CN113959947A - 基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置及方法，其中，装置包括：光片发生单元，所述光片发生单元将激光光束均匀激发在样本控制单元均匀流动的待测样本，待测样本的二维光散射图像和荧光图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元进行数据分析；所述方法可实现单颗粒尺寸鉴别、荧光分析和粒子计数。所述多模态流式成像检测装置及方法可同时采集单个颗粒的二维光散射图像与荧光图像，实现颗粒尺寸识别，并可确定混合颗粒中荧光与非荧光颗粒的数量及其比例关系。

Description

基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置及方法

技术领域

本发明涉及光学仪器成像技术领域，特别是涉及基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置及方法。

背景技术

本部分的陈述仅仅是提到了与本发明相关的背景技术，并不必然构成现有技术。

近年来,随着研究技术的进步,对各种疾病的诊断、检测以及机理研究不断深入,在单个分子、颗粒以及细胞层面统计分析目标物的物理、化学特性及生物学效应已成为趋势。然而传统的分析方法主要从宏观层面考察复杂体系中的大量颗粒的整体或平均行为，忽略了整体平均下的局部差异以及个体的行为，这些个体行为间的差异性，在许多生理过程和化学反应过程中发挥着至关重要的作用。在生物医学领域，某些疾病的发生发展也使得研究者将目光更多地转向单个细胞、亚细胞层甚至分子层面，如基因突变和蛋白质的错误折叠等。因此,实现对个体差异性的分析,在单分子、单颗粒层面研究分子、颗粒的动力学特征,对诸多生物、物理学过程的揭示和疾病的高灵敏检测具有重要的指导意义。

细胞外囊泡(EVs)是细胞主动释放的一种具有脂质双分子层结构的囊泡，根据其大小以及生物物理特性的不同，可分为外泌体(30nm–200nm)、微囊泡(200nm–2000nm)、凋亡小体(500nm–2000nm)。最初细胞外囊泡被认为是细胞碎片，因而其价值遭到低估。但随着研究的深入，现在细胞外囊泡越来越被认为是细胞间通讯、疾病诊断和愈后循环生物标志物的重要载体。尽管EVs极具临床应用潜力，但由于缺乏灵敏的单细胞外囊泡分析技术，其在临床转化上仍存在困难。

光散射技术作为一种无标记方法在单细胞检测领域扮演重要角色。通过探测颗粒的一维光散射强度，可实现对颗粒的尺寸鉴别。二维光散射可以同时反映光强度在方位角和极角两个方向上的分布，获取包括细胞亚结构、折射率等更丰富的信息。研究表明二维光散射技术可用于区分识别宫颈癌细胞、衰老细胞等。利用二维光散射技术也可识别不同尺寸的微米颗粒，还可以和其他技术诸如机器学习等相结合，进行更大规模的细胞或微粒识别。

自20世纪以来，荧光显微成像技术飞速发展，其空间分辨率高，可用来定位细胞中的特定分子，观察活细胞内的一系列动态过程。荧光成像技术通常和其他的成像模态相结合，一个典型的例子就是流式细胞仪。传统的流式细胞仪除了测量颗粒的前向或侧向散射，往往还集成了荧光通道以检测特定的荧光探针发出的荧光。但传统细胞仪通常需要使用各种荧光试剂或染料对细胞进行复杂的染色标记，操作过程繁琐复杂，可能会对细胞的结构和功能产生一定的损害，而且无法获得关于单个细胞的诸如细胞形态及内含物等更多的信息。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置及方法；可同时采集单个颗粒的二维光散射图像与荧光图像，实现颗粒尺寸识别与荧光特异性检测，并可确定混合颗粒中荧光与非荧光颗粒的数量及其比例关系。

第一方面，本发明提供了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置；

基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，包括：

光片发生单元，所述光片发生单元将激光光束均匀激发在样本控制单元均匀流动的待测样本，待测样本的二维光散射图像和荧光图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元进行数据分析，实现尺寸鉴别、荧光分析和粒子计数。

