CN113049557A - 一种生殖道分泌物多重荧光染色液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物荧光染色技术领域，具体涉及一种生殖道分泌物多重荧光染色液及其制备方法和应用。所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括荧光素、核酸染料、抑菌剂、防淬灭剂、通透剂和缓冲液；pH4.5‑6.0。本发明的生殖道分泌物多重荧光染色液对阴道分泌物样本的染色时间短，适合临床大批量开展工作；染色结果稳定可靠，细胞和各种病原微生物的形态结构清晰，对比鲜明，在显微镜下可清晰的观察到各种病原微生物的形态、大小和分布，以及涂片中各种细胞的种类和数量。此外，本发明的多重荧光染色液稳定性好，可长期使用，大大降低染色成本。

Description

一种生殖道分泌物多重荧光染色液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物荧光染色技术领域，具体涉及一种生殖道分泌物多重荧光染色液及其制备方法和应用。
背景技术
世界卫生组织(WHO)对全球妇女健康调查研究表明，全球妇女阴道炎发病率为13.2％，复发率在80％以上。女性生殖道感染所引发的阴道炎症主要有细菌性阴道病(BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫性阴道炎(TV)、需氧菌性阴道炎(AV)、细胞溶解性阴道病(CV)和混合型感染等。
阴道分泌物检查是妇科最常见的检验项目，是诊断女性外生殖道感染最简单、最常用的检查手段。通过对女性阴道分泌物的外观、清洁度、上皮细胞、白细胞、各种细菌杂菌、真菌及寄生虫等的检查，对阴道内的微生态做出系统性评价，以了解女性的健康状况。
目前各大医院常用的检验方法为生理盐水湿片法，可简便、快速的检查出滴虫。但因受多种因素影响，检出率极低，临床检验效果不甚满意。如样本没有及时送检或保存温度过低，则会导致滴虫死亡，在显微镜下不易观察到，容易造成漏诊。同时，未经染色的细菌、真菌等，由于其与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察，需要检验师具有丰富的临床经验，且诊断的主观性比较强，影响因素多，同一样本多次涂片或同一涂片不同检验师阅片都会存在差异性，所以漏检率比较高。另外，使用生理盐水湿片直接镜检发现线索细胞的概率极低，对于临床检验医师的诊断也存在很大的困难，因此也容易造成漏诊。
根据《全国临床检验操作规程》，阴道分泌物常规检验的标准操作需进行革兰染色，该方法的优点是细菌及真菌易于判断。但该方法操作比较繁琐、染色时间较长，当临床样本量较多时无法满足0.5-1h出报告的要求。操作过程中影响因素也比较多，如固定时温度太高不仅会改变细菌的性质，同时还会破坏滴虫的形态，造成漏诊。另外，脱色时间难以掌控，如脱色过度则会造成假阴性，脱色不全则会造成假阳性。
此外，还可采用传统培养方法对阴道分泌物进行检验，此方法需要根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选择不同类型的培养基及环境进行培养。部分微生物需从初步的培养基上分离纯化后，根据进一步的生化实验结果来鉴定种类。此种培养方法周期较长，对设备及环境要求严格，需要全套的微生物培养基鉴定设备，并且对操作人员的要求较高，限制了其临床应用。
近些年市面上存在一些荧光染色液及其相应的检测试剂盒(荧光法)，但这些方法存在各种各样的弊端：(1)检测目标单一，每种试剂只能检测一种微生物；(2)需要两种试剂进行两次染色，操作步骤繁琐；(3)需要温育30min，操作时间较长；(4)观察过程中需要切换不同的显微镜光源。总之操作非常繁琐，耗时较长，不利于临床大量开展诊断工作。如专利CN110940646A公开了一种阴道微生物双重荧光染色液及其应用，其公开的荧光染色液具有染色液A液和染色液B液2种试剂，需要进行2步染色，虽然能有效检测出病原微生物，但操作繁琐。又如专利CN111019999A公开了一种微生物荧光染色液及其应用，其公开的微生物荧光染色液包括凝集素、荧光素、核酸染料、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水，所述的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，该专利存在磷酸缓冲液不能长期保存、易生沉淀、影响染色效果的弊端。