CZ2018609A3 - Způsob stabilizace buněk, sada pro stabilizaci buněk a jejich použití - Google Patents
Způsob stabilizace buněk, sada pro stabilizaci buněk a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2018609A3 CZ2018609A3 CZ2018-609A CZ2018609A CZ2018609A3 CZ 2018609 A3 CZ2018609 A3 CZ 2018609A3 CZ 2018609 A CZ2018609 A CZ 2018609A CZ 2018609 A3 CZ2018609 A3 CZ 2018609A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- sample
- ethanol
- methanol
- samples
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title abstract description 25
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 title abstract description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 183
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 124
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 45
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 21
- XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N copper(II) nitrate Chemical compound [Cu+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 21
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 19
- -1 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 76
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 46
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- VMCOQLKKSNQANE-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyl-4-[6-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-benzimidazol-2-yl]aniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 VMCOQLKKSNQANE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- GOVMSHRQBGJGSR-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(3h-benzimidazol-5-yl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-1,3-dihydrobenzimidazol-2-yl]phenol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(NC(N2)(C=3C=CC(O)=CC=3)C=3C=C4N=CNC4=CC=3)C2=C1 GOVMSHRQBGJGSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 18
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 abstract description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 abstract description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 abstract description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 abstract description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 abstract description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 abstract description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 abstract description 2
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 abstract 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 29
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 29
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007560 sedimentation technique Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DQLVZNPVMCFANR-UHFFFAOYSA-N 2-(3h-benzimidazol-5-yl)-2-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-1,3-dihydrobenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1(C=2C=C3N=CNC3=CC=2)NC2=CC(N3CCN(C)CC3)=CC=C2N1 DQLVZNPVMCFANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZLCFHIKESPLTH-UHFFFAOYSA-N 4-Methylbiphenyl Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZZLCFHIKESPLTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101100008639 Mus musculus Cd55 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100182528 Oryza sativa subsp. japonica LECRKS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101100059702 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CLN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100010189 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) dpb3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L copper(ii) acetate Chemical compound [Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G3/00—Compounds of copper
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení se týká způsobu stabilizace buněk pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti vzorků obsahujících buňky. Popsaný přístup stabilizace je založen na inkubaci jak neovlivněných buněk, tak buněk inkubovaných v etanolu a/nebo v metanolu, formaldehydem ovlivněných vzorků a usušených vzorků, s roztokem obsahujícím dvoj mocné ionty mědi, přičemž jejich zdrojem je výhodně síran měďnatý, chlorid měďnatý nebo dusičnan měďnatý. Vyvinutý přístup poskytuje vzorky s vysokou odolností vůči různým detergentům včetně polyoxyetylensorbitan monolaurátu, polyoxyetylensorbitan monooleátu, 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenyl-polyetylen glykolu, saponinům, 4-nonylfenyl-polyetylen glykolu, dodecylsíranu sodnému, dodecylsíranu litnému a [dodecanoyl(metyl)amino]acetátu sodnému a v případě vzorků, které jsou tvořeny buňkami na podložkách, významně snižuje nebo zcela zamezuje jejich odstranění z povrchů podložek použitými detergenty. Současně tento způsob umožňuje přípravu vysoce stabilních vzorků fixovaných formaldehydem pomocí sedimentace buněk z buněčných suspenzí.
Description
Způsob stabilizace buněk, sada pro stabilizaci buněk a jejich použití.
