CN102507508B - 检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法，系统有由富集后细胞组成的样品流，储存样品流的样品流室，储存鞘流液体的鞘流管，与样品流相交的相干激发光束，测量被激发的细胞射出的具有中心散射角度的相干散射光束的散射光接受物镜部分，分光及滤波部分，成像测量及数据输出部分，图像处理电路及计算机部分以及显示部分；方法是：将获得血液或淋巴样品制成富集后细胞悬浮液；产生相干散射光信号；获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据并传输到计算机内的图像存储处理单元中；提取图像模式特征；确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；显示及输出相应统计分析数据。本发明可对大量细胞进行快速准确的分类，达到检测肿瘤细胞的目的。

Description

检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法

技术领域

本发明涉及检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析方法，特别是涉及一种通过流动方式测量存在于病人外周血样和其他细胞样品中的肿瘤细胞相干散射光所形成的波长及偏振可调的衍射图像信号，计算提取其与细胞内部三维结构特征高度相关的图像特征，可自动快速准确辩别肿瘤细胞并提供其分布数据的检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法。

背景技术

研究人员发现源于人体上皮组织的恶性实体肿瘤是最为普遍的癌症，如肺癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌和结肠直肠癌等。恶性实体肿瘤在原位发育过程中会生成自有的微血管系统，肿瘤细胞可直接或通过微血管进入血液循环系统，称为循环肿瘤细胞(circulating tumorcells或CTCs)。循环肿瘤细胞可随血细胞一起进入身体的淋巴结及其他器官，一旦生长条件合适，循环肿瘤细胞会在所寄居的器官组织中形成转移瘤后不断增殖，以此为标志开始肿瘤转移扩散期。目前大量临床研究已证明癌症病人外周血样中的循环肿瘤细胞的数量与肿瘤转移扩散程度直接相关，其数量与类型测定可作为肿瘤分期与治疗效果的生物学依据。所以如能在肿瘤转移扩散形成之前发现并定量测量外周血样中的循环肿瘤细胞，可实现癌症的早期检查；还可为制定个体化癌症治疗方案与治疗过程中调整治疗剂量提供可靠的生物学依据。除外周血样外，其他细胞样品如取自恶性肿瘤附近的淋巴结的针吸细胞等也可能包括肿瘤细胞，其检测与计数可为癌症早期诊断和治疗提供可靠的病理依据。

目前癌症诊断检查方法一般基于影像学方法，如x光计算断层影像、超声影像、核磁共振影像和正电子发射断层影像等。影像方法则只能检测尺寸在2毫米以上的肿瘤，难以早期发现肿瘤的转移或复发，一般无法确诊。病理细胞分析检查是最为常用的癌症确诊方法，但病理检查一般需要经过专业训练的病理医生进行，成本高且易受主观因素影响。与病理检查与影像方法相比，循环肿瘤细胞检测可成为一种用于癌症早期诊断的高灵敏度方法，并可提供转移癌准确分期依据，为癌症病人治疗方案的制定提供生物学监测数据，因此近年来对外周血样中循环肿瘤细胞以及其他血样中的肿瘤细胞测量的方法研究受到了极大重视。目前尚未见到有关淋巴结的针吸细胞自动检测仪器的研究报道。

尽管肿瘤细胞的测量可成为癌症早期诊断和治疗监测的有效方法，但由于人体外周血样中的循环肿瘤细胞的数量极小，其准确测定难度极大。在取自早期转移癌病人的体积为7.5毫升的外周血样中，各种血细胞如血小板、红细胞和白细胞等的数量级一般为100亿或10¹⁰个，而循环肿瘤细胞可能只有几到十几个。尽管如此，由于绝大多数血细胞的体积、密度和/或其他特性与循环肿瘤细胞相比有较大差别，所以实现在外周血样中检测循环肿瘤细胞是可能的，但如何能够在血样中众多的血液细胞及碎片中快速可靠地检测数量极少的循环肿瘤细胞并对其分类是一个困难的技术问题。

目前外周血样中循环肿瘤细胞的测量方法通常由两阶段组成：富集和检测。富集阶段一般采用传统的细胞分类方法将外周血样中的绝大多数血细胞去掉，如使用具有不同大小和形状微孔的薄膜过滤，或在密度梯度介质中离心分离等。检测阶段目前一般使用免疫荧光显微检测或免疫荧光流式仪方法，通过残余血细胞与循环肿瘤细胞之间对不同荧光试剂吸附特性检测后者。例如现在最常用的临床方法为美国Veridex公司生产的CellSearch系统，使用镀有可与循环肿瘤细胞结合的免疫磁性纳米球，基于循环肿瘤细胞对纳米磁球的吸附对其进行离心分离富集，然后再对富集后的细胞进行免疫荧光染色显微检测。尽管该方法可对外周血样中的循环肿瘤细胞进行定量测量并具有提供与目前方法相比更为准确的预后评估指标，但其手续繁复，测量成本高而且灵敏度低，应用范围有限，因此亟待改进。

如上所述循环肿瘤细胞一般为上皮细胞。与血小板(平均线性尺寸约为2至4微米)、红细胞(平均线性尺寸约为5至7微米)、白细胞(平均线性尺寸约为8至14微米)相比，上皮细胞体积较大(平均线性尺寸约为12至20微米)。但与血样中存在的少量其他循环细胞如单核细胞及分化后的巨嗜细胞等相比，上皮细胞体积并不大。更为重要的判据应该在于上皮细胞内部的三维结构与血细胞内部的三维结构差别，因此显微检测循环肿瘤细胞的关键在于识别不同种类细胞的结构形态之间的差别。但显微检测基于对细胞三维结构的非衍射二维投影图像，由于细胞结构的复杂性，自动识别易于出错，一般需要人工复检，相应的的缺点为检测速度低且成本高。荧光流式仪检测循环肿瘤细胞的方法具有速度高和可检测细胞体积的优点，但无法测量细胞内部结构特征。

