CZ308385B6 - Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití - Google Patents
Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308385B6 CZ308385B6 CZ2018-610A CZ2018610A CZ308385B6 CZ 308385 B6 CZ308385 B6 CZ 308385B6 CZ 2018610 A CZ2018610 A CZ 2018610A CZ 308385 B6 CZ308385 B6 CZ 308385B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mmol
- piperazinyl
- methyl
- benzimidazole
- aqueous solution
- Prior art date
Links
- 239000000975 dye Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 35
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 12
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- VMCOQLKKSNQANE-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyl-4-[6-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-benzimidazol-2-yl]aniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 VMCOQLKKSNQANE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 7
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- -1 4-methyl-1-piperazinyl Chemical group 0.000 claims description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 14
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 14
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 14
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 11
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N copper(II) nitrate Chemical compound [Cu+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 7
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 5
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- ILZVMRNIDNNCGW-UHFFFAOYSA-N 2-(3h-benzimidazol-5-yl)-1h-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC=C4N=CNC4=C3)=NC2=C1 ILZVMRNIDNNCGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 9
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000011572 manganese Substances 0.000 abstract description 4
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- DQLVZNPVMCFANR-UHFFFAOYSA-N 2-(3h-benzimidazol-5-yl)-2-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-1,3-dihydrobenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1(C=2C=C3N=CNC3=CC=2)NC2=CC(N3CCN(C)CC3)=CC=C2N1 DQLVZNPVMCFANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- GOVMSHRQBGJGSR-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(3h-benzimidazol-5-yl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-1,3-dihydrobenzimidazol-2-yl]phenol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(NC(N2)(C=3C=CC(O)=CC=3)C=3C=C4N=CNC4=CC=3)C2=C1 GOVMSHRQBGJGSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- GREPXKDBAUAJJP-UHFFFAOYSA-N CN(C1=CC=C(C=C1)C1(NC2=C(N1)C=CC(=C2)N1CCN(CC1)C)C1=CC2=C(NC=N2)C=C1)C Chemical compound CN(C1=CC=C(C=C1)C1(NC2=C(N1)C=CC(=C2)N1CCN(CC1)C)C1=CC2=C(NC=N2)C=C1)C GREPXKDBAUAJJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000010936 aqueous wash Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 2
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 125000003563 glycoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/119—Reactions demanding special reaction conditions pH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Předkládaný vynález popisuje selektivní způsob odstranění 4',6-diamidin-2-fenylindolu (DAPI) a/nebo 2´-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5´-bi-1-benzimidazolu (Hoechst 33258) a/nebo 2´-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5´-bi-1-benzimidazolu (Hoechst 33342) a/nebo-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5´-bi-1-benzimidazol]-2´-yl]benzenaminu (Hoechst 34580) ze vzorků obsahujících buňky, přičemž tento způsob dovoluje zcela nebo částečně uchovat vazbu těchto látek k buněčné DNA v těchto vzorcích. Popsaný přístup je založen na inkubaci vzorků obsahujících buňky s promývacím vodným roztokem, jehož pH je nižší než 5,5, přičemž tento roztok současně obsahuje dvojmocné ionty mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku a/nebo draslíku, přičemž iontová síla tohoto roztoku vypočtená z koncentrací zdrojů vyjmenovaných iontů je alespoň 0,1 mol.l. Tento způsob zcela uchovává vazbu všech vyjmenovaných barviv Hoechst k buněčné DNA. V případě DAPI dochází k částečnému uchování vazby DAPI k DNA.