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká stabilizace buněk, sady pro stabilizaci buněk a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Pro zpevnění vzorků obsahujících buňky (fixaci) se používá celá řada protokolů. Fixace rovněž zastavuje nebo alespoň výrazně zpomaluje různé degradační procesy probíhající v buňkách. Kromě toho slouží k uchování buněčné morfologie. V případě, že se jedná o buňky uchycené na podložkách, slouží fixace i k pevnějšímu uchycení buněk na podložky a brání jejich odstranění v průběhu dalšího zpracování. Velice jednoduchou technikou, která našla uplatnění při celé řadě buněčných analýz, je fixace vzorků pomocí etanolu, metanolu nebo acetonu. Fixace pomocí těchto látek je založena na precipitaci a dehydrataci velkých proteinů (např. Vib. Spectrosc., 91, 31-45). Nevýhodou fixace pomocí těchto činidel je malá odolnost takto fixovaných vzorků vůči některým detergentům. Pro zvýšení odolnosti je možné použít např. přístup, který spoléhá na použití jednomocných iontů mědi (patent č. CZ307415). Nevýhodou tohoto způsobuje ovšem produkce radikálů (PLoS One, 7(12), e52584; Cytometry A, 83, 989-1000), což může vést k nežádoucím vlivům jako např. poškození buněčných složek. Jinou používanou technikou pro fixaci je prosté usušení buněk. Ačkoli je tato technologie často používána při přípravě preparátů buněk sedimentovaných z buněčných suspenzí, odolnost usušených vzorků vůči některým detergentům je rovněž nízká. Sedimentační techniky jsou přitom velice často používány i v klinické diagnostice. Pro sedimentaci se používá gravitační nebo centrifugační síla (např. Ned. T. Geneesk., 107, 445-446; Immunology, 9, 403-405) a buňky jsou díky těmto silám zachytávány na podložky, kterými jsou nejčastěji mikroskopická skla. Dalším poměrně často používaným fixačním činidlem je roztok formaldehydu, který reaguje s primárními aminy proteinů a nukleových kyselin a vytváří s nimi metylenové můstky (např. Am. J. Pathol., 161(6), 19611971; Vib. Spectrosc., 91, 31-45). Ačkoli použití formaldehydu je z hlediska odolnosti vůči detergentům obecně efektivnější než použití etanolu nebo usušení, v případě nutnosti použití nízkých koncentrací formaldehydu a/nebo krátkých časů fixace a/nebo sedimentačních technik je tento způsob fixace nedostatečný pro uchycení buněk, pokud není doprovázen usušením buněk nebo nejsou použita speciálně pokrytá skla.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob stabilizace buněk pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti buněk, v různých vzorcích. Předkládaná technologie významně stabilizuje jak neovlivněné buňky, tak buňky inkubované v etanolu a/nebo v metanolu, formaldehydem ovlivněné vzorky a usušené vzorky. Podle našich nálezů umožňuje popsaný přístup mimo jiné vysoce efektivně přichytit formaldehydem fixované buňky k různým podložkám za použití sedimentace.
Popsaný způsob stabilizace účinně zvyšuje odolnost buněk proti mechanickému namáhání a/nebo působení různých látek a efektivně zabraňuje jejich odpadnutí z podložek při mechanickém namáhání a/nebo působení různých látek. Příkladem mechanického namáhání je působení proudu kapaliny nebo působení centrifugační síly. Příkladem látek, u nichž je pozorováno zvýšení odolnosti buněk po použití popsaného způsobu jsou kyseliny, zásady a/nebo detergenty.
Vzorky mohou být kousky tkáně, buňky v roztoku nebo buňky na podložkách. Buňky mohou být na podložkách kultivovány nebo mohou být na podložky naneseny např. pomocí sedimentace prostřednictvím gravitačních nebo centrifugačních sil. Podložkami mohou být např. podložní
- 1 CZ 2018 - 609 A3 nebo krycí skla, nebo další materiály, které jsou použity pro pěstování nebo záchyt buněk např. pomocí sedimentace prostřednictvím gravitačních nebo centrifugačních sil. Jedná se např. o různé destičky ze skla nebo termoplastů např. polystyrenu, polyamidu nebo polymetylmetakrylátu, případně láhve nebo misky ze skla nebo termoplastů. Příkladem jsou kultivační láhve, Petriho misky nebo více-jamkové destičky.
Popsaný přístup stabilizace buněk je založen na inkubaci vzorků s dvojmocnými ionty mědi. Výhodně je tato inkubace provedena ve vodných nebo etanolových nebo metanolových roztocích, případně v různých kombinacích těchto roztoků. Příkladem je roztok dvoj mocných iontů mědi v roztoku obsahujícím vodu i etanol a/nebo metanol. Dále je roztok obsahující dvojmocné ionty mědi nazýván jako stabilizační roztok.
Zvláště výhodná je kombinace předkládaného způsobu stabilizace buněk pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti buněk s dalšími přístupy zvyšujícími mechanickou a chemickou odolnost. Příkladem dalších přístupů je ovlivnění vzorků po aplikaci nebo před aplikací stabilizačního roztoku etanolem a/nebo metanolem a/nebo formaldehydem a/nebo usušením. Ovlivnění vzorků etanolem a/nebo metanolem a/nebo formaldehydem je výhodně provedeno inkubací vzorků v roztocích obsahujících etanol a/nebo metanol a/nebo formaldehyd. Výhodně se jedná o vodné roztoky uvedených látek.
Zdrojem dvoj mocných iontů mědi je výhodně síran mědnatý, chlorid měďnatý nebo dusičnan měďnatý. Zdroje dvojmocných iontů mědi jsou přidány do stabilizačního roztoku, a to buď v nerozpuštěné podobě, nebo je možné nejprve připravit jejich zásobní koncentrované roztoky např. ve vodě a/nebo etanolu a/nebo metanolu a/nebo v různých směsích obsahujících vodu a/nebo etanol a/nebo metanol a ty potom použít pro přípravu stabilizačního roztoku. Výhodně jsou tyto zásobní roztoky připraveny ve vodě nebo vodných směsích. Je možné použít i jiné zdroje dvojmocné mědi, jako je např. octan měďnatý. Ten je však hůře rozpustný, a tudíž méně vhodný.
