KR20050010794A - 세포 및 조직의 ｒｎａ 및 형태의 보존 - Google Patents

Abstract

세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 용액이 기재되어 있다. 본 발명의 간단한 비수성 조성물은 약 10% 폴리에틸렌 글리콜 및 90% 메탄올을 갖을 수 있다. 실온에서 사용될 수 있다. 특별한 화학물질, 기기 및 기술을 필요로 하지 않는다. 상기 용액에 보존 및/또는 보관된 조직은 다양한 방법에 의하여 화학적 염색 및/또는 항체 결합과 같은 세포학 및 조직학 분석을 위하여 처리될 수 있다; 항원, DNA 및 RNA을 처리된 조직으로부터 고수율 및 최소의 분해 또는 분해 없이 추출할 수 있다. 본 용액의 이점의 예는 다음과 같다: 경제성 및 안전성, 기록보관 물질에 대한 용이한 접근성 및 세포 분석 및 유전분석 모두와의 호환성. 본 용액의 사용 및 제조에 관하여 또한 기재되어 있다.

Description

세포 및 조직의 ＲＮＡ 및 형태의 보존{Preservation of ＲＮＡ and Morphology in Cells and Tissues}

세포학적 그리고 조직학적 처리는 생체로부터 분리된 세포 및 조직의 자가용해 (autolysis)를 막는다. 더욱이, 개개 세포의 구조 및 조직 내에서 그들의 체계는 그와 같은 처리에 의하여 안정화된다. 그러나, 세포 및 조직을 임상 세팅 (clinical setting)에서 처리하기 위해서는 대부분의 경우 정교한 절차 및 전용 기기가 요구된다. 따라서, 표본은 보통 내과 병동 또는 외과에서 수집되고 중앙화된 병리 서비스센터로 이송된다. 세포 또는 조직의 보존 (preservation) 및 보관 (storage)에 적합한 조성물은 자가용해를 막고 처리될 때까지 세포의 형태, 항원 및 핵산을 유지할 수 있어야 한다.

더욱이, 유전분석 (genetic analysis)은 그 자체로도 중요하며, 또한 병리학에서 세포 염색, 효소 분석 및 면역적 기술을 보완하고 있다. 돌연변이 유전자의 발현 또는 정상 유전자의 과발현은 핵산을 분석하여 관찰할 수 있다. RNA의인 시츄검출은 다른 형태의 세포를 포함하는 조직 내에서 전사물 (transcripts)을 배치할 수 있게 한다; 이것은 선별된 세포 또는 절단된 조직의 다른 부분에서 추출한 RNA를 검출하는 것에 의하여 달성할 수 있다. DNA 또는 RNA에서 돌연변이도 알 수 있다.

선별된 세포 및 절단된 조직의 세포학적 /조직학적 분석 및 유전분석을 교대로 실시하는 것은 세포 및 분자 수준에서 병리학적 현상을 상호 연관시키데 사용될 수 있다. 유전분석은 분해가 억제되고 거대 분자 구조가 안정화되어 있는 경우에 가능하다. 하지만, 많은 보존 조성물 및 고정제 (fixatives)는 핵산 (예를 들어, DNA 및 특히 RNA)의 구조에 비가역적인 손상을 야기하며 (예를 들어, 도처에 존재하는 뉴클레아제의 활성, 포스포디에스테르 결합의 가수분해 및/또는 염기의 디아미데이션 (deamidation)), 그들의 수율을 감소시켜 진단 및 연구에 대한 유전기술의 유용성을 제한하게 된다. 결과적으로, 신선한 세포나 조직에서 핵산을 보존하기 위해서는 통상적으로 즉각적인 처리 또는 동결과 같은 특별한 처리를 필요로 하며, 비로소, 세포학적, 조직학적, 면역학적 및 유전적 기술의 조합으로 실험을 하는 것이 가능하게 된다.

