CN110551816A

CN110551816A - 检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN110551816A
Application number: CN201810548849.0A
Authority: CN
Inventors: 熊慧; 谢立群; 徐任; 陆孟超; 陈嘉铮; 李云航; 高峰英
Original assignee: Suzhou Yuntai Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Suzhou Yuntai Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-12-10

Abstract

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML‑RARa融合基因的试剂盒。本申请的采用PCR结合实时荧光探针技术，对临床外周血标本中的白血病相关融合基因PML‑RARa的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择，具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。

Description

检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法

技术领域

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法。

背景技术

白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒－单核细胞白血病(CMML)等。

白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2.76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。

t(15；17)(q22；q12-21)易位，即15号染色体上的PML基因易位到17号染色体上的RARa基因上形成PML-RARa融合基因，约90％以上的APL患者中可检测到此融合基因，可作为APL诊断依据、疗效评价，以及监测白血病微小残留状态的分子指标。

目前对白血病的检查主要有血象检查、骨髓涂片检查、血液生化检查等，但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。

其中，FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因，适用于多种临床标本，包括血液，骨髓、组织印片，甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH对处于分裂中期和间期细胞都能检测，克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍，但最低检出量较低，主要用于初诊和复发的检测。

PCR是检测融合基因的首选方法，不同类型的白血病和淋巴瘤存在不同的染色体易位，目前检测融合基因的主要PCR方法有巢式PCR方法，但这些大多是终点PCR方法，而且需要经过电泳检查，容易污染，极大地抑制了其在临床的广泛应用。

基因芯片方法是将许多白血病特异的探针固定在特定的介质上，利用分子之间相互识别的原理，来检测与探针相互作用的分子。通过基因芯片检查，可以发现病人骨髓中是否存在染色体易位。但目前该技术尚不够成熟，尤其是在PCR后的开管取样用于杂交，对其后的PCR反应，存在着很大的污染隐患，因此有一定的假阳性和假阴性率，且结果不容易解释，临床推广困难。

在荧光定量PCR技术普及前，很多研究学者采用竞争性定量PCR技术对融合基因进行定量分析，但竞争性定量PCR不仅耗时耗力，而且不利于标准化操作的建立，极大限制了其在临床上的应用。

实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)基于荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，通过检测PCR过程的荧光信号而得知靶基因的初始拷贝数。实时定量PCR应用简化了检测过程，其反应速度快，最低检出量高，特异性强，可重复性好，是目前国内外学者研究白血病融合基因首选的检测手段。2002年，由欧洲10个国家26个实验室共同参与制定了“欧洲防癌计划”，建立了一套白血病标准化的融合基因检测方法，为大规模的临床融合基因检测奠定了理论基础，但因为缺乏中国患者的数据，未能在中国大规模应用。

鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本申请的发明目的在于提出一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒。

为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：

本申请涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括PML-RARa PCR反应液和内参PCR反应液；

其中，所述PML-RARa PCR反应液用于检测PML-RARa融合基因，所述内参PCR反应液用于检测内参基因；

其中，所述用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:1～SEQID NO:3所示的上游引物、由SEQ ID NO:4所示的下游引物、由SEQ ID NO:5所示的探针；

所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:6所示的上游引物、由SEQID NO:7所示的下游引物、由SEQ ID NO:8所示的探针；

所述探针的两端标记有荧光基团。

可选的，SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA，SEQID NO:8所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。

可选的，所述核酸扩增试剂中还包括PML-RARa酶液，所述PML-RARa酶液包括Taq酶和UNG酶。

可选的，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为质粒混合液，所述质粒混合液中含有PML-RARA-L质粒DNA和内参质粒DNA；

其中，PML-RARA-L质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

可选的，所述试剂盒中还包括参考品，所述参考品用于形成目的基因和内参基因的标准曲线从而对目的基因和内参基因分别进行定量，所述参考品包括PML-RARa参考品1、PML-RARa参考品2、PML-RARa参考品3、PML-RARa参考品4、内参参考品1、内参参考品2、内参参考品3和内参参考品4；