细胞功能和与外界的相互作用与其三维结构形态紧密关联。因此通过检测细胞三维结构形态特征与差异是分析辨别细胞的最佳方法之一。例如光学显微镜是人类用于观察细胞结构形态最早也是目前最常用的仪器之一。但由于下述原因，使用光学显微方法识别细胞的方法具有局限性，很难用于对包含极小量循环肿瘤细胞的富集后的血样进行快速分析辨别。第一，常用的光学显微镜(如荧光显微镜，明视场或暗视场显微镜等)是基于非衍射成像原理设计的，其图像是通过对细胞三维结构的二维投影而形成，利用这种图像所测的细胞结构特征为结构二维投影特征，无法真实反映细胞的三维结构形态与特征。第二，由于显微图像是对细胞三维结构的二维投影，据此图像分析辨别细胞通常需要非常复杂的图像分析方法，在分析具有复杂三维结构形态的细胞时更是如此，一般需要人工分析，因而基于光学显微镜的图像分析方法很难自动化，而且相关的光学显微镜操作与图像测量也需人工操作，费时，易产生误差且分析速度极低。第三，免疫荧光染色往往需要昂贵的试剂和复杂费时的工序。近年来，光学显微镜技术取得了新进展，例如使用共聚焦技术，可获取多幅景深很短的二维图像，通过二维图像叠加重建细胞的三维结构形态。但共聚焦光学显微镜技术只解决了上述第一个问题，通常需要更长的图像数据测量和分析时间，而其他问题依然未解决。

上世纪六十年代以来对以细胞为代表的细胞在层流快速流动状态下进行光学测量的研究基础之上，流式细胞仪成为一种集流体力学，激光技术，光电测量以及数据处理研究成果之大成的可对大量单个细胞进行快速测量分析的仪器。流式细胞仪利用同心喷嘴和液体压强差在样品室内形成由样品流和鞘流组成的层流。环包在样品流外的鞘流通过压强差减小含有细胞的样品流直径，迫使细胞以单列方式流动通过激发光束，被激发光束照射的细胞会产生与激发光波长相同的散射光，其强度随散射角度变化而变化。这种波长与激发光波长相等的散射光也称为弹性散射光，是由于细胞内部的被激发光束电磁场感应而形成的分子电偶极子产生的辐射。细胞内部的感应分子电偶极子浓度分布由其内部的光折射率分布表达，因此细胞内部三维结构可通过其光折射率三维分布表达。如细胞内部的光折射率三维分布不均匀或与其所悬浮的载体材料光折射率不同，散射光即存在，并且通常是细胞被光照的条件下所产生的各种光信号中最强的信号。被激发光束照射的细胞如含有荧光分子还会产生其波长大于激发光波长的荧光，荧光是由于细胞内部的荧光分子被激发后产生的辐射光。许多包括细胞在内的细胞不含或含有很少的荧光分子，所以这些细胞只有在染色后才可产生足够强度荧光信号。流式细胞仪通过测量染色后细胞产生的荧光以及散射光信号，可对细胞进行快速分析辨别，其处理速度可达每秒数千个细胞。与光学显微分析方法相比，在分析包含大量细胞的群落及统计分布有其独特的优势。自上世纪八十年代以来，流式细胞仪在细胞生物学研究，污染监测和其他领域领域内得到广泛应用。

目前流式细胞仪产品可按其光学信号测量方式分为角度积分型与非相干图像型两种，绝大多数现有流式细胞仪为角度积分型。在这种流式细胞仪中，流动细胞在入射光束照射下产生的散射光信号和荧光信号由不同的单体光电传感器(如光电二极管，光电倍增管等)接受而产生相应的输出电信号。单体传感器为只输出1个电信号的传感器，其信号强度正比于散射光或荧光信号强度在传感器面积相对于光源所形成的立体角度内的积分值，简称为散射光或荧光信号。荧光信号与细胞内部包含的特定分子(如细胞中的可与荧光分子结合的某种蛋白质分子)存在与否以及数量有关，而角度积分后的散射光信号则只与细胞体积和内部光折射率均匀度即颗粒度有关，与光折射率分布不同，颗粒度为光折射率分布的角度积分值。将散射光和荧光信号结合，通过计算机进行数据分析，可对包含大量细胞的群落进行自动分析辨别，达到将群落中的细胞进行快速种类区分的目的。目前角度积分型流式细胞仪通常可测量2到10个荧光信号以及2个散射光信号。荧光信号不包含结构信息，虽然2个散射光信号(前向与侧向散射光信号)可提供体积和内部颗粒度的信息，但其结构信息含量极其有限，因而角度积分型流式细胞仪主要依靠荧光信号对细胞进行快速分析辨别。

近年来图像测量技术开始在流式细胞仪得到应用，形成非相干图像型流式细胞仪。这种流式细胞仪基于传统的光学显微镜方法，利用如电荷耦合器件(CCD)相机等图像传感器测量非相干光信号在空间的角度分布，可输出荧光，明视场和暗视场等图像数据，但各种图像均为细胞三维结构的二维投影。与角度积分型流式细胞仪相比，非相干图像型流式细胞仪可对每个流动细胞测量并输出多幅图像，其包含的结构信息显然大为增加，因此可对细胞结构进行更细致的分析。但与传统的光学显微镜方法相同，利用非相干光信号成像的图像型流式细胞仪具有类似的局限性，如无法根据细胞三维结构位形态特征分析辨别细胞，需要对细胞染色才能获得荧光图像等。更为重要的是，由于二维投影图像与三维结构之间的关系非常复杂，通常需要人工分析，因此很难实现通过计算机软件对包含大量细胞的群落进行自动图像数据分析，无法达到将群落中的细胞进行快速种类区分的目的。由于图像信号型流式细胞仪可以每秒测量几百至上千个细胞，其图像信号数据总量非常大，如无法实现自动图像信号分析，其应用受到极大的限制。

