KR20110138340A - 약물 타겟을 진단, 예후 예측 및 동정하기 위한 단일 세포 유전자 발현 - Google Patents

약물 타겟을 진단, 예후 예측 및 동정하기 위한 단일 세포 유전자 발현 Download PDF

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스티븐 알. 퀘이크
피에로 디. 달레바
후이핑 리우
안느 리야트
토머 칼리스키
맥시밀리언 디엔
지안빈 왕
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명은, 단일 세포 분석으로 수득한 유전자들의 세트의 발현을 분석함으로써 질병의 진단 및 예후 예측 방법을 제공한다. 분류화를 통해, 치료법의 최적화, 특정 치료법의 진행 여부 결정 및 치료제의 용량, 선택 등의 최적화가 가능하다. 또한, 단일 세포 분석은 질병 상태의 세포에서 돌연변이 및/또는 경로를 표적으로 하는 치료법의 동정 및 개발을 제공한다.

Description

약물 타겟을 진단, 예후 예측 및 동정하기 위한 단일 세포 유전자 발현{SINGLE CELL GENE EXPRESSION FOR DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND IDENTIFICATION OF DRUG TARGETS}
본 출원은 2009년 1월 20일자 미국 가출원번호 61/205,485호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 국립암센터로부터 연방 보조금 U54 CA 126524 하에 정부 지원을 받아 수행되었다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 갖는다.
최근, 유전자 발현 패턴 분석은 수많은 질병들의 진단과 위험도 등급화(risk stratification)를 개선시키는 방법을 제공하고 있다. 예를 들어, 전체적인 유전자 발현 패턴의 자율적인 분석을 통해, 고전적인 진단 방법에서는 동일한 종류인 것으로 간주되었던 질병들이, 유전자 발현에서의 현격한 차이에 의해 구별되는, 분자적으로 상이한 암의 서브타입들로 식별되고 있다. 이러한 분자적인 서브타입들은 흔히 상이한 임상적 결과와 연계된다. 또한, 전체 유전자 발현 패턴은 예후 표지자(prognostic signature)를 개발하기 위한 임상적인 행태와 상호 관련있는 특징들에 대해서도 조사될 수 있다.
다수 질병과 마찬가지로 암 역시 대게는 그 원인이 매우 한정된 한가지 요인으로 인한 결과가 아니며, 각각 정보 경로(informational pathway)에서의 여러가지 이상에 의해 야기되는, 궁극적으로 겉보기에 비슷한 병적 표현형으로 나타나는, 몇가지 질병들로서 볼 수 있다. 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해, 암성, 전암성 또는 낮은 전이 잠재성을 가진 세포에서 차별적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 동정함으로써, 진단 툴의 기반을 제공할 수 있으며, 후보 물질에 대한 타겟을 제시함으로써 약물 개발을 촉진시킬 수 있고, 또한 치료할 타입의 암에 대한 보다 맞춤형 암 치료법에 대한 치료학적 타겟의 동정이 가능해진다.
또한, 차별적으로 발현되는 유전자 산물의 동정은, 복합적인 질환들의 진행과 성질에 대한 이해를 제공하며, 예컨대 전이성 표현성 또는 염증 표현형의 발현과 관련된 표현형의 원인이 되는 유전적 인자들을 동정하는데 필수적이다. 다양한 단계와 다양한 타입의 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자 산물의 동정은 조기 진단 검사 방법을 제공할 수 있으며, 아울러 치료학적 타겟을 제시할 수 있다. 또한, 차별적으로 발현되는 유전자의 산물은 이의 활성(예, 이의 발현, 생물학적 활성 등)을 조절하는 화학치료제를 동정하기 위한 스크리닝 분석법의 기초가 될 수 있다.
질병의 조기 진단은 질병의 진행을 정지시키고 사망율을 낮추는데 매우 중요하다. 유전자 발현 패턴을 확인하기 위한 환자의 샘플 분석은, 기존 치료법에 비해 부작용을 낮출 수 있는, 보다 특이적이고 합리적인 질병 치료법의 기초이다. 또한, 병소가 환자에서 위험성이 낮은지를 확인하는 것은(예, 종양이 양성임) 불필요한 치료를 피할 수 있게 한다. 간단하게 말해, 질병-관련 세포의 유전자 발현의 패턴을 동정하는 것은 치료법, 진단법, 예후 전망, 테라메트릭(therametric)의 기초가 될 수 있다.
다른 예로, 감염성 질병은 특정 유기체에게서 질병 발병과 사망을 초래하는 조직과 장기에 손상을 야기한다. 인플루엔자 A에 감염된 경우, 입원과 사망의 주된 요인은 폐 조직의 감염이다. 그러나, 인플루엔자에 감염된 정확한 세포와, 손상된 폐를 회복시키는 세포는, 단일 세포 수준에서 파악되지 않는다. 이러한 지식은 바이러스 감염 예방을 위한 새로운 약물과, 이환율(morbidity)을 개선하기 위한 새로운 치료제 등의, 개입해야할 치료학적 타겟을 동정하는데 도움이 될 수 있다.
많은 종양들에는 이의 증식과 생존을 위해 사용하는 신호 전달 경로가 서로 다를 수 있는 혼성 암 세포 집단이 포함되어 있다. 이들 암 세포들은 구체적인 치료법에 대한 반응성이 다르기 때문에, 특정한 암 줄기 세포 집단의 내성이 세포독성의 방사선 치료와 화학치료 이후의 재발에 기여한다. 이처럼, 임상에서의 치료 실패는 부분적으로 그 치료에 대한 특정 암 세포 집단의 내성이 원인일 수 있다.
치료한 직후에 대게 관찰되는 종양의 최초 수축(initial shrinkage)은, 그 종양의 덩어리를 포함할 수 있는, 한가지 암세포 서브집단의 상대적인 민감성을 반영한 것에 지나지 않을 수 있으며, 장기 생존에는 중요하지 않을 수 있다. 따라서, 치료 반응과 예후를 평가하는데 있어 가장 중요한 임상적인 변수는 종양의 절대 크기가 아니라 치료 후에 남아있는 특정 암 세포 집단의 절대 수일 수 있다. 종양 내부에 있는 이러한 상이한 암세포 집단들에 의해 사용되는 신호전달 경로의 차이를 동정할 수 있다면, 각 세포 집단을 표적으로 하는 치료법을 설계할 수 있다. 모든 집단들을 표적화함으로써, 각각의 상이한 집단에 작용하는 약물을 이용한 치료를 통해 종양을 없앨 수 있다.
다른 예로, 염증성 장 질환은 정상적인 장 구조의 파괴로 인해 발생하는 질환으로, 설사, 출혈 및 흡수 불량증이 나타난다. 이러한 문제들은 장의 정상적인 점막 라이닝의 파괴에 의해 초래된다. 결장의 점막 라이닝은 장샘(crypt)으로 구성되어 있는데, 배상 세포(goblet cell), 줄기 세포 및 전구 세포(progenitor cell)가 장샘의 바닥에, 장세포 및 배상 세포를 비롯한 성숙 세포는 장샘의 상부에 존재한다. 염증성 장 질환의 경우에, 어떤 세포 집단이 손상되는지, 손상된 점막의 회복에 필요한 신호전달 경로는 무엇인지는 확실하지 않다.
적은 수의 세포를 이용하여 질병 병소내 세포의 수와 표현형을 정확하게 확인하는 방법은, 염증성 장 질환, 감염, 암, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환 및 감염 등의 다수 질환에서, 예후 판단, 진단 및 특이적인 치료법에 표적이 될 수 있는 신호전달 경로의 동정에 특히 중요하다.
단일 세포의 유전자 발현 프로파일링 및/또는 트랜스크립톰(transcriptome) 분석용 조성물과 방법을 제공한다. 본원의 방법은, 종양으로부터 각각의 세포를 서로 분리된 위치(discrete location)로 무작위 분할하는 단계; 상기 분리된 위치에서 개개 분할된 세포의 복수 유전자에 대한 트랩스크립톰 분석을 수행하는 단계; 및 클러스터링 분석을 수행하여 1종 이상의 상이한 세포 집단을 동정하는 단계를 포함하는, 이질적인(heterogeneous) 고형 종양 샘플에서 상이한 세포 집단들을 동정하는 방법을 제공한다. 일부 예로, 상기 각각의 세포는 분할 전 농화(enrich)되지 않는다. 트랜스크립톰 분석은 1000개 이상의 각각의 세포에 대해 동시에 수행할 수 있다. 트랜스크립톰 분석은 핵산 분석을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분리된 위치들은 평평한 기판 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 무작위 분할은 마이크로유체 시스템에서 수행한다. 트랜스크립톰 분석은 발현된 RNA, 비-발현된 RNA 또는 이들 모두를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 트랜스크립톰 분석은 전체(total) 트랜스크립톰 분석일 수 있다. 트랜스크립톰 분석은, 일부 구현예에서, 네스티드 프라이머(nested primer)가 아닌, 한쌍의 프라이머 세트를 이용하여 RNA를 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. 트랜스크립톰 분석은 각각의 세포들 전체 또는 이의 서브세트에 대해 동시에 또는 실질적으로 실시간으로 수행할 수 있다. 상기 1종 이상의 세포 집단은 정상 줄기 세포, 정상 전구 세포, 정상 성숙 세포, 염증 세포, 암 세포, 암 줄기 세포 또는 비-종양원성(non-tumorigenic) 줄기 세포일 수 있다.
본 발명은, 생검으로부터 세포들을 분리된 위치들로 무작위 분할하는 단계; 상기 각각 분할된 세포의 유전자 50개 이상에 대해 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계; 및 트랜스크립톰 데이타를 이용하여 종양의 한가지 이상의 특징을 동정하는 단계를 포함하는, 개체의 이질적인 종양 생검을 분석하는 방법을 제공한다. 상기 수행 단계는 세포 타입의 사전 농화없이 수행할 수 있다. 동정하는 특징은 암 세포의 존재, 부재 또는 수일 수 있다. 또한, 동정하는 특징은 줄기 세포, 초기 전구 세포, 최초 분화된 전구 세포, 후기 분화된 전구 세포 또는 성숙 세포의 존재, 부재 또는 세포의 수일 수 있다. 또한, 동정하는 특징은 하나 이상의 세포 제거에 대한 치료제의 효능일 수 있다. 동정하는 특징은 또한 신호전달 경로, 예컨대 암 줄기 세포, 분화된 암 세포, 성숙 암 세포 또는 이의 조합에 특이적인 경로의 활성일 수 있다. 본 방법은 상기 특징을 이용하여 암 환자나 암 단계를 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 이질적인 샘플로부터 세포를 무작위 분할하는 단계; 상기 분할된 세포에 대한 트랜스크립톰을 수행하는 단계; 트랜스크립톰 분석을 이용하여 하나 이상의 질병 상태의 세포를 동정하는 단계; 상기 하나 이상의 질병 상태의 세포에 대한 트랜스크립톰 분석 결과를, a) 비질병 상태의 세포, b) 다른 질병 상태의 세포, 및 c) 질병 상태의 줄기 세포에 대한 트랜스크립톰 분석 결과와 비교하는 단계; 및 (i) 질병 상태의 세포, (ii) 질병 상태의 줄기 세포, 및 (iii) 선택적으로 다른 질병 상태의 세포에서 발현되지만, 비질병 상태의 세포에서는 발현되지 않는, 신호 전달 경로를 동정하여, 질병 상태의 세포에 의해 이용되는 신호전달 경로를 동정하는 단계를 포함하는, 질병 상태의 세포에 의해 이용되는 신호전달 경로를 동정하는 방법이다. 상기 질병 상태는 암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 신호전달 경로는 상기 질병 상태의 세포의 생존에 필요하다.
또한, 본 발명은, 이질적인 샘플로부터 세포를 무작위 분할하는 단계; 상기 분할된 세포에 대해 제1 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계; 하나 이상의 질병 상태의 세포에 대한 상기 제1 트랜스크립톰 분석을, 비질병 상태의 세포에 대한 제2 트랜스크립톰 분석과 비교함으로써, 트랜스크립톰 분석을 이용하여 하나 이상의 질병 상태의 세포를 동정하고, 이로써 개체에서 상기 질병 상태의 세포와 관련된 증상의 존재 또는 부재를 진단하는 단계를 포함하는, 증상을 보이는 개체를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 질병 상태는 유방암, 대장암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 트랜스크립톰 분석은 발현된 RNA, 비발현된 RNA 또는 양자의 분석을 포함할 수 있다. 트랜스크립톰 분석은 전체 트랜스크립톰 분석(whole transcriptome analysis)일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 또다른 방법은, 질병 상태의 세포를 가지고 있는 제1 개체를 하나 이상의 테스트 물질에 노출시키는 단계; 상기 개체의 대상 부위로부터 이질적인 종양 생검을 취하는 단계; 하나 이상의 질병 상태의 세포를 포함하는, 상기 이질적인 종양 생검으로부터 유래된, 하나 이상의 각각의 세포에 대해 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계; 상기 트랜스크립톰 분석을, (i) 질병 상태의 세포가 없는 제2 개체 또는 (ii) 상기 노출 단계 수행 전의 제1 개체의 트랜스크립톰과 비교하는 단계; 상기 테스트 부위의 세포에 대한 트랜스크립톰이, 상기 제2 개체 또는 노출 전의 제1 개체의 트랜스크립톰과 보다 비슷하게 되도록 작용하는 물질을 동정하는 단계를 포함하는 치료제의 스크리닝 방법이다. 상기 증상은 유방암, 대장암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 치료제는 항체 또는 항체 단편, 소분자, 핵산(예, siRNA), RNA, DNA, RNA-DNA 키메라, 단백질 또는 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명은, 질병 상태의 세포로 구성된 제1 집단을 분리된 위치로 분리시키고, 상기 분리된 위치가 개개 세포를 포함하도록 하는 단계; 상기 개개 세포 하나 이상으로부터 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여, 질병-상태 표시자를 산출하는 단계; 질병 상태의 세포로 구성된 제2 집단을 물질에 노출시키는 단계; 상기 질병 상태의 세포로 구성된 제2 집단을 서로 분리된 위치로 분리시켜, 상기 분리된 위치가 개개 세포를 포함하도록 하는 단계; 상기 제2 집단 유래의 하나 이상의 개개 세포로부터 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 제2 집단 유래 개개 세포의 발현 수준을 상기 질병 상태를 표시하는 표시자와 비교하여, 상기 물질의 질병에 대한 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 치료제의 질병에 대한 잠재적인 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 노출 단계는 생체내에서 수행할 수 있다. 일부 예로, 상기 제1 집단과 상기 제2 집단은 개체, 예컨대 인간으로부터 분리된다. 상기 질병은 암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 상기 핵산 또는 단백질은 암 세포 마커, 암 줄기 세포 마커 또는 이들 두 가지일 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA의 발현 수준을 결정하는 단계는 10개 이상의 핵산의 발현 또는 발현 결여의 검출을 포함한다. 또한, 발현 수준은 단백질 발현 수준일 수 있다. 상기 분리 단계는 세포의 집단을 개개 세포에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 개체 유래의, 하나 이상의 세포가 질병 상태의 세포인 세포 집단을 분리된 위치로 분리시켜, 상기 분리된 위치가 개개의 세포를 포함하도록 하는 단계; 상기 질병 상태에 있는 개개의 세포 하나 이상으로부터, 치료제의 타겟이 되는, 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 기초로 개체의 반응 가능성을 결정하는 단계를 포함하는, 치료제에 대한 개체의 반응 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 발현 수준은 mRNA 발현 수준일 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 10개 이상의 핵산의 발현 또는 발현의 결여를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 발현 수준은 단백질 발현 수준일 수 있다. 상기 분리 단계는 세포의 집단을 개개의 세포에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 치료제는 항암제일 수 있다.
본원에 상세히 기술된 다른 방법은, 이질적인 샘플의 세포를 개별적으로 어드레스가능한 위치(separately addressable position)로 분리하는 단계; 개개의 세포를 용혈시키고, 수득한 용혈물을 2 이상의 분획으로 나누는 단계; 개개의 세포로부터 유래된 mRNA 또는 cDNA를 증폭하는 단계; 상기 용혈물 분획들 중 하나로부터, 서브집단에 대한 정보가 되는, 유전자 발현 프로파일을 측정하는 단계; 및 타겟 서브집단에 속하는 하나 이상의 세포에 대해 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 개개의 세포의 유전자 발현을 이용한 예후 예측 또는 진단 방법을 제공한다. 일부 방법들에서, 102개 이상 또는 103개 이상의 개개의 세포가 분석된다. 세포는 세포 표면 마커 하나 이상의 발현에 대해 분류할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 의해 분석되는 세포는, 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포일 수 있다. 최초 샘플에는 세포가 106개 미만 또는 105개 미만으로 포함될 수 있다. 세포는 CD34 및 Thyl 중 하나 이상의 발현에 대해 분류할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상 또는 다섯 개(5) 이상의 조혈 줄기 세포 관련 유전자의 발현을 검출한다. 트랜스크립톰 분석은 전체 트랜스크립톰 분석이다.
또한, 본 발명은, (a) 샘플로부터 줄기 세포 트랜스크립톰 프로파일을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 트랜스크립톰 프로파일을 기준 줄기 세포 트랜스크립톰 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 분류하는 방법이다. 트랜스크립톰 프로파일은 약 5개 이상의 줄기 세포-관련 단백질에 대해 수득한 데이타세트를 포함할 수 있다. 분석되는 줄기 세포는 암 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 장 줄기 세포, 백혈병 줄기 세포 또는 폐 줄기 세포일 수 있다. 분석되는 샘플은 암, 예컨대 유방암 또는 대장암의 세포를 포함할 수 있다. 또한, 트랜스크립톰 프로파일 분석은, 줄기 세포 샘플로부터 mRNA를 추출하는 단계; 줄기 세포 특이적인 서열에 해당되는 하나 이상의 mRNA 종의 수준을 정량하는 단계; 및 상기 하나 이상의 mRNA 종의 수준을 상기 기준 샘플에서의 상기 mRNA 종의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 본원에 기술된 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 트랜스크립톰에 대한 데이타를 수집하는 단계 및 상기 데이타를 컴퓨터에 보내는 단계를 포함하는, 트랜스크립톰에 대한 데이타를 수집하는 방법이다. 컴퓨터는 서열분석 장치와 연결될 수 있다. 트랜스크립톰에 대한 데이타는 송신 후 추가로 저장될 수 있으며, 예컨대 데이타는 컴퓨터로부터 추출가능한 컴퓨터 판독가능한 매체에 저장될 수 있다. 데이타는 예컨대 인터넷을 통해 컴퓨터에서 원격 위치(remote location)로 전송될 수 있다.
본 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 첨부된 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 카피는 신청서와 필요한 비용을 제출하여 특허청으로부터 제공받을 수 있다.
도 1. NOD/SCID 마우스에 이종 이식된 인간 결장직강 암 조직(tumor #4m6)으로부터 정제된 인간 "결장직강 암 줄기 세포"(EpCAMhigh)의 실시간 PCR에 의한 단일 세포 유전자 발현 분석. 첫번째 실험(패널 A)에서, 16개의 단일 세포를 각 세포-유전자 조합에 대해 27회 리플리케이트(replicate)를 수행하여, 5개의 유전자 발현에 대해 분석되었으며; 본 실험에서, 반응 매트릭스의 3개의 연속된 가로 구획에 각각의 단일 세포의 각 mRNA 조제물을 사용하고, 9개의 연속된 세로 구획에는 각각의 유전자-특이적인 프라이머 세트를 사용하나, 단 앞에서 3개까지는 프라이머를 첨가하지 않으며, 각 개별 세포의 유전자 발현 수준은 컬러 스케일을 이용하여 3 x 9 블롯으로서 가시화할 수 있다. 2번째 실험에서(패널 B), 비슷한 방법을 수행하였으며, 단, 16개의 단일 세포를 각각의 세포-유전자 조합에 대해 9회 리플리케이트를 수행하여 16개의 유전자 발현에 대해 분석하였고; 이러한 2번째 실험에서, 각 단일 세포 유래의 각각의 mRNA 조제물은 반응 매트릭스의 3개의 연속되는 가로 구획에 사용하고, 각 유전자-특이적인 프라이머 세트는 3개의 연속되는 세로 구획에 사용하여, 각각의 개별 세포의 유전자 발현 수준을 컬러 스케일로 3 x 3 블롯으로서 가시화할 수 있다. 이들 2가지 실험에서, 각 리플리케이트 세트에서의 재현성과 일관성이 우수하였다.
도 2. 인간 "결장직장 암 줄기 세포" (EpCAMhigh/CD166+ 세포, 이종이식 #8m3)의 실시간 PCR에 의한 단일 세포 유전자 발현 분석. 도 2에서, 각 가로줄은 단일 세포이고, 각 세포줄은 개별 유전자이다. 유전자 발현 세기는 컬러 코드를 이용하여 나타내었는데, 빨간색이 진할수록 세기가 강하고, 푸른색이 진할수록 세기는 약하다. 분석을 통해, 이들의 전사 레페토리를 기초로 EpCAMhigh/CD166+ 종양 세포를 별개의 서브세트로 하위 분류할 수 있는 것으로 명확하게 확인된다. 보다 중요하게도, 결장 내피의 최종 분화 마커를 코딩하는 유전자(예, Cytokeratin 20, CD66a/CEACAMl, Carbonic Anhydrase II, MUC2, Trefoil Family Factor 3)를 고수준으로 동조된 동시 발현성을 보이는 세포 서브세트는, 장 줄기 세포의 후보 마커를 코딩하는 유전자 또는 줄기 세포 기능에 필수적인 것으로 공지된 유전자(예, hTERT, LGR5, Survivin)를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하고, 그 역도 성립한다.