V případě kombinace přístupu stabilizace vzorků s ovlivněním vzorků etanolem a/nebo metanolem je výhodné použít takové koncentrace etanolu a/nebo metanolu, aby jejich koncentrace a/nebo součet jejich koncentrací byl roven nebo vyšší než 10 % (obj./obj.) a čas inkubace s etanolem a/nebo metanolem roven nebo vyšší než 5 sekund. Výhodně jsou použity vodné roztoky etanolu a/nebo metanolu.
V případě kombinace přístupu s ovlivněním vzorků formaldehydem je výhodně koncentrace formaldehydu rovna nebo vyšší než 0,1 % (hmotnost/obj.) a čas inkubace s formaldehydem roven nebo vyšší než 10 sekund. Výhodně se jedná o vodné roztoky formaldehydu.
Výhodně je koncentrace zdrojů dvojmocných iontů rovna nebo vyšší než 0,1 pmol.T1 a čas inkubace s dvojmocnými ionty mědi roven nebo vyšší než 1 sekunda.
Přístup je proveditelný v širokém rozmezí teplot. Úspěšně byly testovány teploty od -25 °C do 50 °C. Výhodně je přístup možné použít v oblasti běžných laboratorních teplot, to je od 18 °C to 30 °C.
Ačkoli z hlediska uchování buněčné struktury je výhodné pracovat s roztoky dvojmocné mědi, jejichž pH je blízko 7, přístup je proveditelný v širokém rozmezí pH. Úspěšně byla testována i pH pod hodnotou 2 nebo nad hodnotou 13.
Přístup je výhodně využitelný např. při všech procedurách, kde se vyžadují inkubace v kyselých nebo zásaditých roztocích a/nebo v roztocích obsahujících detergenty, což jsou kroky, které mohou vést k destrukci buněk. Přístup je rovněž výhodně použitelný v případech, kdy se používají centrifugace a/nebo dochází k proudění různých roztoků kolem vzorku. Příkladem procedury, kdy dochází k proudění, je např. výměna roztoků pomocí pipety. Popsaný způsob
-2CZ 2018 - 609 A3 stabilizace je zvláště výhodný v případě, že je vyžadována inkubace buněk s detergenty. Příkladem detergentů je např. polyoxyetylensorbitan monolaurát (Tween 20; Schéma 1), polyoxyetylensorbitan monooleát (Tween 80; Schéma 1), 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenylpolyetylen glykol (Triton X 100; Schéma 1), saponiny (skupina amfipatických glykosidů), 4nonylfenyl-polyetylen glykol (Nonidet P 40; Schéma 1), dodecylsíran sodný (NaCnFUSCX, rovněž označovaný jako sodiumdodecylsulfát, SDS), dodecylsíran litný (LÍC12H25SO4, litiumdodecylsulfát, LiDS) a [dodecanoyl(metyl)amino]acetát sodný (CAlLxNNaCl·. sodiumlaurylsarkosinát, sarkosyl).
Twn 20 v o
Tnw X-40O
Nůnídst P-40
Schéma 1
Oproti stabilizaci jednomocnými ionty mědi (CZ307415) je stabilizace za pomocí dvojmocných iontů mimo jiné výhodná díky možnosti současného značení DNA pomocí skupiny barviv DNA sestávající z 4',6-diamidin-2-fenylindolu (DAPI, Schéma 2; Biotech. Histochem., 70, 220-233), 2-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5-bi-lH-benzimidazolu (Hoechst 33258), 2'-(4etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazolu (Hoechst 33342) a ΛΆ'-dimctyl4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5 -bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenaminu (Hoechst 34580; Schéma 2; J. Histochem. Cytochem., 23, 493-505, J. Histochem. Cytochem., 24, 24-33, Cytometry, 44, 133- 136).
-3 CZ 2018 - 609 A3
DAF1 Hrnete 33258
Hósehst 33342 Hwtef 345B0
Schéma 2
Zatímco přítomnost jednomocných iontů mědi vede k výraznému snížení až k úplnému zabránění značení pomocí těchto barviv, dvojmocné ionty tento efekt nevykazují, naopak umožňují současnou aplikaci barviv DNA a tím zkrácení celého přístupu.
Předmětem vynálezu je rovněž sada pro stabilizaci buněk obsahující vodný roztok síranu mědnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého a volitelně vodný roztok etanolu a/nebo metanolu nebo sada pro stabilizaci buněk obsahující vodný roztok síranu mědnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého obsahující současně etanol a/nebo metanol. Výhodně je koncentrace síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého 0,02 až 1 mol.l1.
Přístup je výhodně využitelný v případě stanovení množství buněk pomocí technologie založené na vymytí barviv DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 dle patentu CZ307415, přičemž je lhostejné, zdaje přístup použit před aplikací barviv, současně s aplikací barviv nebo až po aplikaci barviv. Výhodně jsou zdroje dvojmocných iontů mědi přítomny v promývacích roztocích.
