CZ2018610A3 - Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití - Google Patents

Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2018610A3
CZ2018610A3 CZ2018-610A CZ2018610A CZ2018610A3 CZ 2018610 A3 CZ2018610 A3 CZ 2018610A3 CZ 2018610 A CZ2018610 A CZ 2018610A CZ 2018610 A3 CZ2018610 A3 CZ 2018610A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
piperazinyl
mmol
methyl
benzimidazole
aqueous solution
Prior art date
Application number
CZ2018-610A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308385B6 (cs
Inventor
Karel KOBERNA
Anna Ligasová
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2018-610A priority Critical patent/CZ2018610A3/cs
Publication of CZ308385B6 publication Critical patent/CZ308385B6/cs
Publication of CZ2018610A3 publication Critical patent/CZ2018610A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/119—Reactions demanding special reaction conditions pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Předkládaný vynález popisuje selektivního způsob odstranění 4',6-diamidin-2-fenylindolu (DAPI) a/nebo 2´-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5´-bi-1-benzimidazolu (Hoechst 33258) a/nebo 2´-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5´-bi-1-benzimidazolu (Hoechst 33342) a/nebo-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5´-bi-1-benzimidazol]-2´-yl]benzenaminu (Hoechst 34580) ze vzorků obsahujících buňky, přičemž tento způsob dovoluje zcela nebo částečně uchovat vazbu těchto látek k buněčné DNA v těchto vzorcích. Popsaný přístup je založen na inkubaci vzorků obsahujících buňky s promývacím vodným roztokem, jehož pH je nižší než 5,5, přičemž tento roztok současně obsahuje dvojmocné ionty mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku a/nebo draslíku, přičemž iontová síla tohoto roztoku vypočtená z koncentrací zdrojů vyjmenovaných iontů je alespoň 0,1 mol.l. Tento způsob zcela uchovává vazbu všech vyjmenovaných barviv Hoechst k buněčné DNA. V případě DAPI dochází k částečnému uchování vazby DAPI k DNA.

Description

Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu selektivního odstranění barviv, které se váží k DNA, z různých vzorků obsahujících buňky s minimálním vlivem na jejich vazbu k DNA a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
Pro barvení DNA se používá celá řada látek. Mezi ně se řadí i barviva jako je DAPI (4',6diamidin-2-fenylindol; Biotech. Histochem., 70, 220-233, Schéma 1) nebo barviva Hoechst: Hoechst 33258 (2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol), Hoechst 33342 (2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol), Hoechst 34580 (N,N-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5'-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin; dále jen barviva Hoechst; In Vitro Cell Dev. Biol., 24, 247-252; J. Immunol. Methods, 162, 4145; J. Histochem. Cytochem., 23, 493-505; J. Histochem. Cytochem., 24, 24-33; Schéma 1). Je známo (např. CZ307415), že se jedná o látky, které se poměrně silně váží i ke kultivačním povrchům a/nebo povrchům nádob a/nebo povrchům různých podložek, které se používají při kultivaci buněk a/nebo při zpracování vzorků obsahujících buňky a rovněž na další buněčné složky, např. proteiny, lipidy či RNA. V některých přístupech, např. při stanovení počtu buněk (CZ307415). pak takto vázané molekuly DAPI a barviv Hoechst vedou ke snížené senzitivitě použitých přístupů. Proto je nutné tyto interakce selektivně eliminovat. Dosavadní přístupy spoléhají na poměrně zdlouhavou cestu promývání v běžných pufrech doplněných o některé detergenty.
Hoechst 33342
Hoechst 34580
Schéma 1
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob odstranění barviva, vybraného ze skupiny 4',6-diamidin-2fenylindol (DAPI) 2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol (Hoechst 33258), 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol (Hoechst
- 1 CZ 2018 - 610 A3
33342) a A'A'-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5 -bi-IH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin (Hoechst 34580) (Schéma 1), ze vzorků obsahujících buňky, který zcela nebo částečně uchovává vazbu těchto barviv na buněčnou DNA těchto buněk.
