CN110951580A - 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，包括高通量单细胞编码芯片和整合分析装置；所述整合分析装置包括壳体以及设置在所述壳体内的温控热循环模块、荧光成像模块和数据存储分析模块，所述荧光成像模块包括光源组件、显微物镜、荧光分光组件和成像探测器。本发明通过设计具有微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码功能的高通量单细胞编码芯片，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来；再通过温控热循环模块可实现PCR扩增，通过荧光成像模块采集样品的荧光图像，通过数据存储分析模块对荧光图像进行存储于分析，能实现单细胞转录组与基因突变整合分析。

Description

高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置。

背景技术

肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一，肿瘤细胞从基因型到表型上存在极大的差异(肿瘤的高度异质性)，而这种高度异质性与肿瘤的恶性程度、耐药性、复发转移等都密切相关，是造成肿瘤早期诊断困难、临床诊治复杂、耐药复发和预后差的根源之一。全面解析肿瘤异质性是实现肿瘤精准治疗的关键。

高通量测序技术的发展为解析异质性肿瘤群体带来希望。目前各种组学水平的常规高通量测序成为肿瘤异质性群体研究的常用手段，用来发现新的遗传变异或异常通路，探索新的发病或耐药机制等。然而目前基于bulk(混合群体)的常规高通量测序技术无法克服肿瘤细胞高度异质性的难题，仅能通过大样本人群研究发现关键主克隆变异及通路改变，难以实现对单个患者异质性克隆群体的全面解析，成为实现肿瘤精准治疗的瓶颈。近年来新兴的单细胞测序技术为解析肿瘤异质性、鉴别不同功能亚群提供了可能。单细胞测序能够获得每个细胞的基因组变异图谱及转录组表达图谱，通过单个细胞的图谱精确划分克隆归属，实现对异质性克隆群体的全面解析。Timothy A.Graubert团队将一例已通过全基因组测序与靶向深度测序进行全面刻画的继发白血病样本进行了单细胞基因组分型测序，仅通过12个细胞DNA测序数据即发现了之前被认为是一个亚克隆的群体其实是由两个互斥的亚克隆构成，充分说明单细胞测序的优势和其在多克隆研究中的必要性。然而早期的单细胞测序技术往往通量低，成本高，一定程度上限制了精确分析并追踪异质性群体变化的分析。2016年10x Genomics公司推出的10x Chromium Single Cell Gene ExpressionSolution平台实现了高通量的单细胞转录组测序，具有周期短、成本低、细胞捕获率高等优势，在发育生物学及肿瘤异质性群体研究中应用广泛，在转录组水平实现对异质性肿瘤群体的全面刻画。

然而对于基因组变异驱动的恶性肿瘤群体，仅从转录组水平无法实现对肿瘤群体的鉴定以及功能异质性的解析。研究者开始着眼于基于单细胞水平的多组学研究平台，10x和BD公司分别实现单细胞转录组与单细胞染色质开放性(ATAC-seq)或单细胞蛋白质组的结合。然而，对于肿瘤异质性研究中最需要的单细胞转录组与基因组信息的整合平台，目前尚无成熟技术。对此，来自不同实验室的研究者进行了大量尝试，目前大部分技术仍然依赖同时将单个细胞中的转录组与基因组进行分离而分别测序，操作繁琐且通量较小。对转录组和基因组同时测序的技术又面临扩增效率低下或等位基因扩增偏好等难题，近期新提出的Target-seq技术针对肿瘤群体设计同时检测转录组及特异基因突变的技术，也说明了肿瘤研究中对该技术的需求，但该技术仍处于实验室水平，仍然无法实现一次上千细胞数的分析。另外，Peter Van Galen等人在Cell发表文献，通过单细胞转录本与三代测序技术相结合，首次实现对白血病患者肿瘤群体(以基因组变异为金标准)中转录组异质性的解析，发现肿瘤群体存在于表达谱不同的多种谱系中，明确了基因组异质性与转录组异质性相互独立又相互影响的关系，也表明在单细胞转录组水平进一步明确细胞的基因组变异的重要性。然而，该研究中使用的三代测序检测突变的技术具有很大局限性，突变检出率受到具体突变位点的限制，单个突变检出率最高仅23％，平均可以检测到突变的细胞不超过5％，作者最终采用随机森林的机器学习算法预测肿瘤群体，无法实现对肿瘤细胞群体的直接鉴定，也没有将基因组与转录组异质性很好的对应。且该技术操作繁琐，样本需求量高，花费大，不适于全面推广。