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种生殖道分泌物多重荧光染色液，只需一步就能完成染色，操作简便、快捷，染色结果稳定可靠，细胞和各种病原微生物的形态结构清晰，对比鲜明，在显微镜下可清晰的观察到各种病原微生物的形态、大小和分布，以及涂片中各种细胞的种类和数量。同时，该多重荧光染色液稳定性好，可长期使用，大大降低染色成本。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一种生殖道分泌物多重荧光染色液，包括荧光素、核酸染料、抑菌剂、防淬灭剂、通透剂和缓冲液；pH4.5-6.0。
其中，所述的荧光素为吖啶橙、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、5-羧基-4,7-二氯罗丹明6G、6-羧基-4,7-二氯罗丹明6G、5-羧基-4,7-二氯四甲基罗丹明、6-羧基-4,7-二氯四甲基罗丹明、5-羧基-4,7-二氯-X-罗丹明、AMCA琥珀酰亚胺酯、AMCA C2马来酰亚胺、7-二乙胺基-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸、AMCA乙二胺、EDANS酸5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸、EDANS钠盐5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸钠盐、EDANS C2马来酰亚胺、生物素酰肼或生物胞素酰肼中的一种或几种的组合。
优选地，所述的荧光素为吖啶橙。
所述的核酸染料为6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、氨基烯丙基-DUTP钠盐、DAPI、碘化丙啶、溴化乙啶或溴化乙啶衍生物中的一种或几种的组合。
优选地，所述的核酸染料为碘化丙啶。
所述的抑菌剂为Proclin 300、叠氮钠、硫柳汞、山梨酸钾、异噻唑啉酮、庆大霉素、甲醛或多聚甲醛中的一种或几种的组合。
优选地，所述的抑菌剂为多聚甲醛。
所述的防淬灭剂为甘油、P-苯二胺、n-丙基没食子酸盐、1，4-二偶氮双环-辛烷、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸、4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯、DABCYL C2胺、DABCYL C2马来酰亚胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合。
优选地，所述的防淬灭剂为甘油和P-苯二胺。
所述的通透剂为Triton X-100或吐温。
优选地，所述的通透剂为Triton X-100。
所述的缓冲液为乙酸-乙酸钾缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液中的一种或几种的组合。
优选地，所述的缓冲液为乙酸-乙酸钾缓冲液。
在一种具体的实施方式中，所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括吖啶橙0.01-100mg/L，碘化丙啶0.01-100mg/L，多聚甲醛0.01-5g/L，甘油10-100mL/L，P-苯二胺0.1-1g/L，Triton X-100 1-10mL/L，乙酸钾1-30g/L，乙酸1-10mL/L，纯化水补足至1L；pH4.5-6.0。
更优选地，所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括吖啶橙0.01-50mg/L，碘化丙啶0.01-50mg/L，多聚甲醛0.01-2g/L，甘油10-50mL/L，P-苯二胺0.1-0.6g/L，Triton X-1001-5mL/L，乙酸钾5-20g/L，乙酸2-8mL/L，纯化水补足至1L；pH4.5-5.5。
