JPH04184168A - フローサイトメトリーによる白血球の分類方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における白血球の分類測定法
およびそれに使用する試薬に関するものであり、さらに
詳しく上よ、フローサイトメーターを用いて、蛍光染色
処理された血球を光学的に測定し、白血球を分類する方
法において採血後の経過時間の差にかかわらず常に正し
い白血球分類精度を維持できる方法に関するものである
。

（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらは各々その
機能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再生不良
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられる
。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血病などに
みられる。

白血球を分類・計数するために従来から最も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定（祝電法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類−計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのために、測定者に大きな負
担をかけるものとなっている。さらに、計数する白血球
数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布となっ
ている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある測
定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行なえる方
法が強く求められており、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の祝電法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には祝電法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もある。

白血球を自動的に分類−計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ細
い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき
検出器で発生する信号を分析することにより白血球を分
類するものである。このフローシステムを利用した方法
は、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出すの測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものである
。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光で
照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によっ
ては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白
血球を分類しようとするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメンッキー（Ｌ
、Ａ、Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ）　　ｒブラッド・セルズ（
Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）Ｊ　、第６巻、１２１〜１４
０頁、１９８０年に記載された方法がある。この方法は
、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色液を加え、
１分間イ ＋ンキュベートしたのち、アルゴンイオンレーザ−等の
光源で照射したとき血球から発する緑色螢光と赤色螢光
を測定し、その二次元分布から、白血球を分類・計数す
るものである。

第２の方法に属する他の例としては、特開昭５０−２０
８２０号公報およびエイチ・エム・シャピロ（１４１，
５ｈａｒｉｒｏ）他「ザ・ジャーナル・オプ・ヒストケ
ミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊ
ｏｕｙｎａｌ　ｏｆ　Ｈ４５ｔｏｃｈｅ＊１ｓｔｒｙ　
ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ）第２４巻第１
号、３９６〜４１１頁、１９７６年；同じく第２５巻第
８号、９７６〜９８９頁、１９７７年に記載された方法
がある。この方法は、血液に４倍量の染色液１を加え、
３分間インキュベートした後、血液と等容の２０％ホル
ムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない、希釈用の染
色液■で１５〜２０倍に希釈し、フローサイトメーター
で測定するものである。この測定に用いられるフローサ
イトメーターは、光源として光を３分割した水銀アーク
ランプ又は三本のレーザーを備え、染色液に含まれる３
種の螢光染料を各々励起し、その３種の螢光と前方散乱
光、側方散乱光、吸光の６つのパラメーターを測定し、
４段階の二次元分布解析により白血球を分類・計数する
装置である。

さらに、特開昭６３−７０１６６号公報においては、緩
衝液、無機塩類及び螢光染料からなる染色液に血液を加
えて染色するという一段階染色工程が開示されているが
、未溶解の赤血球が測定データに影響を及ぼし、測定が
不明確となるおそれがあった。

一方特開昭６３−１３４９５８号公報において、低張酸
性の蛍光塗料溶液と、その浸透圧と液性を変化させる溶
液とを用いる二段染色法が開示されている。

そして、その染色された血液試料をフローサイトメータ
ーに供し蛍光信号、散乱信号を得、第２図に示す蛍光強
度対側方散乱光強度の二次元分布図を描き、白血球の５
分類を行っている。第２図中の１〜６はそれぞれリンパ
球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ノイズ成分の集
団を示している。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときには測定値の正確さが
損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血病の螢光強度の差が最大となる時間に測定するこ
とを特徴としている。しかしながら、白血球数が極端に
多いか、または少い検体については、染色強度が適正レ
ヘルとなる染色時間は正常な検体とは異ることになり、
検体ごとに適切な染色時間を選定しなければならない。

また、この方法は螢光強度の差のみによって白血球を分
類しようとしているため、リンパ球と単球との分類等各
皿球の分離が必ずしも良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
０−８５３号公報等に記載された方法は、細す 胞による染料の吸収が平衡に達する前に、尋なわち、染
色の途中で各白血球の螢光強度の差が最大となる時間に
測定することを特徴としている。

しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い検
体については、染色強度が適正レヘルとなる染色時間は
正常な検体とは異なることになり、検体ごとに適切な染
色時間を選定しなければならない。また、この方法は螢
光強度の差のみによって白血球を分類しようとしている
ため、リンパ球と単球との分離等各血球の分離が必ずし
も良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭５０−２０８２０号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複
雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が３種
必要であることに加え、６つのパラメーターを測定しな
ければならないため装置が非常に複雑で高価なものとな
る。さらに、このように多くのパラメーターを測定して
いるため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要と
するという問題もある。

さらに、前出の特開昭６３−７０１６６号の発明を含め
フローサイトメトリーにより白血球を分類する方法にお
いては、血液を長時間放置しておいたため好中球が死細
胞になると、フローサイトメーターでは検出できなくな
る場合があると言う問題があった。また、特開昭６３−
１３４９５８号公報には、死細胞を検出し正しい好中球
数を算出する方法が記載されているが、検体によっては
必ずしも死細胞の弁別が完全に行えないという問題があ
った。また損傷を受けた細胞の場合にも分布域が移動し
、他の細胞分布域に混入し弁別が不完全になるという問
題があった。このため測定血液は必ず新鮮血液を使用し
なければならなかった。

この発明は、上記発明にさらに改良を加え、検体差や、
細胞膜の損傷等により通常とは異なる位置に分布する細
胞がある場合にもかかわらず、より正しい白血球分類が
行える方法を提供することを目的とし、上記従来の問題
点を解決するために、簡単な手順と構成で、白血球を正
確に分類・計数するための方法を提供するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明の白血球分類方法は、 低張酸性状態の蛍光染料溶液である第１？ｆｌと、その
浸透圧、液性を変化させる溶液である第２液とを用いた
フローサイトメトリーによる方法であり、 上記第１液に、損傷を受けている白血球細胞の核を特異
的に蛍光染色する染料を追加した液を用いて測定し、 得られた２種類の二次元分布を関連付けて解析すること
により、細胞膜の損傷等により通常とは異なる位置に分
布する白血球細胞の数を求め、白血球分類結果を算出す
ることを特徴としている。

具体的には、第１液にＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｓ　１ｏ
ｄｉｄｅ）、ＥＢ（Ｅｔｉｄｉｕ＋＊　ｂｒｏｍｉｄｅ
）などの第３の染料を追加して含有させ、赤色蛍光強度
対側方散乱光強度、緑色蛍光強度対側方散乱光強度の両
二次元分布を関連付けて解析することにより、採血後の
時間経過などにより変質し通常とは異なる位１に分布す
るようになった白血球細胞（例えば細胞膜を損傷した好
中球）の数を求めることができるようにした。

本発明の方法において第１液の染料として使用できる染
料の例は次のとおりである。

第１の染料：アストラゾンイエロー３Ｇ第２の染料ニ アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ヘルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン タレジルファーストハイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １．１′−ジメチルチオカルボシアニン１．１’−ジー
チルチオカルボシアニン１．１′−ジエチル−９−メチ
ルチオカルボシアニンプロミド ５−ペンゾオキサゾリウムヨージド アストラソ゛ンレンド６Ｂ ヘイシソクハイオレノト１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノス、チＩＪル）−１−エチル
−４，５−ヘンゾチア゛ノ１ノウムヨージド２．４−ビ
ス（ｐ−ジメチルアミノスチ１ノル）−１−エチル−ピ
リジニウムヨーシト′２．６−ビス（ｐ−ジメチルアミ
ノスチ１ノル）−１−エチル−ピリジニウムヨーシト′
Ａ−２ アストラゾンオレンジＲ 第３の染料： プロビデイウムイオダイド、エチデイウムフ゛ロマイド
およびＭ−２６４ さて、白血球より発せられる前記螢光（３号および側方
散乱光信号のうち、螢光信号番よ、細胞イヒ学的特定を
反映するものであり、染料と各白血球との相互作用によ
り、各白血球力・ら異なる強度の信号が得られる。

