CN102971617A - 分析细胞dna含量的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种作为2步法而快速简单地量化生物细胞的核酸的方法。在第一步中，用含有非离子去垢剂和特异性DNA荧光标记的酸性溶液处理细胞。在第二步中，可中和样品。对核含量的测定可以通过荧光显微镜来执行。该方法也可用于获得细胞周期分析、倍性确定以及细胞的增殖、健康、胁迫水平、凋亡、坏死或其他状态的分析检测法。本发明也涉及包括酸剂、去垢剂、标记试剂和任选的中和剂的部件试剂盒。
Description
本申请中引用或者本申请中的所有专利和非专利文献都在此通过整体引用而引入本文。
技术领域
本发明涉及测定生物细胞的核酸量的方法。该方法简单、快速且可靠地分析并量化生物细胞的DNA或DNA和RNA含量。在此描述的方法是基于通过向样品中添加酸来裂解生物细胞，标记核酸以及任选地在检查被标记的核酸前中和样品。该方法尤其适合与作为标记试剂的能够鉴定DNA和/或RNA的荧光团一起使用。该方法可以，例如用于细胞周期分析、倍性确定以及细胞的增殖、健康、胁迫水平、凋亡、坏死或其他状态的分析检测法。本发明也涉及测定生物细胞的核酸量的装置以及用于该装置中的盒(cassette)。本发明也涉及用于测定生物细胞的核酸量的部件试剂盒(a kit of parts)。
背景技术
表征细胞存活性以及其他细胞特征能够对于广泛的应用提供有用的信息。然而，目前采用的方法非常复杂且耗时。细胞周期代表了真核细胞中最基础且重要的过程。作为以细胞生长并分化成两个子细胞结束的有序的事件集合，细胞周期紧密地受到若干细胞周期调控子的限定的时空表达、定位和损坏的调控。细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)是细胞周期的主要控制开关，造成细胞从G1期移至S期或从G2期移至M期。在给定的群体中，细胞将分布在细胞周期的三个主要时期：G1/G0期(每个细胞一套配对的染色体)、S期(具有可变的DNA量的DNA合成期)以及G/M期(在细胞分裂前，每个细胞两套配对的染色体)。
由于细胞周期异常调控在瘤形成中普遍地发生，发现抗癌药剂的新靶标以及改善疗法的机会成为集中关注的焦点。细胞周期分析应用于生命科学研究和药物开发的多种领域，包括癌生物学、细胞凋亡分析、药物筛选和测量细胞培养物的健康状态，例如在生物反应器中。
测定细胞周期阶段的最常见的方法是基于细胞DNA含量的测量。DNA含量可以使用与DNA质量成比例地展现发射信号的DNA选择性的荧光染色来测定。细胞荧光性通过流式细胞仪、图像或激光扫描细胞仪来测量。多种荧光染料可以用于DNA染色。
DNA染色通常是在用非离子型去垢剂或醇固定而透性化的细胞上进行。在文献中已经发表了基于这两种方法进行细胞透性化的过多的方案。尽管这些方案中多数都相对简单并可应用于许多细胞类型，但是它们有若干缺点和限制。首先，现有技术的方法需要细胞处于悬浮状态并因此，不得不在分析前使粘附细胞系脱落。其次，现有技术的方法含有洗涤步骤，需要离心而通常会造成细胞损失。第三，现有技术的方法促进细胞聚集，这会损害单个细胞的DNA含量的量化。
在此描述的方法通过释放细胞中的核并在这些核上执行核酸量化，是量化单个细胞的DNA和/或RNA的简单方法。
普遍使用的监控粘附细胞的细胞浓度的方法是对释放的核计数。核的释放通常是通过使用含有诸如Triton-X100的温和去垢剂的溶液来实现。已经描述了Triton-X100结合柠檬酸可从贴壁依赖性培养物以及含有细胞聚集体的培养物中有效地释放核(Lin et al.，Arapid method for counting cell nuclei using a particle sizer/counter(1991).BiotechnologyTechniques，5，153-156)。Lin等人使用100mM柠檬酸、1％tritonX-100以及0.1mg/ml结晶紫的溶液。这一溶液的pH值低于2，并且有非荧光染料。Lin等人的方法是用于细胞计数而并非用于测定核中的核酸量。
当量化核的核酸以评估细胞周期的阶段时，重要的是获得没有很多“噪音”的结果。在此描述的发明使得能够在低倍率下，从被标记的核酸获得良好的结果，且噪音程度很低。
发明内容
在此所述的方法提供了简单、快速且稳健地分析并量化细胞DNA含量的方法。优选的方法是两步方案。在第一步中，简单地用含有非离子型去垢剂和诸如DAPI的DNA特异性染料的弱酸溶液处理。这一处理造成细胞核从细胞中的有效脱落，样品核酸的解凝集并均一染色。在第二步中，可通过加入弱碱溶液来中和样品。中和样品后，可以使用流式、图像或激光扫描细胞仪来直接量化细胞荧光性。
出人意料地发现，当通过在此所述的方法来处理细胞时，能够获得具有被标记的核酸的细胞核，其中即使在低倍率显微设备中也能够容易地检测核中的核酸量。在此所述的方法造成：
·很少或没有聚集的细胞核，
·样品的液体稠度，使得很容易分析样品，
·当绘示标记的核的核酸含量谱时，引起G0/G1或G2期的尖峰的细胞核，
·引起峰的CV降低的细胞核，
并且该方法简单快速并得到可靠的结果。
本发明因此涉及量化至少一种生物细胞的核酸的方法，其中该方法包括步骤：
i.提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分是获自至少一种生物细胞，
ii向样品中添加酸剂使样品酸化至pH水平在2.0和3.0之间，
iii向样品中添加去垢剂使生物细胞裂解，
iv.向样品中添加荧光标记试剂，获得具有被标记的核酸的样品，其中荧光标记试剂与核酸相互作用，
v.确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量。
酸剂优选将样品pH降低至pH 1.5-4.5，例如降低至pH水平在2.0和3.0之间。降低的pH和去垢剂一起造成细胞核从细胞中释放。细胞核释放后，这些核的核酸优选用荧光团标记。基于荧光性的分析可以揭示核中存在的核酸量。
该方法也可用于获得关于细胞周期分析、倍性确定、核苷酸掺入的测量以及细胞的增殖、健康、胁迫水平、凋亡、坏死或其他状态的分析检测法的信息。
本发明也涉及用于在此所述方法的部件试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
·一定量的酸剂，
·一定量的去垢剂，
·一定量的能够与核酸相互作用的标记试剂，以及
·任选地，一定量的中和剂。
一种用于裂解及标记生物细胞的组合物，所述组合物包括：
·酸剂或酸缓冲液，
·去垢剂，和
·荧光标记试剂。
另一种组合物可以是用于标记生物细胞同时中和包括该生物细胞的样品的组合物，其中，所述组合物包括：
·荧光标记试剂，和
·中和剂。
该方法简单快速，并且可以在加载设备后几分钟内获得结果，该设备包括结合了图像分析软件的荧光显微镜、流式细胞仪以及激光扫描细胞仪。
该方法可以用于分析造成个体的细胞不稳定的疾病发展，其中该方法包括在两不同时间点的步骤：
a.从个体获得生物样品，
b.分析所获得的生物样品中不稳定细胞的存在，
c.比较在两不同时间点时在生物样品中鉴定出的不稳定细胞数，
d.基于在两生物样品中鉴定出的不稳定细胞数，确定疾病的发展。
本方法尤其适于监控癌症疾病或改变血液细胞的疾病的发展。
附图说明
图1示出不同细胞类型的核的DNA含量谱图，其中核是通过酸裂解及用DAPI染色而获得。
图2示出在不同pH值裂解的MCF-7细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱图。
图3示出附着到不同底物的U2OS细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱图。
图4示出在不同生长时期A3细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱图。
图5示出用不同药物处理的U2OS细胞的DNA直方图。
发明具体说明
在此所述的方法允许对细胞群中的生物细胞脱落、透性化、解凝集以及均一染色。以简单的形式，可以以两个简单步骤执行该方法而不需要任何洗涤和/或不需要任何离心。
一方面，本发明涉及量化至少一种生物细胞的核酸的方法，其中该方法包括步骤：
i.提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
ii向样品中添加酸剂使样品酸化，
iii向样品中添加去垢剂使生物细胞裂解，
iv.向样品中添加荧光标记试剂，获得具有被荧光标记的核酸的样品，其中荧光标记试剂与核酸相互作用，
v.确定样品中至少一种生物细胞或者细胞部分的被荧光标记的核酸的含量。
如下所述，可同时将酸剂和去垢剂加入样品中，由此将上述三步法减少到更简单的两步法。标记试剂可以与酸剂和去垢剂一起添加或者可以在后面添加。中和剂可以与标记试剂一起添加或者在用标记试剂标记核酸后添加。可以例如，通过流式细胞仪、激光扫描显微镜和荧光显微镜，例如在包括荧光显微镜和能够分析从标记的生物样品获得的数据的成像和处理工具的系统中，来测定被标记的核酸的含量。
样品
在此所述方法要分析的样品可为任何样品，例如生物样品，包括应确定核酸量的细胞。对细胞核酸量的确定可以用于多种目的，这些目的中的一些为细胞周期分析、倍性确定、核苷酸掺入的测量以及细胞的增殖、健康、胁迫水平、凋亡、坏死或其他状态的分析检测法。
术语“核酸量”通常意指存在于细胞核中的核酸，但是也可以是细胞核与其他细胞器中的整个核酸量。对于没有细胞核的细胞(原核细胞)，“核酸量”是细胞核酸的整个含量。
特别地，生物样品可选自体液样品、组织样品、发酵样品、液体培养样品、细胞培养样品、水样品，例如哺乳动物和酵母细胞培养物、饮料样品、药物样品、在液体中悬浮的细胞以及来自生产治疗性蛋白的细胞。
更特别地，生物样品选自血样、尿样、唾液样品、精液样品、水溶性组织样品、乳样、脑脊液或淋巴液。生物样品也可以选自肝样品、肾样品、肌肉样品、脑样品或肺样品。
生物样品可选自任何物种，例如人类样品、小鼠样品、大鼠样品、猴子样品、狗样品。此外，样品可选自细胞培养物，例如细菌培养物、哺乳动物细胞培养物、原生动物培养物或其他细胞培养物。
代表生物材料的样品可以自原始材料获取和在与制造、存储以及运输所述生物材料相关的过程获取。
待分析的样品可包括至少一个生物细胞，或者该样品可包括具有核酸的细胞部分，其中该细胞部分是从至少一个生物细胞中获得的。细胞部分可例如，是从任何类型的细胞分离的核，或者细胞部分可以是例如从植物细胞、细菌细胞或真菌细胞获得的原生质体或原生质球。
在此提及的任何样品的生物细胞可为原核细胞。对于没有细胞核的原核细胞，将要被在此所述的方法标记的核酸量是细胞的整个核酸。当用在此所述的酸剂和去垢剂处理原核细胞而不除去细胞膜时，这一细胞膜阻止细胞的核酸释放，使得能够分析单个细胞。优选地，用在此所述的方法分析的细胞是没有细胞壁的细胞。
优选地，待分析的生物细胞是真核细胞。真核细胞可选自原生动物、真菌、细菌、动物细胞和植物细胞。
获自真菌的样品可以从发酵生物组中获得，例如酵母-酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、白色念珠菌(candida albicans)；从丝状真菌中获得，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。