Description
Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu selektivního odstranění barviv, které se váží k DNA, z různých vzorků obsahujících buňky s minimálním vlivem na jejich vazbu k DNA a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
Pro barvení DNA se používá celá řada látek. Mezi ně se řadí i barviva jako je DAPI (4',6diamidin-2-fenylindol; Biotech. Histochem., 70, 220-233, Schéma 1) nebo barviva Hoechst: Hoechst 33258 (2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol), Hoechst 33342 (2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol), Hoechst 34580 (N,N-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5'-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin; dále jen barviva Hoechst; In Vitro Cell Dev. Biol., 24, 247-252; J. Immunol. Methods, 162, 4145; J. Histochem. Cytochem., 23, 493-505; J. Histochem. Cytochem., 24, 24-33; Schéma 1). Je známo (např. CZ307415), že se jedná o látky, které se poměrně silně váží i ke kultivačním povrchům a/nebo povrchům nádob a/nebo povrchům různých podložek, které se používají při kultivaci buněk a/nebo při zpracování vzorků obsahujících buňky a rovněž na další buněčné složky, např. proteiny, lipidy či RNA. V některých přístupech, např. při stanovení počtu buněk (CZ307415), pak takto vázané molekuly DAPI a barviv Hoechst vedou ke snížené senzitivitě použitých přístupů. Proto je nutné tyto interakce selektivně eliminovat. Dosavadní přístupy spoléhají na poměrně zdlouhavou cestu promývání v běžných pufrech doplněných o některé detergenty.
Hoechst 33342
Hoechst 34580
Schéma 1
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob odstranění barviva, vybraného ze skupiny 4',6-diamidin-2fenylindol (DAPI) 2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol (Hoechst 33258), 2'-(4-ctoxyfcnyl)-5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)-2.5'-bi-l//-bcnzimidazol (Hoechst
- 1 CZ 308385 B6
33342) a A'.N-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5 -bi-IH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin (Hoechst 34580) (Schéma 1), ze vzorků obsahujících buňky, který zcela nebo částečně uchovává vazbu těchto barviv na buněčnou DNA těchto buněk.
Vzorky obsahující buňky mohou být např. samostatné kousky tkání, kousky tkání v různých nádobách, kousky tkání na podložkách, buňky, buňky v různých nádobách, buňky přisedlé na podložkách, nebo preparáty získané sedimentací buněk pomocí gravitační nebo centrifůgační síly na různé podložky. Podložkami mohou být např. podložní nebo krycí skla, nebo další různé destičky nebo různé nádoby ze skla nebo termoplastů např. polystyrenu, polyamidu, polypropylenu nebo polyetylénu nebo polymetylmetakrylátu, které jsou použity pro pěstování nebo záchyt buněk. Nádobami se rozumí jakékoli nádoby použité pro kultivace a/nebo zpracování vzorků. Příkladem jsou zkumavky nebo kultivační láhve nebo misky, např. Petriho misky, nebo kultivační destičky. Mohou být např. ze skla nebo termoplastů např. polystyrenu, polypropylenu, polyetylénu, polyamidu nebo polymetylmetakrylátu.
Při aplikaci popsaného přístupu dochází k odstranění barviv Hoechst nebo DAPI z různých materiálů. Materiálem mohou být např. nádoby a/nebo podložky, které se používají při kultivaci buněk a/nebo při zpracování vzorků obsahujících buňky a/nebo buněčné složky, přičemž buněčnými složkami mohou být proteiny a/nebo RNA a/nebo lipidy. Naopak popsaný přístup zcela nebo částečně uchovává vazbu barviv Hoechst nebo DAPI k buněčné DNA.
Popsaný přístup je založen na inkubaci vzorků obsahujících buňky, které byly před aplikací popsaného přístupu inkubovány s barvivý Hoechst nebo DAPI, s promývacím vodným roztokem, jehož pH je nižší než 5,5, přičemž tento roztok současně obsahuje dvojmocné ionty mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku a/nebo draslíku, přičemž iontová síla tohoto roztoku vypočtená z koncentrací všech zdrojů uvedených iontů je alespoň 0,1 mol.l1. Tento způsob zcela uchovává vazbu všech vyjmenovaných barviv Hoechst k buněčné DNA. Doba nutná pro odstranění více než 95 % barviv Hoechst nenavázaného na DNA je zpravidla kratší než 10 minut. V případě DAPI dochází k částečnému uchování vazby DAPI k DNA. Doba vymytí pro více než 95 % barviva DAPI nenavázaného na DNA je zpravidla kratší než 5 minut. Při této době dochází jen asi k 2 % odstranění barviva DAPI z DNA.
