CN111524550B - 整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于神经细胞分类领域，公开了一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，是先对新鲜大脑目标脑区的神经元进行单细胞转录组分析，确定代表这些神经元细胞类型的独有标签基因；然后，对同种属、同性别、且同年龄大脑内相同目标脑区的神经元进行荧光标记并断层成像，得到各个脑片，获取这些神经元的单细胞形态；最后，取含有这些神经元胞体的脑片，通过标签基因原位杂交的介导，实现这些神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的间接整合。本发明采用新思路，通过间接整合的流程设计，方法更加简单方便，为神经元细胞类型精准普查等，提供了重要的方法和技术支撑。

Description

整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法

技术领域

本发明属于基础医学与生物技术中的神经细胞分类领域，更具体地，涉及一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，是一种基于单细胞的神经细胞分型研究方法，能够实现神经细胞的分类，适用于各种哺乳动物大脑。

背景技术

脑是脊椎动物最复杂的器官，是神经系统的中枢，直接或间接地控制着动物的几乎一切行为。神经元是大脑结构和功能的基本单元。人脑包含数以千亿计的神经元，即使像小鼠这样的小型哺乳动物，其大脑也包含上亿的神经元。数量如此多的大脑神经元，包含着成百上千的细胞类型。大脑神经元细胞类型普查，是当前脑科学研究的重大基础性问题之一。无论是欧洲的人脑计划还是美国脑计划，都将神经元细胞分类作为优先主攻任务。因为，大脑神经元的细胞分型，是一项非常重要的基础性工程，有利于人们理解大脑的工作机制，防治大脑神经疾病。

目前，神经元的细胞类型并没有严格的定义，一般是根据神经元的形态结构、分子表达、电生理特性等方面属性相似来确认归属为同一类神经元。早在1888年，卡哈尔提出了有关神经系统组成的神经元学说。通过染色方法看到单个神经元形态，人们开始知道大脑神经元有椎体细胞、颗粒细胞等。这种根据神经元细胞形态进行细胞分型的方法，发展最早也最为经典。之后发展了根据神经元电生理特性、蛋白质和RNA构成来分类研究神经元的方法。尤其是近年来，随着单细胞RNA测序技术的发展，单细胞转录组技术用于小鼠大脑皮层、下丘脑、纹状体、海马等脑区或核团的细胞分型，确定了神经元单细胞转录组和神经元功能存在较好的对应关系，显示出了良好的应用前景。因此，单细胞转录组用于神经元的细胞分型，越来越受到神经科学领域研究者的重视和认可。

转录组广义上是指特定细胞在某一功能状态下所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA以及其他各种非编码RNA。狭义上指所有信使RNA(mRNA)的集合。传统的转录组分析需要数万或数十万个细胞，这种基于细胞群体的方法将大量细胞的基因表达取平均值进行分析，无法揭示细胞之间基因表达的异质性。而本发明所说的单细胞转录组，就是在单细胞水平上，分析每一个单细胞的转录组mRNA信息。这种方法尤其适用于研究神经细胞这样高度异质性的细胞群体。

然而，传统方法根据神经元形态、电生理特性等单一维度信息进行细胞分类，具有较大的局限性。因为，这种分型非常不精确，不利于我们研究特定类型神经元的结构和功能。比如，根据单细胞基因表达信息，小鼠中脑多巴胺能神经元就包含至少6种神经元亚型，这些不同亚型神经元在轴突投射、帕金森病易感性上存在明显的差异，因此将之分成多种细胞类型更为合理。

值得一提的是，越来越多的研究者认识到，精确的神经元细胞分型，需要整合神经细胞形态投射、分子构成、电生理特性等多维度信息。2016年，Sten Linnarsson等将单细胞转录组信息和电生理数据整合起来，不仅发现了缩胆囊素神经元新的细胞亚型，也确定了不同细胞分型与电生理特性、对特定刺激的响应、神经递质受体表达存在密切的关系，为预测和研究这些不同亚型神经元的功能差异奠定了基础。