본 명세서에서 개시된 조성물은 통상적인 조직 처리방법 및 미합중국 특허 제 6,207,408 호; WO 01/44783; 및 WO 01/44784 등에 기재된 다른 처리방법에 유용하게 사용될 수 있다. 통상적인 기술은 Thompson (Selected Histochemical and Histopathological Methods, Springfield, IL : Thomas, 1966), Sheehan & Hrapchak (Theory and Practice of Histotechnology, St. Louis,MO : Mosby, 1973), Bancroft & Stevens (Theory and Practice of Histological Techniques, New York, NY: Churchill Livingstone, 1982); Boon & Kok (Microwave Cookbook of Patho- logy, Leiden, NL: Coulomb, 1989); 및 Woods & Ellis (Laboratory Histopathology, New York, NY: Churchill Livingstone, 1994) 등의 참고 문헌에 기재되어 있다.

미합중국 특허 제 3,389,052 호 ; 제 3,546,334 호; 제 5,104,640 호 ; 제 5,256,571 호; 제 5,849,517 호; 및 제 6,204,375 호; Florell et al. (Mod. Pathol., 14: 116-128,2001) ; Bostwick et al. (Arch. Pathol. Lab. Med. , 118: 298-302,1994) ;Dimulescu et al.(Mol. Diagnosis, 3: 67- 71,1998) ; Maxwell et al. (J. Clin. Pathol., 52: 141-144,1999) ; Shibutani et al. (Lab. Invest., 80: 199-208,2000) ; 및 Gillespie et al. (Am. J. Pathol., 160: 449- 457,2002) 은 보존용 및 고정용 용액을 기재하고 있다.

본 발명의 조성물은 신규하고 진보성이 있다. 본 발명의 조성물은 PEG 및 메탄올을 포함하는 비수성 용액으로서, 분리된 세포 또는 고상 (solid) 조직에서분해를 방지하기 위하여 표본을 냉장하거나 냉동하는 불편함 없이 형태학적 특성, 동계 항체에 의한 항원의 인식 및 핵산 (예를 들어, DNA 및 RNA)의 온전한 상태를 보존하다. 따라서, 분리된 세포 및 고상 조직을 대기 온도에서 장시간 보관할 수 있다.

본 발명에 의한 유용성 및 개선점은 하기에서 검토한다.

본 발명은 세포 또는 조직의 보존 (preservation)을 위한 ,특히, 대기 온도에서 세포 또는 조직의 보존을 위한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 메탄올을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포 또는 조직의 보관에 사용된다. 본 발명의 조성물로 보존 (preserved) 및/또는 보관된 (stored) 세포 또는 조직은 냉장 또는 동결 없이도 그 형태적 특징, 동계의 항체 (cognate antibody)에 의한 항원의 인식 및 핵산 (예를 들어, DNA 및 RNA)의 본래의 모습을 유지하다.

도 1은 RNA을 변성조건 하에서 분리한 에티디움 브로마이드 염색된 아가로스 겔을 보여준다. 조직을 25℃에서 3 일 (도 1A) 또는 1 주 (도 1B) 동안 다른 조성물에서 반응시킨 후, RNA를 Trizol RNA 분리 키트 (Gibco BRL)를 사용하여 추출하였다. 각각의 시료 (A 내지 F)를 복수 레인 (1 및 2)에 전개하였다.

도 2는 헤마토크실린-에오신 (hematoxylin-eosin) 염색된 조직 절편을 보여준다. 조직을 25℃에서 10% 폴리에틸렌 글리콜 및 90% 메탄올 (도 2A, 2C 및 2E) 또는 RNAlater (도 2B, 2D 및 2F)에서 48시간 (도 2A-2B), 72시간 (도 2C-2D) 또는 1주 (도 2E-2F) 동안 반응시켰다. 상기 조직을 통상적인 방법 및 미합중국 특허 제 6,207,408 호에 기재된 방법에 따라 처리하였으며, 그 다음 염색하였다. 배율은 400 x (도 2A-2F)이다.