V případě barviv Hoechst je zvláště výhodné použít roztoky s pH nižším než 3, ještě výhodněji s pH nižším než 2. Takto nízká pH společně s přítomností výše uvedených iontů zajišťují odstranění více než 95 % původně vázaných molekul barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky již v průběhu 1-3 minut, aniž jsou tato barviva odstraněna z DNA těchto vzorků. Podle provedených experimentů tato pH nevedou k odstranění barviv Hoechst z DNA těchto vzorků ani po několika hodinách inkubace v promývacích vodných roztocích. To umožňuje na jednu stranu významně zrychlit a zefektivnit proces odstranění barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky a na druhou stranu poskytuje dostatek času pro provedení celého procesu bez nutnosti přesně kontrolovat čas inkubace v promývacím roztoku.
V případě DAPI je výhodné použít pH promývacího roztoku v rozmezí hodnot 4 až 5. Ačkoli je možné i v případě DAPI použít nižší pH než 4, takto nízká pH společně s přítomností výše uvedených iontů již vedou k poměrně rychlému vymývání DAPI nejen ze vzorků obsahujících buňky ale i z DNA těchto vzorků. To vede k podstatnému zkrácení doby, po kterou je možné promývat vzorky obsahující buňky bez výrazného poklesu vazby DAPI na DNA těchto vzorků. Proto jev případě DAPI výhodné omezit čas vymývání v závislosti na použitém pH vymývacího roztoku. Při pH 4 až 5 a přítomnosti výše uvedených iontů je ze vzorků obsahujících buňky odstraněno více než 95 % molekul DAPI nenavázaných na DNA v průběhu 2-3 minut. Tento čas je možné prodloužit, ovšem časy vyšší než 30 minut již vedou i k významnému snížení vazby DAPI na DNA těchto vzorků. V případě použití promývacího roztoku s pH 3-4 dochází k významnému poklesu vazby DAPI na DNA těchto vzorků již po 5 minutách promývání a v případě pH 2 až 3 již po 1 minutě.
-2CZ 308385 B6
Pro maximální účinnost promytí, a to jak v případě barviv Hoechst, tak DAPI, je výhodné provést jednu nebo několik výměn promývacího vodného roztoku nebo omývat vzorky obsahujících buňky proudem promývacího vodního roztoku.
Zdroji použitých iontů jsou výhodně síran měďnatý a/nebo chlorid měďnatý a/nebo dusičnan měďnatý a/nebo chlorid vápenatý a/nebo chlorid manganatý a/nebo chlorid hořečnatý a/nebo chlorid sodný a/nebo chlorid draselný.
Kyselost promývacího roztoku je výhodně upravena přídavkem kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové a/nebo kyseliny chlorovodíkové.
Další mírné zvýšení efektivity odstraňování použitých barviv DNA ze vzorků obsahujících buňky je možné dosáhnout přídavkem detergentů. Zvláště výhodným příkladem detergentu je polyoxyetylensorbitan monolaurát (Tween 20; Schéma 2), výhodně v koncentraci od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.). Dalšími výhodnými příklady detergentů je polyoxyetylensorbitan monooleát (Tween 80; Schéma 2) nebo 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenyl-polyetylen glycol (Triton X-100; Schéma 2) nebo saponiny (skupina amfipatických glykosidů) nebo 4-nonylfenylpolyetylen glycol (Nonidet P 40; Schéma 2), výhodně v koncentraci od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.). Použité roztoky mohou rovněž obsahovat etanol a/nebo metanol bez signifikantního vlivu na rychlost odstranění barviv DNA.