第二方面，本发明提供了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法；

基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，包括：

启动光片发生单元中的激光器，激光器发射圆柱状光束，经过柱面透镜调制光束宽度，然后经过第一物镜进一步聚焦，产生照明光片；

照明光片激发样本流动腔室内悬液中的待测样本，来自单个颗粒的散射光分布于三维空间，调整第二物镜与待测样本之间的距离，随后移除带通滤光片，检测两个CMOS成像数据，使得两个CMOS探测器呈现单个微粒的二维光散射图样且成像视野相同；

第二物镜采集设定角度范围内的散射光和荧光，通过二向色镜将散射光与荧光分开，分开后的散射光由第一CMOS探测器采集，记录该样本的二维光散射图样；再加入带通滤光片，分开后的荧光通过带通滤光片再一次滤除散射光的干扰，得到纯净的荧光，纯净的荧光由第二个CMOS探测器采集，记录该样本的荧光图像；

将两个CMOS探测器捕获的二维光散射图样与荧光图像，输入至成像分析单元，进行图像处理和样本识别及计数。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用光片照明技术作为激发方式均匀激发单个微颗粒，在获取样本低背景噪声的二维光散射图样的同时还可进行多通道荧光成像，可对单个微米以及亚微米级别的颗粒进行快速尺寸鉴定以及荧光与非荧光计数检测。

(2)本发明采用二维光散射图样有效区分不同尺寸亚微米颗粒，为在衍射极限尺寸附近的亚微米颗粒分析提供了一种新的有效途径和方法；

(3)本发明装置可对单个亚微米及微米颗粒进行二维光散射与荧光双通道成像，相比传统流式细胞仪中探测一维光强信号的方法能够获取更多信息量；

(4)本发明采用光片照明方式作为激发光源，提供高质量的激发光片限制激发区域，避免了同时激发其他样本颗粒引起干扰，提供较好的成像信噪比，并且在样本静止和流动状态下都可成像，可检测单一或混合样本，满足不同检测需求；

(5)本发明采集装置具备二维光散射和荧光两个工作模式，可单独工作或同时工作。可以同时捕获单个细胞的二维光散射图样和荧光图像，有助于建立颗粒结构等物理性质与特异性荧光标记性质的对应关系，两个通道的成像有很好的对应。既能对单个颗粒进行无标记二维光散射图样分析又能对特异性荧光标记进行分析，弥补了二维光散射与荧光各自的不足，扩展了应用范围；

(6)本发明适用于微米与亚微米级别颗粒的成像识别与计数，具备普遍推广性。

附图说明

如下包括构成本发明的一部分的说明书附图，用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明装置的结构和原理示意图；

图2(a)-图2(d)为本发明实例提供的单颗粒多模态流式成像检测装置校正结果图；

图3(a)-图3(b)为本发明实例提供的微米级不同粒径聚苯乙烯微球的二维光散射图样和荧光图像；

图4(a)-图4(f)为微米级不同粒径聚苯乙烯微球二维光散射图样的实验和模拟结果；

图5为实验得出的微米级不同粒径聚苯乙烯微球浓度与个数比，并与标准值比较的结果；

图6(a)-图6(d)为本发明实例提供的亚微米级不同粒径聚苯乙烯微球二维光散射图样的实验和模拟结果。

其中，1、激光器，2、柱面透镜，3、第一物镜，4、样本流动腔室，5、注射器，6、第二物镜，7、二向色镜，8、第一CMOS探测器，9、带通滤光片，10、第二CMOS探测器，11、计算机终端。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本实施例所有数据的获取都在符合法律法规和用户同意的基础上，对数据的合法应用。

实施例一

本实施例提供了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置；

如图1所示，基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，包括：

光片发生单元，所述光片发生单元将激光光束均匀激发在样本控制单元均匀流动的待测样本，待测样本的二维光散射图像和荧光图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元进行数据分析，实现尺寸鉴别、荧光分析和粒子计数。

所述光片发生单元，包括：依次连接的激光器1、柱面透镜2以及第一物镜3；激光器发射圆柱状光束，经过柱面透镜调制光束宽度，然后经过第一物镜进一步聚焦，产生微米级厚度的照明光片。