因此，在肿瘤研究中实现单细胞水平基因组与转录组异质性的整合分析具有重要性与迫切性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，包括高通量单细胞编码芯片和整合分析装置；

所述高通量单细胞编码芯片具有用于捕获单细胞的微孔，每个所述微孔具有唯一的空间坐标编码，且所述微孔内修饰有若干条用于捕获目标RNA的核酸序列，所述核酸序列包括用于标示RNA源自的细胞的细胞标签和用于标示结合的RNA的分子标签，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应；

所述整合分析装置包括壳体以及设置在所述壳体内的温控热循环模块、荧光成像模块和数据存储分析模块，所述荧光成像模块包括光源组件、显微物镜、荧光分光组件和成像探测器；

所述温控热循环组件上设置有用于安置所述高通量单细胞编码芯片的载物热台，所述温控热循环组件用于提供PCR扩增反应所需的温度环境；

所述光源组件发出的激发光经所述荧光分光组件后，再经过所述显微物镜后到达所述温控热循环组件上的所述高通量单细胞编码芯片，其中的样品被激发产生的荧光原路返回经过所述显微物镜和荧光分光模块后，再进入所述成像探测器，进行荧光成像；

所述数据存储分析模块用于存储所述成像探测器采集的荧光图像信息，并进行单细胞转录组与基因突变整合分析。

优选的是，所述光源组件包括第一LED光源、第二LED光源、第三LED光源、第一二向色镜、第二二向色镜和扩束透镜组，

所述第一LED光源发出的光依次透射所述第一二向色镜、第二二向色镜后到达所述扩束透镜组；

所述第二LED光源发出的光经第一二向色镜反射、第二二向色镜透射后到达所述扩束透镜组；

所述第三LED光源发出的光经第二二向色镜反射后到达所述扩束透镜组；

所述第一LED光源、第二LED光源、第三LED光源发出三种不同波长的光，且三种光的波长范围覆盖400nm-700nm。

优选的是，所述荧光分光组件包括支架、可转动设置在所述支架上的旋转台、用于驱动所述旋转台转动的电机以及均匀间隔设置在所述旋转台上的若干个荧光分光模块，

所述荧光分光模块包括激发光滤光片、样品光滤光片和第四二向色镜；

所述旋转台用于将若干个所述荧光分光模块中的一个切换进入光路，所述扩束透镜组出射的激发光经过所述激发光滤光片后被所述第四二向色镜反射，然后经过所述显微物镜到达安置在所述载物热台上的高通量单细胞编码芯片上；所述高通量单细胞编码芯片中的样品产生的荧光经过所述显微物镜后透射所述第四二向色镜，再经过所述样品光滤光片后到达所述成像探测器，所述成像探测器采集的荧光图像信息传输至所述数据存储分析模块。

优选的是，所述壳体上设置有放样窗口，所述放样窗口上设置有滑盖。

优选的是，所述温控热循环组件包括温控盒体、设置在所述温控盒体内的散热器、设置在所述散热器上的帕尔贴以及设置在所述散热器侧部的风扇，所述载物热台设置在所述帕尔贴上，所述载物热台上设置有透明盖板。

优选的是，所述核酸序列还包括Spacer序列、作为PCR扩增时的引物结合区域的通用引物序列以及Ploy T。

优选的是，单个所述微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同所述微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过所述细胞标签标识RNA源自的细胞；

单个所述微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过所述分子标签标识单个细胞中的RNA。

优选的是，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。

优选的是，所述微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为10²-10⁶个；

所述微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。

优选的是，所述高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置分析步骤包括：

1)将样品加入所述高通量单细胞编码芯片中，通过其上的微孔捕获单细胞，将所述高通量单细胞编码芯片置于所述载物热台上，通过所述荧光成像模块对所述高通量单细胞编码芯片进行荧光成像，利用所述数据存储分析模块进行各个微孔位置的单细胞表面蛋白分型分析；

2)对所述高通量单细胞编码芯片的微孔中的单细胞进行原位裂解扩增，逆转录合成携带细胞标签、分子标签的cDNA，游离cDNA收集后用于单细胞转录组分析，固定在微孔内的cDNA序列用于基因突变分析；