Ntwctet P-4Q
Schéma 2
Zvláště výhodným provedením je v případě barviv Hoechst promývání v promývacím roztoku obsahujícím kyselinu citrónovou (10-100 mmol.l1) a/nebo kyselinu octovou (10-100 mmol.l1) v kombinaci s chloridem vápenatým (50-200 mmol.l1) a/nebo chloridem hořečnatým (50200 mmol.l1) a/nebo chloridem manganatým (50-200 mmol.l1) a/nebo chloridem sodným (0,14 mol.l1) a/nebo chloridem draselným (0,1-4 mol.l1), výhodně s 0,05-2% (obj./obj.) Tweenem 20 a výhodněji rovněž se síranem měďnatým (0,1-50 mmol.l1) a/nebo chloridem měďnatým (0,1
-3 CZ 308385 B6 mmol.I1) a/nebo dusičnanem měďnatým (0,1-50 mmol.l1), přičemž celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvoj mocných iontů mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku je alespoň 0,1 mol.l1. Výhodná celková doba promytí je 1 minuta až 1 hodina. Výhodné je rovněž provést alespoň jednu výměnu promývacího roztoku v průběhu inkubace.
Příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, lOOmmol.l1 chloridu vápenatého, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Jiným příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 100 mmol.l1 síranu měďnatého.
Dalším příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 50 mmol.l1 chloridu vápenatého, 150 mmol.l1 chloridu sodného, 0,2% (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Dalším příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 500 mmol.l1 chloridu sodného, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Zvláště výhodným provedením je v případě DAPI promývání v promývacím vodném roztoku obsahujícím 10-200 mmol.l1 citrátového pufru s pH 4 až 5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného, 0,1-4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného výhodně s 0,05-2% (obj./obj.) Tweenu 20 a výhodněji rovněž se síranem měďnatým (0,150 mmol.l1) a/nebo chloridem měďnatým (0,1-50 mmol.l1) a/nebo dusičnanem měďnatým (0,150 mmol.l1), přičemž celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvojmocných iontů mědi a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku je alespoň 0,1 mol.l1. Výhodná celková doba promytí jel minuta až 30 minut. Výhodné je rovněž provést alespoň jednu výměnu promývacího roztoku v průběhu inkubace.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky obsahující vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru s pH 4-5 obsahující kyselinu citrónovou a citrát trisodný, přičemž vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru rovněž obsahuje chlorid vápenatý a/nebo chlorid hořečnatý a/nebo chlorid manganatý a/nebo chlorid sodný a/nebo chlorid draselný a volitelně síran měďnatý a/nebo chlorid měďnatý a/nebo dusičnan měďnatý.
Podle provedených experimentů představuje popsaný způsob a sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky velice rychlé promytí nespecificky vázané DAPI nebo barviv Hoechst a jsou výhodně využitelné při stanovení počtu buněk za pomoci barviv Hoechst a DAPI dle patentu CZ 307415. Zvláště výhodná je aplikace popsaného způsobu těsně po aplikaci DAPI a/nebo barviv Hoechst. Podle našich výsledků dochází k urychlení promývání v řádu desítek minut a rovněž ke zvýšení přesnosti a citlivosti metody. Zatímco bez uplatnění popsaného způsobu a/nebo sady je citlivost metody v závislosti na provedení zpravidla okolo 200-400 buněk na jamku 96-jamkové destičky, při použití výše popsaného způsobu a barviv Hoechst je citlivost cca 20-50 buněk. Současně díky vyšší přesnosti je možné provádět nižší počet opakování, aniž by došlo k negativnímu ovlivnění výsledků měření. Současně tento způsob ani sada nemá vliv na linearitu měření.