Výhodným provedením předkládaného vynálezu je inkubace vzorků obsahujících buňky s vodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut při teplotě 0 až 40 °C. Výhodně tento roztok obsahuje etanol a/nebo metanol. V případě, že tento roztok obsahuje etanol a/nebo metanol, je možné použít i teploty nižší než 0 °C.
Dalším výhodným provedením předkládaného vynálezu je inkubace vzorků obsahujících buňky po dobu 10 sekund až 1 hodiny v 50 až 90% (obj./obj.) roztoku etanolu a/nebo metanolu ve vodě při teplotě 0 až 40 °C a následná inkubace vzorku svodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut rovněž při teplotě 0 až 40 °C.
V jiném výhodném provedení inkubace s dvojmocnými ionty mědi předchází inkubaci s roztokem etanolu a/nebo metanolu.
Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu je inkubace vzorků obsahujících buňky po dobu 30 minut až několika měsíců v 50 až 90% (obj./obj.) roztoku etanolu a/nebo metanolu ve vodě při teplotě -25 až 0 °C a následná inkubace vzorků s vodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut při teplotě 0 až 40 °C.
Dalším výhodným příkladem provedení je inkubace vzorků obsahujících buňky po dobu 10
-4CZ 2018 - 609 A3 sekund až 1 hodiny v 50 až 90% (obj./obj.) roztoku etanolu a/nebo metanolu ve vodě při teplotě 25 až +40 °C, následné usušení vzorků a následná inkubace svodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut při teplotě 0 až 40 °C.
Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu je usušení vzorků obsahujících buňky a jejich následná inkubace s vodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut při teplotě 0 až 40 °C.
Dalším výhodným příkladem provedení předkládaného vynálezu je inkubace vzorků obsahujících buňky po dobu 10 sekund až 1 hodiny ve vodném roztoku obsahujícím 0,1 až 10% (hmotnost/obj.) formaldehyd při teplotě 0 až 40 °C a následná inkubace s vodným roztokem obsahujícím 0,01 až 100 mmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého po dobu 1 sekundy až 40 minut při teplotě 0 až 40 °C.
Výhodným příkladem provedení předkládaného vynálezu je inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi, která proběhne ve vodném roztoku, který vedle dvojmocných iontů mědi dále obsahuje alespoň jednu látku, vybranou ze skupiny zahrnující 4',6-diamidin-2-fenylindol, 2'-(4hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyll-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a N,N-dimetyl-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5-bi-lHbenzimidazol]-2'-yl]benzenamin, přičemž koncentrace těchto látek je v rozmezí od 0,1 pmol.l1 do 0,1 mol.l1.
Popsaný způsob stabilizace buněk ve vzorku pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti buněk, se obecně vyznačuje tím, že se vzorek obsahující buňky inkubuje s dvojmocnými ionty mědi.
Ve výhodných případech se dvojmocné ionty mědi připraví rozpuštěním síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého ve vodě a/nebo metanolu a/nebo etanolu nebo ve směsích obsahujících vodu a/nebo etanol a/nebo metanol, na koncentraci dvojmocných iontů mědi rovnou nebo vyšší než 0,1 pmol.l1.
Výhodně je doba inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi rovna nebo vyšší než 1 sekunda.
Výhodně se inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi provede při teplotě v rozmezí od -25 °C do 50 °C.
Rovněž výhodně se inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi provede před inkubací nebo po inkubaci vzorku s etanolem a/nebo metanolem nebo formaldehydem nebo před nebo po usušení vzorku.
Ve výhodném provedení se inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi provede před inkubací nebo po inkubaci vzorku s vodným roztokem etanolu a/nebo metanolu nebo formaldehydu, přičemž celková koncentrace etanolu a/nebo metanolu je rovna nebo vyšší než 10 % (obj./obj.) a doba inkubace v tomto roztoku je rovna nebo vyšší než 5 sekund a koncentrace formaldehydu ve vodném roztoku je rovna nebo vyšší než 0,1 % (hmotnost/obj.) a doba inkubace v tomto roztoku je rovnaného vyšší než 10 sekund.
V některých výhodných provedeních se mezi inkubací vzorku s etanolem a/nebo metanolem a inkubací vzorku s dvojmocnými ionty mědi vzorek obsahující buňky usuší.
V dalších výhodných provedeních krok inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi proběhne ve vodném roztoku, který vedle dvojmocných iontů mědi dále obsahuje alespoň jednu látku, vybranou ze skupiny zahrnující 4',6-diamidin-2-fenylindol, 2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l
-5 CZ 2018 - 609 A3 piperazinyl)-2,5' -bi- IH-benzimidazol, 2' -(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-1 -piperazinyl)-2,5' -bi- 1Hbenzimidazol a N,N-dimetyI-4-[5-(4-metyl-l-piperazinyl)[2,5 '-bi-lH-benzimidazol]-2'yl]benzenamin. Výhodně je koncentrace látky, vybrané ze skupiny zahrnující 4',6-diamidin-2fenylindol, 2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol, 2 -(4etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5 -bi-lH-benzimidazol a N,N-dimetyl-4-[5-(4-metyl-lpiperazinyl)[2,5'-bi-lH-benzimidazol]-2'-yl]benzenamin, v rozmezí od 0,1 pmol.l1 do 0,1 mol.I1.