另一方面，本发明提供了上述生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：
S1.将乙酸钾溶于纯化水中，搅拌至完全溶解；
S2.添加乙酸，调节pH值为4.5-6.0；
S3.将荧光素、核酸染料溶解于S2所得的溶液中，搅拌均匀至完全溶解；
S4.依次将抑菌剂、防淬灭剂及通透剂添加至S3所得溶液中，搅拌均匀；
S5.调节S4所得溶液pH值为4.5-6.0，即得生殖道分泌物多重荧光染色液。
上述生殖道分泌物多重荧光染色液的染色方法，包括如下步骤：
S1.生殖道分泌物涂片后固定；
S2.多重荧光染色液染色5-10s；
S3.流水冲洗、干燥。
又一方面，本发明还提供了上述生殖道分泌物多重荧光染色液在检测阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的多重荧光染色液只含一种试剂，只需一步即可完成染色，操作简便、快捷。
(2)本发明的多重荧光染色液对样本染色只需5-10s，适合临床大批量开展工作。
(3)本发明的多重荧光染色液稳定性好，可长期使用，大大降低染色成本。
(4)女性阴道分泌物经本发明的多重荧光染色液染色后，在荧光显微镜下可同时呈现绿色、黄色及橘红色荧光，对比鲜明，染色鲜艳。
(5)本发明的多重荧光染色液检测方法敏感，既能检出活的病原菌，也能检出死的病原菌。如生理盐水湿片法镜检时，死滴虫难与白细胞区分而易被忽视，但在荧光染色下可清晰的观察到呈绿色荧光的虫体及呈橘红色荧光的偏位核，避免漏诊。
(6)本发明的多重荧光染色液染色结果稳定可靠，细胞和各种病原微生物的形态结构清晰，对比鲜明，在显微镜下可清晰的观察到各种病原微生物的形态、大小和分布，以及涂片中各种细胞的种类和数量。
(7)本发明的多重荧光染色液抛弃市面上常用的磷酸盐缓冲液，改为乙酸-乙酸钾缓冲液，并提高染液的酸度，使染色效果更加稳定，荧光鲜艳，对比鲜明；同时也避免了磷酸缓冲液不能长期保存、易生沉淀、影响染色效果的弊端。
(8)本发明的多重荧光染色液添加多聚甲醛作为抑菌剂，在不危害人体健康的情况下，具有防腐杀菌的功效，可提高荧光染色液的使用期限，同时可对细菌/真菌内的蛋白质起到固定作用，使其形态结构更加清晰。
(9)本发明的多重荧光染色液添加甘油与P-苯二胺作为抗淬灭剂，不仅可以延长荧光物质的淬灭时间，还可以起到保湿、促溶的作用，并提高染色液的稳定性。
(10)本发明的多重荧光染色液添加Triton X-100作为通透剂，通过溶解细胞膜上的脂质成分，提高细胞膜的通透性，加快荧光素及核酸染料与蛋白质等的结合，缩短染色时间。同时也是一种比较温和的去垢剂，作为添加剂可使蛋白质保持稳定，特别是膜蛋白。
附图说明
图1为本发明多重荧光染色液对白色念珠菌标准菌株进行染色后的状态图。
图2为本发明多重荧光染色液对金黄色葡萄球菌标准菌株进行染色后的状态图。
图3为本发明实施例1多重荧光染色液和对比例1染色液对线索细胞、滴虫及孢子染色的荧光强度统计结果。
图4为本发明多重荧光染色液对阴道分泌物中线索细胞进行染色后的状态图。
图5为本发明多重荧光染色液对阴道分泌物中假丝酵母菌菌丝染色后的状态图。
图6为本发明多重荧光染色液对阴道分泌物中假丝酵母菌孢子染色后的状态图。
图7为本发明多重荧光染色液对阴道分泌物中滴虫染色后的状态图。
图8为本发明多重荧光染色液对阴道分泌物中上皮细胞染色后的状态图。
图9为激光照射线索细胞的荧光淬灭曲线。
图10为激光照射滴虫的荧光淬灭曲线。
图11为激光照射孢子的荧光淬灭曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种生殖道分泌物多重荧光染色液，由以下组分组成：吖啶橙0.01mg/L，碘化丙啶0.01mg/L，多聚甲醛0.01g/L，甘油50mL/L，P-苯二胺0.1g/L，Triton X-100 5mL/L，乙酸钾5g/L，乙酸2mL/L，纯化水补足至1L；调节pH值在4.5-6.0之间。
所述生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：
1、将乙酸钾溶于纯化水中，搅拌使其完全溶解；
2、添加乙酸，调节pH值在4.5-6.0之间；
3、将吖啶橙溶解于部分S2所得的溶液中，搅拌使其完全溶解；
4、将碘化丙啶溶解于部分S2所得的溶液中，搅拌使其完全溶解；
5、将S2、S3、S4所得溶液混合在一起，并搅拌均匀；