Vzorky obsahující buňky mohou být např. samostatné kousky tkání, kousky tkání v různých nádobách, kousky tkání na podložkách, buňky, buňky v různých nádobách, buňky přisedlé na podložkách, nebo preparáty získané sedimentací buněk pomocí gravitační nebo centrifugační síly na různé podložky. Podložkami mohou být např. podložní nebo krycí skla, nebo další různé destičky nebo různé nádoby ze skla nebo termoplastů např. polystyrenu, polyamidu, polypropylenu nebo polyetylénu nebo polymetyhnetakrylátu, které jsou použity pro pěstování nebo záchyt buněk. Nádobami se rozumí jakékoli nádoby použité pro kultivace a/nebo zpracování vzorků. Příkladem jsou zkumavky nebo kultivační láhve nebo misky, např. Petriho misky, nebo kultivační destičky. Mohou být např. ze skla nebo termoplastů např. polystyrenu, polypropylenu, polyetylénu, polyamidu nebo polymetylmetakrylátu.
Při aplikaci popsaného přístupu dochází k odstranění barviv Hoechst nebo DAPI z různých materiálů. Materiálem mohou být např. nádoby a/nebo podložky, které se používají při kultivaci buněk a/nebo při zpracování vzorků obsahujících buňky a/nebo buněčné složky, přičemž buněčnými složkami mohou být proteiny a/nebo RNA a/nebo lipidy. Naopak popsaný přístup zcela nebo částečně uchovává vazbu barviv Hoechst nebo DAPI k buněčné DNA.
Popsaný přístup je založen na inkubaci vzorků obsahujících buňky, které byly před aplikací popsaného přístupu inkubovány s barvivý Hoechst nebo DAPI, s promývacím vodným roztokem, jehož pH je nižší než 5,5, přičemž tento roztok současně obsahuje dvojmocné ionty mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku a/nebo draslíku, přičemž iontová síla tohoto roztoku vypočtená z koncentrací všech zdrojů uvedených iontů je alespoň 0,1 mol.l1. Tento způsob zcela uchovává vazbu všech vyjmenovaných barviv Hoechst k buněčné DNA. Doba nutná pro odstranění více než 95 % barviv Hoechst nenavázaného na DNA je zpravidla kratší než 10 minut. V případě DAPI dochází k částečnému uchování vazby DAPI k DNA. Doba vymytí pro více než 95 % barviva DAPI nenavázaného na DNA je zpravidla kratší než 5 minut. Při této době dochází jen asi k 2 % odstranění barviva DAPI z DNA.
V případě barviv Hoechst je zvláště výhodné použít roztoky s pH nižším než 3, ještě výhodněji s pH nižším než 2. Takto nízká pH společně s přítomností výše uvedených iontů zajišťují odstranění více než 95 % původně vázaných molekul barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky již v průběhu 1-3 minut, aniž jsou tato barviva odstraněna z DNA těchto vzorků. Podle provedených experimentů tato pH nevedou k odstranění barviv Hoechst z DNA těchto vzorků ani po několika hodinách inkubace v promývacích vodných roztocích. To umožňuje na jednu stranu významně zrychlit a zefektivnit proces odstranění barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky a na druhou stranu poskytuje dostatek času pro provedení celého procesu bez nutnosti přesně kontrolovat čas inkubace v promývacím roztoku.
V případě DAPI je výhodné použít pH promývacího roztoku v rozmezí hodnot 4 až 5. Ačkoli je možné i v případě DAPI použít nižší pH než 4, takto nízká pH společně s přítomností výše uvedených iontů již vedou k poměrně rychlému vymývání DAPI nejen ze vzorků obsahujících buňky ale i z DNA těchto vzorků. To vede k podstatnému zkrácení doby, po kterou je možné promývat vzorky obsahující buňky bez výrazného poklesu vazby DAPI na DNA těchto vzorků. Proto jev případě DAPI výhodné omezit čas vymývání v závislosti na použitém pH vymývacího roztoku. Při pH 4 až 5 a přítomnosti výše uvedených iontů je ze vzorků obsahujících buňky odstraněno více než 95 % molekul DAPI nenavázaných na DNA v průběhu 2-3 minut. Tento čas je možné prodloužit, ovšem časy vyšší než 30 minut již vedou i k významnému snížení vazby DAPI na DNA těchto vzorků. V případě použití promývacího roztoku s pH 3-4 dochází k významnému poklesu vazby DAPI na DNA těchto vzorků již po 5 minutách promývání a v případě pH 2 až 3 již po 1 minutě.
-2CZ 2018 - 610 A3
Pro maximální účinnost promytí, a to jak v případě barviv Hoechst, tak DAPI, je výhodné provést jednu nebo několik výměn promývacího vodného roztoku nebo omývat vzorky obsahujících buňky proudem promývacího vodního roztoku.
Zdroji použitých iontů jsou výhodně síran měďnatý a/nebo chlorid měďnatý a/nebo dusičnan měďnatý a/nebo chlorid vápenatý a/nebo chlorid manganatý a/nebo chlorid hořečnatý a/nebo chlorid sodný a/nebo chlorid draselný.