激光器发射圆柱状光束，投射到柱面透镜，柱面透镜在一维方向上压缩光束宽度，形成厚度为几十微米的照明光片，再经过第一物镜进一步聚焦。

激光器可选二极管半导体固体激光器及多线激光器，其中二极管半导体固体激光器可发射波长是532nm的激光光束，多线激光器可选择457、488、514nm波段，在本实施例中选择多线激光器的488nm波段与半导体激光器532nm波段作为激发光源。柱面透镜用于压缩光束，装置中选用焦距为150mm的柱面透镜，并经过10倍物镜进一步聚焦压缩。

所述样本控制单元，包括：样本流动腔室4，所述样本流动腔室内设有待测样本，所述样本流动腔室通过材质为PVC、截面为圆形且内径为3mm的第一细软管与注射器5出口连接，所述注射器的活塞柄与注射泵连接，所述注射器向样本流动腔室内注射液体。所述样本流动腔室通过第二细软管与废液杯连接。其中，样本流动腔室为横截面为方形的玻璃管。样本控制单元用于在流式状态下使样本流动稳定并可调节流速。

样本控制单元包括利用细软管、截面为方形的内边长为1mm、壁厚0.2mm的毛细玻璃管和注射器自制的流动腔室和带动样本在腔室中均匀流动的注射泵，在静态和流动状态下均可成像。

所述图像采集单元，包括：第二物镜6，所述第二物镜与二向色镜7连接，所述二向色镜通过第一CMOS探测器8与成像分析单元连接，所述二向色镜还通过带通滤光片9与第二CMOS探测器10连接，所述第二CMOS探测器与成像分析单元连接。

所述二向色镜，采用505nm短通二向色镜。

所述带通滤光片，采用580/10nm带通滤光片。

所述图像采集单元，具有二维光散射成像和荧光成像两种工作模式，样本被激发后，通过第二物镜捕获分布于空间的散射光和荧光，再经过二向色镜将二维散射光和荧光分开。

在二维光散射成像光路下，被捕获的散射光投射到第一CMOS探测器平面，第一CMOS探测器记录该样本的二维光散射图像。

在荧光成像光路下，捕获的荧光透过带通滤光片，进一步滤除荧光中混合的散射光，最后由第二CMOS探测器记录样本的荧光图像。

图像采集单元捕获样本的二维光散射图样和荧光图像，并传送到成像分析单元进行图像处理和数据分析。

所述成像分析单元，为计算机终端11。

所述成像分析单元包括Mie光散射模型模拟模块和不同模态图像对应分析模块。所述Mie光散射模型模拟模块，根据Mie光散射理论模型和数值计算方法，计算单个微球垂直与平行散射面的散射强度，从而可模拟单个微球的二维光散射条纹的数量与空间分布规律。所述不同模态图像对应分析模块，将二维光散射通道与荧光通道采集到的视频结果拆分为图像帧，将散射通道获取的单个微球的二维光散射实验结果与Mie光散射模型模拟图样进行对比，可区分不同尺寸的微球。对于相同尺寸的微球，即确定该尺寸下此微球为荧光微球或非荧光微球，进一步对比相应编号的荧光图像帧，如果荧光图像上显示清晰的荧光点，则该微球为荧光微球，反之为非荧光微球。从两个通道的结果中选取连续时间编号对应的若干图像帧，数出流过的微球个数，可以算出微球之间的个数比，与原始浓度进行对比。

实施例二

本实施例提供了基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法；

基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，包括：

S201：启动光片发生单元中的激光器，激光器发射圆柱状光束，经过柱面透镜调制光束宽度，然后经过第一物镜进一步聚焦，产生照明光片；

S202：照明光片激发样本流动腔室内悬液中的待测样本，来自单个颗粒的散射光分布于三维空间，调整第二物镜与待测样本之间的距离，随后移除带通滤光片，检测两个CMOS成像数据，使得两个CMOS探测器呈现单个微粒的二维光散射图样且成像视野相同；

S203：第二物镜采集设定角度范围内的散射光和荧光，通过二向色镜将散射光与荧光分开，分开后的散射光由第一CMOS探测器采集，记录该样本的二维光散射图样；再加入带通滤光片，分开后的荧光通过带通滤光片再一次滤除散射光的干扰，得到纯净的荧光，纯净的荧光由第二个CMOS探测器采集，记录该样本的荧光图像；