V popsaném způsobu se vzorky obsahující buňky po inkubaci s barvivý vybranými ze skupiny DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580 inkubují s promývacím vodným
-4CZ 308385 B6 roztokem, obsahujícím alespoň jeden iont vybraný ze skupiny zahrnující dvojmocné ionty mědi, vápníku, manganu, hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku, draslíku, přičemž iontová síla tohoto promývacího vodného roztoku, vypočtená z koncentrací všech zdrojů těchto iontů v roztoku, je alespoň 0,1 mol.l1, a přičemž pH roztoku je nižší než 5,5.
Promývací vodný roztok výhodně rovněž obsahuje kyselinu citrónovou a/nebo kyselinu octovou a/nebo kyselinu chlorovodíkovou.
Ve výhodném provedení je v případě, že barvivém je DAPI, pH promývacího vodného roztoku v rozmezí od 4 do 5.
V některých výhodných provedeních je v případě, že barvivém je barvivo vybrané ze skupiny Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580, pH promývacího vodného roztoku nižší než 3, s výhodou je pH nižší než 2.
V některých výhodných provedeních promývací vodný roztok rovněž obsahuje alespoň jeden detergent, s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitan monolaurát, polyoxyetylensorbitan monooleát, 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenyl-polyetylen glykol, saponiny, 4-nonylfenyl-polyetylén glykol, s výhodou je koncentrace detergentu v promývacím roztoku v rozmezí od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.).
V případě, že barvivém je DAPI, je ve výhodném provedení použit vodný promývací roztok obsahující 10 až 200 mmol.l1 citrátového pufru o pH 4 až 5, 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného, a volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurát a rovněž volitelně 0,1 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
V případě, že barvivém je barvivo vybrané ze skupiny Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580, je ve výhodném provedení použit vodný promývací roztok obsahující 10 až 100 mmol.l1 kyseliny citrónové a/nebo 10 až 100 mmol.l1 kyseliny octové a 50 až 200 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu hořečnatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu draselného, a dále volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 20 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
Výhodně je popsaný způsob použit pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
Seznam použitých zkratek
Iris tris(hydroxymetyl)aminometan
PBS fosfátem pufrovaný íyziologický roztok
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahující buňky a použití tohoto způsobu pro stanovení počtu buněk.
Následující postup popisuje odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahující buňky. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
-5 CZ 308385 B6
- Petriho misky, kultivační láhve, 12-, nebo 24-, nebo 48-, nebo 96-jamkové destičky, nebo kruhová skla o průměru 12 mm s přisedlými nebo sedimentovanými buňkami, které byly inkubovány s DAPI a/nebo barvivý Hoechst byly následně inkubovány v promývacím vodném roztoku alternativně po dobu 1 minuty, 5 minut, 30 minut nebo 40 minut nebo 2 hodin.
- Promývací vodný roztok obsahoval 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 citrátového pufru pH 3 nebo 4 nebo 5 nebo 5,5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného. Dále tento roztok obsahoval 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu draselného.
- Alternativně promývací roztok obsahoval 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 kyseliny citrónové a/nebo 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 kyseliny octové, dále tento promývací roztok obsahoval 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu hořečnatého a/nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu draselného.
- V některých experimentech promývací roztok rovněž obsahoval 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
- Použité koncentrace byly voleny tak, aby celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvojmocných iontů mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku byla alespoň 0,1 mol.l1.
- Inkubace v promývacím vodném roztoku probíhala alternativně po dobu 30 sekund, 1 minuty, 2 nebo 5 nebo 10 minut. V některých provedeních byl promývací vodný roztok odstraněn a nahrazen novým promývacím vodným roztokem. Tento krok byl v některých provedeních ještě jednou nebo dvakrát opakován. Doba inkubace v těchto dalších krocích byla vždy stejná jako v prvním kroku.
V jednotlivých krocích bylo aplikováno 0,2 - 0,8 ml promývacího vodného roztoku na 1 cm2 plochy v závislosti na typu nádoby.