Kyselost promývacího roztoku je výhodně upravena přídavkem kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové a/nebo kyseliny chlorovodíkové.
Další mírné zvýšení efektivity odstraňování použitých barviv DNA ze vzorků obsahujících buňky je možné dosáhnout přídavkem detergentů. Zvláště výhodným příkladem detergentu je polyoxyetylensorbitan monolaurát (Tween 20; Schéma 2), výhodně v koncentraci od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.). Dalšími výhodnými příklady detergentů je polyoxyetylensorbitan monooleát (Tween 80; Schéma 2) nebo 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenyl-polyetylen glycol (Triton X-100; Schéma 2) nebo saponiny (skupina amfipatických glykosidů) nebo 4-nonylfenylpolyetylen glycol (Nonidet P 40; Schéma 2), výhodně v koncentraci od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.). Použité roztoky mohou rovněž obsahovat etanol a/nebo metanol bez signifikantního vlivu na rychlost odstranění barviv DNA.
’Ifůou
P-4Q
Schéma 2
Zvláště výhodným provedením je v případě barviv Hoechst promývání v promývacím roztoku obsahujícím kyselinu citrónovou (10-100 mmol.l1) a/nebo kyselinu octovou (10-100 mmol.l1) v kombinaci s chloridem vápenatým (50-200 mmol.l1) a/nebo chloridem hořečnatým (50200 mmol.l1) a/nebo chloridem manganatým (50-200 mmol.l1) a/nebo chloridem sodným (0,14 mol.l1) a/nebo chloridem draselným (0,1-4 mol.l1), výhodně s 0,05-2% (obj./obj.) Tweenem 20 a výhodněji rovněž se síranem měďnatým (0,1-50 mmol.l1) a/nebo chloridem měďnatým (0,1
-3 CZ 2018 - 610 A3 mmol.I1) a/nebo dusičnanem měďnatým (0,1-50 mmol.l1), přičemž celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvoj mocných iontů mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku je alespoň 0,1 mol.l1. Výhodná celková doba promytí je 1 minuta až 1 hodina. Výhodné je rovněž provést alespoň jednu výměnu promývacího roztoku v průběhu inkubace.
Příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, lOOmmol.l1 chloridu vápenatého, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Jiným příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 100 mmol.l1 síranu měďnatého.
Dalším příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 50 mmol.l1 chloridu vápenatého, 150 mmol.l1 chloridu sodného, 0,2% (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Dalším příkladem výhodného provedení promývacího roztoku pro barviva Hoechst je vodný roztok obsahující 20 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové, 500 mmol.l1 chloridu sodného, 0,2 % (obj./obj.) Tweenu 20 a 2 mmol.l1 síranu měďnatého.
Zvláště výhodným provedením je v případě DAPI promývání v promývacím vodném roztoku obsahujícím 10-200 mmol.l1 citrátového pufru s pH 4 až 5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného, 0,1-4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného výhodně s 0,05-2% (obj./obj.) Tweenu 20 a výhodněji rovněž se síranem měďnatým (0,150 mmol.l1) a/nebo chloridem měďnatým (0,1-50 mmol.l1) a/nebo dusičnanem měďnatým (0,150 mmol.l1), přičemž celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvojmocných iontů mědi a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku je alespoň 0,1 mol.l1. Výhodná celková doba promytí jel minuta až 30 minut. Výhodné je rovněž provést alespoň jednu výměnu promývacího roztoku v průběhu inkubace.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky obsahující vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru s pH 4-5 obsahující kyselinu citrónovou a citrát trisodný, přičemž vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru rovněž obsahuje chlorid vápenatý a/nebo chlorid hořečnatý a/nebo chlorid manganatý a/nebo chlorid sodný a/nebo chlorid draselný a volitelně síran měďnatý a/nebo chlorid měďnatý a/nebo dusičnan měďnatý.