所述PML-RARa参考品1、所述PML-RARa参考品2、所述PML-RARa参考品3和所述PML-RARa参考品4中含有PML-RARA-L质粒DNA，所述内参参考品1、所述内参参考品2、所述内参参考品3和所述内参参考品4中含有内参质粒DNA；

其中，所述PML-RARa参考品1中的质粒浓度为1×10⁶copies，所述PML-RARa参考品2中的质粒浓度为1×10⁵copies，所述PML-RARa参考品3中的质粒浓度为1×10⁴copies，所述PML-RARa参考品4中的质粒浓度为1×10³copies，所述内参参考品中的质粒浓度为1×10⁶copies，所述内参参考品2中的质粒浓度为1×10⁵copies，所述内参参考品3中的质粒浓度为1×10⁴copies，所述内参参考品4中的质粒浓度为1×10³copies；

可选的，所述试剂盒中还含有PML-RARa MIX反应液。

可选的，所述试剂盒所适用的样本选自外周血标本。

本申请还涉及一种检测人PML-RARa融合基因的引物和探针，包括由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的上游引物、由SEQ ID NO:4所示的下游引物、由SEQ ID NO:5所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。

优选的，所述引物和探针还包括用于检测内参基因的引物和探针，所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:6所示的上游引物、由SEQ ID NO:7所示的下游引物、由SEQ ID NO:8所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。

本申请还涉及该试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：

(1)采集样本，提取样本RNA；

(2)样本RNA逆转录成cDNA；

(3)配制扩增试剂：将PML-RARa PCR反应液、PML-RARa MIX反应液和PML-RARa酶液混合制备成PML-RARa PCR预反应液；将内参PCR反应液、PML-RARa MIX反应液和PML-RARa酶液混合制备成内参PCR预反应液；

(4)加样：从各参考品、样本、阴性对照、阳性对照分别取样，分别加至各装有所述PML-RARa PCR预反应液和所述内参PCR预反应液中；

(5)PCR扩增；

(6)检测并判定结果。

本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：

本申请试剂盒采用PCR结合实时荧光探针技术，对临床外周血标本中的白血病相关融合基因PML-RARa的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择，具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。

1、本申请试剂盒的最低检出量高：敏感度达10²copies，且线性范围宽，可在10²～10¹⁰copies的范围内进行定量。

2、本申请试剂盒特异性强：荧光探针和模板杂交的应用，并通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，故与传统的PCR技术相比，特异性大为提高。

3、本申请试剂盒稳定性好，因为域值设置在指数扩增期，各反应组分浓度相对稳定，C_T值与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比，能更精确地反映起始模板的拷贝数。

4、本申请试剂盒的污染小：一般PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和紫外光进行观察，或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，且染色剂溴化乙锭对人体有害，这些繁杂的实验过程给污染和假阳性提供了机会。本申请试剂盒采用一步法逆转录，只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要逆转录后或PCR后处理，因此操作简便、省时、减少污染，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。

具体实施方式

本申请实施例涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，采用PCR结合实时荧光探针技术，对临床外周血标本中的白血病相关融合基因PML-RARa的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择。

同时，本申请实施例的试剂盒还使用尿苷酶(UNG)防污染体系,经加热可选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染；采用内参基因，控制整个试剂盒检测过程的有效性。采用两套参考品标准曲线对目的基因和内参基因的进行分别定量以达到精准比值。

具体的，本申请实施例的试剂盒具体如表1所示：

表1

具体的，引物和探针的核苷酸序列具体如表2所示：

表2

名称	编号	核苷酸序列	修饰
				ENF1	SEQ ID NO:1	tcttcctgcccaacagcaa	—
ENF2	SEQ ID NO:2	acctggatggaccgcctag	—
				ENF3	SEQ ID NO:3	ccgatggcttcgacgagtt	—
ENR1	SEQ ID NO:4	gcttgtagatgcggggtagag	—
				P3	SEQ ID NO:5	agtgcccagccctccctcgc	5‘-FAM；3'-TAMRA
内参-F	SEQ ID NO:6	tggagataacactctaagcataactaaaggt	—
				内参-R	SEQ ID NO:7	gatgtagttgcttgggaccca	—
内参-P	SEQ ID NO:8	ccatttttggtttgggcttcacaccatt	5‘-FAM；3'-TAMRA