一方、側方散乱光信号は細胞内情報を反映するものであ
る。すなわち、細胞内のｍ胞核力ζ大きしＡはど、また
、顆粒が多し１しよど細胞内での光の反射が強まり、側
方散乱光強度は増大する。したがって、リンパ球は、そ
の内部に顆粒が存在しないかあるいは少いので、散乱光
強度は一番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存
在し、また、大きな核を持つので、散乱光強度は大きく
なる。好酸球の散乱光強度は好中球のそれにほぼ匹敵す
る。

単球、好塩基球による散乱光強度はリンパ球と好中球の
中間にある。

したがって、螢光信号と側方散乱光信号とを組白血球の
５分類が儲となる。

本発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の一
具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第１
図は側方散乱光と赤螢光と緑螢光とを測定する場合を示
している。このフローサイトメーターの光学系１０に使
用された光源は、波長；４８８ｎｍ、出力ｉ　１０ｍＷ
のアルゴンイオンレーザ−１２である。レーザー１２か
ら発せられた光は、シリンドリカルレンズ１６によって
絞られ、フローセル１４中を流れる測定用試料を照射す
る。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。

このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過し
たのち、ダイクロイックミラー２２に達する。

ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射せ し、螢光２６を透過さ吋る。ダイクロイックミラー２２
によって反射された側方散乱光２４は光電子増倍管２８
によって測定される。ダイクロイックミラー２２を透過
した螢光２６のうち赤螢光３２はダイクロイックミラー
３０によって反射させられ、緑螢光３８のみが透過させ
られる。反射された赤螢光３２はカラーフィルム３４を
通過したのち、光電子増倍管３６によって測定される。

透過した緑螢光３８はカラーフィルター４０を通過した
のち光電子増倍管４２によって測定される。

ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い螢光しか
発しないので、螢光強度を測定する限りにおいては、赤
血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）しても
、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱光を
測定する場合には、赤血球は白血球と同しヘルの強度の
散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与え
る。このとき、螢光と散乱光を同時に測定し、一定レベ
ル以上の強度の螢光を発したもののみを白血球とするこ
とはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときには
、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重畳され
るので、正しい白血球の散乱光強度を測定することがで
きない、第１図に示したフローサイトメーターの光学系
１０では、希釈倍率をたとえば２０倍とし、赤血球と白
血球との同時通過が起こる確率を減少させ、赤血球によ
る妨害の程度を実用上無視できる程度におさえた測定用
試料をフローセル１４に流すようにしている。

（実施例） 本発明具体的には特開昭６３−２８２６９８号公報に記
載した発明（実施例２．２：２ステツプ法）の改良であ
り、以下の実施例によって説明される。しかし、それを
以って本発明を限定するものではない。下に試薬組成を
示す試薬を調製した。第１の染料は好酸球、好塩基球の
両方を選択的に蛍光染色し、第２の染料は白血球の核を
蛍光染色し、第３の染料は細胞膜に損傷を受けた白血球
の核を蛍光染色する。

玉上丘 ・第１の染料　ヘーンフクイＩト１１（Ａｌｄｒｉｃｈ
）　　１００　ｐｐｍ・　第２の染料　　アストラゾン
オレンジＲ（東京化成）３３０ｐｐｍ・　緩衝側　　　
　　ジグリコール酸−水酸化ナトリウム　　　１０−Ｍ
（ｐＨ４，０、浸透圧３０ｍ０ｓｓ／ｋｇ）なお、ＥＢ
　（エチディウムプロマイド）はＤＮＡのＧ−Ｃペアに
インターカレイション結合する。ＰＩ（プロピディウム
イオダイド）も同様である。

蚤Ｉ丘 ・緩衝側　トライシン−水酸化ナトリウム　３００　ｍ
Ｍ・浸透圧調整剤　塩化ナトリウム　　　　　７５０　
ｍＭ（ｐ）１９．８〜９．９、浸透圧２２００醜Ｏｓｓ
／ｋｇ）上記第１液及び第２液を使用して以下のように
白血球分類のための蛍光および散乱光の測定を行なった
。

まず、健康な人の血液を抗凝固処理し、該抗凝固処理さ
れた血液１００μ！と上記第１液１８００μｌとを均一
に混合し、撹拌後２５°Ｃで約２０秒インキエヘーショ
ンする。その後さらに上記第２液を２００μ！加え、撹
拌後２５°Ｃで約４０秒間インキユヘーシゴンする。こ
の測定用サンプル液は最終的にＰＨ８，６〜８．７、浸
透圧的２８０ｍ０５ｍ／ｋｇ　（等張）となる。