3)启动所述温控热循环组件，针对固定在所述高通量单细胞编码芯片的微孔内的cDNA进行PCR扩增，并对目的基因的野生型和突变型进行双色荧光标记，通过所述荧光成像模块采集双色荧光图像，然后通过所述数据存储分析模块对双色荧光图像进行分析，计算各微孔位置的野生型与突变型的比例，得到单细胞的基因突变表达信息；

4)通过所述数据存储分析模块将相同位置的单细胞表面蛋白分型信息与扩增后的单细胞基因突变表达信息结合，建立单细胞表面蛋白分型与突变整合分析的数据库。

本发明的有益效果是：本发明的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，通过设计具有微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码功能的高通量单细胞编码芯片，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来；再通过温控热循环模块可实现PCR扩增，通过荧光成像模块采集样品的荧光图像，通过数据存储分析模块对荧光图像进行存储于分析，能实现单细胞表面蛋白分型与突变整合分析的数据库、高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的完整数据库的建立，实现单细胞转录组与基因突变整合分析；

本发明在明确单个细胞中携带的基因组变异信息后，结合单细胞转录组甚至蛋白表达信息，可实现对肿瘤细胞多组学的全面认识和对肿瘤异质性群体的全面刻画，为肿瘤的早期诊断、耐药机制、新靶点探索和治疗方案优化提供基础。

附图说明

图1为本发明的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置的原理框图；

图2为本发明的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置的内部结构示意图；

图3为本发明的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置的外部结构示意图；

图4为本发明的荧光分光组件的支架的结构示意图；

图5为本发明的荧光分光模块的结构示意图；

图6为本发明的荧光分光模块的剖视结构示意图；

图7为本发明的温控热循环模块的分解图；

图8为本发明的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置的光路图。

附图标记说明：

1—高通量单细胞编码芯片；2—整合分析装置；3—壳体；4—温控热循环模块；5—荧光成像模块；6—光源组件；7—显微物镜；8—荧光分光组件；9—成像探测器；30—放样窗口；31—滑盖；40—载物热台；41—温控盒体；42—散热器；43—帕尔贴；44—风扇；60—第一LED光源；61—第二LED光源；62—第三LED光源；63—第一二向色镜；64—第二二向色镜；65—扩束透镜组；70—升降台；80—支架；81—旋转台；82—电机；83—荧光分光模块；810—安装槽；830—镜片安装块；831—激发光滤光片；832—样品光滤光片；833—第四二向色镜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本实施例的一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，包括高通量单细胞编码芯片1和整合分析装置2；

高通量单细胞编码芯片1具有用于捕获单细胞的微孔，每个微孔具有唯一的空间坐标编码，且微孔内修饰有若干条用于捕获目标RNA的核酸序列，核酸序列包括用于标示RNA源自的细胞的细胞标签和用于标示结合的RNA的分子标签，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应；

整合分析装置2包括壳体3以及设置在壳体3内的温控热循环模块4、荧光成像模块5和数据存储分析模块，荧光成像模块5包括光源组件6、显微物镜7、荧光分光组件8和成像探测器9；

温控热循环组件上设置有用于安置高通量单细胞编码芯片1的载物热台40，温控热循环组件用于提供PCR扩增反应所需的温度环境；

光源组件6发出的激发光经荧光分光组件8后，再经过显微物镜7后到达温控热循环组件上的高通量单细胞编码芯片1，其中的样品被激发产生的荧光原路返回经过显微物镜7和荧光分光模块83后，再进入成像探测器9，进行荧光成像；

数据存储分析模块用于存储成像探测器9采集的荧光图像信息，并进行单细胞转录组与基因突变整合分析。

实施例1

在以上基础上，本实施例中提供一种具体的整合分析装置2。

参照图2-8，其中，光源组件6包括第一LED光源60、第二LED光源61、第三LED光源62、第一二向色镜63、第二二向色镜64和扩束透镜组65，第一LED光源60发出的光依次透射第一二向色镜63、第二二向色镜64后到达扩束透镜组65；第二LED光源61发出的光经第一二向色镜63反射、第二二向色镜64透射后到达扩束透镜组65；第三LED光源62发出的光经第二二向色镜64反射后到达扩束透镜组65；第一LED光源60、第二LED光源61、第三LED光源62发出三种不同波长的光，且三种光的波长范围覆盖400nm-700nm。