6、依次将多聚甲醛、甘油、P-苯二胺、Triton X-100添加至S5所得溶液中，搅拌均匀；
7、调节pH值在4.5-6.0之间；
8、密封避光保存。
所述生殖道分泌物多重荧光染色液的染色方法，包括如下步骤：
1、生殖道分泌物涂片后固定；
2、多重荧光染色液染色5-10s；
3、流水冲洗、干燥。
实施例2
一种生殖道分泌物多重荧光染色液，由以下组分组成：吖啶橙1mg/L，碘化丙啶1.5mg/L，多聚甲醛0.5g/L，甘油40mL/L，P-苯二胺0.2g/L，Triton X-100 4mL/L，乙酸钾20g/L，乙酸6mL/L，纯化水补足至1L；调节pH值在4.5-6.0之间。
所述的生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法和染色方法与实施例1相同。
实施例3
一种生殖道分泌物多重荧光染色液，由以下组分组成：吖啶橙5mg/L，碘化丙啶10mg/L，多聚甲醛1g/L，甘油30mL/L，P-苯二胺0.35g/L，Triton X-100 3mL/L，乙酸钾10g/L，乙酸4mL/L，纯化水补足至1L；调节pH值在4.5-6.0之间。
所述的生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法和染色方法与实施例1相同。
实施例4
一种生殖道分泌物多重荧光染色液，由以下组分组成：吖啶橙20mg/L，碘化丙啶30mg/L，多聚甲醛1.5g/L，甘油20mL/L，P-苯二胺0.5g/L，Triton X-100 2mL/L，乙酸钾15g/L，乙酸8mL/L，纯化水补足至1L；调节pH值在4.5-6.0之间。
所述的生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法和染色方法与实施例1相同。
实施例5
一种生殖道分泌物多重荧光染色液，由以下组分组成：吖啶橙50mg/L，碘化丙啶50mg/L，多聚甲醛2g/L，甘油10mL/L，P-苯二胺0.6g/L，Triton X-100 1mL/L，乙酸钾8g/L，乙酸3mL/L，纯化水补足至1L；调节pH值在4.5-6.0之间。
所述的生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法和染色方法与实施例1相同。
对比例1
市场常见的荧光染色液，其成分为：吖啶橙100mg/L，余量为磷酸盐缓冲液；其pH值为6.8。
对比例2
市场常见的荧光染色液，其成分为：吖啶橙50mg/L，溴化乙啶50mg/L，磷酸二氢钠4.554g/L，磷酸氢二钠17.956g/L，氯化钠85g/L；其pH值为7.2。
对比例3
申请号为201911058048.7，发明名称为一种阴道微生物双重荧光染色液及其应用，实施例1的配方：其中，染色液A液：Sybr GreenI2.5mL/L，PerCP2.5mg/L，甲基绿10mg/L，乙酸60g/L，乙酸钠2.5g/L，纯化水9.4mg/ml；染色液B液：无水磷酸二氢钠10g/L，十二水合磷酸氢二钠30g/L，氢氧化钠1g/L，甘油10g/L，Proclin300 1g/L，纯化水9.9mg/mL。
实施例性能及效果验证
(一)实施例与革兰染色法及盐水湿片法对于女性阴道炎诊断阳性率的比较
1、样本的采集
通过阴道窥镜，用无菌棉试子自阴道后穹窿或阴道内壁处旋转采集阴道分泌物，装入无菌塑料管中送检。
2、样本悬液的制备
(1)将阴道分泌物充分洗脱至装有300μL生理盐水的试剂瓶，制备成样本悬浊液；
(2)取10μL样本悬浊液进行涂片，干燥后，火焰固定；
(3)同一样本涂3张片，分为实验组、对照组1和对照组2；
(4)实验组使用实施例5试剂，按照实施例1的染色方法进行染色；对照组1取市面上常见的革兰氏染色液，按照其说明书进行染色操作；对照组2则不进行染色，涂片后直接显微镜下观察，即生理盐水湿片法。
实验结果如下表1所示。
表1本发明多重荧光染色液与革兰染色法及盐水湿片法的检验结果
Figure BDA0002974363190000071
结果讨论：
从以上数据可知，本发明所述的生殖道分泌物多重荧光染色法对于细菌性阴道病(BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫性阴道炎(TV)、需氧菌性阴道炎(AV)、细胞溶解性阴道病(CV)及混合型阴道炎等的检出率，明显优于革兰染色法及生理盐水湿片法。