S204：将两个CMOS探测器捕获的二维光散射图样与荧光图像，输入至成像分析单元，进行图像处理和样本识别及计数。

进一步地，所述方法中，S201步骤之前还包括：

S2001：选用截面为方形的毛细玻璃管作为样本流动腔室；毛细玻璃管一端通过细软管连接注射器，另一端通过细软管导入废液杯，承接废液。

进一步地，所述方法中，S201步骤之前还包括：

S2002：配置同种样本悬液并等比例混合得到混合样本悬液。用注射器吸取混合样本导入样本流动腔室中，并将玻璃管放平固定在样本架上，保证没有外力作用时，样本处于稳定静止状态。

进一步地，所述S2002中，可对静止状态的样本进行单模态或多模态成像，样本可以是单一种类粒子也可以是两种及以上混合。也可连接启动注射泵，在样本均匀流动状态下进行成像，可获得样本中各颗粒数量及比例信息，满足不同的测试需求。

进一步地，所述S201：启动光片发生单元中的激光器；具体包括：

确保激光光束依次通过光片发生单元中柱面透镜和第一物镜的光轴，保持光束水平传播，水平调整柱面透镜和物镜位置，使照明光片的束腰位置穿过样本流动腔室中心，达到耦合效果。光片厚度的大小取决于光束投射到柱面透镜的有效数值孔径大小。

进一步地，所述S202：照明光片激发样本流动腔室内悬液中的待测样本，具体包括：照明光片从样本流动腔室侧面照明样本悬液，从而激发悬液中的待测样本。注射器及注射泵可调节样本流动速度，形成均匀流动稳定液流。

进一步地，所述S203：样本被激光光片激发后，分布于三维空间的散射光及荧光被第二物镜检测和收集，二向色镜将散射光与荧光分开，其中散射光直接透过而荧光被反射。第一CMOS探测器捕获二维光散射图样并记录，而荧光通过带通滤光片进一步滤除残留的散射光，得到更纯净的荧光，被第二CMOS探测器捕获。

进一步地，所述S204：将两个CMOS探测器捕获的二维光散射图样与荧光图像，输入至成像分析单元，进行图像处理和样本识别及计数；具体包括：

采用Mie散射模拟结果图样与单个颗粒的二维光散射图样进行对比，可区分识别混合颗粒中的不同种类颗粒，如不同尺寸与不同内容物颗粒。除此之外，荧光通道提供了同时检测颗粒荧光的能力，通过图像中有无荧光点进一步确定颗粒种类特性。

本发明采用的光片照明对样本溶液进行激发，能够有效限制激发区域，在成像中减少背景噪声干扰。二维光散射成像可提供待测样本极角和方位角两个角度范围上的信息，获得比一维光散射更加丰富的信息，并可同时进行荧光成像，精确定位颗粒，实现对单颗粒的多模态成像，对混合颗粒实现识别和计数。

物镜对准待测样本聚焦，然后缓慢调节使物镜在远离待测样本一定距离工作，直到CMOS探测器接收到清晰的单个颗粒二维光散射图像和荧光图像，该距离定义为正向去焦距离。在本发明中，去焦距离为200μm。第二物镜在对应的角度范围内收集该样本的二维散射光和荧光，经过二向色镜将其分开。

在二维光散射成像光路下，被捕获的散射光投射到CMOS探测器平面，探测器记录该样本的二维光散射图像。

在荧光成像光路下，捕获的荧光透过带通滤光片，进一步滤除荧光中混合的激发光与散射光，随后调整第二个CMOS探测器使荧光图像呈现聚焦状态，最后由CMOS探测器记录样本的荧光图像。

成像分析单元包括Mie光散射模型模拟以及不同模态图像对应分析。根据Mie光散射理论模型和数值计算方法，编写MATLAB模块代码计算单个微球垂直与平行散射面的散射强度，从而可模拟单个微球的二维光散射条纹的数量与空间分布规律。该段代码块只需要修改入射光波长、不同探测物镜对应的散射采集角度以及单个微球的直径即可实现对不同激发光下不同尺寸的单个微球二维光散射图样模拟。流式状态下，将两个CMOS探测器记录的视频拆分成图像帧。

以混合样本(3.87μm非荧光微球、2μm非荧光微球和2μm荧光微球)为例：将散射通道获取的单个微球的二维光散射实验结果与Mie光散射模型模拟图样进行对比，可区分3.87μm与2μm微球。