본 발명의 목적은 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 폴리에틸렌 및 메탄올을 포함한다. 편리하게도, 본 발명의 조성물은 실질적으로 대기 온도 이하의 녹는점을 갖는 비수성 용액이다. 세포학적 분석을 위하여 세포가 보존 또는 보관된다; 조직학적 분석을 위하여 조직이 보존 또는 보관된다. 상기 세포 또는 조직으로부터의 항원 또는 핵산을 분석한다. 형태의 보존은 현미경으로 판단한다. 항원 및 핵산의 보존은 세포 또는 조직으로부터 추출 후 최소한 부분적으로 비분해된 항원 및 핵산의 수율 또는 증가된 항체 결합 및 상기 세포 또는 조직에 대한 상보적인 프로브 혼성화에 의하여 판단한다. 또한, 상기 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 표본 홀더 및 벌크 (bulk) 컨테이터이다.

본 발명에 따라 보존 및/또는 보관된 세포 또는 조직은 세포학적, 조직학적, 면역학적 및/또는 유전분석에 사용된다. 분리된 세포는 펠렛, 스미어 (smear) 또는 현탁액의 형태로 제공된다; 주입 (impregnation) 후 얻어진 조직의 절편 또는 블록이 제공된다. 보존, 보관 또는 처리된 분리된 세포 또는 고상 조직으로부터 추출한 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)은 본 발명의 다른 하나의 구현예이다.

본 발명의 추가적인 구현예는 하기에 상세하게 기술되며, 본 명세서의 개시 사항으로부터 당업자에게 명확하다.

본 명세서에서 기재된 조성물은 화학적 간결성, 조직의 형태 및 유전학적 특징을 보전할 수 있는 능력 및 대기 온도에서 사용의 편리함과 실용성을 위하여 개발되었다. 세포 또는 조직을 조성물에 보관하여 세포학적, 조직학적 및/또는 유전적 분석을 위한 기록보전 소스(archival source)로 사용할 수 있다. 장래의 또는 소급적인 연구를 위하여 보존되거나 보관될 수 있다. 바람직하지는 않지만, 본 발명의 조성물에서 보관은 다른 보존제 또는 고정제와 세포 또는 조직의 접촉 후에도 가능하다.

세포는 펠렛 또는 현탁액이며, 바람직하게는 생물학적 유체 (예를 들어, 복수 (ascites), 혈액, 뇌척수액, 림프, 흉막 삼출)로부터 분리된 세포, 기관의 아스퍼레이션 (aspiration) 또는 신체 공동 (cavity)의 세척액으로부터의 세포 현탁액 또는 세포 스미어 (cell smear) (예를 들어, 자궁경부)이다.

세포는 효소적 및/또는 기계적 분해에 의하여 얻을 수 있다. 보존 및/또는 보관 전에 유지 또는 증식을 위하여 살아있는 세포로서 배양될 수 있다. 세포를세척하고 원심분리기에 의하여 펠렛으로 수집할 수 있다; 세포를 슬라이드 또는 다른 기재 상에 수집할 수 있다.

혈액 및 다른 단일-세포 현탁액에 대해서는 침강 또는 밀도 구배 원심분리, 코팅 또는 비코팅 플라스틱 플레이트 상에서 패닝 (panning), 유리면 또는 다른 크로마토그래피 메트릭스의 통과, 로세팅 (rosetting), 빛 산란 또는 형광 표지된 항체에 의한 선별, 자성 입자로 코딩된 항체 결합 또는 이들의 조합으로 세포를 분리할 수 있다. 세포는 암세포 (양성 또는 악성) 또는 전암세포, 질병에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 동물 또는 인간으로부터 얻어지는 것 (정상 또는 병든) 또는 다른 병리현상을 갖는 것이다. 세포는 부검 또는 생검 (예를 들어, 도뇨 (catheterization) 또는 채혈) 또는 다른 유체 수집에 의하여 얻을 수 있다. 세포는 신체 또는인 비트로배양에서 채집한 후 1 내지 30분 내에 조성물과 접촉시켜야 하나 상기 시간은 세포를 얼음에서 냉장하여 연장할 수 있다. 세포는 보존 및/또는 보관된다.