如前所述，在激发光束照射下的细胞会产生散射光，其波长与激发光波长相同。如果激发光束为一具有高度相干性的光束，在波长相等的条件下散射光也具有高度相干性。含有荧光分子的细胞也会同时产生荧光，其波长与激发光束波长不同，不具有相干性。如使用具有高度相干性的激光束作为激发光束，细胞内部的感应分子电偶极子产生的具有高度相干性的散射光电磁场会在空间内形成由于相位差造成的光强度随角度变化的衍射分布，相干散射光的衍射分布及偏振态由激发光束波长与偏振态以及细胞内部的光折射率与其悬浮介质折射率差的三维分布决定，因此相干散射光强的衍射分布及偏振态与细胞内部三维结构形态高度相关，也与激发光束波长及偏振态有关。利用图像传感器测量相干散射光的衍射分布即为衍射图像。通过多幅衍射图像计算分析细胞三维结构特征，可获得细胞三维结构形态或相关之信息。这种方法的最早应用为可见光波长范围内的激光全息成像技术以及在X光波长范围内推算生物大分子三维结构的X射线衍射技术。一般情况下，推算细胞三维结构需要在不同激发光束入射角度下获得足够多幅(5至10幅或更多)衍射图像后再做复杂的三维结构重建计算。在细胞流式仪中由于细胞快速流动，很难同时得到足够多幅不同角度的衍射图像数据，即使能够获得足够多幅的图像，也不可能在数秒或更短时间内完成三维重建计算。此外细胞在层流液体内流动经过入射光束时，其附近会存在曲率半径极小的光学界面，包括鞘流与流体室材料如玻璃等的折射率不同造成的界面等。这些曲率半径极小的光学界面通常会引起成为图像噪音的散射光场，一般可大于或远大于细胞所产生的衍射光强分布，使得所测量到的衍射图像与细胞结构有关的信号对比度很小。获得高质量的与细胞结构有关的光学衍射图像需要减小或消除由于这些光学界面所产生的图像噪音，是一个很难解决的技术问题。此外如何利用所获得的衍射图像数据，得到与细胞三维结构特征高度相关的信息并据此快速分析包含大量细胞的群落并分类，也是一个技术难题。由于这些问题，尽管目前商用流式细胞仪大多使用激光束作为激发光束，但均无法通过测量与分析衍射图像的方式辨别细胞。在角度积分型流式细胞仪中，其所测得的散射光信号为角度积分，因此由于散射光相干性造成的随角度变化的衍射分布在经过角度积分后的信号中基本消失，所得到的结构特征只包括体积和内部颗粒度类的简单特征；而在非相干图像信号型流式细胞仪中，其荧光图像由于荧光波长相对于激发光束波长的变化为非相干图像，而明视场或暗视场图像则一般是在非相干白光照射条件下获得的，也属于非相干图像。

最近在对包括细胞在内的细胞光散射的理论和实验多年研究基础之上，一种新型衍射图像型流式细胞仪方法已经公布，详细讨论可见参考文献(例如X.H.Hu，K.M.Jacobs，J.Q.Lu.“Flow cytometer apparatus for three dimensional diffraction imaging and relatedmethods”，PCT Application No.WO 2009/151610by East Carolina University)。这种新型衍射图像型流式细胞仪提出了将层流置于主要由液体形成的流体室的设计概念，使用如电荷耦合器件相机等图像传感器纪录细胞所产生相干散射光的角度分布，可获得高对比度的衍射图像信号。实验结果表明这种新型衍射图像信号型流式细胞仪可根据细胞衍射图像信号分析辨别具有不同三维结构的细胞，详细讨论可见参考文献(例如K.M.Jacobs，L.V.Yang，J.Ding，A.E.Ekpenyong，R.Castellone，J.Q.Lu，X.H.Hu，“Diffraction imaging ofspheres and melanoma cells with a microscope objective”，Journal of Biophotonics，vol.2，pp.52l-527(2009)；K.M..Jacobs，.J.Q.Lu，X.H.Hu，“Development of adiffraction imaging flow cytometer”，Optics Letters，vol.34，pp.2985-2987(2009))。通过基于经典电动力学理论的细胞光散射模型和大规模数值计算，现已证明由衍射图像型流式细胞仪所获得的细胞二维衍射图像与其三维结构高度相关，可以从中提取与细胞三维结构特征相关的许多特征，详细讨论可见参考文献(例如J.Q.Lu，P.Yang，X.H.Hu，“Simulations of Light scattering from a biconcave red blood cell using the FDTDmethod”，Journal of Biomedical Optics，vol.10，024022(2005)；R.S.Brock，X.H.Hu，D.A.Weidner，J.R.Mourant，J.Q.Lu，″Effect of detai led cell structure on lightscattering distribution：FDTD study of a B-cell with 3D structure constructed fromconfocal images″，Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer，vol.102，pp.25-36(2006)；K.Dong，Y.Feng，K.M.Jacobs，J.Q.Lu，R.S.Brock，L.V.Yang，F.E.Bertrand，M.A.Farwell，X.H.Hu，“Label-free classification of cultured cellsthrough diffraction imaging”，Biomedical Optics Express，vol.2，pp.1717-1726(2011))。此外一种可自动辨别细胞的衍射图像测量分析系统及方法已经公布，根据此方法可通过获取不同波长及偏振衍射图像数据并提取其图像模式参数矢量，基于特征参数矢量与细胞内部三维结构特征之间的高度关联快速分析辨别大量细胞的类别(例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种可在使用常规方法如薄膜过滤或离心分离富集后的血样如外周细胞或淋巴结的针吸细胞等样品中准确快速地检测肿瘤细胞的检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法。

本发明所采用的技术方案是：一种检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法。检测肿瘤细胞的流动测量系统，包括有由富集后细胞组成的样品流，储存包括细胞在内的样品流的样品流室，储存鞘流液体的鞘流管，与样品流相交的相干激发光束，测量被相干激发光束所激发的细胞射出的具有第一中心散射角度的相干散射光束的第一散射光接受物镜部分，第一分光及滤波部分，第一成像测量及数据输出部分，图像处理电路及计算机部分以及与图像处理电路及计算机部分相连的显示部分；样品流室沿轴向贯穿鞘流管，所述的样品流室的顶端设置有样品流室排气管，所述的样品流室在位于鞘流管上方部分的一侧设置有样品流入管，所述的样品流入管的另一端通过三通阀分别连接样品流压液入口和样品悬浮液入口，所述的样品流室的底端形成样品流喷嘴；所述的鞘流管用于减小样品流直径，鞘流管的一侧设置有鞘流压液流入管，鞘流管的底部形成为开口状态的鞘流管出口；样品流喷嘴和样品流出口与鞘流管出口共同构成复合喷嘴，所述的复合喷嘴用于形成由样品流和鞘流组成的层流，使得样品流与鞘流在流出喷嘴后形成层流；所述的第一分光及滤波部分用于对所接收的微粒发射的散射光进行分光和滤波；所述的第一成像测量及数据输出部分用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得由相干散射光束形成的衍射图像；所述的图像处理电路及计算机部分用于接收数据输出部分的输出信息，提取不同波长及偏振衍射图像数据特征并计算、分析和辨别；所述的显示部分是将计算、分析和辨别结果的统计数据进行显示与输出，