其中，荧光分光组件8包括支架80、可转动设置在支架80上的旋转台81、用于驱动旋转台81转动的电机82以及均匀间隔设置在旋转台81上的若干个荧光分光模块83，荧光分光模块83包括镜片安装块830以及设置在其中的激发光滤光片831、样品光滤光片832和第四二向色镜833；镜片安装块830上设置3个开口，底部开口供激发光和样品光直接通过，左侧开口安装激发光滤光片831，上部开口安装样品光滤光片832。

旋转台81用于将若干个荧光分光模块83中的一个切换进入光路，扩束透镜组65出射的激发光经过激发光滤光片831后被第四二向色镜833反射，然后经过显微物镜7到达安置在载物热台40上的高通量单细胞编码芯片1上；高通量单细胞编码芯片1中的样品产生的荧光经过显微物镜7后透射第四二向色镜833，再经过样品光滤光片832后到达成像探测器9，成像探测器9采集的荧光图像信息传输至数据存储分析模块。本实施例中包括5个不同的荧光分光模块83，分别设置在旋转台81上开设的5个安装槽810内，从而实现多种荧光的分光。

其中，壳体3上设置有放样窗口30，放样窗口30上设置有滑盖31。通过放样窗口30方便将高通量单细胞编码芯片1放入到载物热台40上。

其中，温控热循环组件包括温控盒体41、设置在温控盒体41内的散热器42、设置在散热器42上的帕尔贴43以及设置在散热器42侧部的风扇44，载物热台40设置在帕尔贴43上，载物热台40上设置有透明盖板，通过透明盖板密封，且不影响荧光成像。通过温控热循环组件实现PCR扩增反应过程中的温度控制。载物热台40具有很好的导热性能，帕尔贴43对载物热台40进行加热，散热器42具有多个散热鳍片，配合风扇44实现快速散热，从而实现温度升降控制。

其中，显微物镜7安装在升降台70上，可上下移动，方便调节，配合电机实现对焦功能。整个整合分析装置2可通过上位机进行集中控制。

实施例2

在上述基础上，提供一种高通量单细胞编码芯片1。

其中，芯片在其基板上设有多个微孔，每个微孔具有唯一的空间坐标编码，且微孔内修饰有若干条用于捕获目标RNA的已知的核酸序列，核酸序列包括用于标示RNA源自的细胞的细胞标签和用于标示结合的RNA的分子标签，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应。

其中，核酸序列还包括Spacer序列、作为PCR扩增时的引物结合区域的通用引物序列以及Ploy T。在进一步优选的实施例中，每个微孔内修饰的核酸序列不小于10⁶条。分子标签为一段已知的随机核酸序列。

其中，微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。在优选的实施例中，微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为10²-10⁶个。微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。

当该微孔阵列装载细胞后，针对每一个特定微孔，一个细胞就携带了该微孔空间坐标编码，这个微孔空间坐标同时对应一个已知的细胞标签(核酸序列)和一组已知的分子标签(随机序列)。装载的单细胞可以进行免疫荧光标记，通过高通量多色荧光成像获取蛋白表达信息。

其中，单个微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过细胞标签标识RNA源自的细胞；所以，在最后测序数据中可以通过细胞标签知道序列来源与哪个细胞，区分哪些序列是来自同一个细胞，哪些是来自不同的细胞。

单个微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过分子标签标识单个细胞中的RNA。分子标签标识只负责针对同一个细胞内的RNA进行标记，而不管不同细胞之间的RNA。对于单个细胞来说，通过分子标签可区别每一条RNA。所以，对于最后得到的检测数据，通过细胞标签区分不同的细胞，并且一个细胞标签对应一个唯一的微孔空间坐标编码，从而知道RNA源自的细胞以及微孔坐标位置，然后再通过分子标签区分每一条RNA。从而能将每一条RNA源自的细胞、位置坐标信息对应起来，在单细胞转录组与基因突变整合分析中，通过本发明的芯片所采用的微孔空间坐标、细胞核酸标签和分子核酸标签的三重编码技术，可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来。