具体的，质粒DNA的核苷酸序列具体如表3所示：

表3

本申请试剂盒的对样本要求为：

样本采集：本试剂盒适用于抗凝外周血样本。其抗凝样本要求：抗凝剂采用EDTA、草酸钠、枸橼酸钠。

样本保存：取抗凝外周血样本用Trizol按1:3比例混匀，或对新鲜样本破红细胞进行有核细胞的富集，悬浮，按3倍体积量加入Trizol混匀，保存时限4℃不超过24小时。长期保存在-20℃。

样本运输：保存在Trizol抗凝外周血样本4℃，低温运输。

抽提RNA要求：使用Rneasy Mini kit试剂盒抽提。或者采用Trizol方法抽提。提取完的RNA建议立即进行检测，否则短期请于-20℃以下保存，长期请于-80℃保存，防止RNA降解。

本申请试剂盒的使用方法为：

1.样本处理(注意：阴性对照、阳性对照与标本同时处理)：

采用Rneasy Mini kit试剂盒提取RNA核酸，取保存在Trizol里的标本400μl，加入400μl氯仿，混匀，室温放置5分钟。15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液，加入等体积的buffer RLT，混匀，余下具体步骤参见Rneasy Mini kit说明书。

或者用Trizol方法抽提RNA，具体步骤如下：

①取保存在Trizol里的标本400μl，加入400μl氯仿，混匀，室温放置5分钟。15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液。

②在上述上清中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。15000rpm离心10分钟，吸弃上清。

③在上述离心管中，加入300μl预冷的70％乙醇，15000rpm离心5分钟，吸弃上清。室温10分钟，使乙醇挥发。

加入200μl DEPC-ddH₂O混匀溶解，以此作为相关PCR反应的模板。

2.样本逆转录成cDNA：

将上述处理好的样本RNA，用promega公司的MMLV逆转录试剂盒进行制备，实验步骤具体参阅该试剂盒说明书。

3.扩增试剂准备：

从试剂盒中取出各种反应液及MIX反应液，室温融化并振荡混匀后，短暂离心数秒，PML-RARa PCR反应液、内参PCR反应液体系1人份均按如下配制：5μl PCR反应液+13μlPML-RARa MIX反应液+2μl PML-RARa酶液(PCR管数应为样本数、1个阴性对照、1个阳性对照及4个参考品之和)。

将上述配制好的PCR预混液，分别按每管20μl的量，分装于各PCR管内。

4.加样：

从各参考品和样本(包括阴性对照、阳性对照)处理液中分别取5μl，加至装有上述相应PCR预混液的PCR管中，盖紧管盖、将其移至检测区。具体见下表4：

表4

5.PCR扩增：

5.1扩增条件

ABI系列荧光PCR检测仪、Bio-Rad CFX96荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)40个循环。反应体系为25μl。在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。

Stratagene Mx3000p荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)40个循环。反应体系为25μl。在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。

5.2检测通道和参比荧光

ABI 7300荧光PCR检测仪、ABI 7500荧光PCR检测仪检测通道为：FAM-TAMRA，参比荧光设定为none。

Bio-Rad CFX96荧光PCR检测仪检测通道为：FAM。

Stratagene Mx3000p荧光PCR检测仪检测通道为：FAM。参比荧光设定为none。

6.检测：

(1)基线的确定：软件默认设定3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。依据实验曲线走势的不同，一般start值可选择在3-12之间；stop值选择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则，以更好满足统计基线标准偏差的数学要求。