このようにして赤血球を溶血させ各白血球を染めたサン
プル液を調製し、そのサンプル液をフローサイトメータ
ーに供し、白血球からの蛍光、散乱光を測定した。

測定結果は添付の図面にもとづいて次のように説明され
る。

まず、第２図は従来の試薬、すなわち第３の染料を含有
しない第１液を用いて測定した場合に得られる緑色蛍光
強度、側方散乱光強度を２軸とする二次元分布図である
。１〜６はそれぞれリンパ球、単球、好中球、好酸球、
好塩基球、赤血球ゴーストの分布領域である。（なお、
赤色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二次元分布
図も同様の分布パターンを示す。）各分布領域を分画し
その分画内の粒子数を算出することにより各白血球が求
められ、各白血球の比率が得られる。

第２閏は採血後６時間以内の新鮮血を測定した場合の二
次元分布図である。しかし、採血後長時間（例えば２０
時間）室温放置した血液を測定すると、白血球の細胞膜
が損傷したため、本来その細胞から分布すべき領域から
ずれて分布するものが現れる。そしてそれが他の細胞の
分布領域に入り込んで分類精度を低下させることになる
。特に、第３図に示すように好中球の一部が矢印で示す
ように単球の領域に入り込むことの影響が最も大きい、
従来の試薬を用いた場合には２種の二次元分布図はほぼ
同じであった。そこで、従来は二次元分布図上に新鮮血
においてはほとんど分布がなく、長時間放置の血液にお
いて分布が現れるある領域を設定し、その領域の細胞を
好中球の死細胞とみなしていた。

しかし、このやり方は検体ばらつきや細胞の傷つき程度
の差などにより必ずしも精度の良いものではなかった。

そこで本発明ではこれを改良し白血球分類精度を高く維
持するため、第３の染料を加えた第１液を用いたのであ
る。本実施例で示したエチデイウムブロマイドは死細胞
を染色する物質として公知である。しかし、第１．第２
の染料を含有せずエチディウムプロマイドだけを染料と
して含むようにし他は上記と同様に調製した第１液を用
いた場合、損傷を受けた白血球細胞が多く存在する血液
においてさえも損傷細胞を検出することはできなかった
。第１２図、第１３図はそのことを証明するための二次
元分布図である。第１２図は緑色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とし、第１３図は赤色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とする二次元分布図である。いずれにおいて
も損傷を受けた白血球細胞は検出できていない。

一方、第３の染料だけでなく第１．第２の染料も含有さ
せた本実施例の第１液を用いて上記検体を測定した場合
には損傷を受けた白血球細胞は明確に検出できた。第１
０図、第１１図はそれぞれ、緑色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とする二次元分布図であり、赤色蛍光強度、
側方散乱光強度を２軸とする二次元分布図である。第１
１図において線で囲んだ部分がその損傷を受けた白血球
細胞である。

つまり、他の２つの染料とともに第３の染料を存在させ
ることに格別の意義があるのであり、本発明はその知見
から成したものである。

さて、上記の測定方法で得られる白血球の分布域の説明
をする。

第５図は赤色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする第
２の二次元分布図であり、図中１〜８はそれぞれリンパ
球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球ゴースト
、細胞膜に損傷を受けた好中球、細胞膜に損傷を受けた
リンパ球の領域である。第４図は緑色蛍光強度、側方散
乱光強度を２軸とする第２の二次元分布図であり、この
分布は従来の第１液を用いたときとほぼ同様のパターン
を示しており、細胞膜に損傷を受けたリンパ球８はリン
パ球１の領域に、細胞膜に損傷を受けた好中球７は単球
２の領域に入り込む。また、第１の二次元分布図（第４
図）と第２の二次元分布図（第５回）の分布パターンが
異なっていることも注目すべき点である０両者を関連づ
けて解析することにより精度よく白血球分類が行える。