도 3A-B. a: 유방 종양을 가지고 있는 NOD/SCID 마우스의 폐 세포로부터 MTICs ll'ESA+H2K-의 정제. 상단 패널은 H2K-Dapilviable 계통을 게이팅한 것이고, 하단 좌측 패널은 ESA+ 세포, 하단 우측 패널은 CD2441' 세포를 게이팅한 것이며, b: MTIC 및 non-TIC에서의 HIFla, Snail2, Zeb2, E-cadherin, Vimentin, VEGFC, CCR7, Lox, Cox2의 실시간 PCR 분석이다.
도 4. 프라이머리 TIC 및 MTIC를 비교하는 microRNA (miR)에 대한 실시간 PCR 분석의 CT 수치이다.
도 5A-5D. 유방암의 비-종양원성 암 세포 마커로서의 CD66a.
도 6. 수천개의 CNV에 대한 18개의 세포 샘플의 카피수 편차 분석. 몇가지는 게놈 불안정성과 관련있을 수 있으며, 변이된 다능성 줄기 세포 특징을 나타낼 수 있다.
도 7. 단일 세포 분석 디바이스, 원칙
도 8. 줄기 세포 관련 유전자(stem-cell linked gene)의 발현에 대한 유전자 세트 농화 분석(Gene Set Enrichment analysis). 자기 재생(self renewing)성 정상 HSC, 과립구/대식세포 전구 세포(GMP) 유래의 백혈병 줄기 세포에 의해 발현되지만, 비자기-재생성 정상 GMP에 의해서는 발현되지 않는 유전자들은, 유방암 줄기 세포(CSC) 및 이의 비-종양원성 자손(NTG)에서 분석하였다. 예측한 바와 같이, 이들 유전자들은 CSC 유전자 발현 표시자에서 현저하게 과다존재하는 것으로 나타났다. 과발현된 유전자의 히트 맵(heat map)을 나타낸다.
도 9. 세포의 희귀 서브-집단의 분리를 위한 "인 실리코(in silico)"의 도식도. 조혈줄기 세포와 같은 세포 집단을 FACS에 의해 96웰 플레이트에 분류하여, 단일 세포로 넣는다. 세포를 용혈시키고, 용혈물을 2개의 분획으로 나눈다. 용혈물 분획 하나는 유전자 세프의 발현에 대해 분석하여, 표면-단백질 발현이 아닌 전사를 기초로 세포를 특정화할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, 선택한 용혈물 및/또는 유사 세포로부터 모든 용혈물에 대해 전체 트랜스크립톰 분석을 수행한다.
도 10. 컴퓨터를 통한 데이타 수집, 저장 및 전송을 나타낸 묘사도.
본 발명의 방법은, 질병 진단, 특정 치료학적 개입에 대한 민감성, 예후 예측 적용 및 신규 약물 타겟의 동정을 위한 세포 집단을 특정화하기 위해, 초대 세포(primary cell)의 단일 세포 유전자 발현 프로파일링을 이용한다. 이질적인 세포 샘플은, 공간적으로 분리된 단일 세포로 나누고, 선택적으로 대상 특징(표면 마커를 포함할 수 있음)에 대해 분류한 다음, 세포 용혈 후, 내용물을 증폭시켜 대상 유전자의 발현을 각각 분석한다. 이렇게 분석된 세포는 개별 세포의 유전적 표시자에 따라 분류된다. 이러한 분류을 통해 시험 샘플의 세포 조성을 정확하게 평가할 수 있다.
진단 목적으로 단일 세포를 분석하는 통상적인 방법은, 해당 타입의 세포의 수를 계수하기 위해 쿨터 카운터(Coulter counter) 및 유세포 측정기의 사용을 포함한다. 그러나, 이러한 측정 방법은 통상적으로 표면 마커에 대한 항체의 사용을 기초로 하며, mRNA 수준에서 유전자 발현이나 단백질 발현을 분석하지 않는다. 단일 세포 PCR 분석에 대한 기존의 예는 있지만, 유용한 진단학적 정보를 제공하거나 또는 조직내에서 세세한 또는 관련 서브집단을 구별하는 능력을 제공하기에는 세포 및/또는 유전자의 수가 적다. 병리학자가 사용하는 조직-염색 방법도 비슷한 문제점이 있으며, 병리학자의 정성적인 판단에 주로 의존한다. 또한, 이러한 방법은 수개의 파라미터 측정에 국한된다. 그러나, 본 발명의 방법은 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500개, 또는 그 이상의 상이한 파라미터를 측정할 수 있으며, 파라미터로는 mRNA, 유전자 발현, 단백질 발현을 포함하며, mRNA, 유전자 및/또는 단백질 발현과 조합하여 세포 표면 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명을 더욱 기술하기 전에, 본 발명은 구체적인 구현예에 대한 수정이 이루어질 수 있고, 이는 첨부된 청구 범위에 여전히 포함될 수 있기 때문에, 본 발명의 구체적인 구현예로 한정되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 사용되는 용어는 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 제한의 의미는 아닌 것으로 이해된다. 본 명세서와 첨부된 청구항에서, 단수형 "하나("a," "an" 및 "the")"는 명확하게 기술된 경우를 제외하고는 복수의 지칭도 포함한다.
수치 범위가 제시된 경우, 명확하게 기술되어 있지 않은 한, 범위의 상한과 하한 사이의, 하한의 단위의 10 단위로, 개지된 각 수치 및 언급한 그 범위내에서의 임의의 다른 언급되거나 개지된 수치는 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 상기 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위내 임의의 구체적으로 제외되는 한계에 대한 내용도 본 발명에 포함된다. 언급된 범위에 상한 및 하한 중 하나 또는 둘다가 포함되는 경우, 이중 하나 또는 둘다가 제외된 범위도 본 발명에 포함된다.
다르게 정의되지 않은 한, 본원의 모든 기술적, 과학적 용어들은 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 바와 비슷하거나 동일한 임의의 방법, 장치 및 재료를 본 발명을 실시하고 테스트하는데 사용할 수도 있지만, 이하 예시적인 방법, 장치 및 재료를 설명한다.
본원에 언급된 모든 공개문헌들은 공개문헌에 기술된 본 발명의 내용 구성을 설명하고 기술하기 위한 목적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 구성은 이하 기술된 본 발명과 연관하여 사용될 수 있다.
세포을 집단 및 서브집단으로 동정 및 분류
본 발명은, 세포를 집단 및 서브집단으로 동정하는 분류 방법, 및 치료학적 타겟을 진단하고, 예후를 예측하고 및/또는 동정하기 위해 집단 및/또는 서브집단을 이용하는 방법에 관한 것이다. 질병은 임의 부류의 암(비제한적으로, 고형 종양, 유방암, 대장암, 폐암, 백혈병), 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 자가면역 질환, 염증 질환 및 감염성 질환을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은, 항체 및 본원에 기술된 임의의 바이오마커를 검출하는데 사용가능한 핵산 프로브, 또는 본원의 바이오마커를 조절하는 반응시약과 같이, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한, 반응시약 및 키트를 제공한다.
단일 세포의 분리
단일 세포의 유전자 발현 프로파일링은 질병의 진단 또는 예후 전망 적용 뿐만 아니라 신규 약물 타겟을 동정하기 위한 검색 도구로 제공된다. 대상 질병은 면역매개의 기능부전, 암 등을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서, 이질적인 세포 혼합물, 예컨대 종양 바늘 생검, 염증 병소 생검, 활액, 척추 천자(spinal tap) 등을, 공간적으로 분리된 단일 세포로, 예컨대 다중웰 플레이트, 마이크로어레이, 마우크로유체 디바이스 또는 슬라이드에 무작위로 또는 특정 순서로 나눈다. 그런 후, 세포를 용혈시킨 후, 내용물을 증폭시키고, 대상 유전자의 발현을 각각 분석한다. 이렇게 분석한 세포는 개개 세포의 유전자 특성으로 분류한다. 이러한 분류를 통해, 테스트 샘플의 세포 구성을 정확하게 평가할 수 있으며, 평가를 통해 예컨대 종양을 구성하는 암 줄기 세포의 실체와 수를 결정하고; T 세포, 수지상 세포, B 세포 등의 수 및 특이성과 같은 면역-관련 세포의 실체와 수를 결정하는데 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 분석할 세포 샘플은 신선하게 분리하거나 냉동 등이 처리될 수 있는 일차 샘플(primary sample)이다. 그러나, 분석할 세포는 배양된 세포일 수도 있다. 일반적으로, 샘플은, 복수의, 별개의 세포 타입, 별개의 집단 또는 별개의 서브집단, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 세포 타입, 집단 또는 서브집단을 포함하는, 이질적인 세포 혼합물이다. 일부 구현예에서, 샘플은 고형 종양, 백혈병, 림프종 등으로부터 유래된 암 샘플이며, 생검, 예컨대 바늘 생검 등, 다발성 종양 및 백혈병의 혈액 샘플 등 일 수 있다. 샘플은 진단 전, 치료 기간 중 등의 시기에 수득할 수 있다.
조직으로부터 세포를 분리하기 위해, 분산 또는 현탁용 적정 용액을 사용할 수 있다. 이러한 용액은 일반적으로 저농도, 예컨대 통상 5-25 mM의 허용가능한 완충액과 더불어, 소 태아 혈청 또는 그외 천연 인자가 통상적으로 보충된, 평형 염 용액, 정상 염수, PBS, 행크의 밸런스 염 용액 등일 것이다. 통상적인 완충액으로는 HEPES, 포스페이트 완충액, 락테이트 완충액 등을 포함한다. 분리된 세포는 세포의 생활성을 유지하는 임의의 적절한 배지 중에 채집할 수 있으며, 일반적으로 수집관의 바닥에 혈청 쿠션이 존재한다. 다양한 배지를 상업적으로 구입할 수 있으며, 세포의 성질에 따라 사용할 수 있으며, 그 예로는 dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, Iscove의 배지가 있으며, 대게 소 혈청 배지가 보충된다.
일부 구현예에서, 샘플에 포함된 세포는 마이크로어레이 상에서 분리되어진다. 예컨대, 고도로 집적된 생세포 마이크로어레이 시스템은 각각 단일 세포에 충분히 맞을 만큼의 크기를 가진 마이크로웰을 이용할 수 있다(Tokimitsu et al. (2007) Cytometry Part A 71k 1003:1010; and Yamamura et al. (2005) Analytical Chemistry 77:8050; 각 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 대상 세포의 사전 농화 - 예컨대 FACS 또는 그외 분류에 의한 - 는 선택사항이며, 일부 구현예에서, 샘플 유래의 세포를 임의의 사전 분류 또는 농화없이 서로 분리된 위치로 분산시킨다. 예컨대, 샘플(예, 혈액 샘플, 생검, 고형 종양) 유래의 세포를 서로 분리된 위치들로 각각 분리시킬 수 있다. 전형적으로, 고형 조직 샘플의 경우, 샘플을 기계적으로, 화학적으로 및/또는 효소적으로 분리한다(예, 트립신 또는 초음파 처리에 의함). 샘플 유래 세포는 임의의 세포 분류 디바이스(예, 마이크로유체 세포 분류기)에서 개개의 세포로 분리되도록, 예컨대 평평한 표면 상의 어드레스가능한 위치에 둘 수 있다. 평평한 표면은 톱니꼴(indentation), 장벽 또는 개개 세포의 분리를 보장하는 다른 특징을 가질 수 있다. 분리된 세포는 그 후 본원의 방법에 따라 분석할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 서로 분리된 위치 상으로 분리되며, 각 위치에는 세포 1 또는 0개가 포함된다.
세포는, 선택적으로, 예컨대 유세포 측정에 의해, 분리 전에 분류된다. 예컨대, FACS 분류 또는 크기-차 분류를 이용하여, 세포 표면 상에 존재하는 하나 이상의 마커에 따라, 대상 세포의 초기 농도를 적어도 1,000, 10,000, 100,000 또는 그 이상의 배수로 높일 수 있다. 이러한 세포는 선택적으로 세포 표면 마커, 특히 대상 집단 또는 서브집단의 마커의 존재 및/또는 부재에 따라 분류된다.
세포를 분석하기 위해 서로 분리된 위치로 분리시키는 경우, 세포는 마이크로유체 분류기를 이용하여, 유세포 측정에 의해, 현미경 등으로 분류될 수 있다. 미세가공된 형광-활성화된 세포 분류기가 Fu et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 1109 and Fu et al. (2002) Anal. Chem. 74:2451-2457에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 샘플은 다층 연질 리소그래피를 이용하여 일체형 미세가공 세포 분류기를 이용하여 분류할 수 있다. 이러한 일체형 세포 분류기는, 협력화된(coordinated) 자동화 양상으로 세포 분류를 수행하기 위한, 페리스탈릭 펌프, 댐퍼(damper), 스위치 밸브, 입력 웰 및 출력 웰 등의 다양한 마이크로유체 기능장치를 포함할 수 있다. 일체형 세포 분류기에서 구동 밸브(actuated valve)의 활성 부피는 1 pL로 낮을 수 있으며, 광학 인테로게이션(optical interrogation)의 부피는 100 fL만큼 적을 수 있다. 통상적인 FACS 장치와 비교하면, 마이크로유체 FACS는 민감성이 더 높고, 교차 오염이 없으면, 보다 저렴하다.
개개의 세포는 추가적인 분석 및/또는 조작을 위해 서로 분리된 위치(예, 96웰 플레이트 또는 마이크로어레이 어드레스) 상으로 분리될 수 있다. 예컨대, 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함하는 세포 집단은, HSC를 성숙 세포와 구별할 수 있는 항체를 이용하여, FACS를 통해 분류한다. 세포는 96웰 플레이트에서 분류하고, 적절한 방법으로 용혈시킨 다음, 용혈물은 qPCR, 마이크로어레이 분석 및/또는 서열분석으로 분석한다.
단일 세포 분리용 디바이스는, 살아있는 세포를 세포 찌꺼기로부터 분리하고, 단일 세포 현탁물로부터 세포를 분류하는 마이크로유체 세포 분류기를 포함한다. 마이크로유체 디바이스는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 여러가지 표면 마커의 형광 신호(예, 타겟 집단 또는 서브 집단에 대한 마커에 대한 표지된 항체)와 조합 사용할 수 있으며, 이를 이후의 유전자 실험을 위해 각각의 용기에 이를 배치할 수 있다. 종양 또는 세포 배양물을 소화(digest)시켜 세포 현탁물을 수득하고, 형광 표면 마커로 세포를 염색하는 등의, 그외 상위 단계를 이러한 시스템에 통합시킬 수 있다. 분석할 세포의 수는 세포의 이질성(heterogeneity)과 샘플내 대상 세포의 기대 빈수(expected frequency)에 따라 결정된다. 일반적으로, 약 102개 이상의 세포를 분석하며, 적어도 약 103, 적어도 5 x 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 약 1010, 적어도 약 1011, 적어도 약 1012, 적어도 약 1013, 적어도 약 1014, 적어도 약 1015, 또는 그보다 많은 수의 세포를 분석한다.
일부 예에서, 단일 세포 분석 디바이스(SCAD)는 모듈식이며, 일체화되고 모두 자동화된 방식으로 하기 단계들을 수행할 수 있다. 1) 조직의 소화. 조직은 디바디스이 유입 포트에 둔다. 적절한 효소를 디바이스에 넣고, 흘려 주어, 세포외 기질의 소화를 수행함으로써 세포 현탁물을 수득한다. 2) 예컨대, 입자의 크기에 따른 유체 흐름을 스플리팅(splitting)시킬 수 있는, 마이크로유체 "메타머터리얼(metamaterial)"을 통해 흘려줌으로써, 소화된 샘플 현탁물을 살아있는 세포를 찌꺼기로부터 분리함. 3) 염색. 필터링한 단일 세포 현탁물을은 선택적으로 마이크로유체 디바이스의 구획내에서 적절한 표면 마커를 이용하여 염색한다. 최대 5가지의 다른 마커로 염색하는 것이 고순도의 암세포 진단을 달성하는데 유용할 수 있다. 4) 분류. 염색된 단일 세포 현탁물을 마이크로유체 디바이스의 다음번 구획으로 흘려주어, 암 세포를 나머지 세포들로부터 분류해 낸다. 다양한 분류기의 예는 실시예들에 기술되어 있다.
발현 프로파일링
분류된 세포는 각각 세포 융혈시켜, 세포의 유전자(RNA, DNA) 및/또는 단백질 구성의 분석을 수행할 수 있다. mRNA는 올리고-dT 비드 컬럼 상에 포착되어, 비드 상에서 역전사되고, 칩 제거 처리된 후 거시적(macroscopic) 웰로 이동되는 등의 과정을 거칠 수 있다. 임의적으로, DNA 또는 RNA는 분석하기 전에 사전 증폭된다. 사전 증폭은 전체 게놈, 트랜스크립톰 또는 이들의 일부(예, 대상 유전자/전사체)의 사전 증폭일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 샘플은 (예, qRT-PCR에 의해)분석하고 발현 프로파일을 결정하기 위해 칩으로 이송될 수 있다.
"발현 프로파일"이라는 용어는 발현되는 단백질 및/또는 발현되는 핵산을 포함하는 것으로 광의적으로 사용된다. 핵산 샘플은, 개개 세포의 표현형에 결정적인 대상 유전자의 발현 정보를 포함할 수 있는, 구분되는 핵산들의 복수개 또는 집단을 포함한다. 핵산 샘플은 RNA 또는 DNA 핵산, 예컨대 mRNA, cRNA, cDNA 등을 포함할 수 있다. 발현 프로파일은 2가지 샘플 간의 차별적인 유전자 발현을 결정하기 위한 임의의 편리한 수단, 예컨대, mRNA, 표지된 mRNA, 증폭된 mRNA, cDNA 등의 정량적인 혼성화에 의해 제작될 수 있다. 개체 또는 환자 샘플, 예컨대 세포 또는 이의 채집물, 예컨대 조직을 분석한다. 샘플은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 편리한 방법에 의해 채집한다. 부가적으로, 종양 샘플을 채집하여, 테스트함으로써, 정상 세포와 질병에 걸린 세포 간의 차별적인 사멸을 초래하는데 있어서의, 치료법의 상대적인 효능을 정할 수 있다. 대상 유전자/단백질은, 본원에 제공되는 유전자/단백질 등의, 예측용인 것으로 확인된 유전자/단백질이며, 이때 발현 프로파일은 열거된 유전자/단백질 중 5, 10, 20, 25, 50, 100개 또는 그 이상(전체 포함)에 대한 발현 데이타를 포함할 수 있다.
샘플은, 당업계에 공지된 여러가지 복수의 방식으로 당업계에 공지된 바와 같이 제조할 수 있으며, 예컨대, mRNA를 단일 세포로부터 분리함으로써 준비할 수 있으며, 이때 분리한 mRNA는 그대로 사용하여, 증폭시키고, 이를 이용하여 차별적인 발현 분야에서 공지된 바와 같이 cDNA, cRNA 등을 제조한다(예, Marcus, et al., Anal. Chem. (2006); 78(9): 3084-89). 샘플은 개체로부터 회수한 임의의 조직(예, 병소 또는 종양 조직)으로부터 준비할 수 있다. 샘플의 분석은 임의의 목적(예, 진단, 예후 예측, 분류, 트랙킹 및/또는 치료법 개발)으로 사용할 수 있다. 세포는 분석하기 전에 배양할 수 있다.
임의의 통상적인 프로토콜을 이용하여 최초 핵산 샘플에 대한 발현 프로파일을 제작할 수 있다. 차별적인 유전자 발현 분석 분야에서 사용되는 방법 등의, 발현 프로파일을 제작하는 다양한 여러가지 방식들이 공지되어 있지만, 발현 프로파일 제작을 위한 한가지 대표적이고 편리한 유형의 프로토콜은 정량 PCR(QPCR 또는 QT-PCR)이다. QPCR을 수행하기 위해 이용가능한 방법, 예컨대 Valera, et al., J. Neurooncol. (2007) 85(l):l-10에 기술된 방법을 이용할 수 있다.
분석 중인 샘플로부터 발현 프로파일을 수득한 후, 발현 프로파일을 기준 또는 대조 프로파일과 비교하여, 진단, 예후 예측, 약물 효능 분석 또는 그외 바람직한 분석을 행할 수 있다. 기준 또는 대조 프로파일은 제공되거나 또는 경험적 방법에 의해 수득할 수 있다. 수득한 발현 프로파일을 단일 기준/대조 프로파일과 비교하여, 분석 중인 세포/조직의 표현형에 대한 정보를 수득할 수 있다. 다른 예로, 수득한 발현 프로파일은 2가지 이상의 다른 기준/대조 프로파일과 비교하여, 분석한 세포/조직의 표현형에 대한 보다 심층적인 정보를 수득할 수 있다. 예컨대, 수득한 발현 프로파일은 양성 기준 및 음성 기준 프로파일과 비교하여, 세포/조직이 목적한 표현형을 가지는지에 대한 검증된 정보를 수득할 수 있다.