要确定此2μm微球为荧光微球还是非荧光微球，进一步查看相对应编号的荧光图像帧，如果荧光图像上显示清晰的荧光点，则该微球为2μm荧光微球，反之为2μm非荧光微球。

选取连续时间的若干图像帧，数出流过的微球个数，由光散射通道的实验结果可得3.87μm微球与2μm微球个数(2μm荧光与2μm非荧光个数之和)，荧光通道可得2μm荧光微球个数，故2μm非荧光微球的个数可由散射通道中2μm微球个数减去2μm荧光微球个数算出。

进一步可以算出三种微球之间的个数比，与原始浓度进行对比。

实施例三

使用单颗粒多模态流式成像检测装置及方法，实现对微米级单颗粒双通道二维光散射与荧光同时成像，采用标准微球对实验装置进行校准。在光散射成像中，为降低成像过程中的背景噪声，并同时保证待测样本受到均匀照明，本发明采用光片激发，限制激发区域，避免来自于其他样本散射光的干扰。本实例中暂时移除荧光成像光路中的带通滤光片，即两个通道采集到的都是二维光散射，保证两个通道的成像区域相同，方便后续不同模态成像时两个模态的图像能够在时间和空间上对应。

具体操作步骤包括：

(1)分别配置3.87μm微球悬液、2μm微球悬液及2μm荧光微球悬液，将三种悬液按设定比例充分混合摇匀得到混合样本，并将其导入构建好的样本流动腔室中；

(2)打开激光器，校准光路，使激光光束依次通过光学元件包括柱面透镜和物镜的光轴，使光束在水平方向上进行压缩，调整柱面透镜位置，使照明光片束腰位置处于探测物镜中心；

(3)移除带通滤光片，调节探测物镜位置慢慢远离待测样本，直到两个CMOS探测器捕捉到清晰的颗粒二维光散射图样，并且图样的空间位置分布能够对应；

(4)同时触发两个CMOS探测器记录图像，结果如图2(a)、图2(b)、图2(c)及图2(d)所示，其中图2(a)与图2(b)分别为两个CMOS同时拍摄的一组图像，图2(c)及图2(d)为另一组。可知两个探测器的成像区域大致相同，并且采集到的图像成镜像对称关系。

实施例四

为了验证本发明对于微米水平颗粒尺寸鉴别的灵敏度和准确性，使用聚苯乙烯标准微球进行实验验证。本发明中选用三种不同的标准微球(3.87μm、2μm及2μm荧光微球)混合作为成像样品，通过CMOS探测器记录样本流动状态下的视频，获得其二维散射图像以及荧光图像，根据图像对应关系可对混合样本的粒子进行识别。本发明中所选用的探测物镜是数值孔径为0.25的10倍物镜，其对应的可探测角度范围是79°-101°。

具体操作步骤：

(1)配置三种聚苯乙烯微球原液，用超纯水进行稀释，利用血细胞计数板确定各单一悬液浓度；

(2)然后将三种悬液等比例混合，并将混合微球悬液导入样本微腔室；

(3)打开激光器，调整光片发生单元装置，使激光光束保持水平并在光学元件的中心光轴上，形成的光片与目标微球处在同一高度上，并且光片束腰位置保持在物镜视野中心；

(4)将样本流动腔室固定在样本架上，调节探测物镜，确定视场中的成像目标。在荧光成像光路中加入带通滤光片，滤除多余的散射光(488nm)，只允许荧光(575nm)通过。微调探测物镜与第二CMOS，使二维光散射图样正向去焦200μm，荧光图像处在聚焦状态；

(5)打开注射泵，设置流速为400μL/min，等待一段时间直至样本形成稳定均匀流动液流；

(6)同时触发CMOS探测器，记录视频，采集颗粒的二维光散射图像与荧光图像；

(7)根据Mie光散射理论模型，利用MATLAB模拟微球的二维光散射结果。模拟条件为光源波长488nm，微球折射率1.59，微球所处溶液介质折射率1.334，散射极角和方位角的角度范围是79°-101°；