具体的なデータ解析法は次のとおりである。すなわち第
１の二次元分布図において分布が明確なところはそのま
ま分画し、分布が不明確な領域に関してはその領域につ
いて第２の二次元分布図を作製し、第２の二次元分布図
において分画するのである。

まず、第１の二次元分布図に対して第６図に示すように
分画する。

領域Ｉはリンパ球１．８ 領域■は単球２、損傷なしの好中球３、損傷ありの好中
球７ 領域■は好酸球４ 領域■は好塩基球５ 次に、不明確な領域■内の細胞（３種類）に対して第２
の二次元分布図を描かせる。（第７図参照）。３種の細
胞群は第１の二次元分布図においては分布が不明確であ
っても、第２の二次元分布図においては分布が明確であ
る。そこで第７図のように分画する。

領域Ｖは単球２ 領域■は損傷なしの好中球３ 領域■は損傷ありの好中球７ そして、領域■と領域■の細胞を加えると全好中球数と
なる。

以上のようにして各白血球数が精度よく求められる。

白血球分類の安定性の結果を説明する。

第８図は本実施例の第１液、第２液を用い、上記の解析
を行ったときの白血球比率の経時変化を示した図である
。横軸は採血後の室温放置時間である（単位は時間）。

図に示すように採血後、２０時間以上にわたって全項目
とも安定していることがわかる。

第９図は従来の第１液を用い、緑色蛍光強度と側方散乱
光強度の二次元分布図で解析し、得た分類結果である。

従来法では採血後８時間位がら好中球比率が減少し単球
が増加しているのがわかる。

なお、第３の染料としてエチディウムプロマイドだけで
はなく、プロビディウムイオダイドやＭ−２６４も同様
に用いることができる。

（発明の効果） 第１、第２の染料に加えて本発明においては第３の染料
を不させたので、二次元分布上に細胞膜に損傷を受けた
白血球を明確に分布させることができるので、検体の差
、損傷の差にかかわらず、常に安定してそれを検出する
ことができる。そして、このデータを用いて結果をだし
ているので、採血後室温に長時間放夏され損傷細胞が含
まれた血液であっても白血球分類結果の精度が保証され
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一興体例を示す概略図。第１図中の符号は次
のとおりに説明される：１０　７０−サイトメーターの
光学系 １２　　レーザー １４　　フローセル １６　　シリンドリカルレンズ １８　　コンデンサーレンズ ２０　　アパーチャー ２２　　ダイクロイックミラー ２４　　側方散乱光 ２Ｇ　　螢光 ２８　　光電子増倍管 ３０　　ダイクロイックミラー ３２　　赤螢光 ３４　　カラーフィルター ３６　　光電子増倍管 ３８　　緑螢光 ４０　　カラーフィルター ４２　　光電子増倍管 第２図は採血後６時間以内の新鮮血を従来の試薬、すな
わち第３の染料を含有しない第１液を用いて測定した場
合に得られる緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とす
る二次元分布図である。１〜６はそれぞれリンパ球、単
球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球ゴーストの分布
領域である。 第３図には、採血後髪時間（例えば２０時間）室温放置
した血液を第２図の場合と同じ方法で測定して得られた
二次元分布図である。図中の矢印は好中球の一部が単球
の領域に入り込んだことを示す。 第４図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二
次元分布図であり、第５図は赤色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とする第２の二次元分布図である。第４およ
び５図中１〜８はそれぞれリンパ球、単球、好中球、好
酸球、好塩基球、赤血球ゴースト、細胞膜に損傷を受け
た好中球、細胞膜に損傷を受けたリンパ球の領域である
。 第６図は第１の二次元分布図の分画を示す二次元分布図
である。第６図中、 領域Ｉはリンパ球１，８； 領域■は単球２、損傷なしの好中球３、損傷ありの好中
球７； 領域■は好酸球４；そして 領域■は好塩基球５を示す。 第７図は第６図の領域■内の細胞（３種類）に対して描
いた第２の二次元分布図であり、第７図中、 領域Ｖは単球２； 領域■は損傷なしの好中球３；そして 領域■は損傷ありの好中球７である。 第８図は本実施例の第１液、第２液を用い、上記の解析