여러가지 수치의 측정 또는 분석, 즉 2가지 프로파일 간의 발현 차이는, 다양한 방법들이 어레이 분야의 당업자에게 공지되어 있는, 통상적인 임의의 방법을 이용하여, 예컨대, 발현 프로파일의 디지탈 이미지를 비교하거나, 발현 데이타의 데이타베이스를 비교함으로써 등으로 수행할 수 있다. 발현 프로파일을 비교하는 방법이 기술된 특허들로는 미국 특허 6,308,170와 6,228,575가 있지만, 이들로 한정되지 않으며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 발현 프로파일을 비교하는 방법은 본원에 기술되어 있다.
그런 다음, 통계 분석 단계를 수행함으로써, 유전자 세트의 가중 기여도(weighted contribution)를 구할 수 있다. 예컨대, 최근접 수축 중심 분석(nearest shrunken centroids analysis)을 Tibshirani et al.(2002) P.N.A.S. 99:6567-6572에 기술된 바와 같이 적용하여, 각 클래스의 중심을 계산한 다음, 클래스내 표준 편차로 정규화된, 주어진 발현 프로파일과 각 중심 간의, 평균 제곱 거리를 계산할 수 있다.
분류는 확률로 정의될 수 있으며, 컷-오프는 경험적으로 유추할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 약 0.4의 확률, 보다 통상적으로 약 0.5의 확률을 이용하여, 병 휴지 상태의 환자와 유발된 환자를 구별할 수 있으며, 약 0.6 또는 그 이상의 확률을 사용할 수 있다. "높은" 확률은 적어도 약 0.75, 적어도 약 0.7, 적어도 약 0.6, 또는 적어도 약 0.5일 수 있다. "낮은" 확률은 약 0.25 이하, 0.3 이하 또는 0.4 이하일 수 있다. 다수의 구현예들에서, 분석 중인 세포/조직에 대해 수득되는 상기한 정보들을 이용하여, 숙주, 개체 또는 환자를 대상 치료법으로 치료하여야 하는지를 예측하고, 이의 용량을 최적화한다.
세포 집단 및 서브집단의 특정화
본 발명의 일부 구현예에서, 예컨대 비제한적으로 유방암 및 대장암 등의 상피 암의 경우, 암 줄기 세포 마커(예, CD66a)의 발현에 따른 암 줄기 세포의 특정화로, CSC의 동정이 가능하다. 자기-재생(self-renewal) 및 분화 능력 둘다를 가진 종양원성 암 세포의 서브집단이 존재한다. 이러한 종양원성 세포는 종양의 유지를 담당하며, 또한 종양원성이 아닌 비정상적으로 분화하는 많은 수의 자손을 만들어, 암 줄기 세포의 기준을 충족시킨다. 종양원성 잠재성은 본 발명의 마커들을 차별적으로 발현하는 암 세포의 서브집단내에 포함되어 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 암 줄기 세포에 대한 마커를 양성으로 발현하는 세포의 집단에는, 이질성, 예컨대 CD66에 음성인 세포(CD66-)가 암 줄기 세포(종양원성)로 농화되어 있는 반면, CD66a+ 세포는 종양원성이 아닌, 이질성이 존재한다. 집단내의 이러한 이질성을 검출하여 서브집단을 결정할 수 있다.
당해 분야의 당업자는, 다수의 서열 - 제시 유전자, 전사체 및/또는 단백질 - 들을 분석할 수 있음을 알 것이다. 이러한 서열로 샘플내 세포의 표현형을 결정 및/또는 구별할 수 있다.
마커 또는 마커들의 패널은, 샘플, 예컨대 조직 소스(예, 신경 대 상피) 또는 질환 상태(예, 암성 대 비암성)내 타겟 집단 또는 서브집단의 여러 특성을 근거로 선택할 수 있다. 세포 집단 구별(정상 세포에서 암 줄기 세포)에 사용가능한 그외 서열도, 타겟 집단에서의 유전자 변화(예, 상향 또는 하향 조절)를 검출함으로써, 본원에 기술된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
한가지 집단을 다른 집단으로부터 구별하는데 유용한 핵산은 집단들 간의 비교시 하향 조절 또는 상향 조절될 수 있다. 예컨대, 일부 핵산의 발현은, 암 대 정상 세포, 줄기 세포 대 분화된 세포, 및 암 줄기 세포 대 분화된 암 세포에서 상향 또는 하향 조절된다. 일부 예에서, 유전자의 상향 또는 하향 조절을 이용하여 더 큰 집단내에서 서브집단들을 구분하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 일부 핵산은 정상 세포에서만, 정상 세포와 암 줄기 세포, 또는 암 줄기 세포에서만 발현된다.
핵산은 다른 집단 또는 서브집단, 공지된 발현 수준의 특정 핵산, 또는 표준 발현 수준과 비교하여, 상향 또는 하향 조절될 수 있다. 다른 예로, 다수 유전자의 발현을 분석하였을 때, 평균을 제하고 독립적으로 각 유전자에 대한 표준 편차로 나눔으로써 히트맵(heatmap)을 만들 수 있으며, 평균에서의 편차 수준을 기초로 수치 값을 정한다. 예컨대, +/-1 값은 평균에서의 2.5 - 3 표준 편차를 의미할 수 있다. 이러한 분석을 추가로 개선하여, "+/-3" 범위에 포함되는 유전자를 이용하여 다른 타입의 집단들을 클러스터링할 수 있다(예, 암은 "+3" 값으로 주어지며, 정상 조직은 "-3"으로 지정되어, 클러스터링 알고리즘은 이들 서로를 식별할 수 있음). 상향 조절된 유전자는 "+" 값일 수 있다.
일부 예로, 차별적으로 발현된 핵산들의 조합을 특정 집단 또는 서브집단에 대한 프로파일로서 사용할 수 있다. 프로파일은 차별적으로 발현되는 핵산 및/또는 단백질의 임의의 갯수, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 수의 핵산 및/또는 단백질로 구성될 수 있다. 일부 예에서, 타겟 집단 또는 서브집단을 동정하는데 이용되는 핵산은 타겟 및 비타겟 집단이나 비타겟 서브집단에서 비슷하게 발현될 수 있다. 이렇듯 비슷하게 발현되는 핵산은 일반적으로 타겟 집단 또는 서브집단을 동정하기 위해 차별적으로 발현되는 다른 핵산과 조합하여 이용될 것이다.
본원의 방법을 이용하여 임의 소스(예, 생검, 정상 조직, 고형 종양 등)로부터 이질적인 세포 집단을 분석할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 임의의 세포 집단, 예컨대 더 큰 이질적인 집단 또는 서브집단 내의 타겟 집단, 타겟 세포, 암 또는 그외 줄기 세포가 존재하는 이질적인 집단 또는 서브 집단, 또는 전체 이질적인 집단을 분리 및 분석할 수 있다.
바이오마커 발견
본원의 방법은 세포 집단 또는 서브집단(예, 정상 세포, 암 세포, 질병 상태의 세포)과 연관된 새로운 마커를 정할 수 있다. 마커는 임의의 바이오마커를 포함할 수 있으며, 예로 DNA, RNA 및 단백질이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 세포 집단에 대한 마커는 해당 세포에서 정상적으로는 발현되지 않는 유전자 또는 mRNA이다(예, 전구 세포 또는 차별화 마커를 발현하는 세포에 의한 줄기 세포 유전자의 발현, 또는 차별화 마커를 또한 발현하는 세포에 의한 증식 유전자의 발현). 전형적으로, 2종 이상의 마커, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 보다 많은 수의 마커를 분석한다. 마커가 발현된 RNA인 경우, 트랜스크립톰의 임의의 일부분을, 최대로, 전체 트랜스크립톰을 포함하여 결정할 수 있다.
특정한 타겟 세포 집단 또는 서브집단에서의 핵산의 발현 패턴 분석을 통해, 타겟 집단 또는 서브집단을 다른 것과 구별하는 새로운 바이오마커를 동정할 수 있다. 예컨대, 고유한 표면-마커 단백질이 타겟 집단 또는 서브집단에서 발현되는 경우, 동일한 또는 다른 개체에서 상기 집단 또는 서브집단의 세포를 (예, FACS에 의해) 동정 및/또는 분리하는데 이용하기 위해, 상기 마커에 결합하는 항체를 개발할 수 있다. 집단 또는 서브집단에 특이적인 바이오마커의 동정은, 네거티브 선별이 가능할 수 있는 세포 집단 또는 서브집단 상에서의 특정 마커의 부재를 포함한다. 집단 또는 서브집단에서의 마커의 존재는 본원에 기술된 방법을 이용하여 결정할 수 있으며, 세포 집단을 정의하는데 이용할 수 있다. 분석한 세포 집단 또는 서브집단에서의 mRNA는, 특정 유전자가 정상 및 암 세포에서 차별적으로 발현됨을 보여준다. 차별적인 발현은, 전사체 수준의 증가 또는 감소, 전사의 결여, 및/또는 발현의 변이된 조절(예, 자극에 반응하여 다른 패턴의 발현)을 포함할 수 있다. 또한, 세포 집단 또는 서브집단에 대한 마커로서 제공되는, mRNA 또는 다른 마커는, 그 세포 집단 또는 서브집단에 존재하는 돌연변이를 포함할 수 있다(예, 암 세포 및 암 줄기 세포, 그러나 정상 세포는 아님). 당해 분야의 당업자는, 이러한 마커가 테스트한 단일 개체 유래의 세포 집단을 표시할 수 있으며, 및/또는 다수 개체들에 대한 마커들을 표시할 수 있음을 인지할 것이다. 일부 예에서, 발현된 mRNA는 와이드 어레이 단백질 검출 방법들(예, 면역어레이, 웨스턴 블롯 등) 중 임의의 방법에 의해 검출가능한 단백질로 번역한다.
검출할 수 있는 다른 마커로는 마이크로RNA를 포함한다. 일부 예에서, 마이크로RNA의 발현 수준은, 특정 마이크로RNA의 발현이 유사한 세포 집단과 비교하여 약 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0 배 이상으로 증가 또는 감소된, 세포 집단에 대한 마커로서 제공된다.
세포 집단 및 서브집단에서의 트랜스크립톰 결정
본 발명의 방법들 중 임의의 방법(예, 집단으로부터 세포의 FACS 분리 후 부분 전사 분석)에 의해 분리된 세포에 대한 추가적인 정보를 얻기 위해, 세포를 더욱 분석하는 것이 좋을 수 있다. 일부 예에서, (예, 개별 세포의 사전 농화하거나 하지 않고 분리함으로써) 샘플에서 분리한 개별 세포를 세포 용혈시키고, 대상 핵산(예, 게놈 DNA, RNA 등)을 취한다. 본원에 기술된 바와 같이, 유전자 또는 유전자들의 패널을 전사 분석하여, 분리된 세포를 이의 발현 프로파일에서 유사성을 보이는 그룹들로 (예, 암 줄기 세포 대 비-줄기 세포) 분류할 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 세포는 이의 기능과 밀접하게 관련되어 있으므로, 이러한 정보는 기능성 차이를 유전자로서 제시할 수 있다. 일단 세포들이 유사-세포(like-cell) 그룹들로 조직화되면(예, 비슷하거나 동일한 전사 프로파일을 보이는 이들 세포), 개개 세포의 용혈물 및/또는 유사-세포의 핵산 풀을 포함하는 용혈물을, 트랜스크립톰 수준에서 추가로 분석할 수 있다. 일부 구현예에서, 용혈물(예, 단일 세포 또는 유사-세포 풀)에 대해, 각각의 세포 및/또는 유사-세포 풀의 트랜스크립톰의 일부분을 정의하는 방법(예, 고성능 서열분석)을 수행한다. 개개의 세포에 대한 트랜스크립톰 정보는 개개의 세포의 결과를 다른 유사 세포의 결과와 비교 및/또는 조합함으로써, 집단 수준에서 분석할 수 있다. 또한, 유사-세포 풀의 트랜스크립톰 정보를 이용하여, 이러한 풀의 전사 특징들을 정의할 수 있다.
임의의 세포 집단, 예컨대 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 이러한 방식으로 연구할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는, 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 - 암 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 및 간엽 줄기 세포가 있으나, 이들로 한정되지 않음 - 및 유도된 다능성 줄기 세포를 포함한다. 일반적으로, 세포 집단은 이질적인 집단(예, 임상 표본)이다. 더 큰 집단에 포함된 대상 서브집단은, 임의의 관련 기준(예, 표면 단백질 발현)에 따라 본원의 임의의 방법(예, FACS 분류)에 의해 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 이렇게 분류된 세포는, 각 분류 집단이 세포 10개 이하, 5개 이상, 4개, 3개, 2개 또는 1개이도록, 구분된다.
일부 구현예에서, 세포를 용혈시키고, 2가지 이상의 분획으로 나눈다. 용혈물의 일부를 더욱 분석(예, 발현 검출을 위한 유전자들의 패널 분석)하여, 보다 큰 이질적인 집단에 포함된 서브집단들을 검출 및/또는 구별한다. 대상 서브집단에 포함된 것으로 나타난 세포의 용혈물(예, 조혈 줄기 세포)을 더욱 분석한다. 개개 세포의 용혈물 또는 유사-세포로부터 모든 용혈물을 분석할 수 있다. "유사-세포" 집단의 결정은 유전자 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 발현에 대한 유사성을 기초로할 수 있다.
세포와, 대상 세포 집단 또는 서브집단을 추가로 분석할 수 있다. 세포 집단 또는 서브집단들은, 오리지날 샘플의 일부를 구성하는 세포, 예컨대 오리지날 샘플의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상을 구성하는 세포를 포함할 수 있다. 본원의 방법을 이용하여, 분리되어진 집단 또는 서브집단에, 타겟 집단 또는 서브집단에 속하지 않는 세포가 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 없도록, 대상 세포 집단 또는 서브집단을 이질적인 샘플에서 분리할 수 있다. 용혈물은 오리지날 집단으로부터 분리한 세포로부터 제조되기 때문에, 유사-세포 집단에 대한 연구는 유사-세포로부터의 용혈물을 모아 달성할 수 있다.
세포, 집단 및/또는 서브집단에 대한 추가적인 분석은 전체 트랜스크립톰 분석을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 용혈물은 분석을 위해 증폭(예, cDNA)시킬 수 있거나 또는 바로 분석(예, mRNA 서열분석, 마이크로어레이 분석)할 수 있는 mRNA를 포함할 것이다. mRNA 증폭은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다(예, 시험관내 전사, 라이게이션-PCR cDNA 증폭). 일부 구현예에서, mRNA 증폭은 마이크로유체 디바이스에서 또는 이를 함께 사용하여 수행할 수 있다. 전체 트랜스크립톰 분석은, Illumina (RNA-Seq) 및 Helicos (디지탈 유전자 발현 또는 "DGE")로부터 시판되는 것 등의 서열분석 플랫폼에 의해 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 폴리뉴클레오티드를 분석한다. 타겟 핵산은 예컨대 생거-타입의 서열분석을 이용하여 통상적인 겔 전기영동 기반의 방법으로 서열분석할 수 있다. 다른 예로, 서열분석은 몇가지 "다음 세대" 방법을 이용함으로써 달성할 수 있다. 이러한 "다음 세대" 서열분석 방법으로는, 1) 454/Roche Lifesciences (비제한적으로, Margulies et al., Nature (2005) 437:376-380 (2005); 및 미국 특허 7,244,559; 7,335,762; 7,211,390; 7,244,567; 7,264,929; 7,323,305에 기술된 방법 및 장치 등); 2) Helicos BioSciences Corporation (Cambridge, MA) (미국 출원 번호 제 11/167046호, 및 미국 특허 7501245; 7491498; 7,276,720; 및 미국 특허 공개번호 US20090061439; US20080087826; US20060286566; US20060024711; US20060024678; US20080213770; 및 US20080103058에 기술됨); 3) Applied Biosystems (예, SOLiD 서열분석); 4) Dover Systems (예, Polonator G.007 서열분석); 5) Illumina (미국 특허 5,750,341; 6,306,597; 및 5,969,119에 기술된 것); 및 6) Pacific Biosciences (미국 특허 7,462,452; 7,476,504; 7,405,281; 7,170,050; 7,462,468; 7,476,503; 7,315,019; 7,302,146; 7,313,308; 및 미국 출원 공개번호 US20090029385; US20090068655; US20090024331; 및 US20080206764에 기술된 것)의 시판되는 것을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 모든 참고문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 방법들과 장치들은 예로 본원에 제공되나, 한정하고자 하는 것은 아니다.
전체 트랜스크립톰 분석은 상이한 세포 서브집단을 추가로 특정화할 수 있는 다양한 방식으로 수행할 수 있으며, 그 예로는, 1) 서브집단의 고유한 생물학적 특성을 드러낼 수 있는 유전자 및/또는 이의 발생(development)을 조절하는 전사 인자의 활성 검출; 2) 서브집단을 정제하기 위해 사용할 수 있는 표면 마커의 위치 파악 및/또는 특정화(예, FACS 분류에 의함); 및 3) 전체 집단으로부터 서브집단을 구별하는 (예, 암 줄기 세포 대 정상 조직), 질병에 대한 잠재적인 약물 타겟으로서, 세포 유전자 및/또는 유전자 산물의 검출 및/또는 특정화가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
(예, 트랜스크립톰 분석에 의한) 집단 및/또는 서브집단의 분석은 서브집단에 속하는 세포를 분리하기 위한 정제 기법을 고려할 수 있다. 예컨대, 상기 방법으로 서브집단 특이적인 표면 항원이 드러난 경우, 임의의 이용가능한 항원 합성 방법에 의해 개발된 항체를 이용하여, 이질적인 집단(예, 환자 샘플)으로부터 그러한 세포를 분리할 수 있다. 부차적으로, 트랜스크립톰 프로파일을 이용하여, 세포를 다른 집단(예, 동일한 또는 상이한 환자 유래의 샘플)으로부터 동정할 수 있다.
진단 및 예후 예측
본 발명은, 암, 염증 질환, 자가면역 질환 및 감염증 등의 임의의 상태에 대한 예방, 치료, 검출 또는 연구에 사용된다. 암의 예로는, 전립선암, 췌장암, 대장암, 뇌암, 폐암, 유방암, 골암 및 피부암이 있다. 염증 상태의 예로는 과민성 장 증후군 및 궤양성 대장염이 있다. 자가면역 질환의 예로는 크론 질환, 루푸스 및 그레이브 질환이 있다. 예컨대, 본 발명은, 위장계 암, 예컨대 항문암, 대장암, 식도암, 담낭암, 위암, 간암 및 직장암; 생식비뇨기암, 예컨대 음경암, 전립선암 및 고환암; 부인성 암, 예컨대 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 자궁암, 난관암, 질암 및 음문암; 두경부암, 예컨대 하인두(hypopharyngeal) 암, 후두암, 구인두(oropharyngeal) 암, 입술 암, 입 암 및 경구 암, 타액선 암, 소화기관 암 및 부비동암(sinus cancer); 전이 암; 육종; 피부암; 비뇨관 암, 예컨대 방광암, 신장암 및 요도암; 내분비계 암, 예컨대 갑상선암, 뇌하수체암, 부신암 및 췌도암; 및 소아과암을 예방, 치료, 검출 및 연구하는데 사용된다.
또한, 샘플내 개개 세포들을 1차 분류함으로써 치료법을 최적화하고, 분류 정보를 토대로, 부적절한 독성은 최소화하면서 부적절한 타겟 세포에 대한 항-증식성 치료제의 전달의 차별성을 최적화하는, 적절한 치료법, 용량, 치료 방식 등을 선택하는, 방법을 제공한다. 치료제는 유효한 항-증식성 활성을 제공하면서 부적절한 독성을 최소화하는 치료제를 선택함으로써 최적화된다. 치료제는 샘플에서 세포의 서브세트에만 작용하도록 선택할 수 있다. 일부 예에서, 샘플에서 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.02% 미만, 약 0.01% 미만의 세포에게만 작용하는 치료법을 선택한다.