세포학적 분석을 위하여 세포를 처리한다. 슬라이드 상에 세포를 도말하고 현미경으로 실험할 수 있다. 항원 또는 항체를 검출할 수 있는 측색성, 효소성, 형광성, 발광성, 자성 또는 방사성 모이어티 (moiety)로 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있다. 세포는 항체 패닝 또는 선별 (panning 또는 sorting) 또는 다른 친화성 크래마토그래피에 의하여 항원 발현에 따라 동정 및/또는 분리된다.

DNA/RNA 함량, 크기, 생존도, 형광 표지된 항체 결합 또는 이들의 조합에 의하여 사이토미터 (cytometer)는 세포를 분석하고 세포 선별기는 세포를 분리한다.자석은 항체-코팅 자성 비드에 결합하는 세포를 정제하는 데 사용된다. 세포는 세포 주기, 분할, 성장 또는 세포기관에 의하여 특징지어 진다. 세포 집단을 분리하기 위하여 음성 또는 양성 선택 (예를 들어, 친화 또는 선별 기술)을 사용한다.

본 명세서에 개시된 대로 조직을 처리할 수 있다. 고상 조직 예컨대, 파렌키마 (parenchyme), 결합 또는 지방 조직, 심장 또는 골격근, 신장, 간, 피부, 민무늬근 또는 비장이다. 선택적으로 석회화된 조직은 추가적인 처리 전에 미네랄을 제거하는 것이 필요하다. 그러나 "조직"은 통상적으로 생물학적 유체 (예를 들어, 복수 (ascites), 혈액, 및 흉막 삼출)로부터 분리된 세포, 기관의 아스퍼레이션 (aspiration) 또는 신체 공동 (cavity)의 세척액으로부터의 세포 현탁액 또는 세포 스미어 (cell smear)로부터의 단일 세포를 의미하지 않는다. 조직은 종양 (양성 또는 악성), 암세포성 또는 전암세포성, 질병에 걸리거나 걸린 것으로 생각되는 동물 또는 인간으로부터 얻어지는 것 (정상 또는 병든), 또는 다른 병리현상을 갖는 것이다. 세포는 부검 또는 생검 (예를 들어, 내시경 검사 또는 복강경 검사) 또는 외과 절제에 의하여 얻을 수 있다. 조직은 사후 (death) 또는 신체에서 제거한 후 1 내지 30분 내에 조성물과 접촉시켜야 하나 상기 시간은 조직을 얼음에서 냉장하여 연장할 수 있다. 조직의 조각 (예를 들어, 슬라이스 (slice) 또는 블록)을 본 발명의 조성물에 보존 및/또는 보관할 수 있다; 보존 및/또는 보관된 조직은 매질 (medium)에 포매 (embed)될 수 있다. 조직은 인접한 절편에 적용된 다른 분석들과 함께 연속적 재구성을 통하여 분석된다. 음성 또는 양성 선택 (예를 들어, 광학 집게 (optical tweezers) 또는 레이져 절개를 이용한 미세절제)를 세포 집단 분리에 사용한다.

통상적인 조직학적 처리법은 보통 반응성 바이오 분자를 교차결합하는 고정제 (예를 들어, 완충된 포르말린 알데하이드-포함 수성 용액)를 사용하나, 때때로 응집제 또는 침전제 (예를 들어, 케톤) 등의 고정제가 사용된다. 조직 표본은 종종 일련의 농도의 에탄올 (예를 들어, 70% 내지 100%)을 통하여 탈수되고 그 다음, 주입 (impregnation)전에 일련의 크실렌 (xylene)으로 정화 (clear) 한다. 처리는 보통 수 시간 또는 하루 (예를 들어, 오버나잇)가 걸린다.