を行ったときの白血球比率の経時変化を示したグラフで
ある。 第９図は従来の第１液を用い、緑色蛍光強度と側方散乱
光強度の二次元分布図で解析し、得た分類結果を示すグ
ラフである。　第８および第９図において、縦軸の各種
白血球の比率を示し、横軸は採血後８時間位 有する。 口１１０ｆ　ｖ■フフロｒ６−’ＩＩＬ−１１−Ｅ’Ｆ
ＦＢ口［？罫１１ｐ［第１０図は緑色蛍光強度、側方散
乱光強度を２軸とする二次元分布図であり、第１１図は
赤色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二次元分布
図である。第１１図において矢印で示し線で囲んだ部分
は損傷を受けた白血球細胞である。 第１２図、第１３図は、上記実施例で使用したエチディ
ウムプロマイドは死細胞を染色する物質として公知であ
るが、第１、第２の染料を使用せずエチディウムプロマ
イドだけを含むようにして上記と同様の調製した第１液
を用いた場合、損傷を受けた白血球細胞が多く存在する
血液においてさえも損傷細胞を検出することはできない
ことを証明するための二次元分布図である。すなわち、
第１２図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする
二次元分布図であり、第１３図は赤色蛍光強度、側方散
乱光強度を２軸とする二次元分布図である。 第　２　図 脅−１才　づ６ζ　古しノ巴　タ五　ノ５１第　３　菌 例ら氷乱左強度 、　　！ｖ７４−凹　　　第５図 子２図　　　第７図 り１う朱ｔＬ九余度　　　　　営１方散糺先強度吊　８
　園 第　（ｊ′　　凹 ネＶ＊　　襞　φ１ｉＩ！Ｌ綺閾　Ｌ岬　同）予１０凹
　　　　　第１１凹 Ｆ　１２回　　　　第７５図 手続補正書 平成３年２月）１日 ］ １、事件の表示 平成２年特許願第３１０７３０号 ２、発明の名称 フローサイトメトリーによる白血球の分類方法３、補正
をする者 ５、補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６、補正の内容 （１）明細書１６頁１３行と１４行との間に下記を挿入
する。 ｒなお、本発明の第１流および第２流については以下の
条件を満すことが好ましい。 （ａ）　　色素濃度 色素濃度については、第１液、第２液混合後の最終濃度
が次の濃度範囲内になるように第１液に含有されていれ
ばよい。 なお、ベーシックイエロー１１アストラゾンオレンジＲ
については、それぞれアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）
製、東京化成製のものを用いた。 ベーシックイエロー１１の濃度を所定値以上にすると好
塩基球による強度が他の白血球による強度よりも増大し
、さらに高濃度にすると好酸球による強度も増大する。 また、他の白血球の強度はベーシックイエロ−１１濃度
の増加に対して、はとんど増大しない、好塩基球および
好酸球を他の白血球から蛍光強度によって分離するため
には、ベーシックイエロー１１の濃度を７０〜１００ｐ
ｐ＋ａ以上とすれば良い。 アストラゾンオレンジＲは濃度１１００ｐｐ以上でリン
パ球・好中球の蛍光強度とノイズとが分離できるように
なり、２００ｐｐ−以上で分離が良好になる。 ３００ｐｐｍ以上ではリンパ球・好中球とノイズとの分
離は、はぼ一定となり、また、アストラゾンオレンジＲ
濃度の上昇に伴い、好塩基球および好酸球の蛍光強度が
若干低下するので、アストラヅンオレンジＲ濃度は３０
０ｐｐｍ程度が好ましい。 エチディウムプロマイドについては牛丼化学社製のもの
を用いたが、３ｐｐ■（３ｘ／ｄ）以下では損傷を受け
た細胞の、二次元分布図における出現位置が安定せず、
１１００ｐｐ以上では信号検出時のＳＺＮ比が悪（なる
。（蛍光信号とバックグランドとの差が小さくなり、信
号検出がしにくくなる。）プロビデイウムアイオダイド
の場合も含有量の選定については同様に考えればよい。 ［有］）第１液ｐＨ 第１液ｐｔｔは、赤血球を溶血させるために５．０以下
が良いが、血小板の凝集を防ぐためには３．５以上が必
要である。 （Ｃ）　　第１液緩衝剤 第１液緩衝剤としては、クエン酸、マレイン酸、ジグリ
コール酸などｐＫａが４．５付近の緩衝剤なら使用可能
である。たとえばジグリコール酸を用いたとき、ジグリ
コール酸濃度５ｓ＋Ｍ以下では、好塩基球の蛍光強度に