所述的样品流室排气管上设置有第一二通阀。

所述的鞘流压液流入管上设置有第三二通阀。

所述的复合喷嘴内的样品流喷嘴伸出鞘流管出口。

所述的复合喷嘴内的样品流喷嘴的内直径为20微米至2000微米。

用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，包括有如下步骤：

第一步骤：获得血液或淋巴样品后，去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统输出的样品流压液和鞘流压液作用下，经过复合喷嘴形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中，供下一步骤图像分析用；

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据。

步骤一所述的平均线性尺寸的设定阈值在5至15微米之间。

步骤一所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些平均线性尺寸小于设定阈值的细胞，是采用过滤、离心分离或微流器件的方法进行。

步骤五所述的提取图像模式特征，包括有根据灰度共生矩阵算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他种类细胞的图像模式特征。

一种用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的肿瘤多次监测分析方法，包括有如下步骤：

第一步骤：将按预定的监测方案多次获得的肿瘤患者的外周血样品，每次分别去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统输出的样品流压液和鞘流压液作用下，经过复合喷嘴形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中供下一步骤图像分析用；

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据；

第八步骤：将步骤七得到的统计分析数据与之前该肿瘤患者的外周血样品的统计分析数据进行对比，得到肿瘤细胞的响应变化结果。

步骤一所述的平均线性尺寸的设定阈值在5至15微米之间。

步骤一所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些平均线性尺寸小于设定阈值的细胞，是采用过滤、离心分离或微流器件的方法进行。

步骤五所述的提取图像模式特征，包括有根据灰度共生矩阵算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他种类细胞的图像模式特征。

本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法，在对外周血样或其他细胞样品富集后制成悬浮液并注入至样品流室内，使用流体控制系统和复合喷嘴在流体室内或流体通道形成由样品流与鞘流组成的层流，在相干激发光束照射条件下，测量由流动细胞所产生的相干散射光所形成的不同波长与偏振衍射图像数据，快速分析提取衍射图像模式特征参数，组成与细胞内部三维结构特征高度相关的特征参数矢量，据此对所测细胞进行自动快速分类。本发明具有可根据所测细胞内部三维结构特征分析辨别细胞以及无需对细胞染色的优点，可对大量细胞进行快速准确的分类，达到检测肿瘤细胞的目的。

附图说明

图1是本发明所使用的衍射成像系统结构示意图；

图2是本发明所使用的样品流室与复合喷嘴结构示意图；

图3是根据本发明所测量的不同类培养细胞的衍射图像效果图；

其中：

图3A是一个肺癌细胞株A549细胞的衍射图；

图3B是另一个肺癌细胞株A549细胞的衍射图；

图3C是一个乳癌细胞株MCF-7细胞的衍射图；

图3D另一个乳癌细胞株MCF-7细胞的衍射图；

图3E是一个白血细胞株K562细胞的衍射图；

图3F是另一个白血细胞株K562细胞的衍射图；

图4是本发明检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法的流程图。

其中：

1：富集后细胞                            2：样品流

3：相干激发光束                          4：相干散射光束

5：显微物镜                              6：分光片

7：透射窄带滤光片                    8：透射偏振滤光片

9：透射聚焦透镜                      10：透射分光散射光

11：透射图像传感器                   12：透射数据输出输入端口

13：透射图像传感器电源               14：透射图像处理电路及计算机

15：反射窄带滤光片                   16：反射偏振滤光片

17：反射聚焦透镜                     18：反射分光散射光

19：反射图像传感器                   20：反射数据输出输入端口

21：反射图像传感器电源               22：反射图像处理电路及计算机

23：第一中心散射角度                 24：相干散射光束

25：显微目镜                         26：分光片

27：窄带滤光片                       28：偏振滤光片

29：聚焦透镜                         30：散射光

31：图像传感器                       32：数据输出输入端口

35：窄带滤光片                       36：偏振滤光片

37：聚焦透镜                         38：散射光

39：图像传感器                       40：数据输出输入端口

43：第二中心散射角度                 A：第一散射光接受物镜部分

B：第一分光及滤波部分                C：第一成像测量及数据输出部分

D：图像处理电路及计算机部分          A′：第二散射光接受物镜部分

B′：第二分光及滤波部分              C′：第二成像测量及数据输出部分

51：样品流室排气管                   52：第一二通阀

53：鞘流管排气管                     54：第二二通阀

55：样品流压液入口                   56：三通阀

57：样品悬浮液入口                   58：样品流入管

60：样品流室                         61：鞘流管

62：鞘流管出口                       63：样品流喷嘴

64：样品流喷嘴出口                   65：鞘流压液入口

66：第三二通阀                       67：鞘流压液流入管

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法做出详细说明。

本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统及分析和监测方法，利用可调节成像系统测量不同波长及偏振的衍射图像，然后通过计算机软件快速分析多幅衍射图像模式统计参数矢量并根据这些参数矢量与细胞类别分辨判据对大量细胞进行快速分类，达到检测肿瘤细胞的目的。本发明所描述的方法还可以通过其他的光学系统，方法和计算机软件实现。具体方法为将从待诊或治疗的病人提取的外周血样或淋巴结针吸细胞样品，使用过滤或离心分离方法去掉血样中的线性尺寸小于某一阈值如10微米以下的小细胞如血小板、红细胞和大多数白细胞等和细胞碎片；将富集后的细胞用适当的稀释液制成悬浮液后吸入样品流室内，使细胞可在测量时间内保持其结构完整性；样品流室内的细胞悬浮液在一具有适当压强的液体推动下，由一具有内外喷腔的复合喷嘴的内腔作为样品流喷出，另一具有适当压强的液体则从复合喷嘴的外腔作为鞘流喷出；在合适的压强差条件下，样品流与鞘流在流体室或流体通道内形成稳定的层流，以保证样品流内的细胞以单列方式和适当速度条件下经过与层流也即样品流相交的相干激发光束；相干激发光束可由多个不同波长的激光束组成；在相干光束激发下的细胞所产生的相干散射光在空间形成与细胞内部三维结构高度相关的特征分布，使用衍射成像测量系统获得不同波长及偏振衍射图像数据；通过分析提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数，对所测量的过滤后的血样细胞根据其内部三维结构特征进行分类，并输出显示血样细胞内不同类型细胞的类别和数目以及其不同波长及偏振衍射图像模式特征参数数据。其中，

