CN1560277A - 一种定量检测微量循环dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属血清学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光染料的微量循环DNA的定量检测技术。本发明通过染料与纯化的DNA结合后所产生的荧光强度分析，定量出外周血中游离DNA的含量。本发明可精确检测到低至纳克水平的微量循环DNA，具有快速、简便、敏感、精确的特点。通过对一定人群和肿瘤患者循环DNA的测定，验证了本发明具备了较高的可靠性、灵敏性和准确性。本发明可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断以及疗效预后的动态观察。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域，涉及血清学检测技术，具体涉及一种基于荧光染料的微量循环DNA的定量检测技术。
背景技术
肿瘤是严重危害人类健康的疾病，在我国已占各类死亡原因的第二位。肿瘤的早期诊断和治疗，是提高治愈率的关键。近年研究表明，肿瘤在生长过程中，能持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液，故患者循环DNA含量可高于正常，且具有肿瘤特异性的分子遗传改变。循环DNA即存在于外周循环血清/血浆中的游离DNA。循环DNA的水平可反映肿瘤的存在和严重程度，并有望成为新的广谱肿瘤分子标志物。
正常人循环DNA的含量极微弱，每毫升仅为纳克水平，已超出溴化乙锭(EB)染色和OD260检测等实验室常用的DNA定量方法的敏感性范围。目前实验室常用的EB染色法的敏感性比荧光染料法低一个数量级，且EB具有剧毒，操作需要十分小心，不适于大范围推广；而OD260检测则需将待测样品倒入比色杯，体积至少需达到100μl，故无法检测微量DNA，而且样品容易受到污染，无法继续进一步的实验研究。国外多采用放射免疫法、荧光分光光度法、定量PCR法和DipstickTM试剂盒等进行血清DNA的定量研究。但由于放射免疫法涉及同位素且操作复杂，目前已基本淘汰；荧光分光光度仪和定量PCR仪的价格都在10万元以上，对于一些小型的科研机构和临床检验部门来说过于昂贵；而美国Invitrogen公司生产的DipstickTM试剂盒50人份的价格在3000元左右，如果推广，价格难以接受，这在很大程度上限制了我国同类研究的开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、敏感的定量检测微量循环DNA的方法。
本发明通过染料与纯化的DNA结合后所产生的荧光强度分析，定量出外周血中游离DNA的含量。本发明在不增加实验室现有设备的前提下，对血清/血浆进行分离、保存后，抽提其中游离DNA，与荧光染料混匀反应，置紫外投射仪中数码成像，分析荧光信号密度定量，计算血清/血浆中的游离DNA的水平，建立了一种基于荧光的DNA染色定量检测方法。
本发明方法通过下述方法和步骤进行，
1.血清/血浆分离、保存，
取外周静脉血，置试管或抗凝管中，室温静置，3000转/分钟离心。取上层血清再离心，吸上层血清，直接检测或低温保存至使用。
2.抽提游离DNA，采用“微量血液基因组抽提试剂盒”(上海华舜生物工程有限公司)抽提血清DNA。取血清，加2倍体积的裂解液DL以及蛋白酶K，混匀后置65℃水浴消化，加入2倍血清/血浆体积的异丙醇，混匀后12000转/分钟离心，使液体通过试剂盒的吸附柱后，柱中加入缓冲液W1，静置，12000转/分钟离心弃液体。重复W1液洗柱，弃去液体，再离心。收集纯化的DNA，直接检测或低温保存至使用。
3.DNA定量：取上述纯化的血清/血浆DNA，与稀释的荧光染料SYBR GreenI(美国Molecular Probes公司)混匀后点样于透明薄膜上反应，置于紫外投射仪中数码成像(FR-200紫外与可见分析装置，上海复日科技有限公司)，用SMART VIEW分析软件对荧光信号进行密度定量，通过标准曲线计算出样品中的DNA含量，并换算出每毫升血清/血浆中的游离DNA的水平。