(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。

(3)注意：对于同一个标本，需同时进行阴性、阳性对照及参考品标准曲线的分析，并且目的基因和内参基因反应液应使用相同的基线和阈值进行分析。

【阳性判断值或者参考区间】

本试剂盒能检出体系中含100个拷贝融合基因的RNA。

【检验结果的解释】

1、有效性判定：试剂盒相关组份必须符合表5要求，否则视为实验无效。

表5

2、结果判定：

(1)定性判定，判定方法具体如表6所示：

表6

(2)定量判定：

在标本PML-RARa融合基因为阳性且PML-RARa和内参基因的检测浓度均大于等于1×10²copies时，进行下列定量结果分析。

参考品1-4在PML-RARa和内参反应中分别设定为：1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³copies，在扩增结束后，用获得的相应两条标准曲线，分别得到各标本PML-RARa的检测浓度(A)和内参基因的检测浓度(B)。

a.若标本：PML-RARa RNA检测浓度(即A)>1×10⁷copies，应不在线性范围内，需酌情适当稀释后重测。

若标本：ABL RNA检测浓度(即B)>1×10⁷copies，应不在线性范围内，需酌情适当稀释后重测。

b.若标本：1×10²copies≤PML-RARa RNA检测浓度(即A)≤1×10⁷copies，且1×10²copies≤ABL RNA检测浓度(即B)≤1×10⁷copies，则报告为PML-RARa的检测浓度(A)和内参基因的检测浓度(B)的比值即(A/B)×100％。

当本试剂盒在检测最小残留病灶时，为了能检测到低至万分之一的融合基因，对于治疗后的病人，其内参基因的检测C_T值必须小于23，为了精确定量原液进行PML-RARa融合基因检测，RNA原液稀释100倍后进行内参基因检测，以保证相应检测基因的浓度均在线性范围内，此时报告为PML-RARa的检测浓度(A)和内参基因的检测浓度(B)的比值即(A/B)×1％。

实施例1

一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，其组成如表7所示：

表7：

试剂盒各组分的包装及含量如表8所示：

表8：

实施例2：样本线性和参考品线性

选取已确定浓度的PML-RARa和内参基因的质粒各400μl，制成高浓度DNA样本(L0)，上述两个样本分别作为本试剂盒的样本线性质控品L0，然后用工艺用水以1：10梯度将L0样本进行系列稀释，分别得到两组线性质控品L1、L2、L3和L4。具体如表9和表10所示。

以浓度的对数值为Y，Ct均值为X，进行线性拟合，计算其线性相关系数r。具体表9和表10所示。

表9

PML-RARa线性质控品	进入反应模板数(copies)
		PML-RARa-L0	5×10<sup>6</sup>
PML-RARa-L1	5×10<sup>5</sup>
		PML-RARa-L2	5×10<sup>4</sup>
PML-RARa-L3	5000
		PML-RARa-L4	500
r值	≥0.980

表10

内参基因线性质控品	进入反应模板数(copies)
		ABL-L0	5×10<sup>6</sup>
ABL-L1	5×10<sup>5</sup>
		ABL-L2	5×10<sup>4</sup>
ABL-L3	5000
		ABL-L4	500
r值	≥0.980

根据上述线性相关系数r可知，本申请试剂盒的样本线性良好。

按试剂盒说明书进行操作，以参考品浓度的对数值为Y，C_T均值为X进行线性拟合，计算其线性相关系数r，实验结果为：r≥0.980。说明本申请试剂盒的系列参考品线性良好。

实施例3：本申请试剂盒的准确性检测

采用实施例1的试剂盒对准确性参考品进行检测：选取检定合格的NB4细胞株裂解物、PML-RARa-S质粒、PML-RARA-V质粒，上述3份样本组成本试剂盒的准确性质控品PB1～PB3。具体配制方法如表11所示。

表11

其中，PML-RARa-S质粒、PML-RARA-V质粒的核苷酸序列如表12所示。

表12

采用本申请试剂盒对上述3份准确性质控品进行测定，具体实验结果如表13所示：

表13

采用本申请的试剂盒检测准确性参考品，阳性符合率为100％。

实施例5：本申请试剂盒的分析特异性检测

采用实施例1的试剂盒对分析特异性参考品进行检测：选取检定合格的PML-RARa阴性外周血细胞裂解物、HL60细胞株裂解物、Jurket细胞株裂解物，上述3份样本组成本试剂盒的特异性质控品N1～N3。具体配制方法如表14所示。