然而，单细胞转录组分析这一新发展的具有良好应用前景的技术却很难整合单细胞形态分析这种经典的细胞分型方法，尤其在哺乳动物大脑，比如小鼠全脑上。因为，要获取小鼠大脑神经元相对完整的单细胞形态，就必须先取鼠脑整体或者脑组织块进行断层成像或者光片透明成像。脑组织在成像前必然经过了较长时间的样本包埋或者透明处理。成像前的这些实验操作，尤其是脑组织在多聚甲醛或者其他固定剂中的后固定，会不同程度地导致组织细胞中转录组信息的丢失，尤其是mRNA的断裂、流失和降解。这种样本再进行转录组mRNA测序，很难再获取比较完整的单细胞转录组信息。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明转换思路，不进行直接整合，而是采用间接整合，通过对方法的整体流程设计进行改进，先获取特定脑区神经元的转录组信息，然后分析数据获得可以代表这些神经元细胞类型的标签基因；之后，取相同年龄相同品系的动物，先通过断层成像获取待分析脑区感兴趣神经元的单细胞形态，然后选择性收集包含感兴趣神经元的脑片，以前述标签基因为靶标，进行mRNA原位杂交，最后将神经元mRNA表达信息配准到神经元单细胞形态数据集中。通过原位杂交的介导，除了标签基因之外的其他转录组基因，都可以整合到单细胞形态信息中，从而建立整合单细胞形态和单细胞转录组双维信息的神经元细胞分型新方法。以小鼠为例，相比在同一只小鼠上直接整合单细胞形态和单细胞转录组信息，本发明间接整合的方法更加简单方便，为神经元细胞类型精准普查、特定类型神经元结构与功能研究、以及神经元单细胞形态投射与基因表达的关系研究等，提供了重要的方法和技术支撑。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，其特征在于，该方法是先对新鲜大脑目标脑区的神经元进行单细胞转录组分析，确定代表这些神经元细胞类型的独有标签基因；然后，对同种属、同性别、且同年龄大脑内相同目标脑区的神经元进行荧光标记并断层成像，得到各个脑片，获取这些神经元的单细胞形态；最后，取含有这些神经元胞体的脑片，通过标签基因原位杂交的介导，实现这些神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的间接整合。

其中，所述独有标签基因与所述神经元细胞类型一一对应，这些独有标签基因是通过单细胞转录组分析得到的；对于任意一个独有标签基因，该标签基因仅在一种神经元细胞类型中表达，在其他神经元细胞类型中并不表达。

作为本发明的进一步优选，所述荧光标记包括嗜神经病毒介导荧光蛋白，或者其他方式介导荧光蛋白或荧光染料，标记活体大脑目标脑区的神经元。

作为本发明的进一步优选，所述断层成像是通过机械切削被包埋的大脑实现的。

作为本发明的进一步优选，所述标签基因原位杂交的介导，具体是以含有被标记神经元的成像过的脑片为样本，以独有标签基因为靶标，进行原位杂交并成像确定这些神经元标签基因的表达情况，通过这些脑片的先后两次成像获取冗余信息，以冗余信息为基础，实现神经元标签基因表达情况与神经元单细胞形态的配准，从而将标签基因以及标签基因所代表的该神经元细胞类型其他转录组信息，整合到神经元单细胞形态中。

作为本发明的进一步优选，所述冗余信息具体是指大脑被包埋后断层成像以及脑片原位杂交后成像，先后两次成像获取的同一神经元细胞或细胞结构的重复图像信息；这些重复信息包括荧光标记的神经元细胞形态信息、或细胞核分布密度、或细胞核形态大小信息。