该方法尤其适于酵母菌酿酒酵母和裂殖酵母，因为这两个种类都用作细胞周期控制的模式系统。
优选地，用于在此所述方法的动物细胞是哺乳动物细胞。
动物细胞可获自选自血样、尿样、唾液样品、精液样品、水溶性组织样品和乳样的生物样品。
动物细胞也可获自选自肝样品、肾样品、肌肉样品、脑样品和肺样品的生物样品。
哺乳动物细胞可选自细胞系、组织、体细胞、血液、动物精液、乳、上皮细胞、脂肪细胞、杂交瘤细胞组。
可以由在此所述的方法进行分析的哺乳动物细胞的实例是来自CHO(中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)；MCF-7(乳腺癌细胞系)；U2OS(从骨细胞培养的人成骨肉瘤细胞)；Jurkat细胞；HeLa(人宫颈癌细胞系)；HEK-293(人肾细胞细胞系)；COS-7(非洲绿猴肾细胞系)；MDCK(狗肾细胞系)；NIH-3T3(小鼠胚胎细胞系)以及Schneider S2(果蝇细胞系)细胞的细胞系。在此所述的酸裂解法已经在所有上述细胞类型中验证为具有相似的结果。只是在此没有示出全部这些实验。
优选的待分析细胞系包括HepG2(人肝癌细胞系)、Hep2(人喉癌细胞系)、KB(人咽细胞系)、U87(胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞系)、Saos-2(骨肉瘤)、YAR(EBV转化的B细胞)、Vero(非洲绿猴肾细胞系)、BHK-21(仓鼠肾细胞系)以及Sf9(昆虫(草地贪夜蛾)肾细胞系)。
动物细胞可选自任何动物，例如选自小鼠、大鼠、猴、狗、鱼、牛/牲畜、昆虫、马、猫、鸟和猪的动物组。
待分析的细胞也可为任何种类的植物细胞。作为实例，植物细胞可选自叶细胞、花粉细胞、卵细胞、愈伤组织细胞和原生质体组。植物细胞也可获自幼苗或者获自体外生长的植物或植物器官。
可以不除去细胞壁而分析植物细胞。然而，为了获得良好的结果，及基于对个体细胞进行分析的结果，重要的是在执行对细胞内的核酸量进行分析之前，将细胞彼此分离。
当从植物获得检测细胞时，也能够在原生质体上执行分析。原生质体可以通过对细胞壁进行酶促分解来产生。可以使用任何通常用于除去细胞壁的酶来生产由在此所述方法分析的原生质体。因为在此所述的方法对于生物细胞是致死的，所以不需要原生质体能够再生成植物细胞或整个植物。
当分析植物细胞时，有益的是只执行基于从细胞释放的细胞核的分析。由此，可以避免任何来自能够结合细胞质中存在的标记试剂的细胞器或其他结构的被标记的核酸的可能信号。
如在此所述用来分析的样品可为选自附着于固体支撑物、体外生长板、培养皿中的细胞，在T-烧瓶、微滴定板、生物反应器、悬浮培养瓶、微载体(微载体珠)中培养的细胞，3-D培养物、器官培养物以及悬浮培养的细胞。
用在此所述方法分析的优选的细胞是附着于固体部件的细胞。在执行在此所述的分析之前，从固体部件释放细胞或从贴附到固体部件的细胞膜释放细胞核。
细胞释放
含有待被在此所述方法分析的生物细胞的样品可作为在固体部件上培养的细胞来获得，或者可为来自动物或植物源的组织，或者该细胞可为液体样品，例如获自哺乳动物的液体样品。更多类型的样品如本文其他地方所述。在向生物细胞添加酸剂之前，可从固体部件释放细胞，或者可从组织释放细胞。然而，在优选的实施方式中，整个细胞不需要在悬浮中来执行在此所述的分析。
在固体部件或固体支撑物上培养的细胞可通过用胰蛋白酶、胶原酶、分散酶或补充了诸如EDTA和维尔烯的螯合剂的等渗溶液来处理而从这一固体部件释放。然而，在优选的实施方式中，细胞在通过在此所述方法的添加酸剂和中和剂来释放细胞核之前，从固体部件中释放。由此，该方法不存在胰蛋白酶化处理。细胞核可以直接从在固体部件上培养的细胞中释放。
当用组织进行工作时，组织可以是均质的，例如通过组织均质化，例如用杵使用Potter-Elvehjem组织研磨器进行。均质的组织可以由在此所述的方法进行分析。对于作为组织样品获得的细胞，也能够直接用酸剂和/或去垢剂处理一个或多个组织部件来从组织释放细胞核。在用酸剂和/或去垢剂执行反应前可将组织置于诸如水的液体中。在释放细胞核后，可除去剩余的组织，例如通过过滤来释放，并且释放的细胞核可作为部分过滤的液体来获得。液体可如本文其他地方所述从细胞核中除去。
当具有待分析的生物细胞的样品包括培养物培养基或是获自诸如哺乳动物的液体样品时，可以在用酸剂处理之前或之后，从细胞活细胞部件中除去这一培养物培养基或液体培养基。
除去培养物培养基或液体培养基，例如通过添加酸剂除去培养物培养基或液体培养基，可以通过倒掉液体部分、通过移液管、过滤、沉淀或离心除去液体部分来执行。
细胞或细胞部件的洗涤步骤可以在向样品中添加酸剂之前来执行。优选地，洗涤步骤在除去培养物培养基后来执行。通过洗涤细胞和/或细胞核，可以从样品中除去一些能够与标记试剂(例如染料或荧光染料)相互作用的结构。由此，因为避免了来自这些结构的信号，改善了结果。然而，在优选的实施方式中，不进行洗涤步骤而执行在此所述的方法。
洗涤步骤可以用洗涤溶液来执行。洗涤溶液可选自平衡盐溶液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)、Hanks′Balanced Salt Solution(HBSS)和Earle′s Balanced Salt Solution(EBSS)组。PBS(磷酸盐缓冲液)是优选的洗涤溶液。
如下所述的实施例4阐述了该方法可以用于对来自贴附于不同材料的细胞的细胞核进行有效的释放以及染色，所述材料例如T-烧瓶、微滴定板以及微载体。
如下所述的实施例5阐述了除了贴附细胞以外，该方法还可以用于悬浮细胞，以及广泛到悬浮状态的粘附细胞。
样品酸化
在优选的实施方式中，通过添加酸剂对具有生物细胞或细胞部分的样品进行酸化。通过如在此所述降低样品pH，生物细胞的核酸浓缩，并且降低的pH值使得能够在实际流动的液体中分析分离的核。如果不加入酸剂来执行该方法，那么液体的流动性较差并且更难于处理，即变得更难于获得分离的核来进行分析。不加入酸剂，样品的稠度可描述为“黏性的”。
待加入样品中的酸剂优选液体形式。然而，也可以使用酸性盐作为酸剂。优选液体形式的酸剂是因为相比于用酸性盐来降低pH，液体形式的酸剂更易于将样品的pH调节到正确的数值。
酸剂可以选自柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液、磷酸、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、乳酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐和丙酸盐的生物缓冲液组。
优选的缓冲液是柠檬酸盐、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐和乳酸盐。进一步优选的缓冲液是柠檬酸盐和磷酸盐。
在优选的实施方式中，如上所述的酸剂是以适于获得pH值在1.5-4.5范围的酸化样品的量加入样品中。优选地，样品的pH降低至1.7-4.0。更优选地，pH为1.8-3.5。甚至更优选pH为2.0-3.0，进一步优选2.1-2.9，更优选2.2-2.8。pH范围也可以是2.3-2.7；2.4-2.6；2.45-2.55或者pH可以是约2.5。如果将pH降至低于2，例如降至pH 1.5，那么存在着DNA和/或RNA被破坏的风险。这将降低在检查被标记的核酸含量时所进行的分析的数值。如果pH值太高，即，高于3，例如4.5，那么样品将是黏性的并且细胞可能会彼此粘附，这将降低获得良好分析的能力。
在优选的实施方式中，酸化样品的pH保持在酸性条件下约1-30min的时间段，例如，1.5-20min，如2.5-10min，例如3-8min，如3.5min-7min。优选地，维持酸性条件约4min至约6min。更优选地，酸性条件维持约5分钟。
酸剂优选液体溶液，其中任何提及的缓冲液的浓度在25-250mM的范围，优选在50-200mM的范围，更优选75-150mM，最优选浓度为约100mM。
用于分析带细胞核的样品的酸剂的量可为任何量。然而，当向样品中添加酸剂时，酸化样品的pH值非常重要。酸化样品的pH值应优选如上所述。
在优选的实施方式中，酸化步骤在没有核酸水解下进行，因为水解造成DNA量化不准确。
在另一优选的实施方式中，不将样品胰蛋白酶化作为此方法的一部分执行。
在进一步优选的实施方式中，具有核的样品不进行细胞固定。因此可省略固定步骤，即在酸化步骤前后不存在固定步骤。尤其优选地，不执行用诸如50-96％的醇，例如70％的醇执行的固定步骤。
细胞裂解-去垢剂
在优选的实施方式中，向样品中添加去垢剂。去垢剂透性化或裂解细胞质膜并维持细胞核的完整。通过透性化或裂解细胞质膜，能够使细胞核从细胞中释放。
去垢剂可以和酸剂同时添加到样品中或者在添加酸剂后添加到样品中，例如，当样品保持在降低的pH至少1min时，例如至少2min，如至少3min，例如至少4min，如至少5min，例如至少6min，如至少8min。
去垢剂可以选自Triton X-15、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-207、Triton N-57、Triton N-101、Triton QS-158、Triton 770、Igepal CA-630、NP-40、Brij-35、Brij 96、Tween-20、Tween-80、CHAPS、Cetyl、Cetyl-N3、Luten-Sol、Losec和Pluronic L31的组。
下面的去垢剂都是非离子型的并且是优选的去垢剂：Triton X-15、Triton X-100、TritonX-114、Triton N-57、Triton N-101、Triton QS-158、Igepal CA-630、NP-40以及Brij 96。在此所述的去垢剂优选用作液体，其去垢剂浓度为0.05％-5％(w/v)，更优选0.06％-4％，进一步优选0.07-3.5％，还进一步优选0.08％-3％，甚至更优选0.09％-2.5％，最优选0.1-2％。该浓度因此也可以在0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.5％或1.5％-2％的范围。
更优选地，所用去垢剂的量组成酸剂量的0.05％-5％(w/v)，更优选0.06％-4％，进一步优选0.07-3.5％，还进一步优选0.08％-3％，甚至更优选0.09％-2.5％，最优选0.1-2％。相对于酸剂量，去垢剂的浓度可以因此在0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.5％或1.5％-2％的范围。
在优选的实施方式中，去垢剂与酸剂一起存在于液体中。酸剂的浓度可以是上述任何值，并且去垢剂的浓度也可以是上述任何值。优选地，酸剂的浓度为75-150mM，并且去垢剂以组成液体组合物0.08％-3％的量添加。进一步优选的是酸剂浓度为约100mM并且去垢剂为0.1-2％的液体组合物。
