程;
    該第2の集団に由来する少なくとも1つの該個々の細胞由来の少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定する工程;および
    該第2の集団に由来する該個々の細胞由来の該発現レベルを、該疾患状態の発現シグネチャーに対して比較し、それにより、該疾患に対する該作用物質の効果を決定する工程。
  31. 曝露する工程をインビボで行う、請求項30記載の方法。
  32. 第1の集団および第2の集団が被検体から単離される、請求項30記載の方法。
  33. 被検体がヒトである、請求項32記載の方法。
  34. 疾患が、癌、潰瘍性大腸炎、または炎症性腸疾患である、請求項30記載の方法。
  35. 核酸またはタンパク質が癌幹細胞マーカーである、請求項30記載の方法。
  36. 発現レベルがmRNA発現レベルである、請求項30記載の方法。
  37. mRNA発現レベルを決定する工程が、10種類以上の核酸の発現または発現の欠如の検出を含む、請求項33記載の方法。
  38. 発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項30記載の方法。
  39. 分ける工程が、前記細胞の集団を、前記個々の細胞上に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体に曝露することを含む、請求項30記載の方法。
  40. 以下の工程を含む、治療薬に対する被検体の反応の見込みを決定する方法:
    被検体由来の細胞の集団を個々の位置に分ける工程であって、該個々の位置が個々の細胞を含み、該個々の細胞のうちの少なくとも1つが疾患状態の細胞である、工程;
    該疾患状態の個々の細胞のうちの少なくとも1つに由来する少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルを決定する工程であって、該核酸またはタンパク質が治療薬の標的である、工程;および、
    該少なくとも1種類の核酸またはタンパク質の発現レベルに基づいて、被検体による反応の見込みを決定する工程。
  41. 発現レベルがmRNA発現レベルである、請求項40記載の方法。
  42. mRNA発現レベルを決定する工程が、10種類以上の核酸の発現または発現の欠如の検出を含む、請求項41記載の方法。
  43. 発現レベルがタンパク質発現レベルである、請求項42記載の方法。
  44. 分ける工程が、前記細胞の集団を、前記個々の細胞上に存在するタンパク質に特異的に結合する抗体に曝露することを含む、請求項42記載の方法。
  45. 治療薬が抗癌剤である、請求項40記載の方法。
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