本发明方法能精确检测到低至2ng的微量DNA，而且所用仪器使用普遍且方便，所用试剂价格较便宜。配合高效DNA抽提试剂盒，即能快速、敏感地测出受试人员的循环DNA水平，为恶性肿瘤早期诊断和疗效随访提供实验室检测依据。
应用本发明，对150例健康人员和533例各类肿瘤患者的血清DNA进行了定量检测。结果150名健康人员的平均浓度为22.2ng/ml，与国外放免法、定量PCR法和DipstickTM试剂盒检测结果相一致。而483例恶性肿瘤患者血清标本平均DNA含量为81.3ng/ml。除食管癌以外，其余9类恶性肿瘤患者的血清DNA均显著高于健康对照(P＜0.05)。血清DNA增高以肝癌患者最为显著，平均达155.7ng/ml，超出正常值95％上限(37ng/ml)者高达84.6％(44/52)；其次为结直肠癌和胃癌，平均水平分别为119.2ng/ml和80.1ng/ml。在50例包括子宫肌瘤、甲状腺腺瘤和乳腺腺瘤等良性肿瘤患者中，血清DNA平均水平未见显著增高(P＞0.05)。
本发明以定量检测循环DNA为目标，具有快速、简便、敏感、精确的特点，适用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断以及疗效预后的动态观察，为肿瘤的实验室诊断提供又一新的联合检测指标。
附图说明
图1是各类恶性肿瘤患者血清DNA水平，
图2是标准量DNA的SYBR Green I荧光染色，
图3是DNA含量与荧光强度的相关性曲线，
图4是肝癌患者血清DNA含量检测结果。
具体实施方式
实施例1
1，血清/血浆分离、保存，
取2ml～3ml外周静脉血，置试管或抗凝管中，10℃～20℃静置4小时，3000转/分钟离心10分钟。取上层血清再次以同样转速离心10分钟，吸取上层血清，获完全无血细胞成分的血清或血浆，直接用于检测或于-70℃保存至使用。
2，抽提血清/血浆中游离DNA，以“微量血液基因组抽提试剂盒”(上海华舜生物工程有限公司)抽提血清DNA。取血清500μl～1000μl，加入2倍体积的裂解液DL以及蛋白酶K，终浓度为100μg/ml～150μg/ml，充分混匀后置65℃水浴中消化15分钟～1小时，期间来回颠倒混匀数次，直至液体清亮而且不粘稠。再加入2倍血清/血浆体积的异丙醇，颠倒混匀后分数次以12000转/分钟离心，使所有液体均通过试剂盒自带的吸附柱，丢弃离心下来的液体。然后在柱中加入500μl缓冲液W1，静置1分钟，以12000转/分钟离心弃液体。重复以500μl W1液洗柱一次，弃去液体，然后以同样速度离心1分钟。最后给柱子换新的离心管，加入25μl～40μl H2O，65℃水浴静置5分钟，12000转/分钟离心洗脱DNA，收集离心下来的液体，即纯化好的DNA，可直接用于检测或-20℃保存至使用。
3.DNA定量：取10μl已经纯化的血清/血浆DNA，与10μl 1∶3000稀释(以无菌的三蒸水稀释)的荧光染料SYBR Green I(美国Molecular Probes公司)混匀后点样于透明薄膜上，反应1分钟后置于紫外投射仪中，在激发光波长312nm，吸收光波长cutoff值500nm的条件下数码成像(FR-200紫外与可见分析装置，上海复日科技有限公司)，以SMART VIEW分析软件对荧光信号进行密度定量，通过标准曲线计算出样品中的DNA含量，并换算出每毫升血清/血浆中的游离DNA的水平。
实施例2 制订标准曲线
精确吸取荧光染料SYBR Green I(美国Molecular Probes公司)1μl，加入无菌的三蒸水3000μl，混匀作1∶3000稀释备用。取已知浓度为10ng/μl的质粒DNA(标准量DNA来源于美国Invitrogen公司DipstickTM试剂盒)，稀释5倍至浓度为2ng/μl备用。取出复日科技有限公司紫外与可见分析装置的紫外透射板，铺一块透明薄膜，在膜中央点样。第一点加10μl三蒸水，第二点加2ng/μl的DNA 1μl和9μl三蒸水，第三点加2ng/μl的DNA 2μl和8μl三蒸水，第四点加2ng/μl的DNA 3μl和7μl三蒸水，以此类推，直到第八点加2ng/μl的DNA 7μl和3μl三蒸水。上述八个点的DNA含量分别为0、2、4、6、8、10、12、14ng。然后每点加入10μl稀释的SYBR Green I，充分混匀，静置1分钟后置于紫外投射仪中以紫外灯照射，最佳效果拍摄所产生的荧光信号，结果SYBR Green I染色法至少能精确检测出低至2ng的微量DNA(图2)。并以复日公司的SMARTVIEW图像分析软件密度定量所产生的荧光信号，可见在2ng～10ng的范围内，DNA含量与荧光强度呈明确的线性关系，Spearman’s等级相关分析得其相关系数为0.9972(图3)。