미합중국 특허 제 6,207,408호에 기재된 방법에 따른 조직학적 처리는 시간, 온도 및 압력의 다양한 조건 하에서 일련의 비수성 용액에 반응시키는 것을 포함한다. 조직은 고정되고, 탈수되고, 선택적으로 정화 (clear)되고 그리고 주입 (impregnation)된다; 또는, 조직은 경화되고 주입된다. 각 단계의 경계는 겹쳐질 수 있으며, 이는 일련의 용액 중 하나의 화학적 구성성분이 2 이상의 활성을 가지기 때문이다 (예를 들어, 고정제, 탈수제 및 정화제). 조직 처리는 45분, 1 시간 이하, 90분 이하 또는 2 시간 이하 내에 완결된다. 급속 및 계속 처리는 조직 표본의 두께를 얇게 하는 것, 혼화제 (admixture)를 포함하는 일련의 비수성 용액의 사용, 극초단파 에너지에 의한 가열, 압력 하에서 또는 희석에 의한 조직 표본에서 용매/용질 교환 유도, 기계적 교반, 인핸서 (enhancer) 또는 계면활성제의 첨가 또는 이들의 조합으로 달성될 수 있다.

혼화제 (admixture)는 최소한 하나의 고정제, 최소한 하나의 탈수제 및 최소한 하나의 조직 정화 및/또는 지방 제거용 제제 (예를 들어, 알코올, 케톤 및 크실렌에서 선택)를 포함한다. 다른 혼화제는 최소한 하나의 정화제 및 최소한 하나의 주입제 (예를 들어, 크실렌 및 왁스)를 포함한다.

조직 표본은 다른 사슬 길이의 혼합물을 포함하는 왁스 용액에서 주입 (impregnation)된다 (예를 들어, 대기 온도에서 액상의 미네랄 오일 및 고상의 파라핀). 많은 화학물질이 다중의 활성을 가질 지라도, 바람직한 혼화제는 하나이상의 화학물질을 포함한다. 바람직하게, 혼화제는 2 또는 3 개의 다른 화학물질을 포함한다 (예를 들어, 이소프로파놀, PEG 및 아세톤; 이소프로파놀, 아세톤 및 파라핀).

조직 표본은 적당한 확산을 의하여 최소한 용적이 3 ㎜ 이하이다: 예를 들어, 조직 슬라이스 또는 블록의 두께는 0.5 ㎜ 내지 3.0 ㎜ 이고, 바람직하게는 2.0 ㎜이하, 보다 바람직하게는 1.5 ㎜ 이하, 가장 바람직하게는 1.0 ㎜이하이다. 본 명세서에 참조로서 삽입된 미합중국 특허 제 6,207,408호 및 그의 개시 사항 참조.

포매 미디움은 니트로셀루로스, 플라스틱, 레진 및 왁스이다. 조직 처리는 자가용해 (autolysis) 및 바이오폴리머 (예를 들어, 핵산, 단백질 및 항원)의 분해에 원인이 되는 효소를 비가역적으로 불활성화하는데 작용한다. 따라서, 포매된 조직의 블록 또는 이들의 절편을 보관할 수 있다. 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)은 조직 또는 절편에서 추출되며, 바람직하게는 포매 미디움의 제거 후에 추출된다. 조직 절편은 3 ㎛ 내지 6 ㎛ (니트로셀루로스 또는 왁스) 또는 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛ (플라스틱 또는 레진)이다.

본 발명의 조성물에서 보존된 조직을 사용한 연구는 통상의 보존 용액을 사용하는 경우 보다 핵산이 보다 잘 보존되는 것을 보여준다. 신선한 조직을 본 발명의 방법에 따른 조성물과 접촉시키고, 연구소에 배달 후 바로 세포학적, 조직학적, 면역학적 및/또는 유전적 연구를 위하여 처리할 수 있으며, 또는 기록보존 물질 (archival material)을 보관하여 장래의 연구 및 다른 응용을 의하여 사용할 수 있다. 종래 기술과 비교하여 유전 물질의 수율, 기록보존 형태 (archival form)에서 유전 물질의 안정성, 유전 물질의 크기 및 보존 및 유전 물질의 화학적 변형 감소 등에 개선이 있는 것으로 관찰된다. 연속적 재구성은 인접한 절편에 대한 동일한 또는 다른 분석을 사용한다. 시료를 다른 시간에서 보존하여 차후 분석을 위하여 보존한다. 보존된 조직은 장래의 또는 소급적인 연구를 위하여 적당하다.