当细胞在孔内原位裂解后，释放RNA被孔内的核酸序列捕获，通过碱基互补配对的方式，为检测目标标志物接上了细胞标签和分子标签。并且，通过扩增在孔壁和孔内同时形成了cDNA。针对游离的cDNA通过进行高通量测序，可以获取单细胞的转录组信息，这一组学信息会与单细胞的微孔空间坐标编码进行对应。针对固定在孔壁上的cDNA，进行原位的荧光PCR，可以获取单细胞额基因突变信息。通过这样的三重编码技术，结合本发明的分析方法，即可将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来。

在一种进一步的实施例中，上述芯片可通过以下制作工艺得到：

1)制备微孔阵列芯片：

通过MEMS技术，在硅上通过光刻和深硅刻蚀直接形成微孔，微孔可以是盲孔或通孔；

2)在微孔内修饰核酸序列，获得高通量单细胞分析芯片：

利用喷墨打印的方式，结合寡核苷酸原位化学合成方法，在微孔内合成spacer、通用引物、细胞标签序列和延伸接头；然后通过核酸扩增方法，以分子标签和PolyA为模板，将原位合成的序列延伸形成分子标签序列段，从而得到最终的核酸序列。

实施例3

提供一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，结合实施例1的整合分析装置2和实施例2的高通量单细胞编码芯片1获得。

本实施例中的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置的其分析步骤包括：

1)预先对细胞的目的基因进行荧光标记，再将样品加入高通量单细胞编码芯片1中，通过其上的微孔捕获单细胞，将高通量单细胞编码芯片1置于载物热台40上，启动光源组件6、显微物镜7、荧光分光组件8和成像探测器9，通过荧光成像模块5对高通量单细胞编码芯片1进行荧光成像，然后利用数据存储分析模块进行各个微孔位置的单细胞表面蛋白分型分析；其中，向高通量单细胞编码芯片1中加样、加试剂等操作可先将高通量单细胞编码芯片1从载物热台40上取出后加入，也可通过加样机构直接在载物热台40上进行加入操作；

2)向高通量单细胞编码芯片1再加入裂解液和扩增试剂，对高通量单细胞编码芯片1的微孔中的单细胞进行原位裂解扩增，逆转录合成携带细胞标签、分子标签的cDNA，游离cDNA收集后用于单细胞转录组分析，固定在微孔内的cDNA序列用于基因突变分析；

3)向高通量单细胞编码芯片1中加入PCR扩增试剂，启动温控热循环组件，针对固定在高通量单细胞编码芯片1的微孔内的cDNA进行PCR扩增，并对目的基因的野生型和突变型进行双色荧光标记(加入预先设计的修饰有不同荧光基团的两种引物探针，其中一种用于与野生型目的基因结合，另一种用于与突变型目的基因结合，扩增后野生型目的基因和突变型目的基因均分别带有不同的荧光分子)，通过荧光成像模块5采集双色荧光图像，然后通过数据存储分析模块对双色荧光图像进行分析，计算各微孔位置的野生型与突变型的比例，得到单细胞的基因突变表达信息；

4)通过数据存储分析模块将相同位置的单细胞表面蛋白分型信息与扩增后的单细胞基因突变表达信息结合，建立单细胞表面蛋白分型与突变整合分析的数据库。

5)针对步骤2)中收集的游离cDNA，通过基因测序分析cDNA，获取单细胞转录谱及亚型信息，由于cDNA上接上了细胞标签和分子标签，从而能获知每一条cDNA来源的细胞和微孔位置，从而将单细胞的基因突变、转录组和蛋白表达信息一一对应起来，形成高通量单细胞转录组与基因突变整合分析的完整数据库，建立多组学整合分析模型，实现单细胞转录组与基因突变整合分析。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，包括高通量单细胞编码芯片和整合分析装置；

所述高通量单细胞编码芯片具有用于捕获单细胞的微孔，每个所述微孔具有唯一的空间坐标编码，且所述微孔内修饰有若干条用于捕获目标RNA的核酸序列，所述核酸序列包括用于标示RNA源自的细胞的细胞标签和用于标示结合的RNA的分子标签，每个微孔的细胞标签与空间坐标编码一一对应；