实施例3 肝癌患者血清DNA的抽提和定量
取5名肝癌患者外周血2ml，室温20℃静置4小时，3000转/分钟离心10分钟，吸取上层血清后再离心，共获700μl血清。取血清500μl，加入裂解液DL 1000μl及20mg/ml的蛋白酶K 11.5μl(终浓度为150μg/ml)，混匀后置65℃水浴中消化15分钟～1小时，期间颠倒混匀数次，至液体清亮且不粘稠。取出样品，加入1000μl的异丙醇，颠倒混匀后分数次12000转/分钟离心，使液体通过试剂盒自带的吸附柱，丢弃离心下来的液体。在柱中加入500μl缓冲液W1，静置1分钟，以12000转/分钟离心30秒弃去液体。重复500μl W1液洗柱，弃去液体，同样速度离心1分钟。最后给柱子换新的离心管，加入40μl无菌的三蒸水，65℃水浴静置5分钟，12000转/分钟离心洗脱DNA，收集离心下来的液体，即纯化好的DNA，可直接用于检测或-20℃保存至使用。取上述纯化好的DNA 10μl与1∶3000稀释好的SYBR Green I 10μl点样于透明薄膜上充分混匀，反应1min后置于紫外投射仪中以紫外灯照射，最佳效果拍摄所产生的荧光信号。结果如图4所示，所有5份待测标本均出现阳性信号。各点以复日公司的SMART VIEW图像分析软件密度定量所产生的荧光信号，对照标准曲线计算出样品中的DNA含量分别为1.7ng、7.1ng、0.3ng、16.7ng、9.7ng，根据比例关系换算成对应病人每毫升血清中含13.6ng、56.8ng、2.4ng、133.6ng、77.6ng游离DNA。
Claims (2)
1、一种定量检测微量循环DNA的方法，其特征是基于荧光的DNA染色定量检测方法，包括下述步骤，
(1)分离、保存血清/血浆，取外周静脉血，置试管或抗凝管中，室温静置，3000转/分钟离心，取上层血清再离心，吸上层血清，直接检测或低温保存至使用；
(2)抽提血清/血浆中游离DNA，取血清，加2倍体积裂解液DL及蛋白酶K，混匀后置65℃水浴消化，加2倍血清/血浆体积的异丙醇，混匀后12000转/分钟离心，使液体通过试剂盒的吸附柱后，柱中加入缓冲液W1，静置，12000转/分钟离心弃液体，重复W1液洗柱，弃去液体，再离心，收集纯化的DNA；
(3)取上述纯化DNA与荧光染料混匀点样于透明薄膜上反应，置紫外投射仪中数码成像，用SMART VIEW分析软件对荧光信号密度定量，制订标准曲线，计算血清/血浆中的游离DNA的水平。
2、按权利要求1所述的定量检测微量循环DNA的方法，其特征是其中步骤(3)所述的荧光染料是以无菌三蒸水稀释1∶3000稀释荧光染料，所述紫外投射仪的激发光波长为312nm，吸收光波长cutoff值为500nm。
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|---|---|---|---|---|
| CN102732631A (zh) * | 2012-07-04 | 2012-10-17 | 南通大学附属医院 | 人游离dna完整性的检测方法 |
| CN102971617A (zh) * | 2010-02-11 | 2013-03-13 | 克莫麦特公司 | 分析细胞dna含量的方法 |
| CN103184146A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-07-03 | 安徽科技学院 | 一种dna混样装置 |
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2004
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