본 발명의 보존용 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등을 포함한다. PEG는 바람직하게는 녹는점이 대기 온도 아래 이다. 평균 분자량은 약 800 달톤 이하, 바람직하게는 약 600 달톤 이하, 보다 바람직하게는 약 400 달톤 이하, 보다 더 바람직하게는 약 300 달톤 이하이다; 평균 분자량은 0 내지 약 800 달톤, 약 100 내지 약 600 또는 약 200 달톤 내지 약 400 달톤 이다. 용어 "약" PEG의 평균 분자량에서 언급되는 용어 "약"은 10, 25 또는 50 달톤의 가감이 가능하다는 것을 의미한다. 고분자량 PEG (예를 들어, 1000 평균 분자량 이상)은 바람직하지 않으나, 분자량 분포 중 5%, 10% 또는 20% 이하의 함량으로 존재할 수 있다. PEG 400의 녹는점은 약 4℃ 내지 약 8℃이고 PEG 600은 약 20℃ 내지 약 25℃이다.조성물에서 사용되는 PEG의 녹는점은 37℃ 이하, 32℃ 이하, 27℃ 이하, 22℃ 이하, 15℃ 이하, 10℃ 이하 또는 5℃ 이하이다: 보관 중에 냉동되거나 냉각되는 조직에는 낮은 녹는점이 바람직하다.

본 발명에서 PEG 농도는 약 20% (v/v) 이하, 보다 바람직하게는 약 15% (v/v) 이하, 약 5% (v/v) 이상, 약 10% (v/v) 이상이며, 이들의 중간 범위이다. 용어 "약"은 1% (v/v) 또는 2.5% (v/v) 가감된 PEG 농도를 의미한다. PEG는 분자량에 의존하여 약 1.1 내지 1.2 gm/㎖의 밀도를 가지며, 따라서 본 명세서에 주어진 농도는 비중 (specific gravity)으로 1.1을 사용하여 중량 및 부피로 환산할 수 있다.

본 발명의 보존용 조성물은 또한 메탄올 등을 포함한다. 에탄올과 같은 알코올은 형태 및 유전분석을 위한 조직 보존에 효과적이지 않다. 하지만, 대부분의 조직학자들은 메탄올보다는 에탄올을 선호하며, 메탄올의 휘발성, 인화성 및 비용으로 인하여 에탄올 대신으로 사용하려 하지 않는다. 하지만, 본 발명에 따르면, 조직의 효과적인 보존을 위해서는 메탄올이 요구된다. 반응성 그룹을 교차 결합시키는 고정제 (예를 들어, 알데하이드 및 케톤)는 요구되지 않는다.

본 발명에서 메탄올의 농도는 약 95% (v/v) 이하, 보다 바람직하게는 약 90% (v/v) 이하, 약 80% (v/v) 이상, 약 85% (v/v) 이상 및 이들의 중간 범위이다. 용어 "약"은 2.5% (v/v) 또는 5% (v/v) 가감된 메탄올 농도를 의미한다. 메탄올은 약 0.79 gm/㎖의 밀도를 가지며, 따라서 본 명세서에 주어진 농도는 비중 (specific gravity)으로 0.79를 사용하여 중량 및 부피로 환산할 수 있다.

교반/혼화 (shaking), 극초단파 처리, 초음파 처리, 대기 온도로부터의 가열 또는 냉각, 동결 또는 즉시 처리와 같은 특별한 절차는 본 발명에서는 효과적인 보존을 위하여 요구되지 않는다. 본 발명은 대기 온도에서 보존 및/또는 보관을 가능하게 한다 (예를 들어, 42℃, 37℃ 또는 30℃ 이하 ; 15℃ 내지 30℃ 또는 20℃ 내지 25℃). 따라서, 보존을 위하여 낮은 온도 (예를 들어, 약 4℃ 또는 15℃이하)를 필요로 하지 않으나 보관을 위하여 사용될 수 있다. 1 그램의 조직에 대하여, 약 10 ㎖ 내지 25 ㎖의 조성물을 보존 및/또는 보관 미디움으로 사용한다.