Rovněž výhodně je popsaný způsob stabilizace buněk ve vzorku pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti buněk použit pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
Seznam použitých zkratek
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Stabilizace buněk v tkáních pomocí dvoj mocných iontů mědi.
Následující postup popisuje stabilizaci buněk ve tkáních pomocí dvojmocných iontů mědi. Neníli uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Vzorky tkáně byly promyty v 10 ml Ix PBS (složení viz část Použité roztoky a chemikálie) a následně byly přeneseny do zkumavky o objemu 2 ml, ve které bylo 1,5 ml Ix PBS.
B) Ix PBS bylo odsáto a vzorky byly inkubovány v 1,5 ml alternativně 10% nebo 50% nebo 70% nebo 90% vodném roztoku (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo ve 100% etanolu a/nebo metanolu. Pokud byl použit roztok obsahující současně etanol a metanol, jednalo se o součet jejich koncentrací. Doba inkubace byla alternativně 1 minuta, 10 minut nebo jedna hodina.
V případě použití 50% nebo 70% nebo 90% vodného roztoku (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo 100% etanolu a/nebo metanolu byla doba inkubace alternativně i několik měsíců. Inkubace probíhala alternativně i při -25 °C nebo -20 °C nebo 0 °C nebo 25 °C nebo 40 °C nebo 50 °C. V některých provedeních byly vzorky inkubovány v roztoku 0,1% nebo 2% nebo 8% formaldehydu (hmotnost/obj., přidáno bylo 1,5 ml roztoku) v Ix PBS alternativně po dobu 10 sekund nebo 1 minuty, 10 minut nebo 30 minut.
V některých provedeních byl krok B) vynechán a následoval krok C).
C) Fixační roztok nebo Ix PBS byly odsáty a vzorky byly inkubovány v roztoku 10 pmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého (alternativně byly použity koncentrace 0,1 nebo 0,2 pmol.l1 nebo 0,1 nebo 1 nebo 50 nebo 100 mmol.l1, přidáno bylo 1,5 ml roztoku) ve vodě nebo ve vodném roztoku 20 mmol.l1 citrátového pufru, pH 5 nebo 6, nebo 20 mmol.l1 Tris, pH 7, nebo 10 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové nebo kyseliny chlorovodíkové nebo 10 mmol.l1 hydroxidu sodného nebo ve 100% etanolu a/nebo metanolu nebo v 10% nebo 50% nebo 70% nebo 90% (obj./obj.) roztoku etanolu a/nebo metanolu ve vodě. Pokud byl použit roztok metanolu a současně etanolu, jednalo se o součet jejich koncentrací.
V některých provedeních obsahoval roztok s dvojmocnými ionty mědi DAPI nebo Hoechst 33342 nebo Hoechst 33258 nebo Hoechst 34580 (v koncentracích 0,5 až 20 pmol.l1). Inkubace
-6CZ 2018 - 609 A3 probíhala alternativně po dobu 10 sekund nebo 10 minut nebo 20 minut nebo jedné hodiny.
V některých provedeních byly vzorky v průběhu inkubace třepány na třepačce.
D) Roztok byl odstraněn a byl nahrazen 1,5 ml lx PBS.
E) Roztok Ix PBS byl odstraněn a nahrazen 1,5 ml nového roztoku Ix PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován.
Příklad 2
Stabilizace přisedlých buněk nebo buněk sedimentovaných na podložkách pomocí dvojmocných iontů mědi a použití způsobu stabilizace buněk pro stanovení počtu buněk.
Následující postup popisuje stabilizaci přisedlých buněk nebo buněk sedimentovaných na podložkách pomocí dvojmocných iontů mědi a použití způsobu stabilizace pro stanovení počtu buněk. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Vzorky s buňkami pěstovanými v Petriho miskách, nebo kultivačních lahvích, nebo 12-, nebo 24-, nebo 48-, nebo 96-jamkových destičkách, nebo na kruhových sklech o průměru 12 mm nebo vzorky s buňkami sedimentovanými na mikroskopických kruhových sklech o průměru 12 mm byly promyty v Ix PBS (přidány byly přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby).
B) Ix PBS bylo odstraněno a vzorky byly inkubovány alternativně v 10% nebo 50% nebo 70% nebo 90% vodném roztoku (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo ve 100% etanolu a/nebo metanolu (přidány byly přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby). Pokud byl použit roztok metanolu a současně etanolu, jednalo se o součet jejich koncentrací. Doba inkubace byla alternativně 1 minuta, 10 minut nebo jedna hodina.