(二)实施例与对比例对于标准菌株染色的比较
第1部分：菌悬液的制备
1、将白色念珠菌及金黄色葡萄球菌(购自广东环凯微生物有限公司)制备成菌液，使用生理盐水4000r/min离心10min，此步骤重复3次；
2、使用生理盐水将标准菌株的浓度制备为约1.5×108/mL。
第2部分：标准菌株的染色
1、将上述菌悬液4000r/min离心10min，弃上清液，留沉淀，并放入振荡器中震荡混匀；
2、加入100μL多重荧光染色液，混匀后，静置5～30s；
3、加入1mL生理盐水混匀，以终止反应；
4、放入离心机中4000r/min离心10min，弃上清液，留沉淀；
5、加入1mL生理盐水后放入振荡器中震荡混匀。
注：对比例的时间按照其说明书规定的染色时间进行操作。
第3部分：充池与观察
1、用绸布试净改良牛鲍计数板和盖玻片；
2、取小试管1支，加入生理盐水1mL；
3、用清洁干燥的微量吸管采集染色之后的标准菌菌悬液10μL，擦去管外多余液体，轻轻加至生理盐水底部，再轻吸上清液清洗吸管2-3次，立即混匀；
4、混匀后用微量吸管将标准菌悬液充入计数池；
5、室温下平放3-5min，待下沉后于荧光显微镜B波段下观察；
6、先用低倍镜观察细菌分布是否均匀，如严重分布不均，应重新充池；
7、取5个不同的位置，在同一条件下拍摄5张荧光图片。
第4部分：计数
1、打开ImageJ，导入图片：File→Open：打开需要计数的荧光图片；
2、转换图片格式：Image→Type→8-bit；
3、调整阈值，去除背景，选中目标：Image→Adjust→Threshold；
4、选择Red来进行表征，勾选Dark Background，将背景变为黑色；
5、填补的空隙：Process-Binary-Fill Holes；
6、打断重叠部分：Process-Binary-Watershed；
7、自动分析及计数：Analyze-Analyze Particles，设置完成后，点击OK。
注：勾选Exclude on edges，处于边缘的颗粒不计入。
第5部分：数据整理
将ImageJ计算得出的5组数据求均值，得到本次实验的最终比对数据。
实验结果如下表2和图1、2所示。(数值越大表示染上颜色的标准菌株数量越多)
表2本发明多重荧光染色液与对比例1对标准菌株的染色结果
组别 对比例1 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
白色念珠菌 3198 3771 3785 3792 3809 3824
金黄色葡萄球菌 3274 3963 3975 3986 3992 4003
结果讨论：
从上述数据可知，相同数量的白色念珠菌或金黄色葡萄球菌，在使用实施例1-5及对比例1分别进行染色后，实施例1-5着色的白色念珠菌或金黄色葡萄球菌数量明显高于对比例1，说明本发明所提供的一种生殖道分泌物多重荧光染色液对于细菌及真菌的染色更具有亲和力，着色能力更强。
(三)荧光强度的对比
使用ImageJ对线索细胞、滴虫及孢子的荧光强度进行定量测定，具体操作如下：
1、根据(一)所述的步骤对同一患者的阴道分泌物涂片后分别使用实施例1及对比例1中的染液进行染色；
2、在同一条件下各自拍摄一张荧光图片；
3、打开ImageJ，导入图片：File→Open：打开需要测量的荧光图片；
4、转换图片格式：Image→Type→16-bit(调成灰度图片，此步骤非常重要，但可根据需要调成8或32bit)；
5、设置需测量参数：Analyze→Set Measurements；在弹出的设置选项框中依次勾选测量对象：面积(Area)、平均灰度值(Mean)、累积光密度(IntDen)后，点击OK；
6、调出ROI Manager界面：Analyze→Tools→ROI Manger，勾选Show All及EditMode；
7、在图片上选择测量对象并计算，具体如下；
a.点击主界面的套索工具；
b.用套索工具在图上勾画出一个待测对象轮廓后，在ROI Manager界面点击Add，选中对象，点中后选择Rename，此时命名为1，点击OK；
c.按照步骤b继续用套索工具在图片上勾选出多个待测对象及背景对象，并按照顺序以及目的重命名，选择好后在ROI Manager界面中，按住shift键选择所有测量对象，然后点击Measure；
