CN103983578A - 一种散射光声-共焦荧光双模同时显微成像的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种散射光声-共焦荧光双模同时显微成像的方法及装置，该方法包括光声荧光激发光源经过斩波器及扫描振镜后，由显微物镜汇聚于样品上，激发散射光声信号及荧光共焦信号，分别被散射光声探测器及光电倍增管检测，经过振镜光束扫描之后可重建二维的散射光声显微图像及共焦荧光显微图像；本装置包括激光器、散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器、光电倍增管检测系统、双通道并行数据采集系统、带采集控制软件及图像重建软件的计算机、显微物镜、可调滤色装置、斩波器、二向色镜、扫描振镜。本发明散射光声-共焦双模同时显微成像装置能够实现高对比度高分辨率的散射光声及共焦图像，可广泛应用于材料检测，医学影像等领域。

Description

一种散射光声-共焦荧光双模同时显微成像的方法及装置

技术领域

本发明属于一种无损显微成像领域，特别涉及一种散射光声-共焦荧光同时显微成像的方法及装置。

背景技术

光声显微成像技术是近年来发展的一种新型无损显微成像技术，采用非电离光子，利用脉冲激光诱发-超声探测的方式进行显微成像，有效地结合了纯光学成像的高分辨率、高对比度和纯声学成像的高穿透深度的优点，可实现微米量级的成像精度及厘米量级的探测深度，具有完全非侵入性、无电离辐射、无损等突出特性，在生物医学上具有很广泛的应用前景，如：黑色素瘤的检测、微血管结构与功能成像、内窥镜技术、可视化基因表达成像、分子成像、大脑功能成像等医学成像检测领域。

目前，传统光声显微成像技术均是针对样品自身或标记物吸收所产生的光声信号的探测。然而，在微观生物细胞样品中，并非所有样品都对某一特定波长脉冲激光有热吸收，因此，为了实现对无标记弱吸收生物细胞样品光声显微成像，有必要提出一种针对弱吸收生物细胞样品的光声探测器—散射光声检测技术；充分利用收集样品的前向散射光子，诱发散射光声探测器中的吸收壁产生声信号，实现针对弱吸收强散射生物细胞样品的光声探测。

而共焦荧光显微成像技术由于其具有很高的分辨率及特有的轴向层析能力，在生物医学、生物细胞学、神经学等研究领域具有广泛的应用。它不经可以通过样品后向散射光获取无损的光学切片结构图像，还可以通过荧光标记的方法，获取样品的共焦荧光图像，从而定量定性地分析生物细胞样品的生物信息。

将以上两种技术结合在一起，可实现在细胞水平上同时对同一生物细胞样品进行散射光声-共焦荧光双模成像，互补不足，同时获取更多生物细胞更多的信息。

发明内容

为克服现有技术存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种散射光声-共焦荧光双模同时成像的方法及装置。

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种散射光声-共焦荧光双模同时成像的方法，包括以下操作步骤：

(1)激发光源1发出的连续激光经过斩波器11调制，透过二向色镜12进入扫描振镜13进行二维扫描，再由显微物镜8聚焦到样品的表面，同时激发样品产生的前向散射光子及后向散射或荧光光子。

(2)样品产生的前向散射光子由散射光声探测器收集，经探测器中的吸收腔转换为相应的散射光声信号，并经过前置放大器后，由锁相放大器进行放大处理，再输送到双通道并行数据采集系统中采集，再由计算机实现存储和重建，实现散射光声显微成像。

(3)样品产生的后向共焦散射或荧光光子由显微物镜收集，经过二向色镜后及滤色镜之后由聚光镜聚焦到针孔上，透过针孔的散射光或荧光由光电倍增管进行探测，将相应的信号输送到双通道并行采集系统中进行数据采集，再由计算机进行存储及图像重建，实现共焦荧光显微成像。