(8)将采集到的视频拆分成图像帧，两个视频图像总帧数大致相同，误差在十帧以内(手动触发与结束CMOS产生的时间误差)。将光散射通道获取的单个微球二维光散射实验结果与上一步所得的模拟结果进行对比，可区分3.87μm微球与2μm微球(2μm荧光微球或2μm非荧光微球)，再查看对应编号的荧光图像帧，可进一步识别该微球是2μm荧光微球还是2μm非荧光微球。选取对应的若干连续帧，数出流过的微球个数，由光散射通道的实验结果可得3.87μm微球与2μm微球个数(2μm荧光与2μm非荧光个数之和)，荧光通道可得2μm荧光微球个数，故2μm非荧光微球的个数可由散射通道中2μm微球个数减去2μm荧光微球个数算出。进一步可以算出三种微球之间的个数比，与血细胞计数板测得的原始浓度比值进行对比。

本实例的实验结果如图3(a)-图3(b)所示。图3(a)与图3(b)为两段视频中抽取的对应图像帧，其中图3(a)为二维光散射图像，图3(b)为荧光图像。从图3(a)中可以看出，不同小球的二维光散射图样在条纹数量和分布上呈现明显差异性，3.87μm微球的光散射图样出现4条明条纹，2μm微球中出现2条明条纹，因此，可以通过判断光散射图样的条纹数量直接把3.87μm微球与其他两种区分出来，而2μm荧光微球和非荧光微球不能通过二维光散射图样进行区分。又因为图3(b)的荧光图像与图3(a)的二维光散射图像具有镜像对称关系且图3(b)的荧光图像上有一个荧光点，所以可判定在图3(a)中，中间的小球是2μm非荧光微球而靠近边缘的与之条纹数相同的是2μm荧光微球。图4(d)～图4(f)是利用MATLAB代码根据Mie模型模拟的两种小球的光散射图样结果，该结果与图4(a)～图4(c)的实验结果呈现比较一致的散射条纹分布。步骤(1)中血细胞计数板测得3.87μm微球悬液、2μm微球悬液以及2μm荧光微球悬液的浓度分别为9x 10⁵个/mL，6.6x 10⁵个/mL和2.2x 10⁵个/mL，因此相互之间的浓度比为4.1：3：1。本实例中从两段视频结果中选取中间连续40s的对应视频进行粒子计数，得出该时间段内流过样本腔成像区域内的3.87μm微球、2μm非荧光微球和2μm荧光微球的个数分别是266、187和68，个数比为3.9：2.75：1。图5显示了三种不同微球之间的个数与浓度比值，其中①代表的柱状图值为实验所得的粒子相互之间的个数比，②代表的柱状图值为血细胞计数版测得的粒子相互之间的标准浓度比，实验结果与标准值比较一致。本实例证明了本发明用于微米分辨率颗粒尺寸鉴别及计数的可行性以及准确性。

实施例五

使用单颗粒多模态流式检测装置及方法，对亚微米级颗粒进行识别。本实例中对直径为250nm和510nm颗粒进行二维光散射图样采集，并将实验结果与Mie模拟的结果进行对比分析。本发明中所选用的激光器激发波长为532nm，选用的探测物镜是数值孔径为0.65的40倍物镜，其对应的可探测角度范围是60.8°-119.2°。

具体实现：

(1)配置250nm和510nm聚苯乙烯微球原液，用超纯水进行稀释，将微球悬液导入样本微腔室，并固定样本流动腔室于样本架上。

(2)启动光片照明装置，在去焦200μm模式下，分别获得两类微球的二维光散射图样。

(3)为了降低背景噪声的影响，对图片经过滤波处理、强度归一化。

(4)根据Mie光散射理论模型，模拟亚微米颗粒的二维光散射图样并与实验结果图样进行对比。

本实例的图6(a)和图6(b)为250nm微球二维光散射图样实验结果与模拟结果，可以看出实验结果与模拟结果基本吻合，250nm微球的光强度在60.8°-119.2°的极角范围内随着极角增大，光强度逐渐减小。图6(c)和图6(d)为510nm微球二维光散射图样实验结果与模拟结果，510nm微球的光强度在60.8°-119.2°的极角范围内随着极角增大，光强度先增大后减小，由此可通过该方法区分250nm与510nm微颗粒。本实例证明了本发明用于亚微米分辨率颗粒尺寸鉴别的可行性以及准确性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，包括：