若干の低下が見られ、５０５Ｍ以上では赤血球の溶血不
良が見られる。最適なジグリコール濃度は約１０ｍＭで
ある。 （ｄ）　　第２液浸透圧 第２液に添加する浸透圧補償剤（たとえば塩化ナトリウ
ム）の量を変化させて、最終浸透圧を１６７〜３８７ｍ
ｏｓ−／ｋｇＯ間に変えても、分画パターンに変化は無
い。第２液浸透圧は最終浸透圧がほぼ等張（２８０ｍｏ
ｓｍ／　ｋｇ　）となるようにすれば良い。 （ｅ）　　第２液緩衝剤 第２液緩衝剤としては、ホウ酸、トリス、トライシンな
どｐＫａが８．５〜９．０付近の緩衝剤が使用できる。 たとえばトライシンを用いたとき、トライシン濃度５０
＋ｗＭ以下では、好塩基球および好酸球の蛍光強度が低
下する。好ましいトライシン濃度は３００ｍＭ程度であ
る。ｊ （２）明細書２０頁１２行［Ｄ　ｒｌｏｐｐ＋ｗ　Ｊ　
ヲｒｌｏｏｐｐｍ１ト訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のａ〜ｅの工程からなることを特徴とするフロー
   サイトメトリーによる白血球の分類方法。 ａ）、好酸球と好塩基球の両方を選択的に蛍光染色する
   第１の染料と、 白血球の核を蛍光染色する第２の染料と、 細胞膜に損傷を受けた白血球の核を蛍光染色する第３の
   染料と、 ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤と、 からなる低張な第１液と、血液とを混合する工程。 ｂ）、第１液の酸を中和し、溶液ｐＨを染色ｐＨに保つ
   ための緩衝剤と、 白血球の形態を保持する浸透圧に溶液を調整するための
   浸透圧調整剤と、 からなる第２液と、前記ａ工程で得られた試料液とを混
   合する工程。 ｃ）、前記ａ、ｂ工程にて得られた試料液をサンプルと
   してフローサイトメータに供し、個々の白血球について
   蛍光および散乱光などの複数の信号を測定する工程。 ｄ）、白血球から発せられた蛍光、散乱光信号などの信
   号のうち２つの信号強度を２軸とする第１の二次元分布
   を得る工程。 ｅ）、上記第１の二次元分布において各白血球を分画す
   る際に、採血後の時間経過などの原因により本来の分布
   領域からずれて分布している細胞群の分布領域を設定し
   、その領域の細胞群に対し別の２つの信号強度を２軸と
   する第２の二次元分布を得、その第２の二次元分布にお
   いて上記ずれて分布している細胞群を分画し、これを計
   数する工程。 ２、第１液の第３の染料がプロピディウムイオダイド、
   エチディウムプロマイドおよびＭ−２６４から選ばれた
   ものである、請求項１の方法。 ３、第１液の第１の染料が、アストラゾンイエロー３Ｇ
   である、請求項１の方法。 ４、第１液の第２の染料が、次の群から選ばれたもので
   ある、請求項１の方法。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ ベルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
   ロミド ２−〔ｒ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
   リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
   オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
   ，５−ベンゾチアゾリウムヨージド２，４−ビス（ｐ−
   ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−ピリジニウム
   ヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
   チル−ピリジニウムヨージド ＴＡ−２ アストラゾンオレンジＲ ５、第１の二次元分布が緑色蛍光強度と側方散乱光強度
   を２軸とするものであり、第２の二次元分布が赤色蛍光
   強度と側方散乱光強度を２軸とするものである、請求項
   １〜４のいずれか１つの方法。 ６、第１の二次元分布における設定領域が、単球、好中
   球の分布領域であり、第２の二次元分布において単球、
   正常な好中球、細胞膜に損傷を受けた好中球を分画する
   、請求項５の方法。