作为本发明的进一步优选，所述大脑为哺乳动物大脑。

通过本发明所构思的以上技术方案，以小鼠大脑为例，本发明通过分离新鲜小鼠大脑目标脑区的神经元，通过单细胞转录组分析确定这些神经元的标签基因，即能够代表这些神经元细胞类型的表达独特的基因；之后取相同品种、性别和年龄的小鼠(尤其是同窝小鼠)，通过诸如嗜神经病毒介导荧光蛋白标记活体小鼠大脑神经元，或者利用其他方式将荧光蛋白或荧光染料标记活体鼠脑神经元，然后通过光片断层成像或者其他断层成像方式获取被标记神经元的单细胞形态。成像过程中，同时选择性收集含有荧光标记神经元胞体的脑片。以标签基因为靶标，对这些脑片进行原位杂交分析，并将标签基因与单细胞形态信息配准，从而实现标签基因，以及标签基因所代表的该类型神经元其他转录组基因与神经元单细胞形态信息的间接整合。

本发明转换思路，不进行直接整合，即不直接拿已经获取神经元单细胞完整形态的小鼠大脑组织再做单细胞转录组分析，而是采用间接整合，即先获取特定脑区神经元的转录组信息，然后分析数据获得可以代表这些神经元细胞类型的标签基因。之后，取相同年龄相同品系小鼠(同窝小鼠更好)，先通过断层成像获取待分析脑区感兴趣神经元的单细胞形态，然后选择性收集包含感兴趣神经元的脑片，以前述标签基因为靶标，进行mRNA原位杂交(原位杂交比转录组分析对mRNA完整度要求低得多，一定程度断裂的mRNA也能进行原位杂交)，最后将神经元mRNA表达信息配准到神经元单细胞形态数据集中。通过原位杂交的介导，除了标签基因之外的其他转录组基因，都可以整合到单细胞形态信息中，从而建立整合单细胞形态和单细胞转录组双维信息的神经元细胞分型新方法。

总体而言，本发明能够取得下列有益效果：

(1)神经元细胞分型的传统方法，是根据神经元形态、电生理特性等单一维度信息分类。本发明结合单细胞转录组和单细胞完整形态这两个维度的信息，能够更加精确地分类研究哺乳动物大脑神经元。

(2)同一个大脑样本上，单细胞转录组信息和单细胞形态很难直接整合，因为同一样本在获取单细胞形态后，存在较严重的mRNA断裂、流失和降解。本发明的方法避开了这些难点，大大降低了整合的难度，不仅为神经元细胞分型提供了新方法，也为特定类型神经元的投射与功能研究，以及神经元形态投射与基因表达的关系研究，提供了关键基础。

附图说明

图1是本发明的方法流程框图；

图2是高通量光片断层成像平台系统示意图；

图3是本发明实施例1中一个标签基因的原位杂交结果，即光片断层成像后脑片标签基因Cbln1的原位杂交。其中，图3中的A为核酸染料标记细胞核结构，图3中的B为荧光蛋白标记神经元形态，图3中的C为标签基因原位杂交信号，图3中的D为图3中A、B、C的叠加图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以鼠脑为例，基于本发明的一种整合鼠脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，通过原位杂交介导，在两只鼠脑上分别获取单细胞转录组信息和单细胞形态信息，来实现双维信息的间接整合。

图1为本发明的方法流程图，本发明提出的整合鼠脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，也是鼠脑神经元细胞分类的一种方法，包括如下步骤：

(1)神经元形态荧光标记：利用荧光蛋白或荧光染料标记活体小鼠大脑特定脑区的一些神经元，经过一定时间后使神经元被荧光高亮标记，神经元形态展现完整；

(2)光片断层成像：将荧光标记好的鼠脑用合适的包埋剂包埋，然后进行光片断层成像，每次成像包埋样本表层50μm，然后通过成像系统自带的振动切片机切削掉表层40μm。之后继续通过斜入射光片成像新表层50μm，然后切削掉样品表层40μm。如此反复循环成像表层和切削表层的过程。成像和切削相差的10μm图像作为冗余图像，用来实现相邻表层之间的自动准确配准。

(3)神经元单细胞形态重建：用神经元形态重建与分析软件(如NeuroGPS-Tree、SparseTracer等)，从二维图像配准所得的三维数据集中，对标记的神经元进行单细胞形态重建。