所述的细胞富集可通过现有的梯度介质离心或薄膜过滤方法进行，例如用一种新型热塑性塑料聚对二甲苯制作的具有以点阵排列微孔的过滤薄膜(见例如美国专利US7846393B2)，可在去除血样中小的血细胞和细胞碎片等杂质粒子后获得富集细胞；也可采用离心分离方法将血样置于离心试管内的梯度介质(如Pharmacia公司出售的商品名为Ficoll-Paque的梯度介质)之上后放于离心机内，以适当的转速旋转30至40分钟后，即可见到具有不同质量密度的不同类细胞分布于梯度介质内不同层次，使用吸管将所需的一类或多类细胞自离心试管内取出后作为富集细胞；此外也可使用微流器件方法去除小细胞和细胞碎片后制成富集细胞；

所述的细胞悬浮液可在使用PBS缓冲液将富集后的细胞多次冲洗，然后使用细胞培养液细胞营养液或平衡盐溶液按所需要的浓度配置细胞悬浮液，然后通过流体控制系统的悬浮液入口吸入至与复合喷嘴内腔相通的样品流室内；

所述的复合喷嘴可由两个或多个同心管组成，其中的内管可由样品室及与其相通的样品喷嘴组成，样品室的一端与流体控制系统的样品流压液通道相连接，在样品流压液的推动下样品室内的细胞悬浮液通过样品喷嘴流出形成样品流，复合喷嘴的外管为鞘流管，与流体控制系统的鞘流压液通道相连接，鞘流压液自鞘流管出口流出后形成鞘流，在适当的样品流压液与鞘流压液压强差条件下样品流和鞘流形成层流，层流内的样品流可在鞘流的压迫下减小其直径，称为流体动力学聚焦，使得样品流内的细胞以单列方式和适当速度通过激发光束；此外，复合喷嘴的鞘流管可由多个同心管组成，利用多个鞘流之间的压强差形成更强和/或更稳定的流体动力学聚焦；

所述的相干激发光束可由多个激光束组成，与普通光不同，每个激光束单一波长，其内的光子或光束子波的位相相同或相关，因此具有高度的相干性或较长的相干长度，由多个激光束组成的激发光束可在各自的波长上独立激发细胞内的分子，使其在各个激发波长上产生各自独立的相干散射光；

所述的衍射成像测量系统可由显微物镜、分光及滤光部分、聚焦透镜、图像传感器和数据输出输入端口组成；其中显微物镜可在某一立体角度范围内接受被相干激发光束所激发的细胞射出的相干散射光束；分光及滤波部分包括有可将显微物镜接受的相干散射光分为两束的分光片，接收从分光片透射出的散射光的且依次设置的第一窄带滤光片和第一偏振滤光片，以及接收从分光片反射出的散射光的且依次设置的第二窄带滤光片和第二偏振滤光片，分光及滤波部分还可包括光强衰减片；经过分光与滤波部分后的相干散射光由图像传感器接受，其光强的空间变化以不同波长及偏振衍射图像数据的方式经过数据输出输入端口输出至衍射图像处理电路及计算机部分；

所述的图像分析、细胞分类与细胞分类数据显示输出由图像处理电路及计算机部分完成；其图像处理电路可接收由图像传感器数据输出输入端口输出的原始衍射图像数据，在对原始图像数据进行压缩处理后通过数据线输出至计算机；计算机内的图像处理软件可分析不同波长及偏振衍射图像数据并提取模式特征，然后根据与所测量细胞内部三维结构特征高度相关的衍射图像模式特征参数，对所测量细胞进行分类；计算机还可输出并显示所测细胞内不同类型细胞的类别和数目以及其不同波长及偏振衍射图像模式特征参数数据。

本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统可用于检测外周血样或淋巴针吸样品中的肿瘤细胞，作为癌症早期诊断的细胞学依据。本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统还可用于多次监测癌症病人的肿瘤在治疗过程中的响应。例如在数周或更长时间的肿瘤放射或化疗治疗中及时掌握患者肿瘤的响应，适应性地调整治疗方案，进而实现个性化治疗，取得最佳疗效或延长患者生存质量。细胞病理学研究表明，在肿瘤放射治疗或化疗初期，肿瘤细胞核结构不清，核染色质结构不均匀，为粗细不等的不规则颗粒状。随着治疗进程的延续，出现核肿胀、核浆造明、核染色质位于核膜下等，细胞核呈″牛眼样″或称″铁丝圈″样，核膜明显增厚。极度时核染色质凝集，核膜扭曲，核结构不清。呈″木炭样″，或核肿大且形态不规则，出现单核或多核的瘤巨细胞。这些细胞内部三维结构的变化可使用本发明的流动测量系统通过对外周血样中的肿瘤细胞和白细胞测量而获得，根据所测细胞数量与内部三维结构的改变程度可定量判断患者的肿瘤对治疗是否已经产生响应及响应程度，医生可据此及时调整治疗方案(如调整放射或化疗药物剂量、放疗计划、改变分次设计，或者采用放化疗综合治疗等)以期达到最佳治疗效果。

如图1所示，本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统，包括有检测肿瘤细胞的流动测量装置，还设置有用于向检测肿瘤细胞的流动测量装置提供提纯后细胞1的样品室。

所述的检测肿瘤细胞的流动测量装置，包括有含有富集后细胞1的样品流2，还设置有与样品流2相交的相干激发光束3、被相干激发光束3所激发的细胞产生的相干散射光可设置多个衍射成像系统完成测量，例如由细胞产生的具有第一中心散射角度23的相干散射光束4可由包括显微物镜5的第一衍射成像散系统测量，还可以设置有包括显微物镜25的第二衍射成像系统，用于测量被相干激发光束3所激发的细胞产生的具有第二中心散射角度43的相干散射光束24，再经过相应的滤光部分和成像装置部分形成四幅衍射图像数据输出。