상태의 표시자(signature)는 증상이 존재하는 것으로 나타난 단일 세포내에서의 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 패턴을 지칭할 수 있다. 암 줄기 세포 표시자는, 이의 발현이 암 줄기 세포의 표현형을 표시하는, 1종 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 패턴을 지칭할 수 있다. 자가면역 또는 염증성 세포의 표시자는, 자가면역 또는 염증성 세포 표시자로 표시되는 유전자 및/또는 단백질의 발현을 의미한다. 표시자는 데이타세트 전체 또는 일부에서 수득할 수 있으며, 통상적으로, 표시자는 적어도 약 5개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 10개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 15개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 20개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 25개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 50개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 75개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 100개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 150개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 200개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 300개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 400개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 적어도 약 500개 이상의 유전자 및/또는 단백질, 또는 그 보다 많은 수의 유전자 및/또는 단백질로부터의, 유전자 및/또는 단백질 발현 정보를 포함할 것이다. 데이타세트의 서브세트를 이용하는 경우, 서브세트는 상향 조절된 유전자, 하향 조절된 유전자 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
임상 적용을 위한 환자 샘플의 분석
하기 내용은 암 줄기 세포에 초점이 맞추어져 있지만, 본원의 방법을 이용하여, 비제한적으로 임의 조직의 정상 세포(예, 정상 줄기 세포, 정상 전구 세포 및 정상 성숙 세포), 바이러스 감염된 세포, 염증 세포, 전구 세포, 암 세포(예, 종양원성 세포, 비-종양원성 세포, 암 줄기 세포 및 분화된 암 세포), 질병 상태의 세포(예, 암 세포, 염증 장 질환 세포, 궤양성 대장염 세포 등), 미생물(세균, 진균, 원생 생물) 세포 등을 포함하는, 임의의 세포 집단을 분리 및/또는 분석할 수 있다. 즉, 암 줄기 세포(CSC)를 이용하여 제공되는 상세한 내용은 임의의 질병 상태 또는 상태를 수행할 수 있는 분석의 예이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 환자 샘플내 CSC의 수는 암 세포의 총 수를 기준으로 결정될 수 있다. 예컨대, 생검 샘플의 세포를 분리하여, 암 세포를 표시하는 1종 이상의 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 분석하여, CSC 표현형을 표시하는 세포를, 정량한다. 다른 예로, CSC의 특정 집단 또는 서브집단에 대해 수집한 데이타를 이용하여, 집단 또는 서브집단에 대한 친화성(예, 항체) 스크린을 개발할 수 있으며, 이러한 친화성 스크린을 이용하여 세포의 수를 정량할 수 있다. 전형적으로, CSC의 비율이 더 높은 것은 암 표현형을 가진 세포의 계속적인 자기-재생 가능성을 의미한다. 환자 샘플에서의 CSC의 정량 결과를, 양성 및/또는 음성의 기준 샘플, 예컨대 혈액 샘플과 같은 환자의 샘플, 질병 관해된 환자의 샘플 등과 비교할 수 있다. 일부 구현예에서, CSC의 정량화는, 암 세포의 수와 CSC인 그러한 세포의 비율을, 치료 전에, 치료 중에 및 치료 추척 기간 동안에 정량하는, 치료 코스 동안에 수행한다. 암 줄기 세포를 타겟팅하는 치료법은 환자 샘플내 CSC의 총 수 및/또는 비율을 감소시킨다.
CSC는, 특정 마커에 대한 이의 표현형 및/또는 이의 기능적 표현형으로 동정할 수 있다. 일부 구현예에서, CSC는 대상 마커에 특이적인 반응시약을 세포에 결합시킴으로써 동정 및/또는 분리한다. 분석할 세포는 살아있는 세포일 수 있거나, 또는 고정되거나 포매된 세포일 수 있다.
또한, 환자 샘플내 CSC의 존재는 암(예, 백혈병, 유방암, 전립선암)의 단계를 나타낼 수 있다. 또한, CSC의 검출을 이용하여, 치료법에 대한 반응을 모니터링하고 예후 예측을 보조할 수 있다. CSC의 존재는 줄기 세포의 표현형을 가진 세포를 정량함으로써 측정할 수 있다. 이는, 세포 표면의 표현형을 파악하는 것과 더불어, 예컨대 이종 이식 모델에서 생체내에서 종양을 발생시키기 위한, 자기-재생 능력 등의 기능적인 기준에 의해 결정할 수 있는, "줄기 세포" 캐릭터를 가지고 있는, 샘플에서의 세포 정량에 유용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 임상 샘플은 다양한 소스, 특히 혈액으로부터 수득할 수 있지만, 일부 예에서, 골수, 림프, 뇌척수액, 활액 등의 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 생검 또는 세포 함유성 그외 임상 표본을 포함할 수 있다. 일부 샘플들은 고형 종양 또는 이의 일부를 포함한다. 세포 덩어리(mass)를 분석할 경우, 이 덩어리는 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 해리시킬 수 있다(예, 효소에 의한 소화, 물리적 분리). 이러한 샘플은, 원심분리, 세정, 밀도 구배 분리, 성분 채집술(apheresis), 친화성 선별, 패닝(panning), FACS, Hypaque를 이용한 원심분리 등에 의해, 분석 전에 분리할 수 있으며, 통상적으로 단핵구 분획(PBMC)을 사용한다. 이러한 방식으로, 샘플(예, 고형 종양)의 개개 세포를 차별적인 유전자 발현 및/또는 트랜스크립톰 분석에 대해 본원에 기술된 바와 같이 분석할 수 있다.
샘플을 수득하면, 바로 사용하거나, 냉동시키거나, 또는 단기간 적절한 배양 배지에서 유지시킬 수 있다. 다양한 배지를 사용하여 세포를 유지시킬 수 있다. 샘플은 임의의 편리한 공정에 의해, 예컨대 생검, 채혈, 천자(venipuncture) 등을 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 적어도 약 102개의 세포, 보다 통상적으로 적어도 약 103, 104, 105 또는 그 보다 많은 수의 세포를 포함할 것이다. 동물 모델, 예컨대 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 설치류, 예컨대 마우스, 랫, 햄스터, 영장류 등에 사용할 수 있지만, 전형적으로 샘플은 인간 환자 유래이다.
세포 샘플의 분산물 또는 현탁물을 위해 적절한 용액을 사용할 수 있다. 이러한 용액은 일반적으로 5-25 mM의 저 농도로 허용가능한 완충액과 조합하여, 소 태아 혈청 또는 그외 천연 인자들이 편리하게 보충된, 평형 염 용액, 예컨대 정상 식염수, PBS, 행크 평형 염 용액 등이 일반적일 것이다. 편리한 완충액으로는 HEPES, 포스페이트 완충액, 락테이트 완충액 등을 포함한다.
세포의 염색 분석은 통상적인 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 정확한 계수를 제공하는 기법은, 다중 컬러 채널, 저-각도의 둔각 광 분산 검출 채널, 임피던스 채널 등과 같이, 정밀도(degrees of sophistication)를 다양하게 할 수 있는, 형광 활성화된 세포 분류기를 포함한다. 세포는 죽은 세포와 조합되는 염료(예, 프로피듐 아이오다이드)를 채용함으로써 죽은 세포로부터해 선별할 수 있다.
친화성 반응 시약은 전술한 세포 표면 분자에 대한 특이적인 수용체나 리간드일 수 있다. 항체 반응 시약 이외에, 펩타이드-MHC 항원과 T 세포 수용체 쌍들을 이용할 수 있다: 펩타이드 리간드 및 수용체; 작용제 및 수용체 분자 등. 항체 및 T 세포 수용체는 단일 클론 또는 다클론일 수 있으며, 형질전환 동물, 면역화된 동물, 불멸화된 인간 또는 동물 B-세포, 항체나 T 세포 수용체를 코딩하는 DNA 벡터로 형질전환된 세포 등에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조 및 특이적인 결합 구성원으로서의 이용 적합성에 대한 상세한 내용은 당해 기술 분야의 당업계에 잘 알려져 있다.
한가지 방법은 친화성 반응 시약으로서 항체를 사용하는 것이다. 편리하게는, 이들 항체를 분리시 사용하기 위한 표지물질과 접합시킬 수 있다. 표지물질은, 특정 세포 타입의 분리를 용이하게 할 수 있도록, 직접 분리 가능할 수 있는 자기 비드, 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거할 수 있는 바이오틴, 형광 활성화된 세포 분류기와 함께 사용할 수 있는 플루오로크롬 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 표준물질을 포함한다. 사용할 수 있는 플루오로크롬으로는 피코빌리단백질, 예컨대 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레세인 및 텍사스 레드를 포함한다. 각 항체는 대체로 여러가지 플루오로크롬으로 표지하여, 각 마커에 대해 독립적으로 분류할 수 있다.
항체를 세포의 현탁물에 첨가하여, 이용가능한 세포 표면 항원에 결합하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션은 일반적으로 약 5분 이상, 통상적으로 약 30분 미만일 것이다. 분리 효율이 항체 부족에 의해 한정되지 않도록, 항체가 반응 혼합물내에 충분한 농도가 되도록 하는 것이 바람직하다. 적절한 농도는 타이트레이션(titration)에 의해 결정한다. 세포를 분리시키는 매질은, 세포의 생활성을 유지하는 임의의 매질이다. 이용될 수 있는 한가지 매질은 0.1 - 0.5% BSA를 포함하는 포스페이트 완충화된 염수이다. 다양한 매질들을 구입할 수 있으며, 흔히 소 태아 혈청, BSA, HSA 등이 보충된, 둘베코의 변형 이글 배지(dMEM), 행크 염기성 염 용액(HESS), 둘베코 포스페이트 완충화된 염수(dPBS), RPMI, 이스코브의 배지, 5 mM EDTA 첨가된 PBS 등을, 세포의 성질에 따라 사용할 수 있다. 그런 다음, 표지된 세포는 종래와 같이 세포 표면 마커의 발현에 대해 정량할 수 있다.
환자 샘플에 대해 수득한 차별적인 전구 세포 분석(differential progenitor analysis)과 기준인 차별적인 전구세포 분석의 비교는, 적합한 추론 프로토콜, AI 시스템, 통계 비교 등을 이용하여, 달성할 수 있다. 기준인 차별적인 전구세포 분석과, 정상 세포, 유사하게 질병에 걸린 조직의 세포 등의 비교는, 질병 단계에 대한 지표를 제공할 수 있다. 기준인 차별적인 전구세포 분석의 데이타베이스를 집계할 수 있다. 특정한 대상의 분석은, 환자를 예컨대 질병의 만성 및 전-백혈병 단계(pre-leukemic stage)들을 추적하여, 질병의 가속화를 초기 단계에서 관찰하게 한다. 본 발명의 방법은 임상 증상이 개시되기 전에 가속화를 검출함으로써, 조기의 치료학적 개입, 예컨대 화학 치료의 개시, 화학치료법의 용량 증가, 화학치료 약물의 선택 변화 등을 가능하게 한다.
종양 분류 및 환자의 등급화
또한, 1차 분류에 의한 치료법의 최적화 방법을 제공하며, 그 정보를 기초로, 적절한 요법, 용량, 치료 방식 등을 선택하여, 부적절한 타겟 세포에 대한 항-증식성 치료제의 차별적인 전달(between delivery)을 최적화하면서, 부적절한 독성을 최소화한다. 치료는, 부적절한 독성을 최소화하는 치료로 선택하고 효과적인 항-증식성 활성을 제공하도록, 최적화한다.
일 측면에서, 본 발명은, 병소, 예컨대 종양 병소, 면역 장애 샘플 등을 분류하여, 단일 세포(CSC 포함) 유전자 발현 특징에 따라 환자를 그룹핑하거나 또는 "등급화"하는 방법을 제공한다. 예컨대, 암 줄기 세포의 비율이 높은 것으로 분류된 종양은 전이 및 사멸 위험성이 더 크므로, 따라서, 좀더 양성인 타입의 종양 보다 더 공격적으로 치료할 수 있다. 즉, 환자의 샘플에 존재하는 집단 또는 서브집단의 분석을 이용하여, 질병 상태를 특정화하고, 치료 요법을 모니터링하거나 및/또는 치료 방법을 개발할 수 있다.
임상 실험을 위한 잠재적인 집단의 풀에 속하는 각 환자의 샘플은 상기에 언급된 바와 같이 분류할 수 있다. 비슷하게 분류된 병변을 가지고 있는 환자는 동질적인 환자 집단이 바람직한 치료제의 평가 실험 또는 임상 실험에 참여하도록 선정할 수 있다. 또한, 환자의 분류는 이질적인 환자 집단에서 치료제 효능을 평가하는데 사용할 수 있다. 따라서, 개체의 발현 프로파일을 질병 분류에 대한 집단 프로파일과 비교하여, 특정 환자나 환자 집단(즉, 동일한 타입의 암에 걸린 환자들의 그룹)에 대해 안전하고 효과적인 것으로 예상되는 약물 또는 다른 치료 요법을 선택하거나 설계할 수 있다. 분류는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 보다 많은 수의 핵산 및/또는 단백질의 발현(또는 이의 결여)을 기초로 할 수 있다.
진단, 예후 전망, 치료법 평가(테라메트릭스(Therametric)) 및 질병 관리
본원에 기술된 분류 방법 뿐만 아니라 이의 유전자 산물 및 대응되는 유전자 및 유전자 산물들은, 질병의 경로(예, 발암 경로, 염증 경로 등)에 따른 최초 변화를 검출하거나 및/또는 다양한 치료법과 예방적인 개입의 효능을 모니터링할, (예 혈액 또는 조직에서의) 유전자 또는 생화학적 마커로서 특히 흥미롭다.
단계 설정은, 환자에서 암성 상태가 얼마나 진행되었는지를 표시하기 위해 의사가 사용하는 절차이다. 단계 설정은 의사가 예후 결정, 치료 계획 설정 및 이러한 치료의 결과 평가하는 것을 돕는다. 단계 설정 체계는 암 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 다음의 "TNM" 체계가 사용된다: T는 종양의 타입이고, N은 암이 근처 림프절로 전이되었는지를 표시해주며, M은 암이 신체에서 먼 곳으로 전이되었는지를 표시한다. 일반적으로, 암이 어떠한 림프절로도 전파되지 않고 원발성 병소 영역에서만 검출가능하다면, 이는 I 단계이다. 만약 암이 가장 가까운 림프절에만 전파되었다면, II 단계이다. III 단계에서는, 암은 일반적으로 원발성 병소의 부위에서 주변 근처에 있는 림프절에 전파되었다. 간, 뼈, 뇌 또는 다른 부위 등의 신체의 다른 부위로 전파된 암은 IV 단계이며, 가장 많이 진행된 단계이다.
본원의 방법은, 암의 공격성, 예컨대 전이 가능성 뿐만 아니라 신체의 다른 부위에 존재하는지를 동정함으로써, 용이하게 단계 설정 프로세스를 미세 조정할 수 있다. 즉, 전이 잠재력이 높은 암을 나타내는 분류의 II 단계의 암을, 경계선 II 단계 종양에서 III 단계 종양으로 바뀌는데 이용하여, 보다 공격적인 치료법을 입증할 수 있다. 반대로, 보다 낮은 전이 가능성을 나타내는 폴리뉴클레오티드의 존재는 종앙의 보다 보존적인 단계로 있게 해준다.
예컨대, II 단계의 환자로부터 취한 유방암 생검을 본원에 기술된 방법으로 분석한다. 유방암은 환자의 세포로부터 결정되는 발현 프로파일(들)에 따라 높은 전이 잠재성이 있는 것으로 분류할 수 있다. 즉, 치료의는 이러한 정보를 추가적인 분류 없이 예전보다 더 공격적으로 환자를 치료하는데 이용할 수 있다. 또한, 특정 마커의 발현 측정은 약물 요법에 대한 잠재적인 타겟에 대한 정보를 제공한다(예, 약물 타겟을 발현하는 환자로부터의 종양원성 세포).
치료제의 개발 및 동정
본원의 방법 및 조성물은 신규 치료제의 개발 또는 동정, 및/또는 기존 치료법의 개량화에 이용할 수 있다. 예컨대, 단일 세포 분석을 이용하여, 타겟 세포 집단들(예, 암 줄기 세포, 암 줄기 세포 및 준화된 암 세포, 또는 분화된 암 세포)에 대한 발현 프로파일을 분석하여, 치료제에 대한 잠재적인 타겟을 검출할 수 있다. 잠재적인 타겟으로는 특정 바이오마커 및 탈규제된 경로를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 대상 타겟은 대상 세포 집단(들)에 특이적인 마커 또는 경로를 포함할 수 있다.
일 예에서, 타겟 집단 또는 서브집단의 세포는 본원에 기술된 핵산으 발현을 분석하여, 치료의 타겟이될 수 있는 신규 바이오마커를 검출할 수 있다. 예컨대, 암 줄기 세포 및/또는 분화된 암 세포에서만 주로 발현되는 구체적인 세포 표면 분자는, 잠재적인 치료제(예, 항체 또는 그외 결합 모이어티 - 잠재적으로 독소 또는 다른 그러한 작용제와 접합됨 - 표면 분자에 대해 특이성을 가짐)에 대한 타겟으로서 조사될 수 있다. 다른 예에서, 타겟 세포 집단에서 질병 과정(예, 암 세포에서의 세포-주기 장치의 조절 소실)에 관련된 경로의 탈규제를 분석해 볼 수 있다. 경로는, 유전자 발현의 활성자 및/또는 억제자, 특정 유전자 또는 유전자 세트의 발현, 및 보다 복잡한 전체 경로를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 탈규제를 타겟화하는 치료제는, 잠재적으로 타겟 세포에 작용하여, 타겟 세포와 연관된 핵산의 발현을 변형시킨다. 치료제에 의해 유도되는 발현 변이는 핵산의 상향 또는 하향 조절로 나타날 수 있다. 일부 예에서, 세포 및/또는 개체를 1종 이상의 치료제로 치료하면, 핵산의 발현을 비-질병 상태의 세포에서의 발현을 모방하게 할 수 있다(예, 치료에 의해 비-암성 세포와 유사한 세포-주기 관련 유전자가 발현됨).
본원에 기술된 방법과 조성물을 이용하여, 타겟 세포 집단에서 1종 이상의 핵산의 발현 변이를 분석할 수 있다. 신규한 및/또는 개량된 치료제의 개발에는, 타겟 세포 집단(예, 대장암 줄기 세포, 유방암 세포 등)을 분석하고, 이를 "정상" 세포와 비교하여, 변형된 발현 프로파일을 보이는 핵산을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 타겟 집단의 분리된 세포를 후보 물질에 노출시키고, 노출 후의 유전자의 발현 변이에 대해 조사함으로써, 이러한 세포를 이용하여, 이들 및/또는 다른 핵산의 발현에 대한 효과(들)에 대한, 잠재적인 치료제들을 스크리닝할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법을 이용하여, 비제한적으로 유전자 발현, 경로 작용성(예, 세포 사이클링, TERT 경로, 산화적 스트레스 경로) 및/또는 세포 타입이나 형태 등의, 특정한 세포 표현형에 작용하는 화합물의 효과를 분석할 수 있다. 따라서, 이러한 표현형 특징에 작용하는 화합물을, 치료제로서의 화합물의 잠재성 분석과, 더불어 또는 대신, 분석할 수 있다. 예컨대, 1종 이상의 테스트 화합물에 노출된 타겟 집단(예, 정상 대장 세포, 정상 유방 세포, 암 세포, 줄기 세포, 암 줄기 세포 등)에서의 유전자의 발현 변화를 분석하여, 유전자 발현이나 다른 바람직한 표현형(예, 마커 발현, 세포 생활성)에 대한 테스트 화합물의 효과(들)를 분석할 수 있다. 이러한 분석은 복수의 목적으로, 예컨대 세포 주기 검색 또는 공지되거나 미공지된 경로의 분석에 이용할 수 있다.
잠재적인 치료학적 가치를 분석할 물질은 임의의 화합물, 소형 분자, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 그외 치료 목적에 적합한 물질일 수 있다. 타겟 집단의 분리된 세포를 잠재적인 치료 물질의 라이브러리(예, 항체 라이브러리, 소형 분자 라이브러리)에 노출시켜, 유전자 발현 및/또는 세포 생활성에 대한 효과를 결정할 수 있다. 일부 예에서, 후보 치료 물질은 대상 세포 집단을 특이적으로 타겟화할 것이다. 예컨대, 단일 세포 분석시, 타겟 세포(예, 암 줄기 세포 및/또는 분화된 암 세포)에 존재하는 돌연변이의 존재성이 밝혀지면, 후보 치료 물질은 상기 돌연변이를 표적으로 삼을 수 있다. 일부 예에서, 치료 받는 세포는 단일 세포 분석에 노출시켜, 1종 이상의 대상 유전자의 발현에 대한 후보 치료 물질(들)의 효과 및/또는 트랜스크립톰에 대한 효과를 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 물질이 타겟 집단 또는 서브집단 상에 존재하는 마커 또는 마커의 조합에 특이적으로 결합함으로써, 질병 상태의 세포 집단 또는 서브집단을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 물질은, 마커 또는 마커의 조합에 특이적이며, 선택적으로 세포독성 모이어티에 접합되어 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 유도체를 포함한다. 이러한 방법을 이용하여 환자에서 타겟 집단 또는 서브집단을 고갈시킬 수 있다(예, 암 줄기 세포 집단 고갈).
치료 물질의 스크리닝 분석
또한, 마커 또는 마커들의 조합을 발현하는 세포(예, 질병 상태의 세포)는, 분화된 암 세포 및/또는 암 줄기 세포 상에서 활성인, 인자 및 화학치료 물질을 검출하기 위한, 시험관내 분석 및 스크리닝에 사용할 수 있다. 특히, 인간 세포 상에서 활성인 물질에 대한 스크리닝 분석에 사용할 수 있다. 이러한 목적으로, 단백질 결합에 대한 면역분석; 세포 증식, 분화 및 기능적 활성의 측정; 인자들의 생산 등을 비롯한, 매우 다양한 분석을 이용할 수 있다(예, Balis, (2002) /. Natl Cancer Inst. 94:2; 78). 다른 구현예에서, 본 발명의 마커 또는 마커의 조합에 해당되는 분리된 폴리펩타이드는 약물 스크리닝 분석에 사용가능하다.