所述整合分析装置包括壳体以及设置在所述壳体内的温控热循环模块、荧光成像模块和数据存储分析模块，所述荧光成像模块包括光源组件、显微物镜、荧光分光组件和成像探测器；

所述温控热循环组件上设置有用于安置所述高通量单细胞编码芯片的载物热台，所述温控热循环组件用于提供PCR扩增反应所需的温度环境；

所述光源组件发出的激发光经所述荧光分光组件后，再经过所述显微物镜后到达所述温控热循环组件上的所述高通量单细胞编码芯片，其中的样品被激发产生的荧光原路返回经过所述显微物镜和荧光分光模块后，再进入所述成像探测器，进行荧光成像；

所述数据存储分析模块用于存储所述成像探测器采集的荧光图像信息，并进行单细胞转录组与基因突变整合分析。

2.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述光源组件包括第一LED光源、第二LED光源、第三LED光源、第一二向色镜、第二二向色镜和扩束透镜组，

所述第一LED光源发出的光依次透射所述第一二向色镜、第二二向色镜后到达所述扩束透镜组；

所述第二LED光源发出的光经第一二向色镜反射、第二二向色镜透射后到达所述扩束透镜组；

所述第三LED光源发出的光经第二二向色镜反射后到达所述扩束透镜组；

所述第一LED光源、第二LED光源、第三LED光源发出三种不同波长的光，且三种光的波长范围覆盖400nm-700nm。

3.根据权利要求2所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述荧光分光组件包括支架、可转动设置在所述支架上的旋转台、用于驱动所述旋转台转动的电机以及均匀间隔设置在所述旋转台上的若干个荧光分光模块，

所述荧光分光模块包括激发光滤光片、样品光滤光片和第四二向色镜；

所述旋转台用于将若干个所述荧光分光模块中的一个切换进入光路，所述扩束透镜组出射的激发光经过所述激发光滤光片后被所述第四二向色镜反射，然后经过所述显微物镜到达安置在所述载物热台上的高通量单细胞编码芯片上；所述高通量单细胞编码芯片中的样品产生的荧光经过所述显微物镜后透射所述第四二向色镜，再经过所述样品光滤光片后到达所述成像探测器，所述成像探测器采集的荧光图像信息传输至所述数据存储分析模块。

4.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述壳体上设置有放样窗口，所述放样窗口上设置有滑盖。

5.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述温控热循环组件包括温控盒体、设置在所述温控盒体内的散热器、设置在所述散热器上的帕尔贴以及设置在所述散热器侧部的风扇，所述载物热台设置在所述帕尔贴上，所述载物热台上设置有透明盖板。

6.根据权利要求1所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述核酸序列还包括Spacer序列、作为PCR扩增时的引物结合区域的通用引物序列以及Ploy T。

7.根据权利要求6所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，单个所述微孔内的所有细胞标签具有相同的序列，不同所述微孔内的细胞标签的序列均不相同，从而通过所述细胞标签标识RNA源自的细胞；

单个所述微孔内的所有分子标签具有不同的序列，从而通过所述分子标签标识单个细胞中的RNA。

8.根据权利要求7所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。

9.根据权利要求8所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，所述微孔为正六边形，且呈蜂窝状排列，其数量为10²-10⁶个；

所述微孔的外接圆的直径为30-60μm，深度为20-300μm，孔间的间距为10-30μm。

10.根据权利要求7所述的高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置，其特征在于，其分析步骤包括：

1)将样品加入所述高通量单细胞编码芯片中，通过其上的微孔捕获单细胞，将所述高通量单细胞编码芯片置于所述载物热台上，通过所述荧光成像模块对所述高通量单细胞编码芯片进行荧光成像，利用所述数据存储分析模块进行各个微孔位置的单细胞表面蛋白分型分析；

2)对所述高通量单细胞编码芯片的微孔中的单细胞进行原位裂解扩增，逆转录合成携带细胞标签、分子标签的cDNA，游离cDNA收集后用于单细胞转录组分析，固定在微孔内的cDNA序列用于基因突变分析；

3)启动所述温控热循环组件，针对固定在所述高通量单细胞编码芯片的微孔内的cDNA进行PCR扩增，并对目的基因的野生型和突变型进行双色荧光标记，通过所述荧光成像模块采集双色荧光图像，然后通过所述数据存储分析模块对双色荧光图像进行分析，计算各微孔位置的野生型与突变型的比例，得到单细胞的基因突变表达信息；

4)通过所述数据存储分析模块将相同位置的单细胞表面蛋白分型信息与扩增后的单细胞基因突变表达信息结合，建立单细胞表面蛋白分型与突变整合分析的数据库。

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