两个衍射成像系统可通过选用不同窄带滤光片7、15、27、35测量不同波长的衍射图像；还可通过调节两个衍射成像系统相对于相干激发光束传播方向的角度在不同散射角度范围内测量由被测细胞产生的衍射图像，如由显微物镜5收集的相干散射光束4的立体角度范围由显微物镜5的数值孔径决定，在该角度范围内的光强随散射角度的变化即形成衍射图像，第一中心散射角度23可用来标志该散射光角度范围的中心角度位置。被测相干散射光束4的立体角度范围可在0至π球面度，中心散射角度可在5至180度之间；而由显微物镜25收集的相干散射光束24的立体角度范围则由显微物镜25的数值孔径决定，第二中心散射角度43可用来标志该散射光角度范围的中心角度位置。被测相干散射光束24的立体角度范围可在0至π球面度，中心散射角度可在5至180度之间。第一与第二衍射成像系统可采用相同结构，下面以第一衍射成像系统为例叙述其组成结构。

从被相干激发光束照射的细胞所产生的相干散射光束4的立体角度范围可在0至π球面度；所述的第一散射光接受物镜部分A是由多个透镜依次排列组成的具有适当数值孔径及工作距离的显微物镜5构成。其设计制作需满足不同立体角度内通过衍射图像测量散射光分布的要求。

图1所示的分光及滤波部分B用于对所被相干激发光束3所激发的细胞发射的散射光进行分光和滤波，所述的分光及滤波部分B包括有分光片6，接收分光片6透射光的且依次设置的透射窄带滤光片7和透射偏振滤光片8，以及接收分光片6反射光的且依次设置的反射窄带滤光片15和反射偏振滤光片16。所述的透射偏振滤光片8和反射偏振滤光片16的后面还可以设置有光强衰减片，可根据图像传感器光强数据自动调整进入传感器的光强，避免传感器过载饱和。

分光与及滤波部分可根据不同光路设计获得，因此，所述的分光及滤波部分B还可以是：包括有偏振分光片和接收从偏振分光片所射出的不同方向散射光的透射窄带滤波片7和反射窄带滤光片15，以及位于透射窄带滤波片7后面的透射偏振滤光片8和位于反射窄带滤光片15后面的反射偏振滤光片16；或者所述的分光及滤波部分B是由偏振窄带分光片组成，或是由分光片与棱镜或衍射光栅组成。

一般窄带滤光片的光学波长带宽为0.5纳米到50纳米之间，带宽中心波长可调，只有波长位于带宽之内的光波才能在较小衰减的条件下通过。偏振滤光片只允许处于某种偏振状态的光波在较小衰减的条件下通过，例如水平线偏振状态或左旋偏振状态等等。由于透射滤光部分与反射滤光部分的带宽中心波长与偏振可分别独立调整，这样可按照不同的细胞分析要求获得不同波长与偏振的衍射图像后由透射数据输出输入端口12与反射数据输出输入端口20分别输出至图像处理电路。

所述的第一成像测量及数据输出部分C用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得由不同角度范围的散射光所形成的衍射图像。所述的第一成像测量及数据输出部分C包括有分别对分光及滤波部分B所输出的透射与反射光进行聚焦的透射聚焦透镜9和反射聚焦透镜17，位于透射聚焦透镜9后面的透射图像传感器11和位于反射聚焦透镜17后面的反射图像传感器19，以及连接在透射图像传感器11后提供数据输出输入通道的透射数据输出输入端口12和连接在反射图像传感器19后的反射数据输出输入端口20；所述的透射数据输出输入端口12和反射数据输出输入端口20结构完全相同，作为信号通道提供图像传感器工作所需的偏置电压以及图像传感器冷却电源的电源电压，提供图像传感器控制信号并提供传感器输出模拟脉冲数据信号的时序信号，并提供传感器模拟脉冲数据信号数字化后输出的数据信号。其中图像传感器将散射光随空间角度分布转换为衍射图像数据并根据控制信号输出相应的模拟脉冲数据信号。数字化后的衍射图像素灰度值可选为8位到16位；一般情况下像素灰度值位数越高，图像信号测量的动态范围就越大，但需要存储的数据量也大。

所述的图像处理电路及计算机部分D用于接收数据输出部分C的输出数据，计算与提取不同波长及偏振衍射图像模式特征并辨别细胞。包括有分别向透射图像传感器11和反射图像传感器19提供偏置电压及电源电压的透射图像传感器电源13和反射图像传感器电源21，分别通过透射数据输出输入端口12和反射数据输出输入端口20接收图像信号的透射图像处理电路及计算机14和反射图像处理电路及计算机22。

其中，所述的透射图像处理电路及计算机14和反射图像处理电路及计算机22结构完全相同，所述计算机部分为两个不同的计算机，也可为同一计算机；图像处理电路及计算机可对所接收的图像信号进行存储处理以及计算，提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据。

所述的透射图像处理电路及计算机14和反射图像处理电路及计算机22，有可通过图像信号传输线接收图像信号并对所接收的图像信号进行存储处理的图像处理电路，产生图像传感器控制信号及时序信号的电路，以及与图像处理电路相连对所接收的图像进行计算提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据的计算机。所述的计算机显示部分是将分析、计算和辨别结果的统计数据进行显示。

图像处理电路可将输入的图像信号存储于电路内部存储器或电子计算机的存储器内，图像处理电路也可包括可对存储的图像信号进行特定数学运算。

本发明所述的透射图像传感器11和反射图像传感器19均可采用CCD相机，本实施例所使用的CCD相机的型号是：MegaPlus ES2093，厂家：Princeton Instruments。两个CCD相机分别通过透射数据输出端口12和反射数据输出端口20输出的信号可由插在计算机内的帧接收器插板接收并存储后再转入计算机内存储器。帧接收器的型号是：PIXCI E4，厂家：EPIX，Inc。

如图2所示，所述的样品流室和复合喷嘴包括有鞘流管61和轴向贯穿鞘流管61的样品流室60，所述的鞘流管61的顶端设置有鞘流管排气管53，所述的鞘流管排气管53上设置有第二二通阀54，所述的鞘流管61一侧设置有鞘流压液流入管67，所述的鞘流压液流入管67的另一端通过第三二通阀66连接鞘流压液入口65。所述的鞘流管61的底部形成为开口状态的鞘流管出口62，所述的样品流室60的顶端设置有样品流室排气管51，所述的样品流室排气管51上设置有第一二通阀52。所述的样品流室60在位于鞘流管61上方部分的一侧设置有样品流入管58，所述的样品流入管58的另一端通过三通阀分别连接样品流压液入口55和样品悬浮液入口57，所述样品流室60的底端形成有样品流喷嘴63，该样品流喷嘴63伸出鞘流管出口62，并与鞘流管出口62共同构成复合喷嘴，使得样品流与鞘流在流出喷嘴后形成流体动力学聚焦条件下的层流。