Podle provedených experimentů představuje popsaný způsob a sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky velice rychlé promytí nespecificky vázané DAPI nebo barviv Hoechst a jsou výhodně využitelné při stanovení počtu buněk za pomoci barviv Hoechst a DAPI dle patentu CZ 307415. Zvláště výhodná je aplikace popsaného způsobu těsně po aplikaci DAPI a/nebo barviv Hoechst. Podle našich výsledků dochází k urychlení promývání v řádu desítek minut a rovněž ke zvýšení přesnosti a citlivosti metody. Zatímco bez uplatnění popsaného způsobu a/nebo sady je citlivost metody v závislosti na provedení zpravidla okolo 200-400 buněk na jamku 96-jamkové destičky, při použití výše popsaného způsobu a barviv Hoechst je citlivost cca 20-50 buněk. Současně díky vyšší přesnosti je možné provádět nižší počet opakování, aniž by došlo k negativnímu ovlivnění výsledků měření. Současně tento způsob ani sada nemá vliv na linearitu měření.
V popsaném způsobu se vzorky obsahující buňky po inkubaci s barvivý vybranými ze skupiny DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580 inkubují s promývacím vodným
-4CZ 2018 - 610 A3 roztokem, obsahujícím alespoň jeden iont vybraný ze skupiny zahrnující dvojmocné ionty mědi, vápníku, manganu, hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku, draslíku, přičemž iontová síla tohoto promývacího vodného roztoku, vypočtená z koncentrací všech zdrojů těchto iontů v roztoku, je alespoň 0,1 mol.l1, a přičemž pH roztoku je nižší než 5,5.
Promývací vodný roztok výhodně rovněž obsahuje kyselinu citrónovou a/nebo kyselinu octovou a/nebo kyselinu chlorovodíkovou.
Ve výhodném provedení je v případě, že barvivém je DAPI, pH promývacího vodného roztoku v rozmezí od 4 do 5.
V některých výhodných provedeních je v případě, že barvivém je barvivo vybrané ze skupiny Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580, pH promývacího vodného roztoku nižší než 3, s výhodou je pH nižší než 2.
V některých výhodných provedeních promývací vodný roztok rovněž obsahuje alespoň jeden detergent, s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitan monolaurát, polyoxyetylensorbitan monooleát, 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenyl-polyetylen glykol, saponiny, 4-nonylfenyl-polyetylén glykol, s výhodou je koncentrace detergentu v promývacím roztoku v rozmezí od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.).
V případě, že barvivém je DAPI, je ve výhodném provedení použit vodný promývací roztok obsahující 10 až 200 mmol.l1 citrátového pufru o pH 4 až 5, 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného, a volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurát a rovněž volitelně 0,1 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
V případě, že barvivém je barvivo vybrané ze skupiny Hoechst 33258, Hoechst 33342 a Hoechst 34580, je ve výhodném provedení použit vodný promývací roztok obsahující 10 až 100 mmol.l1 kyseliny citrónové a/nebo 10 až 100 mmol.l1 kyseliny octové a 50 až 200 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu hořečnatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 až 4 mol.l1 chloridu draselného, a dále volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 20 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
Výhodně je popsaný způsob použit pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
Seznam použitých zkratek
Iris tris(hydroxymetyl)aminometan
PBS fosfátem pufrovaný íyziologický roztok
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahující buňky a použití tohoto způsobu pro stanovení počtu buněk.
Následující postup popisuje odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahující buňky. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
-5 CZ 2018 - 610 A3
- Petriho misky, kultivační láhve, 12-, nebo 24-, nebo 48-, nebo 96-jamkové destičky, nebo kruhová skla o průměru 12 mm s přisedlými nebo sedimentovanými buňkami, které byly inkubovány s DAPI a/nebo barvivý Hoechst byly následně inkubovány v promývacím vodném roztoku alternativně po dobu 1 minuty, 5 minut, 30 minut nebo 40 minut nebo 2 hodin.
- Promývací vodný roztok obsahoval 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 citrátového pufru pH 3 nebo 4 nebo 5 nebo 5,5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného. Dále tento roztok obsahoval 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu draselného.
- Alternativně promývací roztok obsahoval 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 kyseliny citrónové a/nebo 10 nebo 20 nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 kyseliny octové, dále tento promývací roztok obsahoval 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu hořečnatého a/nebo 50 nebo 100 nebo 150 nebo 200 nebo 250 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 2 nebo 4 mol.l1 chloridu draselného.
- V některých experimentech promývací roztok rovněž obsahoval 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 nebo 0,5 nebo 1 nebo 5 nebo 10 nebo 15 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
- Použité koncentrace byly voleny tak, aby celková iontová síla vypočtená ze zdrojů dvojmocných iontů mědi a/nebo vápníku a/nebo manganu a/nebo hořčíku a/nebo jednomocných iontů sodíku a/nebo draslíku byla alespoň 0,1 mol.l1.