V případě že byl tento způsob použit pro stanovení počtu buněk dle patentu CZ 307415, bylo postupováno podle postupu popsaného v patentu CZ3 07415 s tím, že pro promývání byly použity postupy a roztoky popsané výše v tomto příkladu.
Příklad 2
Sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky.
Následující příklad popisuje sadu pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky.
Sada obsahuje vodný roztok alternativně 0,02, 0,2 nebo 1 mol.l1 kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok 0,1 mmol.l1 citrátového pufru s pH 4 až 5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného, přičemž vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru rovněž obsahuje alternativně 0,1 nebo 0,5 nebo 2,5 nebo 8 mol.l1 chloridu vápenatého a/nebo chloridu hořečnatého a/nebo chloridu manganatého a/nebo chloridu sodného a/nebo chloridu draselného.
-6CZ 308385 B6
V některých provedeních rovněž roztok obsahuje alternativně 2, 50, 100 nebo 200 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého.
Průmyslová využitelnost:
Přístup je využitelný v laboratořích zabývajících se buněčnými kultivacemi a dalším zpracováním buněk pro mikroskopické účely nebo testováním toxicity různých látek na buněčných kulturách.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob odstranění barviva, vybraného ze skupiny 4',6-diamidin-2-fenylindol 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyll-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a W-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5'-bi-1// benzimidazol]-2'-yl]benzenamin, ze vzorků obsahujících buňky, který zcela nebo částečně uchovává vazbu těchto barviv na buněčnou DNA těchto buněk, vyznačující se tím, že se vzorky obsahující buňky po inkubaci s barvivý vybranými ze skupiny 4',6-diamidin-2-fenylindol, 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyll-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol a W-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5'-bi-l//benzimidazol]-2'-yl]benzenamin inkubují s promývacím vodným roztokem, obsahujícím alespoň jeden iont vybraný ze skupiny zahrnující dvojmocné ionty mědi, vápníku, manganu, hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku, draslíku, přičemž iontová síla tohoto promývacího vodného roztoku, vypočtená z koncentrací všech zdrojů těchto iontů v roztoku, je alespoň 0,1 mol.l1, a přičemž pH roztoku je nižší než 5,5.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že promývací vodný roztok dále obsahuje kyselinu citrónovou a/nebo kyselinu octovou a/nebo kyselinu chlorovodíkovou.
- 3. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že barvivém je 4',6-diamidin2-fenylindol a pH promývacího vodného roztoku je v rozmezí od 4 do 5.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že barvivém je 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo AA'-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)[2,5 '-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin a pH promývacího vodného roztoku je nižší než 3, s výhodou je pH nižší než 2.
- 5. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že promývací vodný roztok dále obsahuje alespoň jeden detergent, s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitan monolaurát, polyoxyetylensorbitan monooleát, 4-(1,1,3,3tetrametylbutyl)-fenyl-polyetylen glykol, saponiny, 4-nonylfenyl-polyetylen glykol, s výhodou je koncentrace detergentu v promývacím roztoku v rozmezí od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.).