(4)脑片选择性收集：成像过程中，当实时图像提示即将出现荧光标记的神经元胞体时，收集含有被标记神经元胞体的脑片，编号并保持脑片的完整。

(5)标签基因原位杂交：对收集的脑片进行原位杂交。如有多个标签基因，可以进行多轮原位杂交靶标选择。每轮原位杂交的脑片用Dapi染料标记神经元内核酸分子，获取细胞构筑信息，再加上荧光标记的神经元形态信息，可以作为各轮原位杂交图像配准的基础以及原位杂交结果与单细胞形态信息配准的基础。

(6)配准与整合

多轮原位杂交之间信息的配准：多轮原位杂交在成像过程中均采集了Dapi染料标记细胞核所得的细胞构筑背景，而同一张脑片具有相同的细胞构筑信息，据此可以将多轮原位杂交获取的标签基因表达信息配准到同一幅图上。

原位杂交信息与神经元形态信息的配准：成像神经元形态后的脑片，进行多轮原位杂交后，胞体的荧光信号并不会明显淬灭，在多轮原位杂交结束后进行成像时，既可以获得mRNA的分布信息，又可以同时采集荧光标记的神经元胞体形态(甚至胞体附近的突起形态)，通过和光片断层成像获取的神经元形态进行比对，再结合光片断层成像与原位杂交均可获取细胞构筑信息，可以将标签基因的表达信息配准到断层成像获取的神经元形态数据中。

利用断层成像方法，通过机械切削被包埋的大脑，在成像获取这些脑片中被标记神经元的形态信息时，也能够收集这些脑片进行原位杂交。除标签基因之外，该种神经元相同分型的其他转录组信息，特别是表达没有显著性差异的基因，都可以整合到神经元单细胞形态中，从而实现小鼠大脑神经元单细胞形态和单细胞转录组双维信息的间接整合。

以下为实施例：

实施例1

SST-Cre小鼠V1脑区SST神经元的细胞分类，包括以下步骤：

(1)新鲜鼠脑单细胞转录组分析

参照2016年美国艾伦脑科学研究所曾红葵教授团队报道的单细胞转录组技术(具体可参见Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single celltranscriptomics，Nature neuroscience，2016)，分离获取2月龄SST-Cre小鼠大脑V1脑区SST神经元并进行单细胞转录组分析。这些神经元包含至少6种典型的细胞类型，每一种细胞类型都确定了独特的标签基因。本实施例选择其中6个标签基因Th、Kit、Nr2f2、Cbln1、CrH、Gabrg1，分别代表V1脑区SST神经元的不同转录组分型。根据这些基因的序列信息和mRNA二级结构，设计并合成两级寡核苷酸探针。

(2)同窝小鼠大脑活体荧光标记

将AAV-hSyn-Flex-Flpo(稀释1000倍)+AAV-hSyn-Con/Fon-EGFP两种病毒等体积混合，注射到步骤1所选小鼠的同窝同性别SST-Cre小鼠V1脑区的不同皮层分层：L2/3、L4、L5、L6各注射5只小鼠。两种AAV中，AAV-hSyn-Flex-Flpo可以在Cre重组酶阳性的神经元中(本实施例中为SST-Cre阳性神经元)表达Flpo重组酶。而AAV-hSyn-Con/Fon-EGFP必须在Cre重组酶和Flpo重组酶都存在的情况下才能表达EGFP。这两种AAV组合，通过稀释第一种AAV(携带Flpo重组酶基因)使其只标记十几个或者几十个SST阳性神经元，第二种AAV(携带绿色荧光蛋白基因)只有在第一种AAV进入且成功表达Flpo重组酶的神经元中才能正常表达EGFP，这样就实现了稀疏标记V1脑区少量SST神经元的形态投射。