V případě použití 50% nebo 70% nebo 90% vodného roztoku (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo 100% etanolu a/nebo metanolu byla doba inkubace alternativně i několik měsíců. Inkubace probíhala alternativně i při -25 °C nebo -20 °C nebo 0 °C nebo 25 °C nebo 40 °C nebo 50 °C.
V některých provedeních byly vzorky inkubovány v roztoku 0,1% nebo 2% nebo 8% formaldehydu (hmotnost/obj.) v Ix PBS (přidány byly přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby) alternativně po dobu 10 sekund, 1 minuty, 10 minut nebo 30 minut.
V některých provedeních byly buňky inkubovány v roztoku 0,1% nebo 2% nebo 8% formaldehydu (hmotnost/obj.) v Ix PBS v průběhu sedimentace nebo ještě před sedimentací před krokem A).
V některých provedeních byl krok B) vynechán a následoval krok C).
V dalších provedeních byly vzorky po kroku B) nebo před krokem B) usušeny.
C) Fixační roztok nebo pufr byly odstraněny a vzorky byly inkubovány v roztoku 10 pmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého (alternativně byly použity koncentrace 0,1 nebo 0,2 pmol.l1 nebo 0,1 nebo 1 nebo 50 nebo 100 mmol.l1, přidány byly přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby) ve vodě nebo ve vodném roztoku 20 mmol.l1 citrátového pufiru, pH 5 nebo 6, nebo 20 mmol.l1 Tris, pH 7, nebo 10 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny
-7CZ 2018 - 609 A3 octové nebo kyseliny chlorovodíkové nebo 10 mmol.l1 hydroxidu sodného nebo ve 100% etanolu a/nebo metanolu nebo v 10% nebo 50% nebo 70% nebo 90% (obj./obj.) roztoku etanolu nebo metanolu ve vodě. Pokud byl použit roztok metanolu a současně etanolu, jednalo se o součet jejich koncentrací. V některých provedeních obsahoval roztok s dvojmocnými ionty mědi DAPI nebo Hoechst 33342 nebo Hoechst 33258 nebo Hoechst 34580 (v koncentracích 0,5 až 20 mol. I1). Inkubace probíhala alternativně po dobu 10 sekund nebo 10 minut nebo 20 minut nebo jedné hodiny.
V některých provedeních byly vzorky v průběhu inkubace třepány na třepačce.
V některých provedeních byly buňky před aplikací dvojmocných iontů mědi (krok C) pouze usušeny.
V některých provedeních byl postup popsaný v tomto příkladu použit pro stanovení počtu buněk dle patentu CZ307415. V těchto provedeních byly roztoky obsahující dvojmocné ionty mědi aplikovány ještě před vymytím barviv DAPI a/nebo Hoechst z DNA.
D) Roztok byl odstraněn a byl nahrazen lx PBS (přidáno bylo přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby).
E) Roztok Ix PBS byl odstraněn a nahrazen novým roztokem Ix PBS (přidáno bylo přibližně 0,2 až 0,8 ml roztoku na 1 cm2 plochy, použité množství se odvíjelo od kapacity použité nádoby). Tento krok byl ještě jednou opakován.
Příklad 3
Stabilizace suspenzních buněk pomocí dvojmocných iontů mědi.
Následující postup popisuje stabilizaci buněk rostoucích v suspenzi pomocí dvojmocných iontů mědi. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Suspenze buněk v médiu byla umístěna do 15 ml centrifůgační zkumavky a centrifůgována 5 minut při 300x g. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr.
B) Médium bylo odsáto a k peletě buněk byl přidán Ix PBS (2 ml). Buňky byly rozsuspendovány a centrifugovány 5 minut při 300x g.
C) Ix PBS bylo odsáto a ke vzorkům byl přidán alternativně 10% nebo 50% nebo 70% nebo 90% vodný roztok (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo 100% etanol a/nebo metanol (přidány byly 2 ml roztoku). Vzorky byly rozsuspendovány. Pokud byl použit roztok metanolu a současně etanolu, jednalo se o součet jejich koncentrací. Doba inkubace byla alternativně 1 minuta nebo 10 minut nebo jedna hodina. V případě použití 50% nebo 70% nebo 90% vodného roztoku (obj./obj.) etanolu a/nebo metanolu nebo 100% etanolu a/nebo metanolu byla doba inkubace alternativně i několik měsíců. Inkubace probíhala alternativně i při -25 °C nebo -20 °C nebo 0 °C nebo 25 °C nebo 40 °C nebo 50 °C. V některých provedeních byly vzorky inkubovány v roztoku 0,1% nebo 2% nebo 8% formaldehydu (hmotnost/obj.) v Ix PBS alternativně po dobu 10 sekund nebo 1 minuty nebo 10 minut nebo 30 minut. Následně byly buňky centrifugovány 5 minut při 300xg.