光片发生单元，所述光片发生单元将激光光束均匀激发在样本控制单元均匀流动的待测样本，待测样本的二维光散射图像和荧光图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元进行数据分析，实现尺寸鉴别、荧光分析和粒子计数。

2.如权利要求1所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，所述光片发生单元，包括：依次连接的激光器、柱面透镜以及第一物镜；激光器发射圆柱状光束，经过柱面透镜调制光束宽度，然后经过第一物镜进一步聚焦，产生微米级厚度的照明光片。

3.如权利要求1所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，所述样本控制单元，包括：样本流动腔室，所述样本流动腔室内设有待测样本，所述样本流动腔室通过第一细软管与注射器出口连接，所述注射器的活塞柄与注射泵连接，所述注射器向样本流动腔室内注射液体；所述样本流动腔室通过第二细软管与废液杯连接。

4.如权利要求1所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，所述图像采集单元，包括：第二物镜，所述第二物镜与二向色镜连接，所述二向色镜通过第一CMOS探测器与成像分析单元连接，所述二向色镜还通过带通滤光片与第二CMOS探测器连接，所述第二CMOS探测器与成像分析单元连接。

5.如权利要求1所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，所述图像采集单元，具有二维光散射成像和荧光成像两种工作模式，样本被激发后，通过第二物镜捕获分布于空间的散射光和荧光，再经过二向色镜将二维散射光和荧光分开；

在二维光散射成像光路下，被捕获的散射光投射到第一CMOS探测器平面，第一CMOS探测器记录该样本的二维光散射图像；

在荧光成像光路下，捕获的荧光透过带通滤光片，进一步滤除荧光中混合的散射光，最后由第二CMOS探测器记录样本的荧光图像。

6.如权利要求1所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测装置，其特征是，所述成像分析单元，包括Mie光散射模型模拟模块和不同模态图像对应分析模块；所述Mie光散射模型模拟模块，根据Mie光散射理论模型，实现对微粒的二维光散射模拟；所述不同模态图像对应分析模块，将采集到的视频结果拆分为图像帧，根据颗粒的二维光散射图像和荧光图像的对应关系，确定颗粒的种类及其尺寸，并实现颗粒计数。

7.基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，其特征是，包括：

启动光片发生单元中的激光器，激光器发射圆柱状光束，经过柱面透镜调制光束宽度，然后经过第一物镜进一步聚焦，产生照明光片；

照明光片激发样本流动腔室内悬液中的待测样本，来自单个颗粒的散射光分布于三维空间，调整第二物镜与待测样本之间的距离，随后移除带通滤光片，检测两个CMOS成像数据，使得两个CMOS探测器呈现单个微粒的二维光散射图样且成像视野相同；

第二物镜采集设定角度范围内的散射光和荧光，通过二向色镜将散射光与荧光分开，分开后的散射光由第一CMOS探测器采集，记录该样本的二维光散射图样；再加入带通滤光片，分开后的荧光通过带通滤光片再一次滤除散射光的干扰，得到纯净的荧光，纯净的荧光由第二个CMOS探测器采集，记录该样本的荧光图像；

将两个CMOS探测器捕获的二维光散射图样与荧光图像，输入至成像分析单元，进行图像处理和样本识别及计数。

8.如权利要求7所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，其特征是，所述方法，还包括：

选用截面为方形的毛细玻璃管作为样本流动腔室；毛细玻璃管一端通过细软管连接注射器，另一端通过细软管导入废液杯，承接废液。

9.如权利要求7所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，其特征是，所述方法中，还包括：

配置同种样本悬液并等比例混合得到混合样本悬液；用注射器吸取混合样本导入样本流动腔室中，并将玻璃管放平固定在样本架上，保证没有外力作用时，样本处于稳定静止状态。

10.如权利要求7所述的基于二维光散射的单颗粒多模态流式成像检测方法，其特征是，启动光片发生单元中的激光器；具体包括：

确保激光光束依次通过光片发生单元中柱面透镜和第一物镜的光轴，保持光束水平传播，水平调整柱面透镜和物镜位置，使照明光片的束腰位置穿过样本流动腔室中心，达到耦合。

Images