所述步骤(1)中的激发光源为连续激光器，输出波长可为400-2500nm。

所述步骤(2)中的散射光声探测器响应频率为20～3000Hz，由样品室、吸收壁、微通道、耦合腔及声传感器构造而成。

所述步骤(2)中的散射光声信号由样品的前向散射光子诱导散射光声探测器中的吸收壁所激发。

所述前向散射光声信号的输出经过前置放大器，后经过锁相放大器进行放大处理，再输送到数据采集系统中进行采集。

所述步骤(3)的共焦荧光信号由激光器所发出的激光，通过斩波器进行调制，然后通过二向色镜进入扫描振镜及显微物镜聚焦于样品上所激发。

所述的后向散射光和荧光经过振镜和二向色镜后，通过滤色片，由聚光镜聚焦于针孔上后由光电倍增管检测。

本发明还提供一种散射光声-共焦荧光双模同时显微成像的装置，该装置包括激发光源激光器、斩波器、二向色镜、二维扫描振镜、显微物镜、散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器、双通道并行采集卡、滤色镜、聚光镜、针孔及光电倍增管和带有采集控制、图像重建软件的计算机。

所述激发光激光器、斩波器、二维扫描振镜、光电倍增管、散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器、双通道并行采集卡与带有采集控制、图像重建软件的计算机依次电气相连。

所述显微物镜的为平场物镜，其放大倍数与成像质量有关，倍数越高则质量越好。最小横向分辨率可达～0.3μm。

所述二维扫描振镜为高精度闭环伺服振镜，角分辨率可达15微弧度。

所述的光声探测器，包括光源、样品室和声传感器；该样品室的四周侧壁的内壁涂覆有吸光材料层；光源设置在样品室底面一侧的外部照射样品室，该声传感器与样品室的侧壁连通。

进一步，所述的光声探测器还包括一对声波进行放大的耦合腔，该耦合腔的输入端与样品室的侧壁连通，输出端与声传感器连接。

进一步，所述的光声探测器还包括一导声通道，该导声通道的一端与样品室的侧壁连通，另一端与耦合腔的输入端连通。

进一步，所述的光声探测器的所述吸光材料层为黑色氧化铁层。

进一步，所述的光声探测器的所述声传感器为压电式声传感器，包括压电薄膜和外围电路，该压电薄膜设置在耦合腔的输出端以将声波信号转换为电压信号，该外围电路的输入端分别连接该压电薄膜的两极，并对其产生的电压信号进行放大和滤波。该压电薄膜为PVDF薄膜。

进一步，所述的光声探测器的外围电路包括依序串接的电荷放大器、带通滤波器、电压放大器以及低通滤波器。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明在同一激光光源作用下同时激发样品散射光声和共焦荧光信号，二者被散射光声探测器和光电倍增管同时接收，通过双通道并行采集系统同时采集，实现了散射光声和共焦荧光的同时双模显微成像。对比单一成像模式，该装置能同时提供样品的散射光声图像及共焦荧光图像，提供样品更多的信息参数。

(2)本发明采用的散射光声探测器，克服传统光声显微成像技术无法对弱吸收样品实现光声显微成像的缺点，实现对弱吸收样品免标记的散射光声显微成像，有效地同时利用了样品的前向散射光子及后向散射荧光光子，具有更高的检测灵敏度及更大的应用范围。

附图说明

图1是散射光声-共焦荧光双模同时显微成像装置的结构示意图。

图2是图1所示的结构中的散射光声探测器的结构示意图。

图3是图2中的外围电路的电路图。

图4为采用本发明所述的散射光声-共焦荧光双模同时显微成像装置同时得到的口腔上表皮细胞的散射光声显微图像。

图5为采用本发明所述的散射光声-共焦荧光双模同时显微成像装置中同时得到的口腔上表皮细胞的共焦显微图像。

图6为口腔上表皮细胞的普通光声显微图像。

图7为口腔上表皮细胞的光学显微图像。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

散射光声-共焦同时双模显微成像装置图如图1所示：

该装置包括了连续光激光器1、散射光声探测器2、前置放大器3、锁相放大器4、针孔及光电倍增管5、双通道并行数据采集系统6、带采集控制及图像重建软件的计算机7、显微物镜8、聚光镜9、滤色镜10、斩波器11、二向色镜12、二维扫描振镜13。其中发光激光器1、斩波器11、二维扫描振镜13、光电倍增管5、散射光声探测器2、前置放大器3、锁相放大器4、双通道并行采集卡4与带有采集控制、图像重建软件的计算机7依次电气相连。