d.点击Measure后，会弹出结果值，其中Area列举了每个对象的面积；Mean为每个对象的平均灰度值；IntDen表示为每个对象的累积光密度；
8、数据整理：将步骤7得到的结果另存至EXCEL表格中，求出背景细胞的平均光密度，校正后的累积光密度＝累积光密度-待测对象面积*背景平均光密度；即IntDen(校正)＝IntDen-Area*Mean(背景)。
实验结果如表3和图3所示(数值越大代表荧光强度越强)。
表3本发明多重荧光染色液和对比例1染色液对线索细胞、滴虫及孢子染色的荧光强度
Figure BDA0002974363190000091
Figure BDA0002974363190000101
结果讨论：
从以上数据可知，本发明所述的生殖道分泌物多重荧光染色液与传统荧光染色液相比，本发明对于线索细胞、滴虫及孢子染色后的荧光强度更强。
图4为实施例1对细菌性阴道病患者阴道分泌物进行染色后的效果图，其中线索细胞易于观察，为正常呈绿色荧光的鳞状上皮细胞胞浆粘附大量呈橘红色荧光的球菌和/或小杆菌，导致细胞边界模糊，与正常的鳞状上皮细胞形成鲜明对比。
图5为实施例1对外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道分泌物染色后的效果图，其中假菌丝呈黄色荧光，竹节状结构清晰可见，颜色鲜艳。
图6为实施例1对外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道分泌物染色后的效果图，其中孢子呈黄色荧光，形态清晰，颜色鲜艳。
图7为实施例1对滴虫性阴道炎患者阴道分泌物染色后的效果图，其中滴虫呈梨形，虫体呈绿色荧光，偏位核清晰可见，呈橘黄色荧光，形态完整，可见鞭毛。
图8为实施例1对阴道分泌物中上皮细胞染色后的效果图。
(四)染色液稳定性对比
将实施例1制备的生殖道分泌物多重荧光染色液与对比例1的染色液，按照说明书规定的储存条件保存至有效期末后进行以下实验，实验步骤如下：
1、观察染色液是否有沉淀；
2、根据(一)所述的步骤分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色；
3、根据(三)所述的步骤对线索细胞、滴虫及孢子进行荧光测定。
实验结果如表4所示(数值越大代表荧光强度越强)。
表4本发明多重荧光染色液和对比例1染色液的稳定性对比
Figure BDA0002974363190000102
结果显示：
1、由表4结果可知，处于有效期末的实施例1未发现有沉淀现象，处于有效期末的对比例1出现明显的沉淀，说明本发明所提供的一种生殖道分泌物多重荧光染色液稳定性更好，不易出现沉淀；
2、使用处于有效期末的实施例1及对比例1分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色，实施例1对于线索细胞、滴虫及孢子染色后的荧光强度明显高于对比例1，说明本发明对于细菌、真菌及滴虫的染色更具有亲和力，着色更均匀，荧光强度更强，对比更加清晰。
(五)染色时间对比
以白色念珠菌标准菌株为例，按照上述所提供的染色步骤进行操作，观察在不同染色时间下的染色效果，根据(三)所述的步骤对孢子进行荧光测定。
实验结果如表5所示(数值越大代表荧光强度越强)。
表5本发明多重荧光染色液和对比例1染色液的染色时间对比
Figure BDA0002974363190000111
结果讨论：
由上述实验结果可知，在相同的染色时间下，使用本发明所提供的染色液对于白色念珠菌染色后的荧光强度明显高于对比例1，这归功于本发明所添加的通透剂。
本发明添加Triton X-100作为通透剂，它是一种非离子表面活性剂，可通过溶解细胞膜上的脂质成分，提高细胞膜的通透性，加快荧光素及核酸染料与蛋白质等的结合，缩短染色时间。同时也是一种比较温和的去垢剂，作为添加剂可使蛋白质保持稳定，特别是膜蛋白。
由实验结果可知，本发明添加Triton X-100作为通透剂得到了较理想的效果，和传统的荧光染色液相比，缩短了染色时间，极大的提高了工作效率。其中，图1为本发明对白色念珠菌标准菌株进行染色后的效果图，白色念珠菌均呈黄色荧光，颜色鲜艳，形态清晰，荧光强度强。
(六)对比度对比