在实施例1中，示出了使用酸裂解(柠檬酸+非离子型去垢剂)释放的细胞核可以用DNA特异染料DAPI进行均匀染色并用于通过定量细胞仪获得DNA含量谱图。实施例1的结果进一步示出如果在分析前中和酸释放的细胞核，那么可以显著改善本方法的准确性和精确性。
在下面示出的实施例2中，确定核释放、解聚和均匀DNA染色的最佳pH范围。染色细胞DNA的标准方案描述了中性pH的缓冲液(参见例如，Darzynkiewiez，Z.，et al.(2001)Current Protocols in Cell Biology，Eds.Bonifacino，J.S.，et al.，John Wiley & Son)。然而，为了有效地释放核，没有聚集同时实现高度均匀的DNA染色，揭示了酸性条件是有益的。对于待履行的所有三个标准，最佳pH似乎为2.2-2.8。
标记核酸
用标记试剂对生物细胞的核酸进行标记。
在优选的实施方式中，标记试剂包括能够发射荧光的化学基团。由于产物分子较少是提供足够的电磁辐射以使细胞可视化所必需的，所以基于荧光性的系统通常比基于生色团的系统更灵敏。
作为标记试剂的荧光标记优选能够在被激发光激发时，在300-1200nm的波长范围内激发信号，被激发的信号可具有300nm至800nm的波长，或者在300nm至400nm之间，或者在400nm至500nm之间，或者在500nm至600nm之间，或者在600nm至700nm之间，或者在700nm至800nm之间。一个优选的荧光方法是极化荧光法。
向样品中添加标记试剂步骤的执行可以通过添加标记试剂
·(在添加到样品中之前)到酸剂中，
·酸性样品中，
·(在添加到样品中之前)到中和剂中，或
·中和样品中。
优选地，酸性溶液中包括标记试剂以在加入到样品中时使样品酸化和/或在标记试剂加入到酸化样品中之前，在中和剂中包括标记试剂。优选的是标记试剂只加入酸化溶液或者中和溶液中时，即，标记试剂不在酸性溶液和中和溶液两者中。因此，在优选的实施方式中，标记试剂不包括在酸性溶液(即，具有酸剂的溶液)和具有中和剂的溶液两者中。
标记试剂优选能够与核酸相互作用的荧光染料。染料可以选自DNA特异染料以及结合DNA和RNA的染料组。
优选地，染料是荧光团。荧光团在溶液中时，荧光团具有的发射光可与荧光团结合核酸时不同。由此，能够通过使用过滤发射光的特异过滤片来降低或者消除来自被标记的样品液体部分的信号，即，降低来自背景的信号。
DNA特异染料可以选自DAPI、Hoechst 33342、Hoechst 33258、Hoechst 34580、Draq5以及Nuclear ID红组。优选DAPI。通过使用DNA特异染料来避免RNA信号可以改善所获得的结果。这可以在例如，细胞周期分析时评估DNA量是重要的。
DAPI尤其能够作为染料来测量细胞周期时期。首先，在DAPI染色的细胞上结合的荧光强度与DNA含量成化学计量关系。其次，DAPI优选结合双链DNA并且DAPI/RNA复合物的量子缠了仅为DAPI/DNA复合物的20％。因此，使用DAPI不需要在测量DNA含量前通过RNase处理来除去RNA。这是通常用来测量细胞DNA含量的其他染料如碘化丙啶的先决条件。DAPI与双链DNA通过结合小沟中的AT簇来相互作用。当结合双链DNA时，其吸收最大值在358nm而发射最大值在461nm。将DAPI与DNA结合产生了20倍的荧光增强。因此，DAPI的激发需要紫外光源。
结合DNA和RNA两者的染料可以选自碘化丙啶、7-AAD、溴化乙锭、乙锭均二聚物1、乙锭均二聚物2、吖啶橙、LDS 751组。优选碘化丙啶。
染料也可以是RNA特异染料。RNA特异染料可以选自4″-6-双(2″-咪唑啉基-4′-5′H)-2-苯基l-4′-phenoxindole、苯乙烯基RNA选择性以及
RNASelectTM Green组。
当需要基于RNA的量来分析时，在此所述的方法可以进一步包括向中和样品中加入DNAse的步骤，随后用结合DNA和RNA两者的染料进行标记/染色的步骤。在此，当与仅特异性地标记RNA的方法相比时，可获得大范围的荧光团。为了避免破坏DNAse的酶活性，样品应优选在执行酶反应前被中和。酶反应因此优选跟随中和步骤。DNAse反应可执行约30分钟，例如25-40min。
标记试剂(染料或荧光团)的量优选调整为1-50μg/ml作为含有待标记的核酸的样品的终浓度。更优选地，标记试剂的量为1-40μg/ml，例如2-30μg/ml，如3-20μg/ml，例如4-10μg/ml。如果使用DAPI，那么DAPI的终浓度优选1-20μg/ml，更优选2-15μg/ml，进一步优选5-10μg/ml。如果使用碘化丙啶，碘化丙啶的终浓度优选2-40μg/ml，更优选3-35μg/ml，进一步优选4-30μg/ml，最优选5-25μg/ml。
在实施例3中，阐述了本发明的方法对于DAPI浓度的变化是非常稳健的。此外，示出了DAPI染色可以在裂解步骤中或者在中和步骤中执行。两种染色过程都使得特异且精确地量化细胞DNA含量。
样品中和
样品优选通过在对核或其他细胞部分中的核酸量执行分析前添加中和剂而被中和。
在此所述的方法中，该方法可包括添加中和剂的额外步骤。中和剂的添加可在用去垢剂处理样品后以及在添加标记前执行，或者中和剂可在用标记试剂处理样品后添加。
中和步骤是任选的。然而，可包括中和步骤来提高该方法的准确性和精确性。因此添加中和剂是在此所述方法的优选步骤。
中和剂可选自柠檬酸盐缓冲液、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、乙醇胺、DIPSO、Bis-Tris、ADA、ACES、咪唑、hydrazine、BES、HEPES、HEPPSO、HEPBS、AMP、AMPD、AMPSO、MES、MOPS、MOPSO、MOBS、PIPES、N-二甘氨酸(bicine)、HEPPS、EPPS、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、硼酸盐、CHES、牛磺酸、TEA、TES、三甲基甘氨酸以及三羟甲基氨基甲烷(tris)的生物缓冲液组。
优选地，中和剂选自马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、Bis-Tris、乙醇胺、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、咪唑、BES、MOPS、HEPES、TES、MOBS、DIPSO、TAPSO、TEA、HEPPSO、POPSO、三甲基甘氨酸、肼以及三羟甲基氨基甲烷组。
中和缓冲液的pH可以在7和9之间。优选地，pH是7.0-8.5，更优选7.0-7.5。在液体溶液中的中和剂的浓度可以为50-1000mM，例如60-900mM，如70-800mM，例如80-700mM，如90-600mM。更优选地，浓度为100-500mM。
用于中和具有被标记核的样品的中和剂的量可以是任意量。然而，当将中和剂加入到样品中时，样品的pH值很重要。中和样品的pH值应优选如上所述。
DNA或RNA分解
可执行将RNase或DNase加入到样品中来分解或崩解RNA或DNA以获得只来自核酸的剩余部分的信号。
可以通过加入DNase来执行DNA的分解。在标记步骤中，可加入任何能够与核酸相互作用的染料形式的标记试剂。优选地，染料是如本文其他地方所述的荧光团。
如本文其他地方所述，优选在中和样品后加入RNase。为了除去RNA，优选的酶是RNase A。样品中的RNase的终浓度可以是0.05-5mg/ml。
分解RNA或DNA的步骤优选在样品为中性或者近中性pH值时执行。最适于酶RNaseA的活性的pH为7.6，这是用RNase执行RNA分解时样品的最优选pH。然而，酶RNase A的活性范围是pH 6-10，这也反映了用RNase来分解RNA时的优选pH范围。
分解RNA或DNA的过程执行至少20分钟，例如约25分钟，如约30分钟，例如约25分钟，如约40分钟。优选约30分钟。
样品体积
需要执行在此所述方法和分析的样品的优化体积高度依赖于样品中存在的细胞数或核数以及所寻求的预定统计质量参数。
样品体积可从0.005μl高达几百毫升。因此，在一个实施方式中，样品体积从0.01至20μl，但通常使用大于0.1μl，大于1.0μl或甚至大于10μl的体积。在另一实施方式中，样品体积是从0.02μl至1ml。
如果分析大体积样品的细胞或核，那么可以提取样品的较小部分(fraction)，并且可以在该较小部分上执行如在此所述的方法。当保留来自大样品的细胞或时，可以在比经过诸如过滤器的细胞保留装置的样品体积更小的体积中重悬浮那些细胞
双标记
能够执行对待分析核的核酸的双标记。用DNA特异和RNA特异的标记试剂执行双标记。这些标记试剂可以在执行标记的同时存在或者核酸可以首先用特异的标记试剂之一标记并且随后用特异的标记试剂中的另一种进行标记。标记步骤的顺序可以是核暴露于DNA特异的标记试剂，随后暴露于RNA特异的标记试剂。顺序也可以是首先是RNA特异的标记试剂，随后是核暴露于DNA特异的标记试剂。
标记试剂可以是本文其他地方体积的任何一种。当执行样品的双标记时，如本文其他地方关于标记核酸所述的标记试剂的浓度以及其他特征也是相关的。
获得标记样品的图像
可通过流式细胞仪、激光扫描细胞仪、图像细胞仪以及显微镜来执行样品中细胞或细胞部分的标记的核酸含量的测定，它们都可以利用或者不利用荧光性来执行。
优选使用涉及荧光性的技术，因为这是即使在低倍率下也能够给出良好结果的灵敏系统。因此，优选地，测定样品中细胞或细胞部分的标记的核酸含量的步骤是通过基于荧光性的技术来执行。由此也使用在优选用光照明时，能够发出荧光性的染料。
在此描述的方法的进一步步骤包括对测定样品中细胞或细胞部分的标记的核酸含量所获得的结果进行评估以获得细胞关于细胞周期分析、倍性确定、核苷掺入测量以及细胞增殖、健康、胁迫水平、细胞凋亡、细胞坏死或其他状况状态的信息。这一对结果进行评估的步骤是在确定标记的核酸的含量后执行。
优选对结果进行评估以获得关于细胞周期分析、倍性确定、核苷掺入测量以及细胞死亡如细胞凋亡和细胞坏死的信息。
也优选对结果进行评估以获得关于核苷掺入的测量的信息。更优选对结果进行评估以获得关于细胞周期分析的信息。最优选对结果进行评估以获得核的倍性确定的信息。
该方法可与通过测量DNA分解程度来检测晚期凋亡细胞的TUNEL分析检测法结合。使用末端转移酶来用BrdU标记DNA端部的3’羟基末端。通常，末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口端部标记(TUNEL)是通过标记核酸的末端来检测DNA片段化的方法。TUNEL分析依赖于可以被末端脱氧核糖核酸转移酶鉴定的DNA中缺口的存在，末端脱氧核糖核酸转移酶是将催化dUTPs添加的酶，dUTPs用标记进行二次标记。这一标记可为荧光团，荧光团可以是该方法中使用的唯一荧光团，或者可以与标记核酸中所用的荧光团不同。TUNEL分析也可标记经历了严重的DNA损伤的细胞。
细胞核中的DNA片段化将在峰与主峰区域不同区域的图表而变得可见。