请参阅图2，其是所述的散射光声探测器2的结构示意图。该光声探测器包括样品室214、导声通道216、耦合腔218和声传感器219，该样品室214的内壁涂覆有一高吸收系数的吸光材料层215。待检测的目标样品A设置在盖玻片213上，并被放置在样品室214底部中心处的窗口上，从显微镜8来的光源照射目标样品A后对其检测。该样品室214、导声通道216和耦合腔218依序连通，该声传感器219连接于该耦合腔218的一端，并与前置放大器3连接。该样品室214、导声通道216、耦合腔218和声传感器219设置在一基体箱内整合成一个整体。

该样品室214为封闭的腔室，其为对称结构。在本实施例中，该样品室14为圆柱体，其侧面的内壁涂覆高吸收系数的吸光材料层215，用以吸收光子产生声波。而在该样品室的上下底面不涂覆吸光材料层，以避免将未透过样品的弹道光吸收转换为声波。该吸光材料层的材料可以为：氧化铁、炭黑、松烟怠、石墨、苯胺黑、硫化苯胺黑等。在本实施例中，该吸光材料层215为黑色的氧化铁层，其厚度在0.05mm～0.3mm之间。

该导声通道216为极细的条形通道，其连通该样品腔214的侧壁和耦合腔218，采用非吸声的材料制成，使在样品腔214产生的声波沿导声通道216传导至耦合腔218。在本实施例中，该导声通道216为圆柱形通道，其孔径在0.2mm～0.5mm之间。需说明的是，该导声通道仅为传导声音的通道，不是本发明必要的结构。

该耦合腔218同样为封闭的腔室，采用非吸声的材料制成，在本实施例中，该耦合腔为圆柱形结构。该耦合腔218的体积与导声通道216的体积相匹配，根据亥姆赫兹共振原理，声波在该耦合腔218内经多次反射产生共振，使声波的振幅达到最大，从而可使声传感器219更加容易感测该声波信号。

该声传感器219包括压电薄膜2192和外围电路2194。该压电薄膜2192在本实施例中为高灵敏度的PVDF(聚偏二氟乙烯)压电薄膜，用以感应声波。在本实施例中，该压电薄膜2192与声波的振动方向垂直设置，可最大程度的感测声波。在本实施例中，该外围电路2194包括电荷放大器21942、带通滤波器21944、电压放大器21946以及低通滤波器21948。该外围电路具有输入端I1、I2以及输出端O1、O2。其中，输入端I1、I2分别连接压电薄膜的两极，输出端01、02以连接外部的图像处理装置(图未示)。耦合腔218放大的声波使该压电薄膜2192产生相应频率的振动，由于存在正向压电效应，该压电薄膜2192将机械能转换为电信号，就产生与声波频率相同的电压。然后通过外围电路2194滤波并将电压放大，最后通过图像处理装置显示图像。

具体地，请参阅图3，该电荷放大器21942包括运算放大器A1、电阻R1、电阻R2、电阻R3、电容C1以及电容C2。所述运算放大器A1的正相输入端通过电阻R1与外围电路的输入端I1串接；所述运算放大器的反相输入端与该外围电路的输入端I2电连接；所述电阻R2的两端分别与运算放大器A1的正相输入端与反向输入端电连接；所述电容C1与该电阻R2并联；所述电阻R3的两端分别与运算放大器A1的正相输入端与输出端电连接；所述电容C2与该电阻43并联。运算放大器A1的输出端作为电荷放大器的输出端。电荷放大器是一种输出电压与输入电荷量成正比的前置放大器，利用电容作反馈元件的深度负反馈的高增益运放。压电式传感器本身内阻抗很高，输出电信号很微弱，通常先把传感器信号先输入到高输入阻抗的前置放大器中，经过阻抗交换以后，方可用一般的放大检波电路再将信号输入到指示仪表或记录器中。