생물 활성 물질, 항-증식제 등에 대한 스크리닝 분석에서, 마커 또는 타겟 세포 조성물을 대상 물질과 접촉시키고, 세포 상에서 아웃풋(output) 파라미터, 예컨대 마커의 발현, 세포 생활성 등; 또는 폴리펩타이드에 대한 결합 효능 또는 이에 대한 효소적 또는 수용체 활성을 모니터링함으로써, 물질의 효능을 분석한다. 예컨대, "암 줄기 세포" 발현 프로파일을 보이는 것으로 알려진 유방암 세포 조성물을 타겟 물질에 노출시키고, 노출시킨 세포는 각각 본원에 기술된 바와 같이 분석하여, 상기 테스트 물질이 무처리 세포와 비교하여 발현 프로파일을 변형시켰는지를 측정한다. 본원에 기술되거나 또는 본원의 방법에 의해 제조되는, 임의의 분리된 세포 집단은, 신선하게 분리되거나, 배양되거나, 유전적 변이될 수 있다. 세포는 클론 배양물의 환경 유도성 변이체일 수 있다: 예컨대, 독립적인 배양물로 나누고, 다른 조건, 예컨대 약물이 첨가 또는 무첨가된 상태에서; 사이토카인 또는 이의 조합의 존재 또는 부재하에 증식. 세포가 물질(예, 펩타이드, siRNA, 소분자 등), 특히 약리학적 물질에 반응하는 방식, 예컨대 반응 시간은 세포의 생리학적 상태의 중요한 반증이다.
파라미터는 세포의 정량화가능한 성분, 특히, 예컨대 고성능 시스템으로 정확하게 측정할 수 있는 성분이다. 파라미터는, 세포 표면 결정기(cell surface determinant), 수용체, 단백질 또는 이들의 입체적 또는 번역 후 수정체, 지질, 탄수화물, 유기 분자, 무기 분자, 핵산, 예컨대 mRNA, DNA 등, 또는 이러한 세포 성분으로부터 유래된 일부분, 또는 이들의 조합 등을 비롯한, 임의의 세포 성분 또는 세포 산물일 수 있다. 예컨대, 일 구현예에서, 본원에 기술된 분리된 세포를 1종 이상의 물질과 접촉시키고, 대상 핵산의 발현 수준을 측정한다. 예컨대 세포가 비-질병 상태의 세포에 더 가까운 발현 패턴을 보이는 경우, 검출되는 핵산(들)의 발현을 변형시키는 물질들은, 치료학적 잠재성에 대해 추가로 분석할 수 있다. 대부분의 파라미터(예, rriRNA 또는 단백질 발현)가 정량적인 정보(readout)를 제공하지만, 일부 예에서, 반-정량적 또는 정성적 결과도 허용할 수 있다. 정보에는 측정된 단일 수치가 포함될 수 있거나, 또는 평균, 중앙 값 또는 편차 등이 포함될 수 있다. 특징적으로, 파라미터 정보 값의 범위는 동일한 분석의 다중성으로부터 각 파라미터를 수득한다. 가변성을 예측하고, 테스트 파라미터의 세트 각각에 대한 값 범위는 표준 통계 방법과 단일 값을 제시하기 위해 사용되는 공통된 통계적인 방법을 이용하여 구한다.
스크리닝하기 위한 대상 물질은, 다수의 화학적 클래스, 주로 유기 분자를 포괄하는, 공지 및 미공지 화합물을 포함하며, 유기금속 분자, 유전자 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 중요한 측면은 독성 테스트 등을 비롯하여, 후보 약물을 평가하는 것이다.
복잡한 생물학적 물질 외에도, 후보 물질은, 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필수적인 기능기를 포함하는 유기 분자를 포함하며, 전형적으로 적어도 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실기, 흔히 화학적 기능기들 중 2 이상을 포함한다. 후보 물질은 환형 탄소 또는 이종환형 구조 및/또는 상기 기능기 하나 이상으로 치환된 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함할 수 있다. 또한, 후보 물질은 사이오분자들, 예컨대 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 푸린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조 유사체 또는 조합에서, 발견될 수 있다. 일부 예에서, 테스트 화합물은 공지된 기능(예, 산화 스트레스 완화)을 가질 수 있지만, 미공지 기전을 통해 작용하거나 미공지 타겟 상에 작용할 수 있다.
약리학적으로 활성인 약물, 유전자적으로 활성인 분자 등이 포함된다. 대상 화합물로는, 화학치료제, 호르몬 또는 호르몬 길항제를 포함한다. 본 발명에 적합한 약리학적 물질로는, 문헌: "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, New York, (1996), Ninth edition, under the sections: Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood- Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; and Toxicology에 기술된 것이 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 독소, 화학적 무기제 및 생물학적 무기제도 포함되며, 예로 Somani, S.M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992)을 참조한다.
테스트 화합물은 전술한 분자 클래스들 모두를 포함하며, 추가적으로 내용물을 모르는 샘플을 포함한다. 특히, 식물, 진균, 세균, 원생 생물 또는 동물 등의 천연 소스로부터 유래된 천연 화합물들의 복합적인 혼합물이다. 많은 샘플들은 용액 중에 화합물을 포함할 것이나, 또한, 적정 용매에 용해될 수 있는 고형 샘플도 분석할 수 있다. 대상 샘플은 환경 샘플, 예컨대 지하수, 해양수, 광산수 등, 생물학적 샘플, 예컨대 작물로부터 제조된 용혈물, 조직 샘플 등; 제작 샘플, 예컨대 약제를 제조하는 동안의 시간 코스 샘플; 뿐만 아니라 분석용으로 준비된 화합물의 라이브러리 등(예, 잠재적인 치료학적 가치에 대해 평가중인 화합물, 즉, 약물 후보체)를 포함한다.
또한, 샘플 또는 화합물은 추가적인 성분들, 예컨대, 이온 세기, pH, 총 단백질 농도 등에 작용하는 구성을 포함할 수 있다. 또한, 샘플은, 적어도 부분 분획화 또는 농축을 달성하기 위해 처리될 수 있다. 생물 샘플은, 화합물의 분해를 줄이기 위한 주의가 필요하다면, 예컨대, 질소 하, 동결 또는 이의 조합 조건 하에 둘 수 있다. 사용되는 샘플의 부피는 측정가능한 검출이 가능하게 충분하게 사용되며, 예컨대 생물 샘플은 약 0.1 ml 내지 1 ml이 충분할 수 있다.
후보 물질을 비롯한, 화합물들은, 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 매우 다양한 소스로부터 수득된다. 예컨대, 바이오분자 등의 매우 다양한 유기 화합물의 랜덤 및 지정된 합성에 다수의 수단들, 예컨대 무작위화된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩타이드의 발현을 이용할 수 있다. 다른 예로, 세균, 진균, 식물 및 동물의 추출물 형태인 천연 화합물들의 라이브러리를 구입하거나 쉽게 제조할 수 있다. 추가적으로, 천연 또는 합성에 의해 제조한 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형시킬 수 있으며, 이를 이용하여 조합 라이브러리(combinatorial library)를 제조할 수 있다. 공지된 약리학적 물질은, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등의 직접 또는 랜덤 화학적 변형을 거쳐, 구조적 유사체를 제조할 수 있다.
물질들은, 적어도 하나, 통상적으로는 복수의 세포 샘플에, 일반적으로 상기 물질이 결핍된 세포에도 동시에, 상기 물질을 첨가함으로써, 생물 활성에 대해 스크리닝한다. 상기 물질에 대한 반응 파라미터들의 변화를 측정하고, 이를 예컨대 상기 물질의 존재 및 부재 중의 기준 배양물을 다른 물질 등으로 수득한 것과 비교함으로써, 결과를 평가한다.
물질은 용액 중에 첨가하거나, 또는 쉽게 용해되는 형태로, 배양 중인 세포의 배지에 첨가할 수 있다. 상기 물질은 플로우-쓰루 시스템에, 스트림(steam)으로서, 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가할 수 있거나, 또는 다른 예로, 화합물의 볼루스(bolus)를 단독으로 또는 농도를 증가시키면서, 다른 정적인 용액에 첨가할 수 있다. 플로우-쓰루 시스템에서, 2종의 유체가 사용되는데, 1종은 생리적으로 중성 용액이고, 나머지 용액은 첨가되는 테스트 화합물과 동일한 용액이다. 제1 유체는 세포 위를 지나가고, 다음으로 제2 유체가 지나간다. 단일 용액 방법에서, 테스트 화합물의 볼루스는 세포를 둘러싼 매질의 체적에 첨가된다. 배양 배지의 구성 성분들의 총 농도는 볼루스의 첨가로, 또는 플로우 쓰루 방법에서 2가지 용액들 간에 현저하게 차이가 있어서는 안된다.
일부 물질의 제형은, 전체 제형에 유의한 효과를 가질 수 있는, 보존제와 같은 추가적인 성분을 포함하지 않는다. 즉, 이러한 제형은 생물 활성 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 물, 에탄올, DMSO 등으로 필수적으로 구성된다. 그러나, 화합물이 용매가 첨가되지 않은 액체인 경우, 제형은 화합물 자체로만 필수적으로 구성될 수 있다.
여러가지 분석들을 여러가지 물질 농도에 따라 동시에 진행하여, 다양한 농도에 따른 차별적인 반응을 얻을 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 물질의 유효 농도 결정에는, 전형적으로 1:10 또는 그외 로그 스케일의 희석시킨 농도 범위를 이용한다. 농도는 필요에 따라 2차 희석 시리즈로 더 세밀화할 수 있다. 전형적으로, 이러한 농도 중 한가지는 음성 대조군, 즉 0 농도, 또는 물질의 검출 수준 미만, 또는 표현평에 검출가능한 변화를 제공하지 않는 물질의 농도 이하로 제공된다.
선택한 마커의 존재를 정량화하기 위해, 다양한 방법을 활용할 수 있다. 존재하는 분자의 양 측정을 위한, 편리한 방법은, 분자를, 형광, 발광, 방사능, 효소적 활성 등일 수 있는 검출 가능한 모이어티, 특히 고친화성으로 파라미터와의 결합에 특이적인 분자로 표지하는 것이다. 형광 모이어티는 임의의 생물분자, 구조 또는 세포 타입을 실제 표지하는데 쉽게 이용할 수 있다.
면역형광 모이어티는 특이적인 단백질 뿐만 아니라 특이적인 구조, 절단 산물 또는 인산화와 같은 부위 변형에 결합되게 지정될 수 있다. 개별 펩타이드 및 단백질은, 예컨대 이들이 세포 안에서 그린 형광 단백질 키메라로서 발현시킴으로써, 오토루오레센스(autofluoresce)로 조작될 수 있다(Jones et. al. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81). 따라서, 항체는 이의 구조 중 일부분으로서 형광 염료를 제공하도록 유전작 변형될 수 있다. 선택되는 표지 물질에 따라, 다른 형광 표지 물질을 이용하여, 상기한 면역분석 기법, 예컨대 방사면역분석(RIA) 또는 효소 연계된 면역흡착 분석(ELISA), 동질적인 효소 면역분석, 및 관련 비-효소적 기법을 이용하여, 파라미터들을 측정할 수 있다. 파라미터는 특히 핵산 특히, 메신저 RNA의 정량화이다. 이는, 핵산 뉴클레오티드의 서열에 따라 결정되는 혼성화 기법에 의해 측정할 수 있다. 기법으로는 중합효소 연쇄 반응과 유전자 어레이 기법이 있다. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Freeman at al. (1999) Biotechniques 26(l):112-225; Kawamoto at al. (1999) Genome Res 9(12):1305-12; and Chen et al. (1998) Genomics 51(3):313-24를 예로 참조한다.
발현 프로파일의 데이타베이스 및 데이타 분석
또한, 암 줄기 세포 및 그외 세포 타입의 유전자 발현 프로파일 데이타베이스와 이의 용도를 제공한다. 이러한 데이타베이스는 전형적으로, 암 줄기 세포, 암 비-줄기 세포, 암 세포에 대한 정상 카운터파트, 질병 상태의 세포(예, 염증성 장 세포, 줴양성 대장염 세포), 바이러스 감염된 세포, 초기 전구 세포, 최초 분화된 전구 세포, 후기 분화된 전구 세포, 및 성숙 세포 등의 다양한 세포 서브집단으로부터 유래되는 발현 프로파일들을 포함할 것이다. 발현 프로파일과 이의 데이타베이스는 이의 사용을 쉽게 해주기 위해 다양한 매체에 제공될 수 있다. "매체"는 본 발명의 발현 프로파일 정보가 포함된 제작물을 지칭한다. 본 발명의 데이타베이스는 컴퓨터 판독가능한 매체, 예컨대 컴퓨터로 바로 판독하고 접근할 수 있는 모든 매체 상에 기록될 수 있다. 이러한 매체로는, 자기 저장 매체, 예컨대 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프; 광학 저장 매체, 예컨대 CD-ROM; 전기 저장 매체, 예컨대 RAM 및 ROM; 및 이들 카테고리들의 하이브리드, 예컨대 자기/광학 저장 매체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명의 데이타베이스 정보의 기록을 포함하는 제작물을 만들기 위해 현재 공지된 컴퓨터 판독가능한 임의의 매체를 어떻게 사용할 수 있는지를 쉽게 이해할 것이다. "기록된"은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 임의의 그러한 방법들을 이용하여 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 정보를 저장하는 프로세스를 지칭한다. 조장된 정보에 접근하기 위해 사용되는 수단을 기초로, 임의의 편리한 데이타 저장 구조를 선택할 수 있다. 저장을 위해, 다양한 데이타 프로세서 프로그램 및 포맷, 예컨대 워드 프로세싱 테스트 파일, 데이타베이스 포맷 등을 이용할 수 있다.
본원에서, "컴퓨터 기반 시스템"은 본 발명의 정보 분석에 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단 및 데이타 저장 수단을 지칭한다. 본 발명의 컴퓨터 기반 시스템의 최소 하드웨어로는 중앙 처리 유닛(CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 데이타 저장 수단을 포함한다. 당업자는, 현재 이용가능한 컴퓨터 기반 시스템들 중 임의의 것이 본 발명에 사용하기 적합함을 쉽게 알 수 있다. 데이타 저장 수단은 전술한 본 발명의 정보의 기록을 포함하는 임의의 제작물 또는 이러한 제작물에 접근할 수 있는 메모리 접근 수단을 포함할 수 있다.
본 발명의 컴퓨터 기반 시스템에 정보를 입력 및 출력하기 위해, 입력 및 출력 수단을 위한 다양한 구조적 포맷을 사용할 수 있다. 이러한 제시는 당업자에게 유사성 등급을 제공하며, 테스트 발현 프로파일에 포함된 유사성 정도를 확인한다.
데이타 세트의 분석에 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 일 예에서, 발현 데이타는 변환 및 정규화(normalization)를 거친다. 예컨대, 각 유전자에 대한 발현 데이타를 평균 중심화(mean centering)(소정의 어레이 상의 각 유전자에 대한 강도 측정치를 유전자의 평균 강도 X 모든 어레이로 나눔)하고, (2) 수득되는 비율을 로그-변환(베이스 2)한 다음, (3) 중앙 중심(median centered) 발현 데이타를 어레이와 곱하고 다시 유전자와 곱하여, 비(ratio)를 구한다.
cDNA 마이크로어레이 데이타의 경우, 기준 채널에서 국소 백그라운드 형광 신호 보다 적어도 1.5배 높은 형광 혼성화 신호를 보이는 유전자를, 적절하게 측정된 것으로 본다. 유전자들을 각 데이타세트 내에서 평균값에 의해 중심화하고, 평균 연관 클러스터링을 수행한다.
또한, 데이타 분석에 스케일 방법(scaled approach)을 취할 수 있다. 예컨대, 유전자의 발현 값에 대한 피어슨 상관관계는 각 CSC에 대한 표시자를 반영하는 정량적인 스코어를 제공할 수 있다. 상관관계 값이 높을수록, 샘플은 기준 CSC 표현형에 더 가깝다. 비슷한 상관관계는 정상 세포, 전구 세포, 자가면역 표현형 세포, 염증 표현형 세포, 감염된 세포, 분화된 암 세포, 정상 줄기 세포, 정상 성숙 세포 등을 비롯한, 임의의 세포 타입에 대해 행해질 수 있다. 네거티브 상관관계 값은 반대 행태를 의미한다. 분류에서 역치(threshold)는 임상 목적에 따라 o에서 위로 또는 아래로 이동할 수 있다. 예컨대, 1차 재발율로서 전이를 예측하기 위한 민감성과 특이성은 0.05 증분으로 상관관계 스코어 -1 내지 +1 사이의 각 역치를 계산한 것 있으며, 전이 예측을 위해 원하는 민감성, 예컨대 80%, 90%, 95%를 제공하는 역치 값을 선택할 수 있다.
유의 수준 순서(significance ordering)를 제공하기 위해, 오류 발견율(FDR)을 측정할 수 있다. 먼저, 비유사성 값(dissimilarity values)의 null 분포(null distribution) 세트를 만든다. 일 구현예에서, 관찰되는 프로파일의 값의 순열을 만드어, 찬스 범위 밖에서 수득한 상관계수의 분포의 순서 매켜, 상관계수의 적절한 null 분포 세트를 만든다(Tusher et al. (2001) PNAS 98, 5118-21, 본원에 원용에 의해 포함됨). null 분포 세트는, 이용가능한 모든 프로파일에 대한 각 프로파일의 값의 순열을 만들고; 모든 프로파일에 대한 짝지은 상관 계수를 계산하고; 이 순열에 대한 상관 계수의 확률 밀도 함수(probability density function)를 계산하고; N(N은 큰 수, 통상 300임) 시간 동안 이러한 과정을 반복함으로써, 수득한다. N 분포를 이용하여, 주어진 유의성 수준에서, 실험적으로 관찰되는 유사성 값들의 분포로부터 수득되는, (유사성의) 값을 초과하는, 상관 계수 값의 카운트의 적절한 측정치(평균, 중앙값 등)을 계산한다.
FDR은 실험 데이타에서 이러한 선택한 피어슨 상관관계 보다 많은 수의 상관관계(유의한 상관관계)에 대한, 예상되는 허위의 유의한 상관관계(무작위 데이타 세트에서 선택한 이 피어슨 상관관계 보다 큰 상관관계에서 추정함)의 수의 비율이다. 이러한 컷-오프 상관관계 값은 실험 프로파일들 간의 상관관계에 적용할 수 있다.
전술한 분포를 이용하여, 유의성에 대한 신뢰 수준을 선정한다. 이를 이용하여, 찬스에 의해 수득되게 되는 결과를 초과하는 상관계수의 최소값을 정한다. 이러한 방법을 이용하여, 양성 상관관계, 음성 상관관계 또는 이 둘다에 대한 역치를 구한다. 이 역치(들)를 이용하여, 사용자는 짝지은 상관계수들의 관찰되는 값을 필터링하고, 상기 역치(들)를 초과하지 않는 것을 제거할 수 있다. 또한, 위 양성 비율의 추정을 주어진 역치에 대해 수득할 수 있다. 개별 "랜덤 상관관계" 분포들 각각에 대해, 역치 범위 밖에 해당되는 포함되는 관찰값의 갯수를 구할 수 있다. 이러한 과정은 카운트들의 수열을 제공한다. 수열의 평균과 표준 편차는 잠재적 위양성의 평균값과 이의 표준 편차를 제공한다.
데이타는 자율 계층적 클러스터링(non-supervised hierarchical)을 거쳐 프로파일들 간의 상호관계를 볼 수 있다. 예컨대, 계층적 클로스터링은, 피어슨 상관계수가 클로스터링 메트릭스로서 차용되는 경우에 수행할 수 있다. 예컨대 다차원척도법을 이용한 상관관계 매트릭스의 클러스터링은 기능적 상동성 유사성 및 비유사성의 시각화를 증강한다. 다차원척도법(MDS)은 1차원, 2차원 또는 3차원에 적용할 수 있다.
분석은 하드웨어, 소프트웨어 또는 이 둘다에서 구현할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 기계-판독가능한 저장 매체를 제공하며, 상기 매체는 데이트를 이용하기 위한 지시로 프로그래밍된 기계를 이용하였을 때, 본 발명의 데이타세트 및 데이타 비교 중 임의의 것을 디스플레이할 수 있는, 기계 판독가능한 데이타가 인코딩된 데이타 저장 물질을 포함한다. 이러한 데이타는, 여러가지 목적으로, 예컨대 약물 발견, 세포 성분들 간의 상호작용 분석 등으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 프로그램수행가능한 컴퓨터 상에서 컴퓨터 프로그램으로 구현되며, 상기 컴퓨터는 프로세서, 데이타 저장 시스템(휘발성 및 비-휘발성 메모리 및/또는 저장 요소), 하나 이상의 입력 디바이스, 및 1종 이상의 출력 디바이스로 구성된다. 프로그램 코드는 입력 데이타에 적용하여, 전술한 함수를 수행하여 출력 정보를 작성한다. 출력 정보는 공지된 방식으로 하나 이상의 출력 디바이스에 적용된다. 컴퓨터는 예컨대 개인 컴퓨터, 마이크로컴퓨터 또는 편리한 디자인의 워크스테이션일 수 있다.