更优选对结果进行评估以获得关于细胞周期分析、倍性确定和核苷掺入的信息。最优选对结构进行评估以获得关于细胞周期分析、倍性确定和测量核苷类似物，如BrdU和Edu掺入的增殖分析的信息。
BrdU＝Bromodeoxyuridine(5-溴-2-脱氧尿苷)是一种作为胸腺嘧淀脱氧核苷类似物的合成核苷。BrdU通常用于检测或组织中的细胞增殖。
BrdU可以掺入到复制细胞的新合成DNA当中(在细胞周期的S期过程中)，在DNA复制过程中取代胸腺嘧啶脱氧核苷。针对BrdU的特异性抗体则能够用于检测所加入的化学物质，由此指示有效复制了其DNA的细胞。抗体的结合需要DNA变性，通常是通过将细胞暴露给酸或者加热。为了使抗体可见，可以在抗体结合到BrdU之前或者抗体结合到BrdU之后用荧光标记这些抗体。
EdU(5-乙炔基-2′-脱氧尿苷)是一种以类似于作为胸腺嘧啶脱氧核苷类似物的BrdU的方式加入的核苷类似物。EdU与叠氮修饰的荧光染料有效地反应，形成共价键，由此标记复制的DNA。与基于BrdU的测试相比，EdU测试通常更加简单和快速。
如本文所述的方法的进一步步骤可以是测量核的面积。测量核的面积可以与测量标记的核酸的量同时执行。
核的面积可以用来区分核是起源于两种或更多种类型的生物细胞的样品的不同细胞类型，并因此该分析可以用于确定样品中存在的各细胞类型的核酸量。观察到T细胞(Jurkat)的面积是U2OS细胞核的面积的3-4分之一。MCF-7细胞核的面积在T细胞核的面积和U2OS细胞核的面积之间。
放大率
出人意料地发现即使是相当小的放大率，也能够检测来自被标记的核的信号。
在本发明的实施方式中，当检查细胞和/或核时，由于放大率所致的放大相对较小至非常小。因此，通常优选使暴露于检测元件阵列的空间表示进行如此的线性放大，在检测元件阵列上的线性维度的图像与暴露域的原始线性维度的比例小于40∶1，通常至多20∶1，优选小于10∶1，并且在许多情形下，甚至至多6∶1或甚至小于4∶1，例如小于2∶1，如小于1∶1，例如小于1∶2。优选比例约4∶1、 2∶1和1∶1。
这样的低倍率有若干优点，其中包括增加观察区域和增加聚焦深度，暗示暴露于检测器件的体积增加。
统计
通过荧光性一次分析的样品体积的尺寸是易于适合确定的理想统计量。因此，当测定是对于一定量的核数的测定，或者是对核的大小和/或形状的测定时，该一定量液体样品的大小优选足够大至允许在其中鉴定核中的至少两个。更优选地，该一定量的液体样品的大小足够大至允许在其中鉴定核中的至少四个。这相当于接近50％的重复误差。还更优选地，该一定量液体样品的大小优选足够大至允许在其中鉴定核中的至少10个。这相当于接近33％的重复误差。甚至更优选地，该一定量的液体样品的大小足够大至允许在其中鉴定核中的至少20个。这相当于接近14％的重复误差。显然，尽可能第，优选该一定量的样品的大小能够允许鉴定甚至更高数量的条件。因此，当该一定量的液体样品的大小足够大至允许在其中鉴定核中的至少100个，这相当于接近10％的重复误差，而当该一定量的液体样品的大小足够大至允许在其中鉴定核中的至少1000个，这相当于接近低至3％的重复误差。
静置
在本发明优选的实施方式中，进行确定被标记的核酸量的核在分析期间静置或者基本上静置，因此，允许测量时间的最优使用以便提高对于噪音条件的任何信号。这一设置也消除了在流动条件下，通过振动造成的核的确定和/或评估的固有的任何误差。
当确定核中的被标记的核酸量时所分析的样品体积在0.1-500μL的范围，更优选0.1-400μL，进一步优选0.1-300μL，甚至更优选0.1-200μL，最优选0.2-100μL。
基于核酸含量分析细胞
对测定所分析的核的被标记的核酸含量时获得的结果进行分析可以在荧光显微镜下用数字影像来执行。基于数字影像的分析实例在本文所示的实施例1-5中给出。对结果的分析可用于不同目的，其中一些是量化核酸、分析细胞周期状态、确定倍性或确定药物干扰对细胞周期的影响。
本文所述的方法可以用来量化至少一种生物细胞的核酸，并且包括步骤：
提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
向样品中加入酸剂，使样品酸化，
向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
向样品中加入标记试剂获得具有被标记的核酸的样品，其中标记试剂与核酸相互作用，确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量。
本文所述的方法可以进行修改用来分析至少一种生物细胞的细胞周期状态，该方法包括步骤：
提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
向样品中加入酸剂，使样品酸化，
向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
向样品中加入标记试剂，获得具有标记的核酸的样品，其中标记试剂与核酸相互作用，确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量，
基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量，确定细胞周期状态。
用于分析至少一种生物细胞的细胞周期状态的方法可进一步包括本文所述的任何特征。
本文所述的方法也可以进行修改用来确定至少一种生物细胞的倍性，该方法包括步骤：
提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
向样品中加入酸剂，使样品酸化，
向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
向样品中加入标记试剂，获得具有标记的核酸的样品，其中标记试剂与核酸相互作用，
确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量，
基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量，确定至少一种生物细胞的倍性。
用于确定至少一种生物细胞的倍性的方法可进一步包括本文所述的任何特征。
所述方法也可以进行修改成为用来确定药物干扰对细胞周期的影响的方法，该方法包括步骤：
提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，其中所述至少一种生物细胞在取样前或取样后被暴露于一定量的药物，
向样品中加入酸剂，使样品酸化，
向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
向样品中加入标记试剂，获得具有被标记的核酸的样品，其中标记试剂与核酸相互作用，
确定样品中至少一种生物细胞或者细胞部分的被标记的核酸的含量，
基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸的含量，确定药物干扰至少一种生物细胞的细胞周期的哪个细胞周期阶段。
用于确定药物干扰对至少一种生物细胞的细胞周期的影响的方法可进一步包括本文所述的任何特征。
上面描述的不同方法都是基于确定在被分析的核中存在的核酸量。对核酸量的评估是基于细胞的细胞周期的知识。
S期(合成期)是在细胞周期中在间期期间的时期，，在G1期和G2期之间。G1后，细胞进入S期，发生DNA合成或复制。在S期开始，各染色体由一个盘绕的DNA双螺旋分子(染色单体)组成。酶DNA解旋酶将DNA双螺旋分开。然后DNA聚合酶将DNA链分开，得到两条新的半保守链。在这一时期末，各染色体具有两条相同的DNA双螺旋分子，并因此由两条姐妹染色单体(在着丝粒处结合)组成。S期的最终结果是在细胞中出现复制的遗传物质，它们将最终被分裂到两个细胞中。
G1期是在细胞周期中在间期期间的时期。G1期发生在S期之前。对于许多细胞，G1期是其生命期期间主要的细胞生长时期。在G1期，快速分裂人细胞花费9小时，细胞每24小时分裂。在G1期期间，合成新的细胞器。
细胞可在进入S期前停止在G1期。细胞也可以进入被称作GO期的休眠状态。多数哺乳动物细胞都如此。为了分裂，细胞重新进入S期的周期。
在G1，二倍体真核细胞中的DNA量是2n，意味着在细胞中存在两套染色体。遗传物质作为染色质存在并且如果它们盘绕成染色体，那么将没有姐妹染色单体。单倍体生物如一些酵母菌将是1n并且存在的每个染色体都只有一个拷贝。
G2期是在间期期间的第三个、最后一个并且通常是最短的子阶段。在G2，细胞经历快速生长期以准备进行有丝分裂。G2期是在S期期间成功地完成DNA合成和染色体复制后，并且在通常四至五小时(对于人细胞)期间发生。这深入间期，充分定义了细胞核，细胞核被核包被结合并且含有至少一个细胞和。尽管染色体已被复制，但是它们尚不能被单独地区分，因为它们仍旧处于松散地包装的染色质纤维的形式。G2期准备用于有丝分裂(M期)的细胞，有丝分裂由前期开始。
在G2期末是控制检验点(G2检验点)，其中确定细胞是否可以继续进入M期并分裂。G2检验点防止具有由于最后的分离而损伤的DNA的细胞进入有丝分裂，为DNA修复提供机会并且停止受损细胞的增殖。由于G2检验点帮助维持基因组稳定性，理解造成癌症的分子是重要的关注点。
本文呈现的方法可以用于评估在所获样品中存在的生物细胞的细胞周期阶段。可以在获得样品前或后用药物处理细胞，并且细胞被药物所停止的细胞周期阶段可以被确定为被处理细胞的分析核中存在的核酸量的评估。
下述实施例6示出了所述方法可以用于确定药物干扰细胞周期的效果。
部件的试剂盒
本发明的一方面涉及用于本文其他地方所述的方法中的部件的试剂盒，该试剂盒包括：
一定量的酸剂，
一定量的去垢剂，
一定量的能够与核酸相互作用的标记试剂，以及
任选地，一定量的中和剂。
各组分可以存在于容器中，即在用于酸剂的容器，用于去垢剂的容器，用于标记试剂的容器和/或用于中和剂的容器中。试剂盒可因此包括具有酸剂的容器、具有去垢剂的容器、具有标记试剂的容器和/或具有中和剂的容器。
该一定量的去垢剂可以是
存在于该一定量的酸剂中或者
与该一定量的酸剂、一定量的标记试剂和一定量的中和剂分开。
去垢剂因此可以与酸剂混合并且存在于用于酸剂的容器中。去垢剂也可以在其自己的容器中而与其他组分分开。
在优选的实施方式中，试剂盒的组分都是液体形式，即该一定量的酸剂、一定量的去垢剂、一定量的标记试剂和一定量的中和剂都是液体形式。
该一定量的酸剂可在5μL至10mL的范围，更优选10μL至8mL，进一步优选20μL至7mL，例如30μL至6mL，如40μL至5mL，例如50μL至6mL，如60μL至5ml，例如70μL至4mL，如80μL至3mL。最优选是100μL至2.5mL的量。
本文其他地方描述的关于酸剂、去垢剂、标记试剂和中和剂的特征当为试剂盒一部分时也关注这些组成。所述特征是例如，组成浓度、化学组成种类、pH值。
当与所述一定量的酸剂分开时所述一定量的去垢剂可以是5μL至1mL，更优选5-750μL，进一步优选5-500μL，甚至进一步优选5-250μL，最优选5μL至125μL。
试剂盒中的一定量的标记试剂可以是
该一定量的酸剂的结合部分，
该一定量的中和剂的结合部分，或
与该一定量的酸剂以及该一定量的中和剂分离。