表14

采用本申请试剂盒对上述3份特异性质控品进行测定，具体实验结果如表15所示：

表15

采用本申请的试剂盒检测特异性参考品样本，阴性符合率为100％。

实施例6：本申请试剂盒的精密度检测

采用实施例1的试剂盒对精密度参考品进行检测。选用NB4细胞株裂解物，用Trizol稀释至3×10⁴cells/ml，作为本试剂盒的PML-RARa融合基因精密度质控品，具体配制方法如表16所示。

表16

采用本申请的试剂盒对上述细胞株裂解物的RNA提取液，用相应的反应液各重复检测10次，具体实验结果如表17所示：

表17

采用本申请的试剂盒对各精密度参考品，在相应的反应液中重复做10次，均能检出，实验数据CV值≤5％。

实施例5：本申请试剂盒的最低检出量检测

采用实施例1的试剂盒对最低检出量参考品进行检测。用工艺用水以1：5梯度将PML-RARA的线性质控品L4样本进行稀释，得到质控品LN，作为本试剂盒的检测限质控品，具体配制方法如表18所示。

表18

采用本申请的试剂盒进行检测，检测结果如表19所示。

表19

最低检出量参考品	C<sub>T</sub>值
		PML-RARA-LN	32.51

采用本申请的试剂盒对最低检出量参考品进行检测，最低检出量为100拷贝/反应。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

序列表

<110> 苏州云泰生物医药科技有限公司

<120> 检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcttcctgcc caacagcaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctggatgg accgcctag 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgatggctt cgacgagtt 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttgtagat gcggggtaga g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgcccagc cctccctcgc 20

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggagataac actctaagca taactaaagg t 31

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgtagttg cttgggaccc a 21

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28

<210> 9

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcccagaag aggaagtgca gccagaccca gtgccccagg aaggtcatca agatggagtc 60

tgaggagggg aaggaggcaa ggttggctcg gagctccccg gagcagccca ggcccagcac 120

ctccaaggca gtctcaccac cccacctgga tggaccgcct agccccagga gccccgtcat 180

aggaagtgag gtcttcctgc ccaacagcaa ccacgtggcc agtggcgccg gggaggcagc 240

cattgagacc cagagcagca gttctgaaga gatagtgccc agccctccct cgccaccccc 300

tctaccccgc atctacaagc cttgctttgt ctgtcaggac aagtcctcag gctaccacta 360

tggggtcagc gcctgtgagg gctgcaaggg cttcttccgc cgcagcatcc agaagaacat 420

ggtgtacacg tgtcaccggg acaagaactg catcatcaac aaggtgaccc ggaaccgctg 480

ccagtactgc cgactgcaga agtgc 505

<210> 10

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgggccgcct ggatgctgtg ctgcagcgca tccgcacggg cagcgcgctg gtgcagagga 60

tgaagtgcta cgcctcggac caggaggtgc tggacatgca cggtttcctg cgccaggcgc 120

tctgccgcct gcgccaggag gagccccaga gcctgcaagc tgccgtgcgc accgatggct 180

tcgacgagtt caaggtgcgc ctgcaggacc tcagctcttg catcacccag gggaaagcca 240

ttgagaccca gagcagcagt tctgaagaga tagtgcccag ccctccctcg ccaccccctc 300

taccccgcat ctacaagcct tgctttgtct gtcaggacaa gtcctcaggc taccactatg 360

gggtcagcgc ctgtgagggc tgcaagggct tcttccgccg cagcatccag aagaacatgg 420

tgtacacgtg tcaccgggac aagaactgca tcatcaacaa ggtgacccgg aaccgctgcc 480

agtactgccg actgcagaag tgctt 505

<210> 11

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggcacacc ccgtgccagt gtacgccttc tccatcaaag gcccttccta tggagaggat 60