根据(一)所述的步骤分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色，观察线索细胞、滴虫及孢子的形态及与正常鳞状上皮细胞或背景的对比度。其中对照组为对比例2。
实验结果如表6所示(“+”越多代表形态及结构对比更加清晰)。
表6本发明多重荧光染色液和对比例2染色液的对比度对比
Figure BDA0002974363190000121
结果显示：
与对比例2相比，本发明提供的一种生殖道分泌物多重荧光染色液对于细菌、真菌及滴虫的染色更具有亲和力，着色更均匀，对比更加清晰，易于结果的判读，这得利于本发明使用的核酸染料。
市面上常用的核酸染料为溴化乙啶，它是一种高灵敏度的嵌入性荧光染料，活细胞、固定细胞及各种微生物均能从极稀的溶液中摄取EB染料，当阴道分泌物经其染色之后，在荧光显微镜B波段下会激发大量橘红色荧光，导致与周围细胞或微生物的对比不够清晰，造成视觉疲劳，并干扰判读。
本发明使用碘化丙啶代替溴化乙啶作为核酸染料，得到了理想的效果。碘化丙啶是溴化乙啶的类似物，是一种可对DNA染色的细胞核染料，尽管不能通过活细胞膜，但却能通过破损的细胞膜而对DNA进行染色，与吖啶橙一起使用时，荧光显微镜下激发出的黄色、橘红色、绿色荧光对比清晰，视觉效果良好，易于结果的判读。
(七)多聚甲醛的固定效果
根据(一)所述的步骤分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色，观察线索细胞、滴虫及孢子的形态及与正常鳞状上皮细胞或背景的对比度。其中对照组为本发明提供的生殖道分泌物多重荧光染色液，但未添加多聚甲醛。
实验结果如表7所示(“+”越多代表形态及结构对比更加清晰)。
表7多聚甲醛的固定效果
Figure BDA0002974363190000122
Figure BDA0002974363190000131
结果显示：
由表7结果可知，本发明在添加了多聚甲醛后，可使线索细胞、滴虫及孢子染色后的形态更加清晰，对比更加鲜明，这得益于固定剂的作用。
本发明添加了多聚甲醛作为固定剂，其固定效果温和，可使蛋白质凝固，防止细胞自溶及收缩变形，并具有较强的通透性，可使细菌、真菌及滴虫的形态及对比度更加清晰，取得了较理想的效果。
(八)淬灭时间对比
1、根据(一)所述的步骤分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色；
2、在同一条件下，对同一视野下的线索细胞、滴虫或孢子分别使用荧光显微镜B波段激光照射20s、40s、60s及80s后拍摄一张荧光图片；
3、使用ImageJ对每个时间段的线索细胞、滴虫或孢子的荧光强度进行测量；
4、其中对照组为本发明提供的多重荧光染色液，但未添加抗淬灭剂。
实验结果如表8、图9-11所示(数值越大代表荧光强度越强)。
表8淬灭时间对比
Figure BDA0002974363190000132
结果显示：
荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素则包含多方面，其中光照是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭；另外溶剂种类、pH值及温度等环境条件也会引起荧光的淬灭。因此，本发明添加抗荧光淬灭剂来延缓荧光的淬灭。
由上述结果可知，本发明提供的生殖道分泌物多重荧光染色液在添加了抗淬灭剂后得到显著的抗淬灭效果，同时也增强了荧光强度。
(九)pH值的比对
1、按照实施例1的配制步骤，分别配制pH值为4.5、5.5、6.8及7.2的乙酸-乙酸钾缓冲液液；观察荧光素及核酸染料的溶解度；
2、使用以上试剂根据(一)所述的步骤分别对细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)及外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的阴道分泌物进行染色；观察线索细胞、滴虫及孢子的形态及与正常鳞状上皮细胞或背景的对比度。
实验结果如表9所示(“+”越多代表溶解度越好或形态及结构对比更加清晰)。
表9 pH值的比对
Figure BDA0002974363190000141
结果显示：