在试剂盒中，标记试剂可因此存在于用于酸剂的容器中、用于中和剂的容器中或存在于用于标记试剂的容器中。
标记试剂可为本文其他地方所述的任何标记试剂。本文其他地方所述的标记试剂的浓度和其他特征也考虑所述试剂盒中的标记试剂。这些特征例如染料的类型和染料的浓度。试剂盒可包括本文其他地方所述的任何中和剂。本文其他地方所述的中和剂的浓度和其他特征也考虑试剂盒中的中和剂。这些特征例如中和剂的类型、pH值以及中和剂的浓度。
在试剂盒中，中和剂的量可在5μL至10mL的范围，例如10μL至9mL，如20μL至8mL，例如30μL至7mL，如40μL至6mL，例如50μL至5mL，如60μL至4.5mL，例如70μL至4mL，如80μL至3.5mL，例如90μL至3mL。优选是100μL至2.5mL的量。
试剂盒进一步包括一定量的RNase或DNase。RNase和DNase的特征可为本文其他地方所述的任何特征。
试剂盒也可包括用于该试剂盒的说明书。说明书可为传单。说明书可包括执行所述方法时对于向样品中加入组分的顺序的描述以及对于使用的组分量的描述。说明书也可包括如何评估在测量核的核酸量时所获结果的描述。
试剂盒也可包括盒或载片，用于执行样品和实际之间的反应和/或用于分析反应后的样品。盒或载片可以如在本文其他地方所述。优选如本文上述的试剂盒进一步包括至少一个载片，例如至少两个载片，如至少三个载片，例如至少四个载片，如至少五个载片，例如至少六个载片，如至少七个载片。
部件的试剂盒也可包括用于裂解和标记生物细胞的组成，如本文下面所述。特别地，该组成包括：
酸剂或酸缓冲液，
去垢剂，和
标记试剂。
这一组成可包括如本文其他地方所述的酸剂(或酸缓冲液)、去垢剂和标记试剂的任何特征。
部件的试剂盒也可包括用于标记生物细胞同时中和包括该生物细胞的样品的组成，其中这一组成进一步在下面描述。该组成包括：
标记试剂，和
中和剂。
这一组成可包括如本文其他地方所述的标记试剂和中和剂的任何特征。
在优选的实施方式中，试剂盒包括具有用于裂解和标记生物细胞的组成的容器以及具有用于标记生物细胞同时中和包括该生物细胞的样品的组成的容器。再进一步优选的实施方式中，试剂盒包括具有用于裂解和标记生物细胞的组成的容器以及具有中和剂的容器。
载片
通过将具有核的样品定位在具有用于样品的室的载片上进行分析能够执行对核内标记的核酸量的确定。
载片可以是玻璃载片，例如一次性玻璃载片。载片也可以由聚合材料生产，优选不吸收紫外光和紫光的聚合材料。适合的聚合物的实例是PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))。玻璃载片通常由玻璃如”钠钙硅”(也用于窗户)”硼酸盐玻璃”(也用于实验室玻璃设备)制备。优选的玻璃载片是有效透射UV和紫光的玻璃载片”熔凝石英载片”。
载片的尺寸可以是任何适当的，并且可取决于用于执行细胞核分析的装置的输入载片，优选地，载片的尺寸是75mmX25mmX1mm。
各载片具有大量室用于定位要用荧光技术分析的样品。每个载片上的室数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。各载片上优选的室数是2、4或8。
载片的各室可具有适于含有一定量的样品的大小。各室的大小可以在1μL至100μL的范围，优选2μL至75μL，更优选3μL至50μL，进一步优选4μL至40μL，最优选5μL至35μL。
在优选的实施方式中，载片的各室的宽度比载片的宽度稍小，例如23mm，长度为7-30mm，取决于各载片中的室数以及宽度为0.02-0.1mm。
优选地，在具有两个或更多个室的载片中，室位于一排，各室优选宽度稍短于载片的宽度。在优选的实施方式中，单个室的细胞核同时被分析。这一分析可以只在室的一部分面积上执行，例如约90％的面积，如约80％，例如约70％，如约60％，例如约50％，如约40％。
在优选的实施方式中，测量具有细胞核的核酸量的焦点深度为适于分析Z平面中所有细胞核，即以室的深度，其优选0.02-0.1mm。
在具有两个或更多个室的载片中，室可以用于检查来源于单一样品的细胞核。更优选地，使用单个室来检查来源于单一样品的细胞核。然而，在期望样品中的核数非常低的情形下，使用一个以上的室来检查来自单一样品的细胞核。
适合用于测定细胞核中被标记的核酸量的载片是可以用来自ChemoMetec的NucleoCounter NC-3000进行分析的载片。设备NucleoCounter NC-3000另外描述于PCT/DK2009/050278。
本发明的一方面涉及在本文其他地方所述的载片中量化至少一种生物细胞的核酸的方法，
i.提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
ii提供如本文其他地方描述的盒或载片，
iii.向样品中加入酸剂、去垢剂、标记试剂使样品酸化、裂解并标记样品，
iv.任选地向样品中加入中和剂，中和样品，
v.将至少部分的酸化样品导入盒中或导入载片的室中，以及
vi.当具有标记的核酸的细胞核存在于盒中或在载片的室中时，测定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的标记的核酸的含量。
用于分析标记样品的系统
根据本发明用于测定生物样品的细胞核酸量的方法可在任何适当的系统和设备中进行。
根据本发明的方法可通过在显微镜下、在流式细胞仪下或者在细胞计数装置如来自ChemoMetec A/S的设备下进行监控来执行。
测量可在细胞计数装置中执行，例如来自ChemoMetec A/S的设备，如ChemoMetec A/S的设备的NucleoCounter家族提供，下文使用低倍率和/或任选地一次性盒或载片或其他样品室(参见例如Hansen，F.E.R.，Glensbjerg，M.，Arnvidarson，B.& Jeppesen，J.M.：″AMethod and a System for Determination of Cells in a Liquid″，PCT/DK1998/0000175(WO/1998/050777)。
在优选的实施方式中，被标记的核酸的测定是在包括样品域或室的系统中进行，其中设置样品并去检测并分析来自标记的核酸的信号。
尤其适于执行测定在从样品获得的核中的标记的核酸数量可以是具有成像软件的荧光显微镜。尤其是ChemoMetec的NucleoCounter家族的产品适于执行标记的核酸的量化以及执行分析。NucleoCounter设备是快速精确且客观的，它们不需要校准、清洁或维持，由此由于对核的核酸的快速、精确且客观的分析而使得易于以简单的方式获得良好且精确的结果。NucleoCounter设备是基于荧光显微术，将CCD照相机和图像分析与荧光显微镜在单个便携式单元中结合。荧光显微镜设计用于检测来自对细胞的核的DNA和/或RNA染色的荧光染料的信号。
在优选的实施方式中，执行本文所述的方法使得通过将标记细胞核样品定位到本文上述载片的室中来执行细胞核的标记的核酸量的测定，载片进入NucleoCounter NC-3000，其执行细胞核中标记的核酸量的测定，并且这一设备也执行对所获结果的分析。
用于测定细胞核的标记的核酸量的装置可包括不同光源以激发用于标记细胞核中的核酸的标记和/或不同发射过滤片使其能获得从激发的标记的核酸发射的光的良好图像。设备的光源可激发峰值在例如365、405、455、475、500、525或590nm的光。发射过滤片可使得具有下述波长的光通过过滤片：410-450、415-525、450-500、500-555、520-595、555-605、595-750、630-1100nm。相对于用于标记的核酸的标记来选择激发光和发射过滤片。
当测定被标记的核酸的量时，可以使用40X或更小的光学放大，优选20X或更小，更优选10X或更小，例如6X或更小，例如4X或更小，例如2X或更小。优选地，不存在放大，即1或小至2X或4X。也优选放大小于1，例如0.75X，0.5X和0.25X。在这些小于1的放大中，优选0.75X并且更优选0.5X。
如本文所述的方法能够在低倍率下获得良好的图像而没有太多噪音。由此，能够在极短时间内分析统计学上有代表性数量的细胞核。
当分析10μL样品时，分析时间可以低至小于1min。优选地，在单一室中的样品分析是在10sec内进行，例如在5sec内。
组合物
本发明的一方面涉及用于裂解和标记生物细胞的组合物，所述组合物包括：
酸剂或酸缓冲液，
去垢剂，和
标记试剂。
这一组合物可包括本文其他地方所述的酸剂(或酸缓冲液)、去垢剂和标记试剂的任何特征。优选的组合物包括：酸剂：柠檬酸盐缓冲液(pH 2.25，100mM)，去垢剂：Triton X-100(0.5％)，以及荧光染料：DAPI(5μg/mL)。
本发明的另一方面涉及用于标记生物细胞同时中和包括该生物细胞的样品的组合物，所述组合物包括：
标记试剂，和
中和剂。
这一组合物可包括本文其他地方所述的标记试剂和中和剂的任何特征。优选的组合物包括：中和剂：柠檬酸盐缓冲液(pH 8.3，500mM)，荧光染料：DAPI(5μg/mL)。
应用
优选的用途是本文其他地方所述的部件的试剂盒在量化至少一种生物细胞的核酸的方法中的应用。这一核酸量化可用于如本文所述的任何评估。
本发明的一方面涉及本文所述的方法或者本文所述的试剂盒在检查生物细胞是否包括遗传不稳定的细胞的应用。
可用生物样品进行遗传不稳定的细胞的分析，例如血样或组织样品。
监视疾病发展
本发明的一方面涉及分析造成个体细胞不稳定的疾病的发展的方法，所述方法在两不同时间点包括步骤：
从个体获得生物样品，
分析所获得的生物样品中不稳定细胞的存在，例如遗传不稳定的细胞，
比较在两不同时间点，在生物样品中鉴定的不稳定细胞数，
基于对不稳定细胞数的比较，确定疾病的发展，所述不稳定细胞例如在两不同样品中鉴定的遗传不稳定细胞。
当比较来自相同个体不同时间点所获得的两不同样品所获结果时，评估疾病的发展或者患有疾病的个体的改善状态会是可能的。
两不同时间点可以分开至少24小时。时间点是自个体获得样品的时间。样品可以以至少1天的间隔获得，例如至少2天，如至少3天，例如至少4天，如至少5天，例如至少6天，如至少1周，例如至少2周，如至少3周，例如至少4周，如至少5周，例如至少6周，如至少7周，例如至少8周，如至少9周，例如至少10周，如至少11周，例如至少12周，如至少13周，例如至少14周，如至少15周。
所获得的生物样品并分析不稳定细胞，例如遗传不稳定细胞的存在的生物样品可以是血样或组织样品。
不稳定细胞，例如遗传不稳定的细胞的检测可能是很重要的疾病可以是癌症疾病。癌症可以是淋巴瘤，黑素瘤，白血病以及膀胱、乳腺，结肠和直肠、子宫内膜、肾(RenalCell)、肺、胰腺、前列腺皮肤(非黑素瘤)或甲状腺癌症。
附图具体说明
图1示出来自通过酸裂解获得的CHO、U2OS和MCF-7细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。被释放的核或者直接分析(酸裂解)或者通过在分析前加入稳定缓冲液来中和(酸裂解+中和)。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。左板：NC-3000(2x放大)捕获的图像；右板：Nucleoview NC-3000软件获得的DNA含量直方图，显示出作为细胞数的函数的荧光强度。