gtctccaata caacgacagc ccagaagagg aagtgcagcc agacccagtg ccccaggaag 120

gtcatcaaga tggagtctga ggaggggaag gaggcaaggt tggctcggag ctccccggag 180

cagcccaggc ccagcacctc caaggcagtc tcaccacccc acctggatgg accgcctagc 240

cccaggagcc ccgtcatagg aaccattgag acccagagca gcagttctga agagatagtg 300

cccagccctc cctcgccacc ccctctaccc cgcatctaca agccttgctt tgtctgtcag 360

gacaagtcct caggctacca ctatggggtc agcgcctgtg agggctgcaa gggcttcttc 420

cgccgcagca tccagaagaa catggtgtac acgtgtcacc gggacaagaa ctgcatcatc 480

aacaaggtga cccggaaccg ctgcc 505

<210> 12

<211> 757

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaatgttgg agatctgcct gaagctggtg ggctgcaaat ccaagaaggg gctgtcctcg 60

tcctccagct gttatctgga agaagccctt cagcggccag tagcatctga ctttgagcct 120

cagggtctga gtgaagccgc tcgttggaac tccaaggaaa accttctcgc tggacccagt 180

gaaaatgacc ccaacctttt cgttgcactg tatgattttg tggccagtgg agataacact 240

ctaagcataa ctaaaggtga aaagctccgg gtcttaggct ataatcacaa tggggaatgg 300

tgtgaagccc aaaccaaaaa tggccaaggc tgggtcccaa gcaactacat cacgccagtc 360

aacagtctgg agaaacactc ctggtaccat gggcctgtgt cccgcaatgc cgctgagtat 420

ctgctgagca gcgggatcaa tggcagcttc ttggtgcgtg agagtgagag cagtcctggc 480

cagaggtcca tctcgctgag atacgaaggg agggtgtacc attacaggat caacactgct 540

tctgatggca agctctacgt ctcctccgag agccgcttca acaccctggc cgagttggtt 600

catcatcatt caacggtggc cgacgggctc atcaccacgc tccattatcc agccccaaag 660

cgcaacaagc ccactgtcta tggtgtgtcc cccaactacg acaagtggga gatggaacgc 720

acggacatca ccatgaagca caagctgggc gggggcc 757

Claims

1.一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括PML-RARa PCR反应液和内参PCR反应液；

所述用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的上游引物、由SEQ ID NO:4所示的下游引物、由SEQ ID NO:5所示的探针；

所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:6所示的上游引物、由SEQ IDNO:7所示的下游引物、由SEQ ID NO:8所示的探针；

所述探针的两端标记有荧光基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA，SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括PML-RARa酶液，所述PML-RARa酶液中包括Taq酶和UNG酶。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为质粒混合液，所述质粒混合液中含有PML-RARA-L质粒DNA和内参质粒DNA；

其中，PML-RARA-L质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示、内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括参考品，所述参考品用于形成目的基因和内参基因的标准曲线从而对目的基因和内参基因分别进行定量，所述参考品包括PML-RARa参考品1、PML-RARa参考品2、PML-RARa参考品3、PML-RARa参考品4、内参参考品1、内参参考品2、内参参考品3和内参参考品4；

所述PML-RARa参考品1、所述PML-RARa参考品2、所述PML-RARa参考品3和所述PML-RARa参考品4中含有PML-RARA-L质粒DNA，所述内参参考品1、所述内参参考品2、所述内参参考品3和所述内参参考品4中均含有内参质粒DNA；

PML-RARA-L质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PML-RARa MIX反应液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自外周血标本。

8.一种检测人PML-RARa融合基因的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列包括由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的上游引物、由SEQ ID NO:4所示的下游引物、由SEQ ID NO:5所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团；

9.一种如权利要求1～7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

(1)采集样本，提取样本RNA；

(2)样本RNA逆转录成cDNA；

(3)配制扩增试剂：

将PML-RARa PCR反应液、PML-RARa MIX反应液和PML-RARa酶液混合制备成PML-RARaPCR预反应液；将内参PCR反应液、PML-RARa MIX反应液和PML-RARa酶液混合制备成内参PCR预反应液；

(4)加样：

从各参考品、样本、阴性对照、阳性对照分别取样，分别加至各装有所述PML-RARa PCR预反应液和所述内参PCR预反应液中；

(5)PCR扩增；

(6)检测并判定结果。