该带通滤波器21944包括运算放大器A2、电阻R4、电阻R5、电阻R6、电容C3以及电容C4。所述运算放大器A1的输出端依次通过电阻R4、电容C4与运算放大器A2的正相输入端串接；所述运算放大器A2的负相输入端与外围电路的输入端I2电连接；所述电阻R5两端分别与电阻R4与电容C4之间的电连接点以及外围电路的输入端I2电连接；所述电阻R6的两端分别与运算放大器A2的正相输入端以及输出端电连接；所述电容C4的两端分别与电阻R4与电容C4之间的电连接点以及运算放大器A2的输出端电连接。运算放大器A2的输出端作为带通滤波器的输出端。该带通滤波器用于过滤电信号中的中频段的信号。

该电压放大器21946包括运算放大器A3、电阻R7、电阻R8与电阻R9；运算放大器A2的输出端通过电阻R7与运算放大器A3的正相输入端串接；电阻R8的两端分别与运算放大器A3的负相输入端以及外围电路的负相输入端电连接；所述电阻R9的两端分别与运算放大器A3的正相输入端以及输出端电连接。所述运算放大器A3的输出端作为电压反大器的输出端。

该低通滤波器21948包括运算放大器A4、电阻R10、电阻R11、电阻R12、电阻R13以及电容C5。运算放大器A3的输出端依次通过电阻R10以及电阻R12与运算放大器A4的正相输入端串接；电阻R11的两端分别与电阻R10和电阻R12之间的电连接点以及外围电路的输入端I2电连接；电阻R13的两端分别与运算放大器A4的负相输入端以及外围电路的输入端I2电连接；电阻R14的两端分别与运算放大器A4的正相输入端以及输出端电连接；电容C5与电阻R14并联。运算放大器A4的输出端作为低通滤波器的输出端，同时也为外围电路的输出端O1。该低通滤波器用于过滤电信号中的低频信号。

本发明的光声探测器对强弱光吸收的目标样品均可检测，其工作原理如下：

光源产生的冲光束经过显微物镜形成聚焦光束，然后透过盖玻片会聚在目标样品A的某一点上。

当目标样品A为强光吸收的样品时，光束被目标样品A吸收，目标样品A作为吸收样品快速吸收光束能量，目标样品A内的组织受热膨胀，产生声波。由于样品室14内壁上的吸光材料层215仅对光进行吸收，因此目标样品A产生的声波在样品室214中不会受到该吸光材料层215的影响。样品A产生的声波经过导声通道216后在耦合腔218内被放大，然后通过声传感器219转换为电信号。

当目标样品A为弱光吸收或不吸收光线时，光束通过目标样品A时被散射，从而光束改变了行径的方向。不同角度的散射光携带了该目标样品A的对应位置的结构信息。光束通过目标样品A时被散射后，打在样品室14的侧壁涂覆的吸光材料层215上，吸光材料层215吸收光子后转换成对应的声波；而光束未通过目标样品A的部分直射至样品室214的上底面，由于样品室214的底面未涂覆吸光材料，因此，光束未通过目标样品A的弹道光部分不会被转换成声波。样品A散射后，经吸光材料产生的声波经过导声通道216在耦合腔218内被放大，然后通过声传感器219转换为电信号。