图2示出来自MCF-7细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。上板：在中性pH释放的核；中板：在pH 2.36释放的核；下板：在pH 1.45释放的核。左板：通过NC-3000(2x放大)捕获的图像；右板：Nucleoview NC-3000软件获得的DNA含量直方图，显示出作为细胞数的函数的荧光强度。
图3示出来自U2OS细胞的DNPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。上板：在6-孔板中生长的U2OS细胞；下板：在维持在悬浮培养瓶中的微载体上生长的U2OS。
图4示出来自A3细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000通过定量成像细胞仪来分析荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。上板：指数生长的A3细胞；下板：生长至静止期的A3细胞。
图5示出用不同药物处理的U2OS细胞的DNA直方图。使用Nucleocounter NC-3000通过定量成像细胞仪来分析荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。直方图的右下角是合并未处理的、L-含羞草素、喜树碱和诺考达唑处理的样品的结果。
实施例
已通过量化细胞DNA对本发明的方法进行了评估。分析了所述方法的若干方面，如在下面呈现的实施例中所释。
实施例1、通过酸裂解释放的核并且用于准确且精确的DNA量化
通过对用DAPI(4′，6-联脒-2-苯基吲哚)酸裂解所释放的核进行染色来测量三种粘附细胞系CHO、MCF-7和U2OS的DNA含量。
材料和方法：
在T25烧瓶中，将粘附细胞系在RPMI+10％FCS中生长至80-90％汇集。为了直接从贴附细胞释放核，用5mL的PBS洗涤T25烧瓶一次然后在37℃，在0.65ml的裂解缓冲液(50mM柠檬酸(pH 2.20)，1％Triton X-100，1μg/ml DAPI)存在下孵育5分钟。所释放的核的荧光性或者直接通过定量成像细胞仪进行分析或者在成像前通过加入等量(0.65ml)稳定缓冲液(250mM柠檬酸盐(pH 8.3)，1％Triton X-100)来中和。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)来进行定量成像细胞仪。
结果：
检测利用酸裂解所释放的核是否可以被DNA特异的染料DAPI均匀染色。用补充了Triton X-100和DAPI的酸裂解缓冲液来处理MCF-7、U2OS和CHO细胞(都是粘附细胞系)。酸释放的核或者直接通过定量成像细胞仪来分析或者在成像前通过加入稳定缓冲液而中和。如图1所示，能够获得在酸释放裂解后直接进行分析的细胞的可接受的DNA含量谱。然而，对于所有细胞系，G1/G0峰的变异系数(CV)很广(≥10％)，表明所述方法一定的不准确性。接下来，检测酸释放的核的中和是否可以提高准确性。对于所有检测的细胞系，中和显著地改善DNA量化并且G1/G0峰的CV在3.4至4.9％的范围内。
通过对样品成像，没有观察到所释放的核的聚集或者观察到很少。
总言之，通过酸裂解的核释放提供了量化细胞DNA含量的非常快速且简单的方法。与中和结合，该方法也提供了非常高的准确性何精确性。该方法完全回避了对于包括粘附细胞的样品进行胰蛋白酶化的需要。
图1示出来自通过酸裂解获得的CHO、U2OS和MCF-7细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。被释放的核或者直接分析(酸裂解)或者通过在分析前加入稳定缓冲液来中和(酸裂解+中和)。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。左板：NC-3000(2x放大)捕获的图像；右板：Nucleoview NC-3000软件获得的DNA含量直方图，显示出作为细胞数的函数的荧光强度。
实施例2、测定核释放、解聚集和均匀的DNA染色的最适pH
使用三种粘附细胞系CHO、MCF-7和U2OS来确定下面三个参数的最适pH：
核的有效释放(从贴附细胞中有＞90的核释放)
所释放核很少聚集或没有聚集
提供DNA含量测量的高准确性和精确性的均匀的DNA染色
材料和方法：
在6-孔板(Nunclon surface，Nunc)中，将粘附细胞系在RPMI+10％FCS中生长至80-90％汇集。为了直接从贴附细胞释放核，用1mL的PBS洗涤各孔一次然后在37℃，在0.25ml的裂解缓冲液(0.5％Triton X-100，1μg/ml DAPI溶解在200mM柠檬酸(pH 2.00)，100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.22-6.80)或者溶解在400mM磷酸(pH 1.45)中)存在下孵育5分钟。所释放的核加入0.25ml稳定缓冲液(100或200mM柠檬酸盐，pH 8.3)来中和。关于实验条件的细节参见表1，其中示出了pH对核释放、聚集和DNA量化的影响。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过成像细胞仪来分析核的荧光性。
结果：
简单地用pH跨度在pH 1.45至6.8并且补充了DAPI和Triton X-100的不同缓冲液孵育贴附到塑料孔底部的细胞。通过添加柠檬酸盐(pH 8.3)来中和所释放的核并从孔中移除。随后，在倒置显微镜中检查孔底部以估计核释放的效率。通常，为了有效释放核(＞90％细胞群被裂解并且它们的核释放到溶液中)，pH需要低于2.75。接下来，通过定量图像细胞仪来分析所释放且被中和的核。样品成像揭示了如果裂解缓冲液的pH低于约3.0，那么防止了核的聚集(表1，图2)。然而，DNA含量的量化揭示了pH低于2.2补偿了DNA染色的质量，造成具有不同变异系数的广的G1/G0峰(表1)。此外，非常低的pH促进DNA分解，造成少于1DNA当量的核(图2)。太苛刻的pH可造成脱漂亮，引发DNA的不稳定和片段化。
总言之，为了获得搞笑的核释放而没有聚集，同时实现高度均匀的DNA染色，需要将裂解溶液的pH保持在2.2-2.8的范围。
表1.pH对核释放、聚集和DNA量化的影响
NA＝不可用
1彼此充分分离的尖的、离散的G1/G0和G2峰。
+，，优异；(+)，可接受的；-不可接受的。
图2示出来自MCF-7细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。上板：在中性pH释放的核；中板：在pH 2.36释放的核；下板：在pH 1.45释放的核。左板：通过NC-3000(2x放大)捕获的图像；右板：Nucleoview NC-3000软件获得的DNA含量直方图，显示出作为细胞数的函数的荧光强度。
实施例3、DAPI浓度和染色方法的影响
使用粘附细胞系U2OS来检测DNA染色的准确性和精确性是否可以通过在中和步骤中进行核染色而不在裂解步骤中进行而被进一步提高。
材料和方法：
在6-孔板中，将U2OS细胞在RPMI+10％FCS中生长至80-90％汇集。为了直接从贴附细胞释放核，用1mL的PBS洗涤各孔一次然后在37℃，在DAPI存在或不存在下，在0.25ml的裂解缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液(pH2.25)，0.5％Triton X-100)中孵育5分钟。所释放的核在37℃，在DAPI存在或不存在下，通过用0.25ml稳定缓冲液(500mM柠檬酸盐，pH 8.3)孵育来中和。关于实验条件的细节参见表2，其中示出了DAPI浓度和染色方法的影响。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过成像细胞仪来分析核的荧光性。
结果：
评估了所述方法是否可以通过不向裂解缓冲液中加入DAPI而向中和缓冲液中加入DAPI来进一步改善。如表2所示，很明显，在裂解步骤中和在中和步骤中进行核染色没有差异。在两种情形下，DNA染色的准确性和精确性都很高，提供了具有窄的G1/G0峰的DNA含量谱和显著低的CV。表2还证明了所述方法对于DAPI浓度变化是稳健的。因此，DAPI浓度在1-10μg/ml允许细胞DNA含量的特异且精确量化。
表2：DAPI浓度和染色方法的影响
1彼此充分分离的尖的、离散的G1/G0和G2峰。
+，，优异；(+)，可接受；-不可接受的。
实施例4、使用酸裂解法对贴附到微载体的细胞的细胞周期分析
使用粘附细胞系U2OS来检测酸裂解法是否能用于测量生长在微载体上的细胞的DNA谱。
材料和方法：
在6-孔板(Nunclon surface，Nunc)中或者在维持在悬浮培养瓶中的Cytodex 3微载体(GEhealthcare)中，将U2OS细胞在RPMI+10％FCS中生长至80-90％汇集。为了从在6-孔板上生长的细胞释放核，用1mL的PBS洗涤各孔一次然后在37℃，在0.25ml的裂解缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液(pH2.25)，0.5％Triton X-100，5μg/ml DAPI)中孵育5分钟。
为了从贴附到微载体的细胞释放核，将2ml样品以500g离心5分钟，用1ml的PBS洗涤沉淀的微载体一次，在0.25ml裂解缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.25)，0.5％Triton X-100，5μg/ml DAPI)中重悬，然后在37℃孵育5分钟。向来自6-孔板和微载体的样品中加入0.25ml稳定缓冲液(500mM柠檬酸盐，pH 8.3)进行中和。使用NucleocounterNC-3000(Chemometec)通过成像细胞仪来分析所释放细胞的荧光性。
结果：
将U2OS细胞平行接种到在悬浮培养瓶和6-孔板中的Cytodex 3微载体上并生长。在80-90％汇集时，使细胞进行酸裂解并且用稳定缓冲液中和所释放的核。接下来，通过图像细胞仪来测定两样品的DNA谱。如图3所示，在微载体上生长的样品的DNA谱与在6-孔板上生长的样品几乎相同。通过显微检查，检测并确认了接近100％的细胞群从微载体中释放。因此，酸裂解方法提供了一种测量在微载体上生长的细胞群的DNA含量的简易且可靠的方法。
图3示出来自U2OS细胞的DNPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec)通过定量成像细胞仪来测量荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。上板：在6-孔板中生长的U2OS细胞；下板：在维持在悬浮培养瓶中的微载体上生长的U2OS。
实施例5、使用酸裂解对悬浮细胞的细胞周期分析