V některých provedeních byl krok C) vynechán a následoval krok D)
D) Fixační roztok nebo pufr byly odsáty a k buňkám byl přidán roztok 10 pmol.l1 síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého (alternativně byly použity koncentrace 0,1 nebo 0,2 pmol.l1 nebo 0,1 nebo 1 nebo 50 nebo 100 mmol.l1, přidány byly 2 ml
- 8 CZ 2018 - 609 A3 roztoku) ve vodě nebo ve vodném roztoku 20 mmol.l1 citrátového pufru, pH 5 nebo 6, nebo 20 mmol.l1 Tris, pH 7, nebo 10 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 kyseliny citrónové nebo kyseliny octové nebo kyseliny chlorovodíkové nebo 10 mmol.l1 hydroxidu sodného nebo ve 100% etanolu nebo metanolu nebo 10% nebo 50% nebo 70 % nebo 90 % (obj./obj.) roztoku etanolu a/nebo metanolu ve vodě. Buňky byly rozsuspendovány. Pokud byl použit roztok metanolu a současně etanolu, jednalo se o součet jejich koncentrací. V některých provedeních roztok s dvojmocnými ionty mědi obsahoval DAPI nebo Hoechst 33342 nebo Hoechst 33258 nebo Hoechst 34580 (v koncentracích 0,5 až 20 pmol.l1). Inkubace probíhala alternativně po dobu 10 sekund nebo 10 minut nebo 20 minut nebo jedné hodiny.
V některých provedeních byly vzorky v průběhu inkubace třepány na třepačce.
E) Následně byly buňky centrifugovány 5 minut při 300x g. Roztok byl poté odstraněn a nahrazen lx PBS (přidány byly 2 ml roztoku). Buňky byly rozsuspendovány a po opětovné centrifugaci (5 minut při 300x g) byl roztok Ix PBS odstraněn a nahrazen novým roztoku Ix PBS (přidány byly 2 ml roztoku). Tento krok byl ještě jednou opakován.
Příklad 4
Sada pro stabilizaci buněk.
Následující příklad popisuje sadu pro stabilizaci buněk.
Sada obsahuje vodný roztok síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého a volitelně vodný roztok etanolu a/nebo metanolu. Koncentrace síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého je alternativně 0,001 nebo 0,1 nebo 1 mol.l1. Koncentrace vodného roztoku etanolu a/nebo metanolu je alternativně 70 % nebo 80 % nebo 90 % (obj./obj.).
V jiném provedení obsahuje sada vodný roztok síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého obsahující současně etanol a/nebo metanol. Koncentrace síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého je alternativně 0,001 nebo 0,1 nebo 1 mol.l1. Koncentrace etanolu a/nebo metanolu je alternativně 70 % nebo 80 % nebo 90 % (obj./obj.).
Použité roztoky a chemikálie:
1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.l1 NaCl mmol.l1 KC1 mmol.l1 Na2HP04 mmol.l1 KH2PO4
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 Ix PBS (fosfátem pufrovaný fýziologický roztok v obvyklé koncentraci).
2. Roztoky dvo jmocné mědi
-9CZ 2018 - 609 A3
Pro přípravu pracovních roztoků byly připraveny zásobní roztoky 0,5 mol.l1 síranu měďnatého, chloridu měďnatého a dusičnanu měďnatého ve vodě.
Průmyslová využitelnost:
Přístup je využitelný v laboratořích, které se zabývají buněčnými kultivacemi a jejich dalším zpracováním pro mikroskopické účely a dále v laboratořích, které využívají sedimentaci pro záchyt buněk na různé podložky, např. v klinické diagnostice.
Claims (5)
1 -piperazinyl)-2,5' -bi- IH-benzimidazol, 2' -(4-etoxyfenyl)-5 -(4-metyl-1 -piperazinyl)-2,5' -bi- 1Hbenzimidazol a N,N-dimetyl-4-[5 -(4-metyl-1-piperazinyl) [2,5' -bi-lH-benzimidazol] -2' yl]benzenamin, je v rozmezí od 0,1 pmol.l’Mo 0,1 mold1.
1. Způsob stabilizace buněk ve vzorku pro zvýšení mechanické a chemické odolnosti buněk, vyznačující se tím, že se vzorek obsahující buňky inkubuje s dvojmocnými ionty mědi.
2. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dvojmocné ionty mědi připraví rozpuštěním síranu měďnatého a/nebo chloridu měďnatého a/nebo dusičnanu měďnatého ve vodě a/nebo metanolu a/nebo etanolu nebo ve směsích obsahujících vodu a/nebo etanol a/nebo metanol, na koncentraci dvojmocných iontů mědi rovnou nebo vyšší než 0,1 pmol.l1.
3. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že doba inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi je rovna nebo vyšší než 1 sekunda.
4. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi proběhne při teplotě v rozmezí od -25 °C do 50 °C.
5. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi se provede před inkubací nebo po inkubaci vzorku s etanolem a/nebo metanolem nebo formaldehydem nebo před nebo po usušení vzorku.
6. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle nároku 5, vyznačující se tím, že inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi se provede před inkubací nebo po inkubaci vzorku ve vodném roztoku etanolu a/nebo metanolu nebo formaldehydu, přičemž celková koncentrace etanolu a/nebo metanolu je rovna nebo vyšší než 10 % (obj./obj.) a doba inkubace v tomto roztoku je rovna nebo vyšší než 5 sekund a koncentrace formaldehydu ve vodném roztoku je rovna nebo vyšší než 0,1 % (hmotnost/obj.) a doba inkubace v tomto roztoku je rovna nebo vyšší než 10 sekund.
7. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že se mezi inkubací vzorku s etanolem a/nebo metanolem a inkubací vzorku s dvojmocnými ionty mědi vzorek obsahující buňky usuší.
8. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že krok inkubace vzorku s dvojmocnými ionty mědi proběhne ve vodném roztoku, který vedle dvojmocných iontů mědi dále obsahuje alespoň jednu látku, vybranou ze skupiny zahrnující 4',6diamidin-2-fenylindol, 2-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyI)-2,5-bi-lH-benzimidazol, 2'-(4-etoxyfenyl)-5-(4-metyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-lH-benzimidazol a Ν,Ν-dimetyl- 4-[5-(4metyl-l-piperazinyl)[2,5'-bi-IH-benzimidazol]-2 -yl]benzenamin.
9. Způsob stabilizace buněk ve vzorku podle nároku 8, vyznačující se t í m , že koncentrace látky, vybrané ze skupiny zahrnující 4',6-diamidin-2-fenylindol, 2'-(4-hydroxyfenyl)-5-(4-metyl-
- 10 CZ 2018 - 609 A3
5 10. Použití způsobu stabilizace buněk ve vzorku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro stanovení množství buněk ve vzorcích.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-609A CZ308519B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob stabilizace buněk a jeho použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-609A CZ308519B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob stabilizace buněk a jeho použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2018609A3 true CZ2018609A3 (cs) | 2020-05-20 |
| CZ308519B6 CZ308519B6 (cs) | 2020-10-21 |
Family
ID=70681596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-609A CZ308519B6 (cs) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | Způsob stabilizace buněk a jeho použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308519B6 (cs) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307415B6 (cs) * | 2017-04-27 | 2018-08-01 | Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci | Způsob stanovení množství DNA ve vzorcích a jeho využití pro stanovení množství buněk |
-
2018
- 2018-11-07 CZ CZ2018-609A patent/CZ308519B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ308519B6 (cs) | 2020-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2711682B1 (en) | Clarifying reagent for biological materials and use thereof | |
| JP7278987B2 (ja) | 全血サンプルの安定化 | |
| EP2703801B1 (en) | Method for making biological material transparent | |
| KR20040053115A (ko) | 분석용 세포 및 생물학적 시험편의 안정화 | |
| Uhl et al. | Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis | |
| CN103940658A (zh) | 一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法 | |
| JP2022529596A (ja) | 胃がん及び胆嚢・胆管がん初代細胞を培養する方法及び補助試薬 | |
| Cervero et al. | Podosome reformation in macrophages: assays and analysis | |
| JP2017518321A (ja) | 周囲温度での血液サンプル中の代謝的に活性な細胞の安定化 | |
| Roy et al. | Neutral comet assay to detect and quantitate DNA double-strand breaks in hematopoietic stem cells | |
| Nijssen et al. | Axon-seq for in depth analysis of the RNA content of neuronal processes | |
| KR20050010794A (ko) | 세포 및 조직의 ｒｎａ 및 형태의 보존 | |
| CZ2018609A3 (cs) | Způsob stabilizace buněk, sada pro stabilizaci buněk a jejich použití | |
| Smith et al. | Microscopy studies of placozoans | |
| WO2023241118A1 (zh) | 一种抗衰老药物的筛选方法 | |
| WO2005035736A1 (ja) | 粘液除去方法並びにこれに用いる細胞処理液及び保存液 | |
| US11085916B2 (en) | Method for observing dynamics of sweat glands | |
| CN102174465A (zh) | 一种从组织中分离富集靶细胞的方法 | |
| Voorberg-van der Wel et al. | Isolation of GFP-expressing malarial hypnozoites by flow cytometry cell sorting | |
| Kurilov | Improvement of silver impregnation technique using in situ synthesized protargol | |
| Applewhite et al. | Imaging of the cytoskeleton using live and fixed Drosophila tissue culture cells | |
| CZ308385B6 (cs) | Způsob selektivního odstranění barviv DNA a jeho použití | |
| CN106362212A (zh) | 一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液、试剂盒和方法 | |
| Hyde-Dunn et al. | Visualization of cell replication using antibody to proliferating cell nuclear antigen | |
| CZ28964U1 (cs) | Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20211107 |