- Inkubace v promývacím vodném roztoku probíhala alternativně po dobu 30 sekund, 1 minuty, 2 nebo 5 nebo 10 minut. V některých provedeních byl promývací vodný roztok odstraněn a nahrazen novým promývacím vodným roztokem. Tento krok byl v některých provedeních ještě jednou nebo dvakrát opakován. Doba inkubace v těchto dalších krocích byla vždy stejná jako v prvním kroku.
V jednotlivých krocích bylo aplikováno 0,2 - 0,8 ml promývacího vodného roztoku na 1 cm2 plochy v závislosti na typu nádoby.
V případě že byl tento způsob použit pro stanovení počtu buněk dle patentu CZ 307415, bylo postupováno podle postupu popsaného v patentu CZ3 07415 s tím, že pro promývání byly použity postupy a roztoky popsané výše v tomto příkladu.
Příklad 2
Sada pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky.
Následující příklad popisuje sadu pro odstranění DAPI a/nebo barviv Hoechst ze vzorků obsahujících buňky.
Sada obsahuje vodný roztok alternativně 0,02, 0,2 nebo 1 mol.l1 kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok 0,1 mmol.l1 citrátového pufru s pH 4 až 5 připraveného z kyseliny citrónové a citrátu trisodného, přičemž vodný roztok kyseliny citrónové a/nebo kyseliny octové nebo vodný roztok citrátového pufru rovněž obsahuje alternativně 0,1 nebo 0,5 nebo 2,5 nebo 8 mol.l1 chloridu vápenatého a/nebo chloridu hořečnatého a/nebo chloridu manganatého a/nebo chloridu sodného a/nebo chloridu draselného.
-6CZ 2018 - 610 A3
V některých provedeních rovněž roztok obsahuje alternativně 2, 50, 100 nebo 200 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého.
Průmyslová využitelnost:
Přístup je využitelný v laboratořích zabývajících se buněčnými kultivacemi a dalším zpracováním buněk pro mikroskopické účely nebo testováním toxicity různých látek na buněčných kulturách.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob odstranění barviva, vybraného ze skupiny 4',6-diamidin-2-fenylindol 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyll-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a W-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5'-bi-1// benzimidazol]-2'-yl]benzenamin, ze vzorků obsahujících buňky, který zcela nebo částečně uchovává vazbu těchto barviv na buněčnou DNA těchto buněk, vyznačující se tím, že se vzorky obsahující buňky po inkubaci s barvivý vybranými ze skupiny 4',6-diamidin-2-fenylindol, 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyll-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol a W-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l-pipcrazinyl)|2.5'-bi-l//benzimidazol]-2'-yl]benzenamin inkubují s promývacím vodným roztokem, obsahujícím alespoň jeden iont vybraný ze skupiny zahrnující dvojmocné ionty mědi, vápníku, manganu, hořčíku a/nebo jednomocné ionty sodíku, draslíku, přičemž iontová síla tohoto promývacího vodného roztoku, vypočtená z koncentrací všech zdrojů těchto iontů v roztoku, je alespoň 0,1 mol.l1, a přičemž pH roztoku je nižší než 5,5.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že promývací vodný roztok dále obsahuje kyselinu citrónovou a/nebo kyselinu octovou a/nebo kyselinu chlorovodíkovou.
  3. 3. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že barvivém je 4',6-diamidin2-fenylindol a pH promývacího vodného roztoku je v rozmezí od 4 do 5.
  4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že barvivém je 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo /V,/V-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)|2.5'-bi-l//-bcnzimidazol |-2'-yl Ibcnzcnamin a pH promývacího vodného roztoku je nižší než 3, s výhodou je pH nižší než 2.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že promývací vodný roztok dále obsahuje alespoň jeden detergent, s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitan monolaurát, polyoxyetylensorbitan monooleát, 4-(1,1,3,3tetrametylbutyl)-fenyl-polyetylen glykol, saponiny, 4-nonylfenyl-polyetylen glykol, s výhodou je koncentrace detergentu v promývacím roztoku v rozmezí od 0,01 % (obj./obj.) do 2 % (obj./obj.).