使用Leukemic T淋巴细胞，A3(Jurkat细胞系的衍生物)来检测该酸裂解法是否可用于测量悬浮细胞的DNA谱。
材料和方法：
将A3细胞以2.5x105细胞/ml的密度接种到RPMI+10％FCS中并维持在T-25烧瓶中。
此后24小时(指数生长细胞)和96小时(静止期细胞)分别收获1ml细胞悬液。以500g离心样品5分钟，弃上清并将细胞重悬在0.25ml裂解缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液(pH2.25)，0.5％Triton X-100，5μg/ml DAPI)中。在37℃孵育5分钟，向样品中加入0.25ml稳定缓冲液(500mM柠檬酸盐，pH 8.3)。使用Nucleocounter NC-3000通过成像细胞仪来分析所释放细胞的荧光性。
结果：
使用酸裂解法，分别测量悬浮细胞系(A3，Jurkat细胞系)的指数生长细胞和静止期细胞的DNA含量。如图4所示，酸裂解法揭露了在两种细胞状况下的显著差异；指数生长Jurkat细胞群具有清晰的G2峰，而静止期Jurkat细胞群缺乏G2细胞，留下大多数细胞处于细胞周期的G1期。因此，酸裂解法允许对悬浮细胞的DNA含量进行简易且稳定的量化。
图4示出来自A3细胞的DAPI染色的核的DNA含量谱。使用Nucleocounter NC-3000通过定量成像细胞仪来分析荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。上板：指数生长的A3细胞；下板：生长至静止期的A3细胞。
实施例6、使用酸裂解法测量药物对细胞周期的影响
使用酸裂解法来测量用不同药物处理的U2OS细胞的DNA含量。
材料和方法：
在6-孔板(Nunclon surface，Nunc)中使U2OS细胞在RPMI+10％FCS中生长至约75％汇集，然后用下面的药物处理20小时：
诺考达唑(G2-M阻滞)：0.5μM
L-含羞草素(G1阻滞)：0.5mM
羟基脲，HU(S阻滞)：2mM
喜树碱，CPT(S-G2阻滞)：5μM
依托泊苷(S-G2阻滞)：20μM
未处理对照
药物处理后，用1mL的PBS洗涤各孔一次，然后在37℃用0.25ml裂解缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.25)，0.5％Triton X-100，5μg/ml DAPI)孵育5分钟。在定量图像细胞仪(Nucleocounter NC-3000)之前，通过加入0.25ml稳定缓冲液(500mM柠檬酸盐，pH8.3)来中和样品。
结果：
使用酸裂解法来分析用影响细胞周期的不同时期的药物处理的U2OS细胞。细胞周期分布与已知的药物作用一致(图5)。例如，已知L-含羞草素诱导G1阻滞并且显然用这一药物处理的样品显示出主要的G1峰并且非常少的细胞处于细胞周期的S和G2-M期。同样，喜树碱被描述为诱导U2OS细胞的S-G2阻滞并且事实上用这一药物处理的样品具有积累的S-G2细胞。总之，酸裂解法能够进行简易且可靠的细胞DNA量化并且能够用来评估不同药物对细胞周期的影响。
图5示出用不同药物处理的U2OS细胞的DNA直方图。使用Nucleocounter NC-3000通过定量成像细胞仪来分析荧光性。由Nucleoview NC-3000软件获得DNA含量直方图并且以细胞数的函数显示荧光强度。直方图的右下角是合并了未处理的、L-含羞草素、喜树碱和诺考达唑处理的样品的结果。
Claims (90)
1.一种量化至少一种生物细胞的核酸的方法，
i.提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分是获自至少一种生物细胞，
ii向样品中添加酸剂使样品酸化至pH水平在2.0和3.0之间，
iii.向样品中添加去垢剂使生物细胞裂解，
iv.向样品中添加荧光标记试剂，由此获得具有被标记的核酸的样品，其中荧光标记试剂与核酸相互作用，
v.确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量。
2.根据权利要求1的方法，其中分析样品中的生物细胞，所述样品选自体液样品、组织样品、发酵样品、液体培养样品、细胞培养样品、水样品、饮料样品、药物样品或生产治疗性蛋白的细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物细胞是原核细胞。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物细胞是真核细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中所述真核细胞可选自原生动物、真菌、细菌、动物细胞和植物细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述真菌选自发酵生物组（例如酵母-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、白色念珠菌(candida albicans))、丝状真菌例如黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。
7.根据权利要求5的方法，其中所述动物细胞时哺乳动物细胞。
8.根据权利要求1、2或4-7中任一项的方法，其中所述至少一种生物细胞或所述哺乳动物细胞是在选自血样、尿样、唾液样品、精液样品、水溶性组织样品、乳样、脑脊髓液和淋巴液的生物样品的样品中。
9.根据权利要求7-8中任一项的方法，其中所述至少一种生物细胞或所述哺乳动物细胞是在是在选自肝样品、肾样品、肌肉样品、脑样品、肺样品、皮肤样品、胸腺样品、脾样品、胃肠道样品、胰样品甲状腺样品的生物样品的样品中。
10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞选自细胞系、组织、体细胞、血液、动物精液、乳、上皮细胞、脂肪细胞、杂交瘤细胞组。
11.根据权利要求5的方法，其中所述动物选自小鼠、大鼠、猴、狗、鱼、牛/牲畜、昆虫、马、猫、鸟和猪的动物组。
12.根据权利要求5的方法，其中所述植物细胞选自叶细胞、花粉细胞、卵细胞、愈伤组织细胞和原生质体组。
13.根据任一前述权利要求的方法，其中所述样品包括选自附着于固体支撑物、体外生长板、培养皿中的细胞，在T-烧瓶、微滴定板、生物反应器、悬浮培养瓶、微载体(微载体珠)中培养的细胞，3-D培养物、器官培养物以及悬浮培养的细胞组。
14.根据任一前述权利要求的方法，其中所述样品包括培养基并且这一培养基在步骤ii的处理前从细胞或者具有核算的细胞部分中被除去。
15.根据权利要求14的方法，其中所述培养基通过洗涤步骤被除去或者在除去培养基后执行洗涤步骤。
16.根据权利要求15的方法，其中所述洗涤步骤用洗涤溶液执行，所述洗涤溶液选自平衡盐溶液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)、Hanks'Balanced Salt Solution(HBSS)和Earle'sBalanced Salt Solution(EBSS)组。
17.根据任一前述权利要求的方法，其中所述酸剂是液体形式。
18.根据任一前述权利要求的方法，其中所述酸剂选自柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液、磷酸、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、乳酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐和丙酸盐的生物缓冲液组。
19.根据任一前述权利要求的方法，其中所述酸剂的添加量为获得酸化样品的pH在2.1-2.9，例如2.2-2.8，如2.3-2.7；例如2.4-2.6；如2.45-2.55，如约2.5的范围。
20.根据任一前述权利要求的方法，其中所述酸剂的酸浓度为25-250mM。
21.根据任一前述权利要求的方法，其中所述酸化样品的pH保持在酸性条件下约1-30分钟。
22.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去垢剂选自Triton X-15、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-207、Triton N-57、Triton N-101、Triton QS-158、Triton 770、Igepal CA-630、NP-40、Brij-35、Brij96、Tween-20、Tween-80、CHAPS、Cetyl、Cetyl-N3、Luten-Sol、Losec和Pluronic L31的组。
23.根据任一前述权利要求的方法，其中所述去垢剂的使用量是使其构成所使用酸剂量的0.05%-5%(w/v)。
24.根据任一前述权利要求的方法,进一步包括在步骤iii后或者步骤iv后添加中和试剂，由此在添加标记试剂之前或者之后中和样品。
25.根据权利要求24的方法，其中所述中和试剂选自柠檬酸盐缓冲液、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、乙醇胺、DIPSO、Bis-Tris、ADA、ACES、咪唑、肼、BES、HEPES、HEPPSO、HEPBS、AMP、AMPD、AMPSO、MES、MOPS、MOPSO、MOBS、PIPES、N-二甘氨酸、HEPPS、EPPS、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、硼酸盐、CHES、牛磺酸、TEA、TES、三甲基甘氨酸和三羟甲基氨基甲烷组。
26.根据权利要求24或25的方法，其中所述中和缓冲液具有介于7和9之间的pH。
27.根据权利要求24-26中任一项的方法，其中所述中和试剂的浓度为50-1000mM。
28.根据任一前述权利要求的方法，其中向样品中添加标记试剂的步骤的执行是通过将标记试剂添加到酸剂中，这在添加到样品之前，到酸性样品中，到中和试剂中，这在添加到酸性样品之前，或到中和样品中。
29.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述荧光标记剂是能够与核酸相互作用的荧光染料。
30.根据权利要求29的方法，其中所述荧光染料选自DNA特异的荧光染料以及结合DNA和RNA的荧光染料组。
31.根据权利要求30的方法，其中所述荧光染料是荧光团。
32.根据权利要求31的方法，其中当所述荧光团在溶液中时，荧光团发射的光与荧光团结合核酸时发射的光是不同的。
33.根据权利要求30的方法，其中所述DNA特异染料选自DAPI、Hoechst 33342、Hoechst 33258、Hoechst 34580、Draq5和Nuclear ID红组。
34.根据权利要求30的方法，其中结合DNA和RNA的荧光染料选自碘化丙啶、7-AAD、溴化乙锭、乙锭均二聚物1、乙锭均二聚物2、吖啶橙、LDS 751。
35.根据权利要求29的方法，其中所述荧光染料选自RNA特异荧光染料组。