首先将鞘流压液通过鞘流压液入口65和压液流入管67在开通第三二通阀66后注入鞘流管61内并形成向下流动的鞘流，在注入鞘流液的同时可开通二通阀54使用鞘流管排气管53排除鞘流管61内的气体，在注满鞘流管61后关闭排气管53。然后使用三通阀56开通样品悬浮液入口57将富集后的细胞悬浮液吸入样品流室60，在吸入样品悬浮液的同时可开通样品流室排气管51排除样品流室60内的气体。在完成注入样品悬浮液和形成稳定的鞘流后，可使用三通阀56开通样品流压液入口55，使得样品流室60内的样品悬浮液在样品压液的推动下经过样品流喷嘴63的通道自其样品流喷嘴出口64流出，与自鞘流管出口62流出的鞘流形成层流，并在与复合喷嘴相连的流体室内或流体通道(图中未示)内完成流体动力学聚焦，使得样品流2内的富集后细胞1成单列流动经过可包含多束激光的相干激发光束3。

如图3所示，利用本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统，检测肿瘤细胞可以得到不同培养细胞的衍射图像，其中图3A和图3B为自两个不同的人体非小细胞肺癌细胞株A549细胞所测量的衍射图像，图3C和图3D为自两个不同的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞所测量的衍射图像，图3E和图3F则为自两个不同的人白血病细胞株K562细胞所测量的衍射图像。从这些衍射图像可以观察到在相干激发光束照射下不同类细胞产生的散射光的空间强度分布显示不同的衍射图像模式特征，而这些模式特征与细胞内部的三维结构高度相干。通过已公布的衍射图像分析方法与软件可通过获取非偏振衍射图像模式参数矢量自动快速地分析辨别大量细胞的类别及其内部结构特征，可以准确地分别肿瘤细胞株和源自白细胞的细胞株(例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7；K.Dong，Y.Feng，K.M.Jacobs，J.Q.Lu，R.S.Brock，L.V.Yang，F.E.Bertrand，M.A.Farwell，X.H.Hu，“Label-free classification of cultured cellsthrough diffraction imaging”，Biomedical Optics Express，vol.2，pp.1717-1726(2011))。采用本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统，可测量富集后细胞在不同波长与偏振状态下产生的多幅衍射图像，通过提取多幅衍射图像的模式参数矢量，进一步提高分辨肿瘤细胞和其他细胞种类的准确度。

如图4所示，本发明的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，是利用本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统而进行的，包括有如下步骤：

第一步骤：获得血液或淋巴样品后，去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些细胞，是采用过滤、离心分离或为微流器件的方法进行。

过滤体积较小的细胞的线性尺寸的阈值可根据肿瘤细胞与大多数血细胞之间的尺寸差别设为在5至15微米之间，例如可设为10微米，并据此选择适当的富集材料、器件和方法。

所述的细胞富集可通过现有的梯度介质离心或薄膜过滤方法进行，例如用一种新型热塑性塑料聚对二甲苯制作的具有以点阵排列微孔的过滤薄膜(见例如美国专利US7846393B2)，可在去除血样中小的血细胞和细胞碎片等杂质粒子后获得富集细胞；也可采用离心分离方法将血样置于离心试管内的梯度介质(如Pharmacia公司出售的商品名为Ficoll-Paque的梯度介质)之上后放于离心机内，以适当的转速旋转30至40分钟后，即可见到具有不同质量密度的不同类细胞分布于梯度介质内不同层次，使用吸管将所需的一类或多类细胞自离心试管内取出后作为富集细胞；还可使用微流器件方法去除小细胞和细胞碎片制成富集细胞。

所述的细胞悬浮液可在使用PBS缓冲液将富集细胞多次冲洗，然后使用细胞培养液细胞营养液或平衡盐溶液按所需要的浓度配置细胞悬浮液，然后通过流体控制系统的悬浮液入口吸入至与复合喷嘴内腔相通的样品流室内。

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统如针管泵输出的样品流压液和鞘流压液作用下，形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及肿瘤细胞和其他细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中供下一步骤图像分析用，所述的肿瘤细胞和其他细胞种类的衍射图像分辨判据可由已知细胞种类的三维结构与衍射图像数据库提供(见例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7)；

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

所述的提取图像模式特征，包括有根据灰度共生矩阵算法或其他图像分析算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他细胞种类的图像模式特征(见例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7)。

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据。

本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统，还可以用于对癌症病人治疗响应的监测。具体监测过程可使用本发明的检测肿瘤细胞的流动测量系统按如下步骤进行：

第一步骤：将按预定的监测方案多次获得肿瘤患者的外周血样，每次分别去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些体积较小的细胞，是采用过滤、离心分离或微流器件的方法进行。

过滤体积较小的细胞的线性尺寸的阈值可根据肿瘤细胞与大多数血细胞之间的尺寸差别设为在5至15微米之间，例如可设为10微米，并据此选择适当的富集材料、器件和方法。

所述的细胞富集可通过现有的梯度介质离心或薄膜过滤方法进行，例如用一种新型热塑性塑料聚对二甲苯制作的具有以点阵排列微孔的过滤薄膜(见例如美国专利US7846393B2)，可在去除血样中小的血细胞和细胞碎片等杂质粒子后获得富集细胞；也可采用离心分离方法将血样置于离心试管内的梯度介质(如Pharmacia公司出售的商品名为Ficoll-Paque的梯度介质)之上后放于离心机内，以适当的转速旋转30至40分钟后，即可见到具有不同质量密度的不同类细胞分布于梯度介质内不同层次，使用吸管将所需的一类或多类细胞自离心试管内取出后作为富集细胞；还可使用微流器件方法去除小细胞和细胞碎片制成富集细胞。

所述的细胞悬浮液可在使用PBS缓冲液将富集细胞多次冲洗，然后使用细胞培养液细胞营养液或平衡盐溶液按所需要的浓度配置细胞悬浮液，然后通过流体控制系统的悬浮液入口吸入至与复合喷嘴内腔相通的样品流室内。