각 프로그램은 높은 수준의 절차 지향 또는 개체 지향 프로그래밍 언어로 구현하여 컴퓨터 시스템과 소통할 수 있다. 그러나, 프로그램은 적절하다면 어셈블리 또는 기계 언어로 실행할 수 있다. 임의의 경우에, 언어는 컴파일되거나 해석된 언어일 수 있다. 저장 매체 또는 디바이스를 본원에 기술된 절차를 수행하기 위해 컴퓨터에서 판독할 때 컴퓨터를 구성하고 작동시키기 위해, 각각의 이러한 컴퓨터 프로그램은 일반적인 또는 특수 목적의 프로그래밍가능한 컴퓨터로 판독가능한 저장 매체 또는 디바이스(예, ROM 또는 자기 디스켓)로 수행할 수도 있다. 또한, 시스템은 컴퓨터 프로그램으로 구성된 컴퓨터 판독가능한 저장 매체로서 이행되는 것으로 간주될 수 있으며, 이 경우 그렇게 구성된 저장 매체는 컴퓨터가 특이적이고 사전 정해진 방식으로 작동하여 본원에 기술된 기능을 수행하게 한다.
입력 및 출력 수단에 대한 다양한 구조적 포맷을 사용하여, 본 발명의 컴퓨터 기반의 시스템에 정보를 입력 및 출력할 수 있다. 출력 수단의 한가지 포맷은 진성 프로파일(trusted profile)에 대한 다양한 수준의 유사성을 가진 데이타세트를 테스트한다. 이러한 제시는 당업자에게 유사성 등급을 제공하며, 테스트 패턴에 포함된 유사성 정도를 확인한다.
데이타의 저장과 전송
본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 수집한 데이타를 컴퓨터, 수열 등을 통해 저장 및/또는 전송하는 방법을 제공한다. 비제한적으로 소프트웨어 및 저장 디바이스 등의 임의의 컴퓨터 또는 컴퓨터 보조장치를 이용하여, 본 발명을 실시할 수 있다. 서열 또는 다른 데이타(예, 트랜스크립톰 데이타)를 사용자가 직접 또는 간접적으로 컴퓨터에 입력할 수 있다. 또한, DNA 서열을 분석하거나, DNA를 분석하거나, 또는 트랜스크립톰 데이타를 분석하기 위해 사용할 수 있는 임의의 디바이스를 컴퓨터에 연결하여, 데이타는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터-적합한 저장 매체에 전송시킬 수 있다. 데이타는 적정 저장 디바이스(예, CD) 또는 컴퓨터에 저장할 수 있다. 또한, 데이타는 컴퓨터에서 다른 컴퓨터로, 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법(예, 인터넷, 일반 우편, 항공 우편)을 통해 데이타 수집 포인트로 이동시킬 수 있다. 즉, 본원에 기술된 방법에 의해 수집된 데이타는 임의의 포인트 또는 지리학적 위치에 수집되어, 다른 임의의 지리학적 위치로 이송할 수 있다.
예시적인 방법은 도 10에 기술되어 있다. 이러한 예에서, 사용자는 서열분석 장치에 샘플을 제공한다. 데이타를 수집하고, 및/또는 컴퓨터에 연결된 서열분석 장치로 분석한다. 컴퓨터의 소프트웨어로 데이타를 수집 및/또는 분석할 수 있다. 데이타는 다른 위치에 저장, 표시(모니터 또는 다른 유사 디바이스를 통해) 및/또는 이동시킬 수 있다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 컴퓨터는 원격 사용자(예, 의사, 과학자 또는 분석자)가 사용하는 소형 디바이스에 데이타를 전송하기 위해 사용하는 인터넷에 연결된다. 데이타를 저장하거나 및/또는 전송하기 전에 분석할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 원 데이타(raw data)를 수집하고, 원격자에게 보내어, 데이타를 분석 및/또는 저장할 수도 있다. 전송은 도 10에 나타낸 바와 같이 인터넷을 통해 이루어질 수 있지만, 또한 새털라이트 또는 그외 커넥션을 통해 이루어질 수 있다. 다른 예로, 데이타를 컴퓨터-판독가능한 매체(예, CD, 기억 저장 디바이스)에 저장할 수 있으며, 매체는 마지막 사용자에게 (예, 우편을 통해) 발송될 수 있다. 원격 사용자는 빌딩, 도시, 주, 국가 또는 대륙 등의 다른 또는 상이한 지리학적 위치에 있을 수 있다.
반응시약과 키트
또한, 전술한 방법들 중 한가지 이상을 수행하기 위한 반응시약과 키트를 제공한다. 본 반응시약과 이의 키트는 매우 달라질 수 있다. 대상 반응 시약은 표현형 결정성 유전자의 전술한 발현 프로파일의 제작에 사용하기 위해 특수하게 설계된 반응시약을 포함한다. 예컨대, 반응시약은 타겟 집단 또는 서브집단에서 차별적으로 발현되는 것으로 공지된 유전자에 대한 프라이머 세트를 포함할 수 있다(예, 종양원성 유방 암 세포를 검출하기 위한 반응시약은 CD49f, CD24, 및/또는 EPCAM의 발현을 확장시키고 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있음).
타겟 세포 집단 및 서브집단의 발현 프로파일을 만들기 위해 특수하게 맞춤 준비된 한가지 타입의 반응시약은, 정량적 PCR 및 그외 정량적 방법에 사용하기 위한, 상기한 유전자를 선택적으로 증폭하도록 설계된 유전자 특이적인 프라이머의 콜렉션이다. 유전자 특이적인 프라이머 및 이를 이용하는 방법은 미국 특허 5,994,076에 기술되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특히, 5종 이상의 유전자, 대게 복수의 유전자, 예컨대 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 유전자에 대한 프라이머를 포함하는, 유전자 특이적인 프라이머들의 콜렉션이다. 유전자 특이적인 프라이머 콜렉션은 타겟 집단 또는 서브집단과 연관된 유전자에 대한 프라이머만 포함할 수 있거나(예, 돌연변이, 공지된 탈규제된 유전자 등), 또는 이는 추가적인 유전자(예, 하우스키핑 유전자, 컨트롤)에 대한 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전술한 유전자 특이적인 프라이머 콜렉션을 포함할 수 있다. 상기 키트는 한가지 이상의 표현형에 대한 통계적 분석을 위한 소프트웨어 패키지를 포함하며, 이는 감수성 확률을 계산하기 위한 기준 데이타베이스를 포함할 수 있다. 상기 키트는, 미리 혼합되거나 분리되어 있을 수 있는, 타겟 핵산, dNTP 및/또는 rNTP를 제조하기 위한 프라이머, 하나 이상의 고유하게 표지된 dNTP 및/또는 rNTP, 예컨대 바이오틴화되거나 Cy3 또는 Cy5 테그가 부착된 dNTP, 여러가지 분산 스펙트럼을 보이는 금 또는 은 입자, 또는 그외 합성 후 표지 시약, 예컨대 형광 염료의 화학 활성 유도체, 역전사효소, DNA 중합효소, RNA 중합효소 등의 효소, 다양한 완충제 매질, 예컨대 혼성화 완충액과 세정 완충액, 조립식 프로브 어레이, 표지된 프로브 정제 시약 및 성분, 예컨대 스핀 컬럼 등, 신호 발생 및 검출 시약, 예컨대, 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 접합체, 화학형광성 또는 화학발광성 기질 등의, 다양한 방법으로 사용되는 반응 시약을 포함할 수 있으며, 이들은 미리 혼합되거나 분리되어 있을 수 있다.
대상 키트는, 전술한 성분 외에도, 본 발명을 수행하기 위한 설명서를 더 포함할 것이다. 이러한 설명서는 다양한 형태로 대상 키트에 제공되며, 키트에 하나 이상에 제시될 수 있다. 이러한 설명서가 제시될 수 있는 형태는 적정 매체 또는 기질 상에 인쇄된 정보로서, 예컨대 정보가 인쇄된 종이 조각 또는 조각들로서, 키트의 포장안에, 패키지 인서트 안에 등에 존재할 수 있다. 또다른 수단은 정보가 그 위에 기록되어 있는 컴퓨터 판독가능한 매체, 예컨대 디스텟, CD 등일 것이다. 제시될 수 있는 또다른 수단은, 인터넷을 통해 사용하여 원격 지역에서 정보에 접근할 수 있는 웹 주소이다. 임의의 편리한 수단들이 키트에 제시될 수 있다.
전술한 분석 방법들은 본 발명의 여러가지 측면들을 수행하기 위해 컴퓨터로 실행할 수 있는 지시 프로그램으로서 구체화될 수 있다. 전술한 기법들 중 임의의 기법은 컴퓨터 또는 다른 정보 기구 또는 디지탈 디바이스 상에 탑재된 소프트웨어 구성 요소 수단에 의해 수행할 수 있다. 그렇게 수행할 수 있을 경우, 컴퓨터, 기구 또는 디바이스는 전술한 기법을 수행하여, 전술한 방식으로 복수의 유전자와 연관된 값들의 세트 분석을 보조할 수 있거나 또는 이러한 연관된 값들을 비교할 수 있다. 소프트웨어 구성 요소는 고정된 매체 상에 탑재되거나, 인터넷 또는 그외 컴퓨터 네트워크 타입 등의 통신 매체를 통해 접급할 수 있다. 상기한 특징들은 하나 이상이 컴퓨터 프로그램으로 구현되며, 이러한 프로그램을 수행하는 하나 이상의 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 예시의 목적으로 제공할 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 단일 세포에서의 유전자 발현 분석
설치류 유방 CSC의 상당 분획(significant fraction)에는 ROS가 상대적으로 낮은 수준으로 포함되어 있어, 이들 세포가 NTC 카운터파트에 비해 ROS에 대해 강화된 방어 수준으로 발현할 수 있는 것으로 가정되었다.
단일 세포 유전자 발현 분석. 단일 세포 발현 분석을 위해, qPCR 다이나믹 어레이 마이크로유체 칩(Fluidigm)을 사용하였다. 단일 MMTV - Wnt-1 Thyl+CD24+Lin - CSC - 농화된 세포(TG)와 "Not Thyl+CD24+" Lin" 비-종양원성(NTG) 세포를 FACS에 의해 PCR 믹스(CellsDirect, Invitrogen)와 RNase 저해제(Superaseln, Invitrogen)가 든 96웰 플레이트 상에 분류하였다. 열장성 세포용혈 후, RT-qPCR 효소(Superscript III RT/Platinum Taq, Invitrogen)와, 대상 유전자(GcIm-Mm00514996_ml, Gss-Mm00515065_ml, Foxol-Mm00490672_ml, Foxo4- Mm00840140_gl, Hifla Mm00468875_ml , Epasl-Mm00438717_ml)에 대한 저농도 분석의 풀(프라이머/프로브)이 포함된 혼합물을 첨가하였다. 역전사(50℃에서 15분, 95℃에서 2분 후, 22회 PCR 사이클(각 사이클: 95℃에서 15초, 60℃에서 4분)로 사전 증폭시킴). 총 RNA 대조군을 병행하여 진행하였다. 각 하나의 세포에 대해 수득되는 증폭된 cDNA를 Taqman qPCR mix (Applied Biosystems)와 함께 칩 샘플 유입구에 넣었다. 각 분석물(프라이머/프로브)을 칩 분석 유입구(각각에 대해 2개의 리플리케이트)에 넣었다. 칩을 칩 로더(Nanoflex, Fluidigm)에 1시간 탑재한 후, 써모사이클링 및 형광 정량화를 위해 판독기(Biomark, Fluidigm)로 옮겼다. 저등급의 유전자 분석을 제거하기 위해, qPCR 곡선이 비-지수적 증가를 보이는 유전자 분석은 제외시켰다. 저품질의 세포(예, 사멸 세포)를 제거하기 위해, 하우스키핑 유전자인 Actb (베타-액틴) 및 Hprtl (하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 1)을 발현하지 않는 세포는 제외시켰다. 총 7회 칩 조작을 통해, 248개(종양원성 세포 109개, 비종양원성 세포 130개)의 세포로 구성된 단일 세포 발현 데이타세트를 수득하였다. 2종의 샘플을 Kolmogorov-Smirnov (K-S) 통계를 계산하여, 유전자가 2 집단에서 차별적으로 발현되는지를 평가하였다. 동일한 표지(즉, TG 대 NTG)로 순열을 작성하고, 실제 K-S 통계를 순열-유래 null 분포의 값과 비교함으로써, p 값을 구하였다. p 값을 Bonferroni 보정에 의해 추가로 보정하여, 다중 검정법(multiple hypothesis testing)에 맞게 맞추었다. 실시예 2 "단일 세포 유전자 발현 분석"을 기초로한 새로운 방법 SINCE-PCR을 이용하여 인간 "결장직장 암 줄기 세포"(Co-CSC)의 분석 및 정량화.
SINCE-PCR 방법으로, 인간 결장직장 암 조직에서 "암 줄기 세포"의 동정, 특정화 및 정량화가 가능하며, 기존에 달성할 수 없었던 수준의 순도 및 해상력을 가진다. 종양원성 또는 종양-개시 세포일 수 있는, 암 줄기 세포는, 면역결함 마우스에 이식하였을 때 종양을 형성시키는 능력을 가질 수 있는 암 세포의 서브집단이다. 암 줄기 세포 집단은 현재 유방암, 뇌암, 두개암, 췌장암 및 결장암에서 동정되었다. "암 줄기 세포"의 정확한 기능적 정의 및 정량화는 인간 암의 진단, 예후 예측, 분류화 및 치료학적 표적화에 몇가지 중요한 영향을 가진다.
본 발명자들은, 실시간 중합효소 연쇄 반응(실시간 PCR)에 의한 단일 세포 유전자 발현 분석을 기초로, 인간 결장직장 암 조직에서 "암 줄기 세포"를 동정, 분석 및 정량하는 새로운 방법을 기술한다. 본 발명자들은, 이의 동조되고(coordinated) 차별적인 발현을 동일한 종양 조직 안에서 별개의 암 세포 서브세트를 동정하기 위한 "표시자"로서 사용할 수 있는, 새로운 유전자 세트를 동정하였다. 이러한 새로운 유전자 세트는, 모든 상피 세포에 공통된 하우스키핑 유전자(EpCAM, beta-Actin, GAPDH), 줄기 세포 생물학 관련 유전자(hTERT, LGR5, Survivin)와, 별개의 세포 계통(카본 안하이드라제 II, MUC2, Trefoil Family Factor 3) 및 정상 대상 상피의 분화 단계(Cytokeratin 20, CD66a/CEACAMl)와 관련있는 조직-특이적인 분화 경로에 참여하는 유전자를 포함한다. 이러한 유전자 세트의 발현 패턴을 기초로, 인간 결장직장 암 조직으로부터 정제되고 단일 세포로서 각각 분석된 상피 세포를 "분류"하여, 더욱 진행되거나 또는 덜 진행된 분화 단계(예, 인간 결장 장샘의 상단에 있는 최종 분화된 세포 대 인간 결장 장샘의 기저에 위치된 보다 미성숙된 세포) 및 결장 상피의 구분되는 분화 계통(예, 배상 세포, 장세포, 미성숙 세포)에 해당되는, 구분되는 그룹으로 클러스터링할 수 있다. 각 그룹은 전체 집단의 비율로서 정량할 수 있다. 본 발명자는 이러한 생물 조직의 세포 구성을 분석하기 위한 접근법과 방법을 "SINCE-PCR" (단일 세포 발현 - 중합효소 연쇄 반응)으로 명하였다.
이러한 발견은 몇가지 관찰 결과를 기초로 한다. 신선하게 회수한 고형 종양 조직으로부터 직접적으로 유세포 측정에 의해 농화시킨 인간 "결장직장 암 줄기 세포"는 재현가능하며 확실하게 단일 세포 수준에서 분석할 수 있다(도 1).
인간 대장 암 이종 이식체에서, 실시간 PCR에 의한 단일 세포 유전자 발현 분석으로, "결장직장 암 줄기 세포" 집단이 농화된 것으로 확인된, EpCAM-/CD44+ 및 EpCAM-/VCD166+ 암 세포 둘다, 줄기 세포 생물학 및 분화 프로세스에 참여하는 구분되는 유전자 그룹들의 동조적이고 차별적인 발현이 특징적인 여러가지 세포 서브세트들로 더욱 하위 분류될 수 있는 것으로 보여진다. 가장 흥미로운 점은, 공지된 대장 상피의 최종 분화 마커를 코딩하는 유전자를 보다 높은 수준으로 표시하는 세포 서브세트(예, Cytokeratin 20, CD66a/CEACAMl Carbonic Anhydrase II, MUC2, Trefoil Family Factor 3)들은, 후보 장 줄기 세포 마커를 코딩하는 유전자 또는 줄기 세포 기능에 필수적인 것으로 공지된 유전자(예, hTERT, LGR5, Survivin)를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하며, 그 역도 성립된다. 이는, EpCAM/CD44+/CD166+ 암세포에, 분화 단계가 상이한 것으로 특정화된 구분되는 세포 서브세트가 포함되어 있음을 시사한다(도 2).
형광-활성화된 세포 분류화 방법(FACS)으로 정제하여, 면역결합 NOD/SCID 마우스에 다시 주입하였을 때, CD44+/CD66a+ 및 CD44+/CD66anewl" 세포는 실질적으로 상이한 종양원성 특성을 나타내며, CD44+/CD66aneglow 집단은 최대 종양원성 능력이 부여된 것으로 행동하였다(표 4). 이는, EpCAM+/CD44+ 세포 집단내에서, CD66a/CEACAMI 등의 분화 마커를 코딩하는 유전자를 높은 수준으로 발현하는 세포 서브세트(즉, 보다 "성숙한" 세포 서브세트)가, 대게 상대적으로 종양원성 능력을 고갈한 것으로 보인다. 반면에, CD66a/CEACAMI와 같은 분화 마커가 없거나 낮은 수준으로 발현하는 세포 서브세트(즉, 보다 "비성숙" 세포 서브세트)는, "결장직장 암 줄기 세포"에 농화되어 있다.
CD66a/CEACAMI와 EpCAM 및/또는 CD44을 조합하여, 그 발현을 기초로 한 인간 대장 암 세포의 종양원성 특성
실험 종양 기원 a Linneg 분류된 집단b 세포 농도 종양 회수c 실험 코드
Figure pct00001
a: 각 실험에서, 암 세포 정제용 소스로서 사용한 종양 이종이식물의 생체내 연속 계대는 하기와 같이 기록된다: ml은 일차 종양 생착에서 수득한 1라운드 종양이고, m2는 m1의 생착으로부터 수득한 제2 라운드 종양이고, m3은 m1 생착으로 수득한 제3 라운드 종양으로 그렇게 진행되며; primary는 수술 피검물로부터 직접 회수한 원발성 종양이다. b모든 분류된 집단은 계통 마커에 대해 음성인 것으로 간주되며(Linneg), 이는 NOD/SCID 마우스에서 확립된 인간 종양 이종이식의 경우 마우스 CD45 및 마우스 H2-Kd를 포함하며, 원발성 인간 종양의 경우에는 인간 CD3 및 CD45를 포함한다(이러한 경우 EpCAM는 양성 상피 선별 마커로서 제공됨). c 종양 회수(Tumor take)은 수득되는 종양의 수/주입 수로 기록되며, 종양 회수는 5달 추적한 후 종양 덩어리를 볼 수 없을 때 실패로 본다.
실시예 2: 폐 전이를 이용한 인간 유방 암 이종이식 모델의 제조 및 영상화
환자의 유방암 표본(chunks 또는 TIC)을 NOD-SCID 마우스의 유방 지방 패드에 동소적으로 이식하였다. 6종의 이종이식 종양 모델을 만들었다(1 ER+, 1 Her2+ 및 4 트리플 음성 ER-PR-Her2-). 트리플 음성의 이종이식체 4종 모두에서, IHC 염색, 즉 H&E, 증식 마커 Ki67 및 비멘틴(Vim) 염색에 의해 입증된 바에 따라, 자발적인 폐 마이크로-전이가 발생되었다. 이러한 데이타는, 면역결함 마우스에 이식하였을 때, 유방 종양 세포 또는 TIC가 마우스 미세환경에 적응할 수 있으며, 인간 종양 증식 및 자발성 폐 전이로의 진행을 반복함을 시사한다.