36.根据权利要求35的方法，其中所述荧光染料选自4″-6-双(2″-咪唑啉基-4′-5′H)-2-苯基l-4′-phenoxindole，苯乙烯基RNA选择性以及
RNASelectTMGreen组。
37.根据任一前述权利要求的方法，进一步包括通过向样品中添加RNase或DNase来降解DNA。
38.根据权利要求37的方法，其中通过添加DNase来降解DNA后添加荧光标记试剂，该荧光标记试剂是能够与核酸相互作用的荧光染料的形式。
39.根据权利要求37或38的方法，其中降解RNA或DNA是在中性pH值进行。
40.根据权利要求37或39的方法，其中RNase是RNase A。
41.根据权利要求37-40中任一项的方法，其中降解RNA或DNA的过程执行至少20分钟。
42.根据任一前述权利要求的方法，其中通过流式细胞仪、激光扫描细胞仪、图像细胞仪以及显微镜来执行样品中细胞或细胞部分的被标记的核酸含量的测定，它们都可以利用或者不利用荧光性来执行。
43.根据任一前述权利要求的方法,进一步包括对测定样品中细胞或细胞部分的被标记的核酸含量所获得的结果进行评估以获得细胞关于细胞周期分析、倍性确定、核苷掺入测量以及细胞增殖、健康、胁迫水平、细胞凋亡、细胞坏死或其他状况状态的信息。
44.根据任一前述权利要求的方法，进一步包括测量核面积的步骤。
45.根据权利要求44的方法，其中测量核面积的步骤与测量样品中的至少一种生物细胞或细胞部分的被标记的核酸含量的步骤同时执行。
46.根据任一前述权利要求的方法，执行所述方法而不水解核酸。
47.根据任一前述权利要求的方法，执行所述方法而不对样品或样品的生物细胞或细胞部分进行胰蛋白酶化。
48.根据任一前述权利要求的方法，执行所述方法而不固定细胞，包括通过醇来固定细胞。
49.一种分析至少一种生物细胞的细胞周期状态的方法，
i提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
ii向样品中加入酸剂，使样品酸化至pH水平在2.0和3.0之间，
iii向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
iv向样品中加入荧光标记试剂，获得具有被荧光标记的核酸的样品，其中所述荧光标记试剂与核酸相互作用，
v确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，
vi基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，确定细胞周期状态。
50.根据权利要求49的方法,进一步包括权利要求2-48的任一项的任何特征。
51.一种确定至少一种生物细胞的倍性的方法：
i提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，
ii向样品中加入酸剂，使样品酸化至pH水平在2.0和3.0之间，
iii向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
iv向样品中加入荧光标记试剂，获得具有被荧光标记的核酸的样品，其中荧光标记试剂与核酸相互作用，
v确定样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，
vi基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，确定至少一种生物细胞的倍性。
52.根据权利要求51的方法,进一步包括权利要求2-48的任一项的任何特征。
53.一种用来确定药物干扰对细胞周期的影响的方法，该方法包括步骤：
i提供包括至少一种生物细胞的样品，或者提供包括具有核酸的细胞部分的样品，所述细胞部分获自至少一种生物细胞，其中所述至少一种生物细胞在取样前或取样后被暴露于一定量的药物，
ii向样品中加入酸剂，使样品酸化至pH水平在2.0和3.0之间，
iii向样品中加入去垢剂，使生物细胞裂解，
iv向样品中加入标记试剂，获得具有被荧光标记的核酸的样品，其中标记试剂与核酸相互作用，
v确定样品中至少一种生物细胞或者细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，
基于样品中至少一种生物细胞或细胞部分的被荧光标记的核酸的含量，确定药物干扰至少一种生物细胞的细胞周期的哪个细胞周期阶段。
54.根据权利要求53的方法，进一步包括权利要求2-48中任一项的任何的特征。
55.用于权利要求1-54中任一项的方法中的部件试剂盒，所述试剂盒包括：
一定量的酸剂，
一定量的去垢剂，
一定量的能够与核酸相互作用的标记试剂，以及
任选地，一定量的中和剂。
56.根据权利要求55的试剂盒，其中该一定量的去垢剂是存在于该一定量的酸剂中或者与该一定量的酸剂、一定量的标记试剂和一定量的中和剂分开。
57.根据权利要求55至56中任一项的试剂盒，其中该一定量的酸剂、一定量的去垢剂、一定量的标记试剂和一定量的中和剂都是液体形式。
58.根据权利要求55至57中任一项的试剂盒，其中该一定量的酸剂在5μL至10mL的范围。
59.根据权利要求55至58中任一项的试剂盒，其中该酸剂的酸浓度为25-250mM。
60.根据权利要求55至59中任一项的试剂盒，其中所述酸选自下组：柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液、磷酸、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、乳酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐和丙酸盐。
61.根据权利要求55至60中任一项的试剂盒，其中所述酸剂的pH在1至5的范围内。
62.根据权利要求55至61中任一项的试剂盒，其中在酸剂中存在的所述去垢剂的量组成酸剂量的0.05%-5%(w/v)。
63.根据权利要求55至62中任一项的试剂盒，其中所述一定量的去垢剂当与所述一定量的酸剂分离时，是5μL至1mL。
64.根据权利要求55至63中任一项的试剂盒，其中所述去垢剂选自Triton X-15、TritonX-45、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-207、Triton N-57、Triton N-101、Triton QS-158、Triton 770、Igepal CA-630、Brij 96、Tween-20、Tween-80、CHAPS、Cetyl、Cetyl-N3、Luten-Sol、Losec和Pluronic L31组。
65.根据权利要求55至64中任一项的试剂盒，其中一定量的荧光标记试剂该一定量的酸剂的结合部分，该一定量的中和剂的结合部分，或与该一定量的酸剂以及该一定量的中和剂分离。
66.根据权利要求55至65中任一项的试剂盒，其中所述荧光标记试剂包括能够与核酸相互作用的荧光染料。
67.根据权利要求66的试剂盒，其中所述荧光染料选自DNA特异的荧光染料以及结合DNA和RNA的荧光染料组。
68.根据权利要求66至67中任一项的试剂盒，其中所述荧光染料是荧光团。
69.根据权利要求66至68中任一项的试剂盒，其中所述荧光染料是DNA特异染料，选自DAPI、Hoechst 33342、Hoechst 33258、Hoechst 34580、Draq5和Nuclear ID红组。
70.根据权利要求66至68中任一项的试剂盒，其中所述荧光染料能够结合DNA和RNA两者，并且所述染料选自下组：碘化丙啶、7-AAD、溴化乙锭、乙锭均二聚物1、乙锭均二聚物2、吖啶橙和LDS 751。
71.根据权利要求66至68中任一项的试剂盒，其中所述荧光染料选自RNA特异染料″-6-双(2″-咪唑啉基-4′-5′H)-2-苯基l-4′-phenoxindole，苯乙烯基RNA选择性and 
RNASelectTM Green。
72.根据权利要求66至71中任一项的试剂盒，其中所述荧光染料的浓度为1-50μg/ml。
73.根据权利要求55至72中任一项的试剂盒，其中所述中和剂选自柠檬酸盐缓冲液、马来酸盐、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、苹果酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、乙醇胺、DIPSO、Bis-Tris、ADA、ACES、咪唑、肼、BES、HEPES、HEPPSO、HEPBS、AMP、AMPD、AMPSO、MES、MOPS、MOPSO、MOBS、PIPES、N-二甘氨酸、HEPPS、EPPS、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、硼酸盐、CHES、牛磺酸、TEA、TES、三甲基甘氨酸和三羟甲基氨基甲烷的生物缓冲液组。
74.根据权利要求55至73中任一项的试剂盒，其中所述中和剂具有介于7和9之间的pH。
75.根据权利要求55至74中任一项的试剂盒，其中所述中和剂的浓度为50-1000mM。
76.根据权利要求55至75中任一项的试剂盒，其中所述中和剂的量在5μL至10mL的范围内。
77.根据权利要求55至76中任一项的试剂盒，进一步包括一定量的RNase或DNase。
78.根据权利要求55至77中任一项的试剂盒，进一步包括用于试剂盒的说明书。
79.根据权利要求55至78中任一项的试剂盒,进一步包括盒或载片，用于uzhixing样品和试剂之间的反应和/或用于分析反应后的样品。
80.根据权利要求55至79中任一项的试剂盒,进一步包括权利要求2-45的任一项的任何特征。
81.一种用于裂解和荧光标记生物细胞的组合物，所述组合物包括：
酸剂或酸缓冲液，
去垢剂，和
荧光标记试剂。
82.根据权利要求81的组合物,进一步包括权利要求58、64、66-72和/或77中任一项的任何特征。
83.一种用于标记生物细胞同时中和包括该生物细胞的样品的组合物，所述组合物包括：
●标记试剂，和
●中和剂。
84.根据权利要求80的组合物，进一步包括权利要求66-77中任一项的任何特征。
85.根据权利要求1-55中任一项的试剂盒或者根据权利要求55-80中任一项的试剂盒，用于检查生物样品是否包括遗传不稳定的细胞。
86.根据权利要求85的应用，其中所述生物样品是血样或组织样品。
87.一种分析造成个体细胞不稳定的疾病的发展的方法，所述方法在两不同时间点包括步骤：
●从个体获得生物样品，
●分析所获得的生物样品中不稳定细胞的存在，例如遗传不稳定的细胞，
●比较在两不同时间点，在生物样品中鉴定的不稳定细胞数，
基于对不稳定细胞数的比较，确定疾病的发展，所述不稳定细胞例如在两不同样品中鉴定的遗传不稳定细胞。
88.根据权利要求87的方法，其中两不同时间点分开至少24小时。
89.根据权利要求87或88的方法，其中所述生物样品是血样或组织样品。
90.根据权利要求87或88的方法，其中所述疾病是癌症。
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