激发光源1发出的连续激光经过斩波器11调制，透过二向色镜12进入扫描振镜13进行二维扫描，再由显微物镜8聚焦到散射光声探测器2的样品腔214内样品的表面，同时激发样品产生的前向散射光子及后向散射或荧光光子。样品产生的前向散射光子由散射光声探测器2收集，经探测器中的吸收腔转换为相应的散射光声信号，并经过前置放大器3后，由锁相放大器4进行放大处理，再输送到双通道并行数据采集系统6中采集，再由计算机7实现存储和重建，实现散射光声显微成像。样品产生的后向共焦散射或荧光光子由显微物镜8收集，经过二向色镜12后及滤色镜10之后由聚光镜9聚焦到针孔上，透过针孔的散射光或荧光由光电倍增管5进行探测，将相应的信号输送到双通道并行采集系统6中采集，再由计算机7进行存储及图像重建，实现共焦显微成像。实验结果如图4、5、6、7所示，实验结果显示：本发明可同时获取样品更多的成像参量。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种散射光声-共焦双模同时成像方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)激发光源发出的连续激光经过斩波器调制，透过二向色镜进入扫描振镜进行二维扫描，再由显微物镜聚焦到样品的表面，同时激发样品产生的前向散射光子及后向散射或荧光光子；

(2)样品产生的前向散射光子由散射光声探测器收集，经探测器中的吸收腔转换为相应的散射光声信号，并经过前置放大器后，由锁相放大器进行放大处理，再输送到双通道并行数据采集系统中采集，再由计算机实现存储和重建，实现散射光声显微成像；

(3)样品产生的后向共焦散射或荧光光子由显微物镜收集，经过二向色镜后及滤色镜之后由聚光镜聚焦到针孔上，透过针孔的散射光或荧光由光电倍增管进行探测，将相应的信号输送到双通道并行采集系统中进行数据采集，再由计算机进行存储及图像重建，实现共焦荧光显微成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的激发光源为连续激光器，输出波长可为400～2500nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的散射光声探测器响应频率为20～3000Hz，由样品室、吸收壁、微通道、耦合腔及声传感器构造而成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的散射光声信号由样品的前向散射光子诱导散射光声探测器中的吸收壁所激发。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的共焦荧光信号由激光器所发出的激光，通过斩波器进行调制，然后通过二向色镜进入扫描振镜及显微物镜聚焦于样品上所激发。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的后向散射光和荧光经过振镜和二向色镜后，通过滤色片，由聚光镜聚焦于针孔上后由光电倍增管检测。

7.一种散射光声-共焦双模同时成像的装置，其特征在于：该装置包括散射光声显微成像系统和共焦荧光显微成像系统；

所述的散射光声显微成像系统包括顺序连接的激光器、斩波器、二维扫描振镜、显微物镜、散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器、双通道数据采集系统及计算机；

所述的共焦荧光显微成像系统包括顺序连接的激光器、二向色镜、二维扫描振镜、显微物镜、荧光滤色片、聚光镜，针孔及光电倍增光探测器、双通道数据采集卡及计算机；

所述激发光激光器、斩波器、二维扫描振镜、光电倍增管、散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器、双通道并行采集卡与带有采集控制、图像重建软件的计算机依次电气相连。

8.根据权利要求7所述的一种散射光声-共焦双模同时成像的装置，其特征在于：所述的散射光声探测器，包括光源、样品室和声传感器；该样品室的四周侧壁的内壁涂覆有吸光材料层；光源设置在样品室底面一侧的外部照射样品室，该声传感器与样品室的侧壁连通。

9.根据权利要求8所述的一种散射光声-共焦双模同时成像的装置，其特征在于：所述的散射光声探测器，还包括一对声波进行放大的耦合腔，该耦合腔的输入端与样品室的侧壁连通，输出端与声传感器连接；所述的散射光声探测器，还包括一导声通道，该导声通道的一端与样品室的侧壁连通，另一端与耦合腔的输入端连通；所述声传感器为压电式声传感器，包括压电薄膜和外围电路。

10.根据权利要求9所述的一种散射光声-共焦双模同时成像的装置，其特征在于：该压电薄膜设置在耦合腔的输出端以将声波信号转换为电压信号，该外围电路的输入端分别连接该压电薄膜的两极，并对其产生的电压信号进行放大和滤波；所述的外围电路包括依序串接的电荷放大器、带通滤波器、电压放大器以及低通滤波器。