마우스에서 인간 유방 암 및 전이에 대한 역동적이고 반-정량적인 영상화를 용이하게 하기 위해, 유방 TIC에 개똥벌레 루시퍼라제-EGFP 융합 단백질을 pHRuKFG 렌티바이러스(moi 50)에 형질전환하였고, 이식 4일 후, 원발성 부위에서의 TIC는 약한 생물발광 신호로 검출할 수 있었다. 1달 후, 원발성 종양(L4 및 R2 유방 지방 패드)와 폐 전이 둘다가 검출되었고, 이를 스탠포드 소형 동물 촬영 센터에서 Xenogen IVIS 200 시스템으로 촬영하였다. 종양 크기 또는 세포의 수는 신호 강도와 매우 관련성이 있는 것으로 관찰되었다. 전이가 있는 이종이식 종양의 생성 및 생발광 영상은, 이러한 계획에서 인간 유방암의 MTIC에서의 miRNA의 기능을 확인 가능성을 제공한다.
실시예 3: 인간 유방 mTIC의 실시간 PCR 분석 및 마이크로어레이
인간 유방 원발성 종양 개시 세포 (TIC) 또는 전이성 TIC (MTIC) (CD44+CD24- / lowESA+lineage-)을 유방 암 원발성 부위 또는 늑막 삼출액에서 분리하였다. 폐 met가 이종이식 모델에서 검출되었고, 폐를 blenzyme (Roche)로 분리시켜, MTIC 집단(CD44+CD24-/lowESA+H2K-, 도 8a)을 정제하기 위해, 마우스 H2K 및 인간 CD44, CD24 및 ESA로 세포를 염색하였으며, 상기 집단은 마우스 유방 지방 패드에 이식 후, 200-1000개의 분류된 세포로 5/8 비율로 동소성 종양으로 증식한다.
마이크로어레이 분석과 실시간 PCR로 나타난 바와 같이, Snail, Zeb2, Vimentin, E-cadherin, Lox, Cox2, VEGF 등의, HIF1알파 및 HIF1 조절된 타겟 유전자는 비-종양원성 종양 세포와 비교하여 MTIC에서 차별적으로 발현되었다(도 8B). HIF1알파, Vimentin 및 CD44의 공동 위치화가 면역조직화학 염색으로 확인되었다.
실시예 4: 마이크로RNA 분석
마이크로RNA 스크리닝에 의해, 모체 유방암 줄기 세포 및 폐에서 분리된 전이성 암 세포에 대한 차별적인 발현 프로파일을 확인하였다. 예컨대, 원발성 유방 TIC와 비교하여, 폐 MTIC에서는, miR-10a가 더 강하게 발현되었고, miR-490, mir-199a 등은 낮은 수준으로 발현되었다. 도 4에 3번의 실시간 PCR에서 나타난 바와 같이, 폐 MTIC 대 원발성 TIC의 평균 CT 값 비교: miR-lOa (-7.9), miR-490 (+3.0) 및 miR-199a (+12.9). 내부 대조군으로 NR3을 사용하였다. 데이타에서, 유방암의 원발성 TIC에 비해 MTIC에서, miR-10a는 최대 27'9배까지 상향 조절되었고, miR-199a는 212-9배 하향 조절된 것으로 나타났다.
실시예 5: 유방암의 비-종양원성 암 세포 마커로서의 CD66a
유방암 세포를 CD44 및 CD66a를 기초로 분류하였는데, 세포 대부분은 CD244bw이었다. 그 후, 세포를 NOD/SCID 마우스의 유방 지방 패드 상이 이식하였고, 종양의 증식을 모니터링하였다. CD44/CD66a-세포는 도 5에 나타낸 바와 같이 생발광 영상화에 의해, 더 높은 수준의 이식율과 더 높은 증식율을 나타내는 것으로 확인되었다. CD66+ 세포는 더 낮고 지연된 종양 증식율을 보였고, 종양의 크기는 훨씬 작고, CD66-유래 종양과 비교하여 매우 비슷한 플로우 프로파일을 나타내었다.
도 5a에서, CD44 및 CD66a 마커를 기반으로 하여 플로우 프로파일을 나타내었다. CD66- CD44+ 및 CD66+CD44+ 세포를 생체내 종양원성 분석으로 분류하였다(세포 100개 또는 1000개를 NOD/SLID 마우스의 유방 지방 패드의 Zid 또는 41h에 이식함). 10b에 나타낸 바와 같이, CD66- 세포 100개를 이식한 이식체 8개 중 5개는 종양으로 자랐지만, CD66+ 세포 100개를 이식한 경우 8개 중 2개가 종양으로 자랐다. 세포 1000개의 경우, CD66- 세포를 주입한 경우, 8개 중 8개가 종양으로 자랐지만, CD66+ 세포는 8개 중 3개만 종양으로 자랐다. 명백한 종양들의 증식율을 비교하면, CD66+ 세포는 CD66- 세포로부터 유래된 것 보다 훨씬 적고 작은 크기였다(도 5c). 도 5d에서, CD66-CD44+ 또는 CD66+CD44+ 세포들 중 100K를 주입 전에 개똥벌레 루시퍼라제-EGFP 렌티바이러스에 감염시켰다. 초기에는(13일) CD66+ 세포에서 나온 생발광 신호는 CD66- 세포의 신호 보다 더 강하였다. 1달 또는 2달 후, CD66- 세포는 마지막 날(68일) 최대 생발광 신호를 보였고, 명확한 종양으로 자랐다.
실시예 6: 암 줄기 세포 동정 및 빈도 측정에 사용한 유전자 리스트의 최적화
정상 줄기 세포와 암 줄기 세포 둘다를 동정하기 위해 이때 사용한 대부분의 마커들은 필수적인 줄기 세포 기능과 연계되어 있지 않다. 이것의 발현은, 분리 시기에 줄기 세포가 체류하고 있던 특정한 미세환경과 관련있다. 즉, 중기 세포를 동정하기 위해 사용되는 일반적인 마커들의 활용성은 이들이 채집된 부위에 따라 달라질 수 있다.
본 방법은 중요한 줄기 세포의 기능에 대한 마커를 동정하기 위한 것이었다. 자기 재생은 전형적인 줄기 세포의 특성이므로, 본 발명자들은 재생 경로에 모든 노력을 집중하였다. 이로써, 정상 HSC, 전구 세포로부터 기원된 백혈병 줄기 세포, 및 인간 상피 암 줄기 세포에서는 고도로 발현되지만, 각 해당 조직에서 비-자기 재생 세포에서는 그렇지 않은, 다수의 유전자들을 동정하였다. 예비 결과에서 나타난 이러한 게놈 분석에서, 줄기 세포의 자기 재생과 연계된 것으로 기존에 파악된 유전자 다수가 동정되었다. 마찬가지로, 유방암 줄기 세포 및 비-종양원성 암 세포에서 차별적으로 발현되는 후보 마이크로RNA들을 동정하였다. 이러한 증거들은, 이들 유전자 및 마이크로RNA들 중 몇가지가 중요한 줄기 세포 기능을 가지고 있으며, 이들 유전자의 기능이 hESC 및 iPSC 자기-재생 및 유지에도 또한 중요하다는 것을 입증한다.
종양 세포 집단내 암 줄기 세포의 빈도를 측정할 수 있는 디바이스를 만들기 위해, 암 줄기 세포 동정에 사용되는 유전자 리스트를 최적화하는 것이 바람직하다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, 암 줄기 세포 마카러소 텔로머라제와 자기 재생 과정과 연계된 수종의 유전자를 동정하는 등의, 작업에 큰 진보를 이루었다. 텔로머라제 요소인 TERT는 미성숙 표현형의 대장 암 세포에서만 발현된다. 또한, TERT는 일부 hESC 및 iPSC 세포주의 분화에 따라 효율적으로 하향 조절되지 않는다.
정상 및 암성 대장 상피 세포 둘다 장샘 세포 성숙화 및 자기 재생과 관련된 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 자기 재생 유전자 리스트는 TERT 이외로 확대시켜, 세포가 줄기세포라는 신뢰성을 최대화하였다. 정상 및 암 줄기 세포에 대한 분석에서 동정된 유전자들의 발현을 측정하였다. 암 줄기 세포는, 거칠 수 있는 유사 분열의 횟수를 제한하는 카운팅 기전에서 이탈한 전구 세포나 또는 확장에 대한 제한에서 이탈된 줄기 세포에서 잠재적으로 발생할 수 있기 때문에, 후보 유전자는 정상 설치류 HSC, 전구 세포류부터 유래된 설치류 백혈병 줄기 세포, 및 인간 유방암 줄기 세포에 의해 발현되는 것들이다. 줄기 세포 유지와 관련있는 유전자들이 모두 열거되어 있는 리스트에서 상단에 있는 동정된 후보 유전자로는 BMIl5-IDI, IGFBP3, HOX 패밀리 일원들 H0XA3, H0XA5, MEISl, ETSl, ETS2, RUNX2 및 STAT3이 포함된다. 본 발명자들은 이들 유전자들 중 암 줄기 세포 자기 재생과 관련있는 것을 확인한다. 이를 위해, 시험관내 및 생체내 기법을 이용하여 암 줄기 세포의 자기 재생 역할에 대해 후보 유전자들을 체계적으로 테스트한다.
자기 재생을 조절하는 유전자의 발현은, 케라틴 및 장 뮤신 등의 성숙 마커를 비롯한, 상피 세포에 특이적인 유전자의 발현과 연관되어 있다. 이는, 분석 중인 세포가 생검에서의 정상적인 세포 오염원은 아님을 확인해 줄 수 있을 것이다. 이의 발현이 자기 재생 유전자 BMII에 의해 하향 조절되는, 종양 억제자 유전자의 변이는, 초기 전구 세포의 자기 재생을 가능하게 한다. 이러한 유전자들은 흔히 대장암에서 돌연변이되므로, 자기 재생성 대장암 줄기 세포는 정상적인 줄기 세포와 초기 대장 전구 세포 둘다에서 생겨날 것이다. 또한, 온코제닉 변이는 대장암 세포에 의해 유전자 발현을 변이시킬 것이다. 즉, 정상적인 대장 상피 줄기 세포와, 2종의 자기 재생성 세포 집단을 서로 구별할 수 있게 하는 이의 악성 상태의 카운터파트 간에는, 초기 장샘 세포 돌연변이와 연관된 적어도 일부 유전자들의 발현 차이가 있을 수 있다.
본 발명자들은 암 줄기 세포와 비-종양원성 암 세포에서 차별적으로 발현되는 37개의 miRNA를 동정하였다. 몇가지 miRNA 클러스터는 정상 조직 줄기 세포에서는 하향 조절되었지만, 암 줄기 세포에서는 그렇지 않았으며, 또한, miR-200c 및 miR-183와 같은 일부 miRNA의 발현은 시험관내에서 배아 암 세포의 증식을 억제시켰으며, 생체내 이의 종양-형성력을 무효화하였고, 시험관내에서 유방암 세포의 클론형성을 저해하였다. 이들 miRNA와 다른 클러스터를 동정하였으며, 이는 유방암 줄기 세포와 정상적인 줄기 세포 생물학을 연결시키는 분자적 연결을 제공한다. 종양원성 세포에서 일관되게 상향 조절되거나 하향 조절되는 이러한 마이크로RNA의 발현은, 미분화된 및 분화된 hESC 및 iPSC로부터 단일 세포를 탐침한다. 필수적으로, 미분화된 세포는 Tra 및 SSEA 서브타입 등의 다능성 줄기 세포와 다른 세포 표면 마커에 의해 분류하고, miRNA 발현, 리플레이팅 효율(replating efficiency) 및 생체내 집단 파라미터들에 대해 평가한다(배아 악성 종양, 혼성 배아 악성 종양/분화된 세포 인덱스(%EC 대 분화된), 및 분화된 세포 측면에서, 테라토마 분석의 결과). 분화된 줄기 세포 집단을 배아체 형성에 의해 수득하고, 분화 후 28일 후에 SSENTRA 마커에 대한 양성 및 음성 선별을 통해 분류한다. 분류된 집단에 포함된 단일 세포는, 1) 암 줄기 세포를 나타내는 마이크로RNA 프로파일, 2) 유전자 발현 프로파일(아래), 및 3) 이식/테라토마 분석의 결과로 평가할 것이다. 발명자들은, 이들 집단에서의 "분화 내성" 세포가 악성 배아 암 유도체가 되어, 단일 세포 내부에서 분화된 세포와 미분화된 세포의 마커들을 공동-발현하게 될 것으로 예상한다.
실시예 7: 단일 세포 수준에서의 유전자 발현 프로파일
다능성 세포의 집단들에서, 심지어 21일간의 분화 후에도, TERT 등의 종양원성의 중요 마커들이 하향 조절되지 못한 세포주들이 관찰되었다(도 6). 또한, iPSC 세포주의 약 50%는, 분화된 상태에서, 외인성 및 내인성 다능성 마커들을 모두 하향 조절하는데 실패한 것으로 관찰되었다. 필연적으로, 이는, 종양원성 성향 결과를 예측할 수 있는, 분화 및 자기-재생 간의 "분자 워(molecular war)"를 제시한다. 본 발명자들은 hESC 및 iPSC 세포 배양물에서 악성 세포를 동정하기 위한 유전자 리스트를, 1) 미분화된 hESC 및 IPSC에 비해 EC(배아 암) 세포 및 인간 배아 할구에서 과다 발현되는 유전자들을 분석하거나, 2) Aim 1(암 줄기 세포의 동정을 위해) 유래의 것을 포함하도록 유전자의 리스트 교차-참조, 및 3) 분화된 체세포와 생식 세포 계통(이는 분화에 저항성인 다능성 줄기 세포로 남음)의 유전자를 추가함으로써, 최적화할 수 있다. 본 발명자들은, 이후, 단일 세포의 기저 유전자 발현을 기초로 악성 잠재성에 따라 진단된 서브집단의 종양원성 잠재성을 평가하기 위해 면역 결함 마우스 분석을 이용할 것이다.
CNV 분석. 염색체 변이체는 다능성 인간 줄기 세포 집단의 불안정성과 연관되어 있으며, 염색체 소실 및 취득(gain)이 자주 관찰된다. 그러나, 몇가지 연구에서, 복수 위치들에서 카피 수를 분석하기 위한, 보다 세련된 구조의 고성능 방법이 검토되었다. 본 발명자들은 독립적으로 유래된 다능성 줄기 세포주들에서의 게놈-와이드 CNV 수를 평가하기 위해 본 기술을 개량하도록 제안하며, CNV에서의 변화는 서브염색체의 불안정성을 반영한다. 초기에, 본 발명자들은, 본 실험실에서 이전에 관찰된 바를 비롯하여, 게놈 전체에서 두플리케이션이 인지된 본 유전자/유전자와 리스트에 추가하기 위한 특이적인 프로브 세트를 설계할 수 있다(도 6). 초기 설계에서 SCAD는 최대 1000개의 마커 분석을 수반한다. CNV 분석은 상업적으로 구입할 수 있으며, hESCsIiPSCs에서의 게놈 불안정성과 상호관련있을 수 있다.
실시예 8: 암 줄기 세포를 동정 및 정량하기 위한 자동 디바이스의 조작
자동 디바이스는, 암 줄기 세포를 동정하고, 세포 표면 표현형과 유전자 발현의 조합을 기초로, 종양에서의 이의 빈도(도수)를 계산하도록 설계된다. 본원에 기술된 최적화된 마커/유전자 분석을 이용하여, 단일 세포에서 분화된 및 미분화된 상태에 대한 마커들의 공동-발현을 기초로, 악성 잠재력을 가진 세포를 동정하는데, 유사한 전략을 사용한다. 이러한 디바이스는, 배아체 또는 종양의 바늘 생검의 단일 세포 현탁물을 만들고, 세포 서브집단(상피, 분화된, 미분화된)을 분리한 다음, 수백 또는 수천의 단일 세포의 qRT-PCR을 수행하여, 종양 또는 다능성 세포 배양물의 줄기 세포 함량을 측정한다. 이러한 완전 자동화된 디바이스는 암 줄기 세포의 유세포 측정 분류시 현재 요구되는 노동-집약적인 단계를 생략시키고, PCR 분석에 충분한 암 세포를 분리하는데 100,000개 미만의 세포가 필요한 실제 핸드-오프의 베드-사이드 진단 툴로 암 줄기 세포를 정량할 수 있다. 마이크로유체 칩 기법과 조합된, 자동 조작, 효율 및 낮은 단가로, 개별적이고, 신속한 유전자 진단이 가능할 것이다.
이 시스템의 주요 부분은 마이크로유체 세포 분류기이다. 이 디바이스는 세포 찌꺼기(괴사 세포 및 그외 입자)로부터 살아있는 세포(상피 세포 또는 배양된 다능성 세포나 이의 산물들)을 분리하고, 최대 5가지의 상이한 표면 마커의 형광 신호들을 이용하여 단일 세포 현탁물로부터 세포를 분류하고, 이를 이후의 유전자 연구에 대한 각각의 용기에 둔다. 종양 또는 세포 배양물을 소화시켜 세포 현탁물을 수득하거나, 형광 표면 마커로 세포를 염색하는 등의 그외 상류 단계들을 본 시스템에 통합할 수 있다. 이 시스템을 종양 분석에 사용하는 방법은 아래에서 설명한다: 먼저 생검을 수득하고, 의사가 샘플을 본 시스템의 유입구에 넣는다. 사용자 친화적인 컴퓨터 인터페이스를 이용하여, 의사는 표면 마커의 수 및 타입, 필요한 PCR 사이클 수 등의, 분류와 유전자 분석에 필수적인 파라미터를 설정하고, 기계는 인간의 개입없이 나머지 단계들을 수행한다. 이전에 증명된 기법들을 기반으로, 본 시스템은 초 당 30개 이상의 세포의 분류 처리가 가능하다.
단일 세포 분석 디바이스(SCAD)는 모듈식(도 7)일 수 있으며, 일체화된 완전히 자동화된 양상으로 다음의 단계들을 수행한다: 1) 조직의 소화: 조직을 디바이스의 유입구에 둔다. 적절한 효소를 디바이스에 도입하여, 세포외 기질의 소화를 수행하도록 흘려주어, 세포 현탁물을 수득한다. 2) 살아있는 세포의 찌꺼기로부터의 분리: 현탁물에는 전형적으로 평균 크기 10 - 15 ㎛의 살아있는 세포와 평균 크기 약 5 ㎛의 찌꺼지 물질이 함유되어 있다. 사멸된 물질의 양은 때로는 살아있는 세포 보다 상대적으로 많아, 세포의 효율적인 분리를 위해서는 사멸 물질을 여과 제거하는 것이 중요하다. 이는, 소화시킨 조직 현탁물을, 입자의 크기에 따라 유체성 흐름을 분할시킬 수 있는, 마이크로유체 "메타머터리얼"을 통과하도록 흘려줌으로써 달성한다. 3) 염색: 필터링한 단일 세포 현탁물을 마이크로유체 디바이스의 상이한 구획내 적절한 표면 마커를 이용하여 염색한다. 최대 5종의 상이한 마커를 이용한 염색은 암 세포의 고순도 집단 수득에 유용할 수 있다. 4) 분류: 염색된 단일 세포 현탁물을 마이크로유체 디바이스의 다은 구획으로 흘르게 하여, 암 세포를 나머지 세포로부터 분류한다. 푸아송 통계 및 몬테 카를로 시뮬레이션에서, 암 줄기 세포에서 2배수 변화를 검출할 수 있도록 하기 위해서는 단지 2,000-20,000개의 암 세포만 분류할 필요가 있으며, 신뢰 수준은 99%인 것으로 제시한다. 이러한 소수의 세포로는 현재 유세포 측정으로 효율적으로 분류할 수 없는데, 그 이유는 FACS에 필요한 최초 샘플 크기는 약 세포 백만개이기 때문이다. 본 발명자들은, 세포를 낭비하지 않는, 공기가 통하지 않는 분리된 소량 체적 환경에서, 무한정으로 세포 현탁물을 사이클링하기 위한 마이크로유체 기반의 분류를 이용하여 이를 달성할 것이다.
플로우 기반의 마이크로유체 세포 분류기: 거의 초당 50개의 세포를 처리하는 마이크로유체 세포 분류기가 기술되어 있는데, 이 장치에서 세포는 레이저 빔을 통해 고속으로 흐르며(Di Carlo et al. Lab Chip 2006;6: 1445- 1449), 분산된 광을 검출하고 분석한다. 빠른 전자 기기와 보다 효율적인 영상 장치는 처리 성능을 10배까지 개선시킬 수 있으며, 그래서 분류 시간을 10분 미만으로 낮출 수 있을 것이다.