(3)获取小鼠V1脑区SST神经元单细胞形态信息

AAV稀疏标记SST-Cre小鼠6～8周之后，灌流取鼠脑用琼脂糖包埋。同时，在琼脂糖包埋前辅以EDC(1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)固定住RNA，来进一步降低mRNA在样本制备和成像过程中的流失、降解。通过光片断层成像(如图2显示)获得的图像实时判断SST神经元胞体(EGFP荧光)所在的脑片，从而选择性收集成像过后的脑片，为后续的原位杂交提供样本。

(4)标签基因原位杂交

对收集的脑片进行两轮三色原位杂交。第一轮原位杂交靶标选择Th、Kit、Nr2f2、Cbln1、CrH、Gabrg1这6个细胞类型标签基因的前3个，即Th、Kit、Nr2f2。第一轮原位杂交结束后Dapi染色，然后成像并保存数据。然后用DNase I消化脑片，再用PBS溶液多次洗涤，使结合到靶标mRNA上的DNA探针断裂、洗脱，从而实现探针荧光的消除。这一步需要控制DNaseI消化的浓度和时间(例如，可以控制浓度为10单位/毫升，时间为1小时)，使细胞核内的染色质DNA不发生大量的、明显的消化降解，以便第二轮原位杂交结束后还能复染Dapi。接着进行第二轮原位杂交，靶标为上述6个基因的后3个，即Cbln1、CrH、Gabrg1。第二轮原位杂交结束后Dapi复染，然后成像并保存数据(图3显示了标签基因Cbln1的原位杂交结果)。

(5)配准与整合

利用Dapi染料标记细胞核所得的细胞构筑背景，将步骤4中两轮原位杂交的图像配准到一幅图中。脑片原位杂交之后同时采集EGFP标记的神经元胞体形态(甚至胞体附近的突起形态)，通过和光片断层成像获取的神经元形态进行比对，再结合光片断层成像与原位杂交均可获取细胞构筑信息，从而将标签基因的表达信息配准到断层成像获取的神经元形态数据中。

SST-Cre小鼠V1脑区SST神经元的标签基因信息配准到SST神经元单细胞形态中后，除标签基因之外，该种神经元相同分型的其他转录组信息，特别是表达没有显著性差异的基因，都整合到SST神经元单细胞形态中。

除小鼠全脑外，本发明方法也适用于其他动物的脑，尤其是哺乳动物的脑。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，其特征在于，该方法是先对新鲜大脑目标脑区的神经元进行单细胞转录组分析，确定代表这些神经元细胞类型的独有标签基因；然后，对同种属、同性别、且同年龄大脑内相同目标脑区的神经元进行荧光标记并断层成像，得到各个脑片，获取这些神经元的单细胞形态；最后，取含有这些神经元胞体的脑片，通过标签基因原位杂交的介导，实现这些神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的间接整合；

其中，所述独有标签基因与所述神经元细胞类型一一对应，这些独有标签基因是通过单细胞转录组分析得到的；对于任意一个独有标签基因，该标签基因仅在一种神经元细胞类型中表达，在其他神经元细胞类型中并不表达；

所述标签基因原位杂交的介导，具体是以含有被标记神经元的成像过的脑片为样本，以独有标签基因为靶标，进行原位杂交并成像确定这些神经元标签基因的表达情况，通过这些脑片的先后两次成像获取冗余信息，以冗余信息为基础，实现神经元标签基因表达情况与神经元单细胞形态的配准，从而将标签基因以及标签基因所代表的该神经元细胞类型其他转录组信息，整合到神经元单细胞形态中；

所述冗余信息具体是指大脑被包埋后断层成像以及脑片原位杂交后成像，先后两次成像获取的同一神经元细胞或细胞结构的重复图像信息；这些重复信息包括荧光标记的神经元细胞形态信息、或细胞核分布密度、或细胞核形态大小信息。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光标记包括嗜神经病毒介导荧光蛋白，或者其他方式介导荧光蛋白或荧光染料，标记活体大脑目标脑区的神经元。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述断层成像是通过机械切削被包埋的大脑实现的。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述脑为哺乳动物大脑。

Images