当乙酸-乙酸钾缓冲液的pH值在4.5-5.5时，荧光素及核酸染料的溶解度较好，不易出现沉淀，且配制的多重荧光染色液对细菌、真菌、滴虫染色后可使其形态及对比度更加清晰。最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括荧光素、核酸染料、抑菌剂、防淬灭剂、通透剂和缓冲液；pH4.5-6.0。
2.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的荧光素为吖啶橙、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、5-羧基-4,7-二氯罗丹明6G、6-羧基-4,7-二氯罗丹明6G、5-羧基-4,7-二氯四甲基罗丹明、6-羧基-4,7-二氯四甲基罗丹明、5-羧基-4,7-二氯-X-罗丹明、AMCA琥珀酰亚胺酯、AMCA C2马来酰亚胺、7-二乙胺基-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸、AMCA乙二胺、EDANS酸5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸、EDANS钠盐5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸钠盐、EDANS C2马来酰亚胺、生物素酰肼或生物胞素酰肼中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的核酸染料为6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、氨基烯丙基-DUTP钠盐、DAPI、碘化丙啶、溴化乙啶或溴化乙啶衍生物中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的抑菌剂为Proclin 300、叠氮钠、硫柳汞、山梨酸钾、异噻唑啉酮、庆大霉素、甲醛或多聚甲醛中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的防淬灭剂为甘油、P-苯二胺、n-丙基没食子酸盐、1，4-二偶氮双环-辛烷、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸、4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯、DABCYL C2胺、DABCYL C2马来酰亚胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的通透剂为Triton X-100或吐温。
7.根据权利要求1所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的缓冲液为乙酸-乙酸钾缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的生殖道分泌物多重荧光染色液，其特征在于，所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括吖啶橙0.01-100mg/L，碘化丙啶0.01-100mg/L，多聚甲醛0.01-5g/L，甘油10-100mL/L，P-苯二胺0.1-1g/L，Triton X-100 1-10mL/L，乙酸钾1-30g/L，乙酸1-10mL/L，纯化水补足至1L；pH4.5-6.0。
9.权利要求8所述的生殖道分泌物多重荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将乙酸钾溶于纯化水中，搅拌至完全溶解；
S2.添加乙酸，调节pH值为4.5-6.0；
S3.将荧光素、核酸染料溶解于S2所得的溶液中，搅拌均匀至完全溶解；
S4.依次将抑菌剂、防淬灭剂及通透剂添加至S3所得溶液中，搅拌均匀；
S5.调节S4所得溶液pH值为4.5-6.0，即得生殖道分泌物多重荧光染色液。
10.权利要求1-8任一项所述的生殖道分泌物多重荧光染色液在检测阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本中的应用。
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