  6. 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3 a 5, vyznačující se tím, že barvivém je 4',6diamidin-2-fenylindol a promývací vodný roztok obsahuje 10 až 200 mmol.l1 citrátového pufru o pH 4 až 5, 0,1 až 4 mol.l1 chloridu sodného a/nebo 0,1-4 mol.l1 chloridu draselného, a volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 100 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
    -7CZ 2018 - 610 A3
  7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 a 4 až 5, vyznačující se tím, že barvivém je 2'(4-hydroxyfenyI)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol a/nebo 2'-(4-etoxyfenyl)-5(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a/nebo N,A'-dimctyl-4-|5-(4-mctyl-l- piperazinyl)-[2,5'-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin a promývací vodný roztok obsahuje 10 5 až 100 mmol.I1 kyseliny citrónové a/nebo 10 až 100 mmol.l1 kyseliny octové a 50 až 200 mmol.l1 chloridu vápenatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu horečnatého a/nebo 50 až 200 mmol.l1 chloridu manganatého a/nebo 0,1 až 4 mol.I1 chloridu sodného a/nebo 0,1 až 4mol.l-1 chloridu draselného, a dále volitelně 0,05 až 2 % (obj./obj.) polyoxyetylensorbitan monolaurátu a rovněž volitelně 0,1 až 20 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 ίο chloridu měďnatého a/nebo 0,1 až 20 mmol.l1 dusičnanu měďnatého.
  8. 8. Použití způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
CZ2018-610A 2018-11-07 2018-11-07 Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití CZ2018610A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-610A CZ2018610A3 (cs) 2018-11-07 2018-11-07 Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-610A CZ2018610A3 (cs) 2018-11-07 2018-11-07 Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ308385B6 CZ308385B6 (cs) 2020-07-15
CZ2018610A3 true CZ2018610A3 (cs) 2020-07-15

Family

ID=71524842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018-610A CZ2018610A3 (cs) 2018-11-07 2018-11-07 Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ2018610A3 (cs)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770363A (en) * 1991-10-24 1998-06-23 Brown; David B. Methods for diagnosing human male infertility
ATE438719T1 (de) * 1997-03-07 2009-08-15 Siemens Healthcare Diagnostics Spezifischer marker für prostatakrebs
US9102977B2 (en) * 2010-02-11 2015-08-11 Chemometec A/S Method for analysis of cellular DNA content
CZ307415B6 (cs) * 2017-04-27 2018-08-01 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Způsob stanovení množství DNA ve vzorcích a jeho využití pro stanovení množství buněk

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308385B6 (cs) 2020-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9671321B2 (en) Methods and compositions for exosome isolation
Shevtsov et al. Production of organ extracellular matrix using a freeze-thaw cycle employing extracellular cryoprotectants
Nguyen et al. A human kidney and liver organoid‐based multi‐organ‐on‐a‐chip model to study the therapeutic effects and biodistribution of mesenchymal stromal cell‐derived extracellular vesicles
Shaikh et al. Molecular and phenotypic characterization of CD133 and SSEA4 enriched very small embryonic-like stem cells in human cord blood
JP2018507422A (ja) 免疫分析用の免疫抑制剤薬物の抽出試薬
US20190078153A1 (en) Method of analyzing genetically abnormal cells
Irving et al. The serpinopathies: studying serpin polymerization in vivo
EP2607899B1 (en) Method for labeling intracellular and extracellular targets of leukocytes
CN114958766A (zh) 一种衰老细胞模型的构建方法
Golberg et al. Application of automated immunohistochemistry in anatomical research: A brief review of the method
Wagar Live cell barcoding for efficient analysis of small samples by mass cytometry
de Almeida et al. Histological preparation technique of blood derivative injectable platelet-rich fibrin (I-Prf) for microscopic analyzes
CZ2018610A3 (cs) Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití
Reale et al. Human plasma extracellular vesicle isolation and proteomic characterization for the optimization of liquid biopsy in multiple myeloma
Nijssen et al. Axon-seq for in Depth Analysis of the RNA Content of Neuronal Processes
Guillot et al. Multiplex immunostaining to spatially resolve the cellular landscape in human and mouse livers
US20070054258A1 (en) Method of removing mucus and cell treatment solution and preservative solution used therefor
CN115044639A (zh) 一种抗衰老药物的筛选方法
Zattara et al. Quantifying cell proliferation during regeneration of aquatic worms
Lo Sicco et al. A Method for Isolating and Characterizing Mesenchymal Stromal Cell‐derived Extracellular Vesicles
Shepherd et al. Decellularization of the human liver to generate native extracellular matrix for use in automated functional assays with stellate cells
CN112986575B (zh) 一种串联式验证dna编码苗头化合物修饰抗体的方法
CN111100839B (zh) EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、制备方法及试剂盒
Jabrane-Ferrat et al. Decidua basalis: An ex vivo model to study HIV-1 infection during pregnancy and beyond
US11639490B2 (en) Device and method for producing and purifying exosomes

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20211107