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统输出的样品流压液和鞘流压液作用下，经过复合喷嘴形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中供下一步骤图像分析用，所述的肿瘤细胞和其他细胞种类的衍射图像分辨判据可由已知细胞种类的三维结构与衍射图像数据库提供(见例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7)：

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

所述的提取图像模式特征，包括有灰度共生矩阵算法或其他图像分析算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他细胞种类的图像模式特征(见例如董珂、胡新华：“自动辨别微粒的衍射图像测量分析系统及方法”，中国专利申请号：201010221714.7)。

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据；

第八步骤：将步骤七得到的统计分析数据与之前得到的该肿瘤患者的外周血样品的统计分析数据进行对比，得到肿瘤细胞的治疗响应变化结果。

Claims (12)

1.一种检测肿瘤细胞的流动测量系统，包括有由富集后细胞（1）组成的样品流（2），储存包括细胞在内的样品流(2)的样品流室(60)，储存鞘流液体的鞘流管（61），与样品流（2）相交的相干激发光束（3），测量被相干激发光束（3）所激发的细胞射出的具有第一中心散射角度（23）的相干散射光束（4）的第一散射光接受物镜部分（A），第一分光及滤波部分（B），第一成像测量及数据输出部分（C），图像处理电路及计算机部分（D）以及与图像处理电路及计算机部分（D）相连的显示部分；其特征在于，样品流室（60）沿轴向贯穿鞘流管（61），所述的样品流室（60）的顶端设置有样品流室排气管（51），所述的样品流室（60）在位于鞘流管（61）上方部分的一侧连接样品流入管（58）的一端，所述的样品流入管（58）的另一端通过三通阀分别连接样品流压液入口（55）和样品悬浮液入口（57），所述的样品流室（60）的底端形成样品流喷嘴（63）；所述的鞘流管（61）用于减小样品流直径，鞘流管（61）的一侧设置有鞘流压液流入管（67），鞘流管（61）的底部形成为开口状态的鞘流管出口（62），样品流喷嘴（63）和样品流出口（64）与鞘流管出口（62）共同构成复合喷嘴，所述的复合喷嘴内的样品流喷嘴（63）伸出鞘流管出口（62）；所述的复合喷嘴用于形成由样品流和鞘流组成的层流，使得样品流与鞘流在流出喷嘴后形成层流；所述的第一分光及滤波部分（B）用于对所接收的细胞发射的散射光进行分光和滤波；所述的第一成像测量及数据输出部分（C）用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得由相干散射光束（4）形成的衍射图像；所述的图像处理电路及计算机部分（D）用于接收第一成像测量及数据输出部分（C）的输出信息，提取不同波长及偏振衍射图像数据特征并计算、分析和辨别；所述的显示部分是将计算、分析和辨别结果的统计数据进行显示与输出，

2.根据权利要求1所述的检测肿瘤细胞的流动测量系统，其特征在于，所述的样品流室排气管（51）上设置有第一二通阀（52）。

3.根据权利要求1所述的检测肿瘤细胞的流动测量系统，其特征在于，所述的鞘流压液流入管（67）上设置有第三二通阀（66）。

4.根据权利要求1所述的检测肿瘤细胞的流动测量系统，其特征在于，所述的复合喷嘴内的样品流喷嘴（63）的内直径为20微米至2000微米。

5.一种用于权利要求1所述的检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，其特征在于，包括有如下步骤：

第一步骤：获得血液或淋巴样品后，去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统输出的样品流压液和鞘流压液作用下，经过复合喷嘴形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过相干激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中，供下一步骤图像分析用；

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据。

6.根据权利要求5所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，其特征在于，第一步骤所述的平均线性尺寸的设定阈值在5至15微米之间。

7.根据权利要求5所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，其特征在于，第一步骤所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些平均线性尺寸小于设定阈值的细胞，是采用过滤、离心分离或微流器件的方法进行。

8.根据权利要求5所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的分析方法，其特征在于，第五步骤所述的提取图像模式特征，包括有根据灰度共生矩阵算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他种类细胞的图像模式特征。

9.一种用于权利要求1所述的检测肿瘤细胞的流动测量系统的肿瘤多次监测分析方法，其特征在于，包括有如下步骤：

第一步骤：将按预定的监测方案多次获得的肿瘤患者的外周血样品，每次分别去除样品内的平均线性尺寸小于设定阈值的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞后，制成富集后细胞悬浮液；

第二步骤：将细胞悬浮液输入至样品流室后，在流体控制系统输出的样品流压液和鞘流压液作用下，经过复合喷嘴形成层流，并使得样品流内的细胞以单列方式与设定速度通过相干激发光束，产生相干散射光信号；

第三步骤：被测细胞所产生的相干散射光信号的空间分布由衍射成像系统收集测量，获得相应的具有不同波长及偏振的衍射图像数据；

第四步骤：将被测细胞内所有细胞在不同波长及偏振的衍射图像数据以及细胞种类分辨判据传输到计算机内的图像存储处理单元中供下一步骤图像分析用；

第五步骤：分析不同波长及偏振衍射图像并提取图像模式特征；

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量，并根据该矢量确定所测细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定所测细胞内的所有细胞在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据细胞在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种类分辨判据，将被测细胞自动分类成不同的种类并显示及输出相应统计分析数据；

第八步骤：将第七步骤得到的统计分析数据与之前该肿瘤患者的外周血样品的统计分析数据进行对比，得到肿瘤细胞的响应变化结果。

10.根据权利要求9所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的肿瘤多次监测分析方法，其特征在于，第一步骤所述的平均线性尺寸的设定阈值在5至15微米之间。

11.根据权利要求9所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的肿瘤多次监测分析方法，其特征在于，第一步骤所述的去除样品内的细胞碎片、血小板、红细胞和部分白细胞这些平均线性尺寸小于设定阈值的细胞，是采用过滤、离心分离或微流器件的方法进行。

12.根据权利要求9所述的用于检测肿瘤细胞的流动测量系统的肿瘤多次监测分析方法，其特征在于，第五步骤所述的提取图像模式特征，包括有根据灰度共生矩阵算法提取的用于分辨肿瘤细胞与其他种类细胞的图像模式特征。

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