- 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3 a 5, vyznačující se tím, že barvivém je 4',6diamidin-2-fenylindol a promývací vodný roztok obsahuje 10 až 200 mmol.l1 citrátového pufru o pH 4 až 5, 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného, a volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.-7CZ 308385 B6
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 a 4 až 5, vyznačující se tím, že barvivém je 2'(4-hydroxyfenyI)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol a/nebo 2'-(4-etoxyfenyl)-5(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo /V,/V-dimetyl-4-[5-(4-metyl-lpiperazinyl)-[2,5'-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin a promývací vodný roztok obsahuje 10 5 až 100 mmol.l1 kyseliny citrónové a/nebo 10 až 100 mmol.l1 kyseliny octové a 50 až 200 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu horečnatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu draselného, a dále volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 20 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 ίο chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
- 8. Použití způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-610A CZ308385B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-610A CZ308385B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2018610A3 CZ2018610A3 (cs) | 2020-07-15 |
| CZ308385B6 true CZ308385B6 (cs) | 2020-07-15 |
Family
ID=71524842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-610A CZ308385B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308385B6 (cs) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770363A (en) * | 1991-10-24 | 1998-06-23 | Brown; David B. | Methods for diagnosing human male infertility |
| WO1998039447A1 (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-11 | Diagnostic Products Corporation | Prostate cancer-specific marker |
| WO2011098085A1 (en) * | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Chemometec A/S | Method for analysis of cellular dna content |
| EP3395956A1 (en) * | 2017-04-27 | 2018-10-31 | Univerzita Palackého v Olomouci | Method and kit for determining the amount of dna in samples, and use thereof |
-
2018
- 2018-11-07 CZ CZ2018-610A patent/CZ308385B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770363A (en) * | 1991-10-24 | 1998-06-23 | Brown; David B. | Methods for diagnosing human male infertility |
| WO1998039447A1 (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-11 | Diagnostic Products Corporation | Prostate cancer-specific marker |
| WO2011098085A1 (en) * | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Chemometec A/S | Method for analysis of cellular dna content |
| EP3395956A1 (en) * | 2017-04-27 | 2018-10-31 | Univerzita Palackého v Olomouci | Method and kit for determining the amount of dna in samples, and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2018610A3 (cs) | 2020-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9671321B2 (en) | Methods and compositions for exosome isolation | |
| JP6605627B2 (ja) | 免疫分析用の免疫抑制剤薬物の抽出試薬 | |
| Conchinha et al. | Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: brain, choroid, lung, and muscle | |
| Olivier et al. | PSC-RED and MNC-RED: albumin-free and low-transferrin robust erythroid differentiation protocols to produce human enucleated red blood cells | |
| JP6545198B2 (ja) | 周囲温度での血液サンプル中の代謝的に活性な細胞の安定化 | |
| US20190078153A1 (en) | Method of analyzing genetically abnormal cells | |
| EP3104177B1 (en) | Method for labeling intracellular and extracellular targets of leukocytes | |
| EP2022858A1 (en) | Two-Step Gram Staining Method | |
| Nijssen et al. | Axon-seq for in depth analysis of the RNA content of neuronal processes | |
| CZ308385B6 (cs) | Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití | |
| CN114958766A (zh) | 一种衰老细胞模型的构建方法 | |
| JP2016529908A5 (cs) | ||
| US20070054258A1 (en) | Method of removing mucus and cell treatment solution and preservative solution used therefor | |
| Zattara et al. | Quantifying cell proliferation during regeneration of aquatic worms | |
| Vatan et al. | Volumetric super-resolution imaging by serial ultrasectioning and stochastic optical reconstruction microscopy in mouse neural tissue | |
| Ando et al. | 3D imaging in the postmortem human brain with CLARITY and CUBIC | |
| Zhu | Cell proliferation assay by flow cytometry (BrdU and PI staining) | |
| Cattoglio et al. | Assessing self-interaction of mammalian nuclear proteins by Co-immunoprecipitation | |
| CN115044639A (zh) | 一种抗衰老药物的筛选方法 | |
| CN111100839B (zh) | EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、制备方法及试剂盒 | |
| WO2018177583A1 (en) | Device and method for producing and purifying exosomes | |
| Kristofich et al. | Rapid and Efficient Isolation of Total RNA-Bound Proteomes by Liquid Emulsion–Assisted Purification of RNA-Bound Protein (LEAP-RBP) | |
| CN112986575A (zh) | 一种串联式验证dna编码苗头化合物修饰抗体的方法 | |
| CZ2018609A3 (cs) | Způsob stabilizace buněk, sada pro stabilizaci buněk a jejich použití | |
| Lopes et al. | In situ Hybridization of miRNAs in Human Embryonic Kidney and Human Pluripotent Stem Cell-derived Kidney Organoids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20211107 |