평행 분류(Parallel sorting): 세포 분류기는 각각이 어드레스가능한 마이크로유체 챔버의 2D 챔버에서 세포를 밀도로 포착하는 것을 기반으로 하여 개발되고 있다(도 7B 및 7C). 세포는 분류기 어레이로 유입되어, 조립식 바스켓에 의해 포착된다. 이 바스켓은 종래에 신선하게 흐르는 현탁물에서 50% 이상의 단일 세포 포착 효율을 가지고 있는 것으로 입증되었다(상기 Di carlo et al.). 모든 바스켓이 채워진 후, 마이크로유체 밸브를 닫고, 맞춤형으로 설계된 컴퓨터 조절형 옵틱스를 이용하여, 종양형성 세포 동정에 필요한 모두 5가지의 형광 색으로 어레이를 촬영한다. 또한, 이 새로운 칩은, 위상차 영상화가 가능하며, 그래서 세포 형태를 연구하는데 유용함을 입증할 수 있다. 동정된 종양원성 세포는 세포 용혈을 위해 다음 모듈로 흘러 들어가고, 나머지 세포는 칩의 밖으로 흐른다. 세포는 매우 여러번 순환될 수 있고, 따라서 폐기되지 않게 되므로, 이러한 새로운 세포 분류기로 초기 극 소수의 세포로도 운영할 수 있다. 현행 마이크로유체 칩 기법은, 3 x 3 cm 면적 상에서 거의 10,000개의 요소들을 장착시킬 수 있게 하여, Fluidigm Biomark system에 사용되는 것과 같은, 최첨단 촬영기를 이용하여 (1회 샷) 신속하게 신호를 보낼 수 있다. 이러한 세포 분류기는 초당 거의 30개의 세포를 처리하는 능력을 가질 수 있다. 흐름 기반의 세포 분류기에 대립되는 것으로서, 평행 분류 디바이스 이용시의 한가지 이점은, 분류 및 PCR 운행 동안의 영상화는 동일한 영상기에 의해 수행될 수 있으며, 이로써 개개 세포의 형광 및 형태 데이타를 유전자 데이타와 연관지을 수 있다는 것이다.
세포 용혈 및 mRNA 포착: 분류된 암 줄기 세포는 개개 챔버에서 용혈시키기 위해 다음 모듈로 흘러들어간다. mRNA는 올리고-dT 비드의 컬럼 상에 포착될 수 있으며, 비드 상에서 기존에 기술된 바와 같이(Marcus et al. Anal Chem 2006;78:3084-3089) 역전사되고, Heliscope에서 개발한 새로운 유전자 서열분석 프로토콜을 통해 가공 처리되거나, 또는 거시 웰(㎕ 범위)로 이송되며, 현 프로토콜에 따라 유전자 세트를 사전증폭시키기 위한 반응 시약과 혼합될 수 있다. 사전 증폭된 샘플은 qRT-PCR 및 진짜 암 줄기 세포 함량을 정하기 위한 Fluidigm Dynamic 어레이 칩과 비슷한 모듈로 이동된다.
정상적인 유방 및 혈액 줄기 세포 뿐만 아니라 대장, 두경부 및 유방암 줄기 세포에 대한 분석을 기반으로, 최초로, 정확하고, 확실하게 생검 표본에서의 암 줄기 세포를 동정하고 계수할 수 있게 하는 새로운 단일 세포 분석을 확인하였고, 다증성 줄기 세포 집단들을 배양하였다. 원리의 입증으로서, 이러한 분석을 단일 결장 암 세포의 분석에 적용하였다. 이를 위해, FACS를 이용하여, 2명의 환자로부터 확립한 초기 계대의 이종이식편으로부터 CD66+CD44 계통의 대장 암 세포들을 분류하였다. 이들 마커로 종양에서 대장암 줄기 세포(CoCSC)를 약 3-5배 농화시킬 수 있다. 이러한 마커로 분리된 암 세포는 오직 CoCSC에 대해서 부분적으로 농화된 것으로 추측되었다. 단일 세포 유전자 발현 분석과 이후의 종양원성 연구를 통해, 실제 CD66+CD44+ 계통의 세포가 CoCSC와 비-종양원성 세포의 혼합물이고, 이러한 분석을 이용하여, 생검 표본에서 CoCSC의 빈도를 보다 정확하게 동정할 수 있는 것으로 확인되었다. 단일 세포 분석에서, 정상 대장 장샘을 연상시키는 대장암 세포의 계층적 발생 구조가 드러났다. 명백하게, 대장 종양내 대부분의 미성숙 세포들은 종양의 장기간 유지에 중요한 텔로머라제 복합체의 구성원인 TERT를 발현함으로 확인하였다. 또한, 정상적인 대장 줄기 세포임을 나타내는 LGR5의 발현은, 미성숙 세포로 한정되지 않는다. 반면, MUC2,'CK20, CA-2 등의 성숙 대장 장샘 세포에 의해 발현되는 유전자, 특히 CD66a는, 미성숙 세포 마커들을, 가장 명확하게는 TERT를, 공동 발현하지 않는 세포에 의해 발현되었다. 정상적인 성숙 상피 장샘 세포와 같은 이들 세포는 막대한 유사분열을 거치는 능력에 한계가 있는 것으로 보인다. 실제, CD66a+ (분화된 대장암 세포)와 CD66a- 대장암 세포를 면역결함성 마우스에 이식하였다. CD66a- 세포는 종양을 형성하였지만(6개 중 5개의 주입물), CD66+ 세포를 종양을 형성하지 못하였다(5개 중 0개). 마찬가지로, 테스트한 2종의 인간 유방암 종양에서, 면역결함 마우스 모델에서 테스트하였을 때 CD66ew 세포는 암 줄기 세포에 대해 농화되었다. 이러한 결과는, 단일 세포 유전자 발현 분석으로 생검 및 배양물에서의 암 줄기 세포의 동정과 정량을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
실시예 9: 혈액과 유방 상피 조직 둘다에서의 정상적인 줄기 세포와 암 줄기 세포에 의해 공유되는 유전자 발현 특징
최근, 암 줄기 세포가 상이한 세포 구획들에서 발생할 수 있다는 것이 명백해지고 있다. 일부는 줄기 세포 풀의 확장에 제한이 없어진 돌연변이 줄기 세포에서 발생될 수 있다. 나머지는 이들이 거칠 수 있는 유사 분열의 횟수를 정상적으로 제한하는 카운팅 기전이 없어진, 보다 분화된 초기 전구 세포에서 발생한다. 물론, 줄기 세포나 전구 세포로부터 발생하는 암 또는 백혈병 줄기 세포의 다수 마커들은 상이하다. 그러나, 줄기 세포는 세포의 기원에 상관없이 자기 재생력을 유지할 것이다. 줄기 세포 구획 또는 부분적으로 분화된 자손 중 어느 쪽에서 발생하는, 암 줄기 세포에서 자기 재생을 조절하는 몇가지 경로는, 서로 그리고 정상 HSC와 공유될 수 있음을 생각하였다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 정상 마우스 HSC와, 전구 세포(즉, 자기 재생 집단)에서 발생하지만 정상적인 전구 세포(즉, 비-자가 재생 집단)에서 발생하는 설치류 백혈병 줄기 세포에 의해 발현되는 유전자들이, 또한 유방암 줄기 세포에서는 발현되지만, 이의 비-종양원성 카운터파트에서는 발현되지 않는지를, 분석하였다. 두드러지게도, 비-종양원성 카운터파트가 아닌 인간 암 줄기 세포는 이들 유전자를 과다 발현한다(도 8). 또한, 본 발명자들은 다른 잠재적인 호보를 동정하기 위한 다른 2가지 유전자 리스트를 만들었다: i) 유방암 줄기 세포와 정상 유방 줄기 세포에서는 발현되지만, 비-종양원성 암 세포 또는 성숙 유방 상피 전구 세포에서는 발현되지 않는, 유전자, ii) 정상 인간 HSC와 인간 유방암 줄기 세포에서는 발현되지만, 인간 혈액 전구 세포나 비-종양원성 유방 세포에서는 발현되지 않는 유전자.
이들 유전자 다수가 자가 재생과 암과 연관되어 있었다. 이는, 인슐린 성장 인자 결합성 파트너 IGFBP3, HOX 패밀리 구성원 H0XA3, H0XA5, MElSl 뿐만 아니라 ETSl, ETS2, RUNX2 및 STAT3와 같은 전사 인자들을 포함한다. 전사 인자 STAT3이 진짜 암 줄기 세포 조절자인지를 테스트하였다. STAT3는 ES 세포와 HSC 둘다의 유지에 역할을 한다. 마우스와 인간의 유방암 줄기 세포에 대한 게놈 분석으로, 다수의 STAT3 활성화된 전사체들이 암 줄기 세포에서 과다발현되는 것으로 나타났다. 다음으로, 유방 종양의 면역화학적 분석을 수행하였을 때, STAT3 양성 세포는 암의 침투성 가장자리에 집중되는 경향이 있었으며, 단백질은 종양의 내부 영역에서 보다 분화된 것으로 보이는 세포에서는 관찰되지 않았다. 마지막으로, STAT3의 소분자 저해제들이 있었다. 이러한 저해제들은 암 줄기 세포 모델에서 테스트할 수 있다. STAT3 저해제인 쿠쿠르비탁신의, 설치류 유방암 줄기 세포의 콜로니 형성 능력에 대한 효능을 테스트하였다. 이 저해제에 단기간 24시간 노출시키면, 콜로니가 ~50%까지 감소되었다(p<0.02, t-검정). 이러한 결과들은, STAT3는 적어도 몇가지 유방암 줄기 세포에서 중요한 역할을 함을 시사한다.
2번째 대상 유전자는 MEIS1이다. MEIS1은 정상 혈액 및 유방 줄기 세포, 백혈병 줄기 세포 및 유방암 줄기 세포에서 선호적으로 발현된다. 유전자 연구를 통해, MEIS1의 발현이 정상적인 혈액 줄기와 이의 백혈병 카운터파트 둘다에서 자기 재생과 유지에 절대적으로 필요하다. MEIS1은 유방암 줄기 세포 재생을 조절할 수 있다.
정상 줄기 세포와 암 줄기 세포 둘다에서 발현되는 특히 흥미로운 후보 유전자로는, CAVl, GASl, MAP4K4 (키나제) MYLK (키나제), PTK2 (키나제), DAPKl (키나제), LATS (키나제), FOSL2, AKT3 (키나제), PTPRC (티로신 포스파타제), MAFF (온코진), RRAS2 (RAS 관련), NFKB, ROBOl, IL6ST (STAT3를 활성화 함), CRlMl, PLS3, SOX2, CXCL14, ETSl, ETS2, MEISl 및 STAT3 뿐만 아니라 CD47이 포함된다. 암 줄기 세포에서는 과다 발현되지만 정상 줄기 세포에서는 과다 발현되지 않는 흥미로운 후보 유전자는 RGS4, CAV2, MAF (온코진) WTl (온코진), SNAI2, FGFR2, MEIS2, 101,103, ID4 및 FOXCl이다.
실시예 10: 조혈 줄기 세포의 전체 트랜스크립톰 분석
본 실시예에서는, 조혈 줄기 세포의 트랜스크립톰 분석을 이용하고자 하였다. 이러한 구현예의 전체 모식도는 도 9에 나타낸다. 본 실시예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포의 집단을 테스트 개체에서 분리하였다. 그런 다음, 세포 집단을 공지된 조혈 줄기 세포 마커(예, CD34, Thyl 등)에 대한 형광 항체에 노출시켜, FACS 분석용으로 준비한다. 세포는, 각 웰에 단일 세포만 포함되도록 96웰 플레이트에 분할하여 넣는다.
분리된 단일 세포를 용혈시키고, 용혈물을 2가지 분획으로 나눈다. 제1 분획은, 기본적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이, 발현 수준 또는 존재에 의해, HSC와 비-HSC를 구별할 수 있는 유전자(예, CD34+, CD19-, CD17-)의 선별을 이용하여, 실시간 PCR에 의해 단일 세포 유전자 발현 분석을 실시한다. 집단내에서 HSC를 동정한 후, HSC인 것으로 동정된 단일 세포의 용혈물의 풀을 제조한다. 표준적인 방법을 이용하여 총 mRNA를 증폭시켜, cDNA 라이브러리를 제조한다. 그 후, cDNA를 본원에 기술된 임의의 방법 등의 "다음 세대" 방법을 이용하여 서열분석한다. 그런 다음, 서열분석한 트랜스크립톰을 분석하여, 고유 유전자 및/또는 표면 마커가 존재하는지를 결정한다.
HSC에 고유한 표면 마커를 동정한 후, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 이용가능한 기법으로 제조한다. 항체의 특이성과 효능을 검증한다(예, 분리된 및/또는 재조한 단백질에 대한 결함). 그 후, 항체를 형광 모이어티로 표지한다. 이후, FACS 분류 및/또는 분석을 다른 세포 집단(예, 동일하거나 상이한 개체)에 대해 새롭게 발견된 표면 항원에 대한 항체를 이용하여 수행할 수 있다.
실시예 11. 치료학적 물질의 분석
본 실시예에서, 후보 치료 물질의 선별을 수행한다. 타겟 세포, 예컨대 대장암 줄기 세포 및 대장암 세포(분화됨)를 분리하고, 전술한 바와 같이 단일 세포 수준에서 분석한다. 타겟 세포를, 이전에 동정된 타겟 세포에 특이적인 마커를 이용하여 생검 표본으로부터 분리한다(예, 타겟 세포 특이적인 항체를 이용한 FACS 분리 및/또는 타겟 세포 특이적인 핵산의 형광 표지).
타겟 세포를 단일 세포를 포함하는 어드레스가능한 위치로 분리시킨다. 그 후, 분리된 세포를 후보 치료 물질(예, 항체, 독소-접합된 항체, 소형 분자)의 라이브러리에 노출시킨다. 그런 다음, 세포를 채집하여 유전자 발현 패턴 및/또는 세포 생활성을 분석한다. 성공적인 후보 치료 물질은 세포를 사멸 표적화하는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 후보 치료 물질은, 비-질병 상태의 세포의 발현 패턴과 비교하여, 탈규제(예, 상향 또는 하향 조절된)된 것으로 공지된 유전자의 발현을 변형시킬 수 있다. 후보 치료 물질에 타겟 세포이 노출되면, 정상(즉, 비-질병 상태) 세포의 패턴(들)에 보다 가깝게 비슷한 핵산 발현 패턴(들)을 변형시킬 수 있다. 타겟 세포의 사멸 또는 변이에 대한 유망성을 보이는 후보 치료 물질을 정상 세포에 노출시켜, 치료 물질로서의 이의 잠재적인 용도를 결정한다(예, 후보 물질이 타겟 세포와 정상 세포를 사멸시킨다면, 이는 어쩌면 유용한 물질로서 배제시킬 수 있음).

Claims (45)

  1. 이질적인(heterogeneous) 고형 종양 샘플에서 상이한 세포 집단들을 동정하는 방법으로서,
    상기 종양으로부터의 각각의 세포들을 분리된 위치들로 무작위 분할시키는 단계;
    상기 분리된 위치에 분할된 각각의 세포들에서, 복수의 유전자들에 대한 트랜스크립톰(transcriptome) 분석을 수행하는 단계; 및
    클러스터링 분석을 수행하여, 1종 이상의 상이한 세포 집단들을 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각각의 세포는 상기 분할되기 전에 농화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 세포 1000개 이상의 개별 세포들에 대해 동시 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 핵산 분석을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분리된 위치는 평평한 기판 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 무작위 분할은 마이크로유체 시스템에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 발현된 RNA, 비발현된 RNA 또는 이 둘다의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 전체 트랜스크립톰 분석(whole transcriptome analysis)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 한쌍의 프라이머 세트를 이용하여 RNA를 증폭시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 네스티드(nested) 프라이머가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 상기 각각의 세포 전체 또는 서브세트에 대해 동시에 또는 실질적으로 실시간으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 세포 집단은 정상 줄기 세포, 정상 전구 세포, 정상 성숙 세포, 염증 세포, 암 세포, 암 줄기 세포 또는 비-종양원성(non-tumorigenic) 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 개체의 이질적인 종양 생검을 분석하는 방법으로서,
    생검으로부터 세포들을 분리된 위치들로 무작위 분할하는 단계;
    상기 각각 분할된 세포에서 50개 이상의 유전자에 대해 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계; 및
    트랜스크립톰 데이타를 이용하여 상기 종양의 한가지 이상의 특징을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 수행 단계는 세포 타입의 사전 농화없이 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 특징은 암 세포의 존재, 부재 또는 세포 수인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 특징은 줄기 세포, 초기 전구 세포, 최초 분화된 전구 세포, 후기 분화된 전구 세포 또는 성숙 세포의, 존재, 부재 또는 세포 수인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 특징은 하나 이상의 세포를 제거하는 치료 물질의 효능인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 특징을 이용하여 암 환자를 진단하거나 암 단계를 진단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 특징은 신호전달 경로의 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 암 줄기 세포, 분화된 암 세포, 성숙 암 세포 또는 이의 조합에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 질병 상태의 세포에 의해 이용되는 신호전달 경로를 동정하는 방법으로서,
    이질적인 샘플로부터 세포를 무작위 분할하는 단계;
    상기 분할된 세포에 대한 트랜스크립톰을 수행하는 단계;
    트랜스크립톰 분석을 이용하여 하나 이상의 질병 상태의 세포를 동정하는 단계;
    상기 하나 이상의 질병 상태의 세포에 대한 트랜스크립톰 분석 결과를,
    a) 비질병 상태의 세포,
    b) 다른 질병 상태의 세포, 및
    c) 질병 상태의 줄기 세포에 대한 트랜스크립톰 분석 결과와 비교하는 단계; 및
    (i) 질병 상태의 세포, (ii) 질병 상태의 줄기 세포, 및 (iii) 선택적으로 다른 질병 상태의 세포에서 발현되지만, 비질병 상태의 세포에서는 발현되지 않는, 신호 전달 경로를 동정하여, 질병 상태의 세포에 의해 이용되는 신호전달 경로를 동정하는 단계를 포함하는, 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 질병은 암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 상기 질병 상태의 세포의 생존에 필요한 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 증상을 보이는 개체를 진단하는 방법으로서,
    이질적인 샘플로부터 세포를 무작위 분할하는 단계;
    상기 분할된 세포에 대해 제1 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계;
    하나 이상의 질병 상태의 세포에 대한 상기 제1 트랜스크립톰 분석을, 비질병 상태의 세포에 대한 제2 트랜스크립톰 분석과 비교함으로써, 트랜스크립톰 분석을 이용하여 하나 이상의 질병 상태의 세포를 동정하고, 이로써 개체에서 상기 질병 상태의 세포와 관련된 증상의 존재 또는 부재를 진단하는 단계를 포함하는, 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질병 상태는 유방암, 대장암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 발현된 RNA, 비발현된 RNA 또는 양자의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 트랜스크립톰 분석은 전체 트랜스크립톰 분석(whole transcriptome analysis)인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 질병 상태 세포는 유방암 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 치료제의 스크리닝 방법으로서,
    질병 상태의 세포를 가지고 있는 제1 개체를 하나 이상의 테스트 물질에 노출시키는 단계;
    상기 개체의 대상 부위로부터 이질적인 종양 생검을 취하는 단계;
    하나 이상의 질병 상태의 세포를 포함하는, 상기 이질적인 종양 생검으로부터 유래된, 하나 이상의 각각의 세포에 대해 트랜스크립톰 분석을 수행하는 단계;
    상기 트랜스크립톰 분석을,
    (i) 질병 상태의 세포가 없는 제2 개체, 또는
    (ii) 상기 노출 단계 수행 전의 제1 개체의 트랜스크립톰과 비교하는 단계; 및
    상기 테스트 부위의 세포에 대한 트랜스크립톰이, 상기 제2 개체 또는 노출 전의 제1 개체의 트랜스크립톰과 보다 비슷하게 되도록 작용하는 물질을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 치료제의 질병에 대한 잠재적인 효능을 결정하는 방법으로서,
    질병 상태의 세포로 구성된 제1 집단을 서로 분리된 위치로 분리시켜, 상기 분리된 위치가 개별 세포를 포함하도록 하는 단계;
    하나 이상의 상기 개별 세포에서, 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여, 질병-상태 표시자(signature)를 산출하는 단계;
    질병 상태의 세포로 구성된 제2 집단을 물질에 노출시키는 단계;
    상기 질병 상태의 세포로 구성된 제2 집단을 서로 분리된 위치로 분리시켜, 상기 분리된 위치가 개별 세포를 포함하도록 하는 단계;
    상기 제2 집단 유래의 하나 이상의 개별 세포에서, 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 제2 집단 유래의 개별 세포의 발현 수준을, 상기 질병 상태를 표시하는 표시자와 비교하여, 상기 물질의 질병에 대한 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 노출 단계는 생체내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제1 집단과 상기 제2 집단은 개체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 질병은 암, 궤양성 대장염 또는 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 핵산 또는 단백질은 암 줄기 세포 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 발현 수준은 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 결정하는 단계는 10개 이상의 핵산의 발현 또는 발현 결여를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제30항에 있어서, 상기 발현 수준은 단백질 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제30항에 있어서, 상기 분리 단계는, 상기 세포 집단을, 상기 개별 세포 에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 치료제에 대한 개체의 반응 가능성을 결정하는 방법으로서,
    개체 유래의, 하나 이상의 세포가 질병 상태의 세포인 세포 집단을 분리된 위치로 분리시켜, 상기 분리된 위치가 개개의 세포를 포함하도록 하는 단계;
    하나 이상의 상기 질병 상태에 있는 개개의 세포로부터, 치료제의 타겟이 되는, 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 기초로 개체의 반응 가능성을 결정하는 단계를 포함하는, 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 발현 수준은 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 10개 이상의 핵산의 발현 또는 발현의 결여를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 발현 수준은 단백질 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 분리 단계는 세포의 집단을 개개의 세포에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 치료제는 항암제인 것을 특징으로 하는 방법.
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