조직 내로 조성물이 잘 투과되도록 조직을 얇게 자를 수 있다 (예를 들어, 약 1 ㎜, 1.5 ㎜, 2 ㎜, 2.5 ㎜, 3 ㎜, 3.5 ㎜ 또는 4 ㎜이하의 최소 슬라이스 용적). 보관은 1 주, 2 주, 한달, 3 달, 6 달 또는 1 년 동안 가능하다.

본 발명의 조성물 (즉, 대기 온도에서 비수성 용액)은 소망하는 농도를 달성하기 위한 적당한 함량에서 PEG 및 메탄올을 혼합하여 제조한다. 보존제로서의 조성물의 활성에 영향을 미치지 않는 다면, 소량의 다른 화학물질을 첨가할 수 있다. 조성물은 초기에 첨가된 물을 포함하지 않으나, 소량의 물이 존재할 수 있으며, 이는 PEG 및 메탄올의 흡수성 또는 조직으로부터 물이 나오기 때문이다.

본 발명의 조성물은 조직 홀더 (holder) 내에서 제공되며, 상기 홀더는 바람직하게는 조직을 담그고 엎질러지는 것을 방지하도록 되어있다. 홀더는 30 ㎖ 내지 50 ㎖의 총 부피를 가지며, 이것은 1 그램 또는 그 이상의 조직 조각을 조성물에 담그기에 충분한 크기이다 (예를 들어, 최소한 50-90%의 총 부피). 예를 들어, 부착된 또는 분리된 덮개 (맞춰진 리드 (lid) 또는 캡 (cap))를 갖는 유리 또는 플라스틱 바이알 (vial)을 사용할 수 있다; 또는, 밀봉할 수 있는 부위를 갖는 플라스틱 백은 확실한 담가 주기 위하여 빈 공간을 제거하는 것이 요구된다. 투명한 바이알에 사용한 가스킷 (gasket)을 갖는 스크루 캡이 흘림을 막기 위하여 바람직하며, 큰 부피 (예를 들어, 리터 또는 갤런)는 병, 양동이 또는 마개를 갖는 내산병을 사용한다. 홀더는 컨테이너 (힌지 카세트 (hinged cassette), 메쉬 백, 다공성 스폰지)와 함께 제공될 수 있으며, 컨데이너는 홀더 안에 놓여지고 조직의 작은 조각을 둘러싸서 용액의 교환을 원활히 한다. 홀더는 고상 조직의 조직이 조성물에 담가지도록 개조될 수 있다. 바람직하게는, 홀더에서 공기 포겟을 감소시키는 것 및/또는 컨네이더를 홀더에 놓는 것에 의하여 고상 조직의 전체 표면이 둘러싸이도록 한다.

조직 홀더는 판지 상자 (carton)에 6 내지 총 유닛 (예를 들어, 25 또는 100) 사이에서 포장된다; 홀더 및 컨테이너는 조직을 수집을 위하여 단일-사용 키트에서 분리되어 포장될 수 있다. 각각의 홀더를 개개의 인식표 (예를 들어, 문자숫자 프린팅 또는 바코드) 또는 적절한 인식 사항을 기재할 수 있는 표면 (예를 들어, 조직의 소스에 관한 정보 또는 실시될 분석)으로 표시하는 것이 편리하다. 혈액 또는 팹도말 (pap smear) 또는 단일 세포를 위한 홀더와 달리, 홀더에 포함된 슬라이드나 스왑 (swap)을 갖는 것은 바람직하지 않으며, 이는 고상 조직에 대해서는 제한된 유용성을 갖기 때문이다.

조직의 처리

고정화 (fixation)는 조직 표본의 경화를 초기화하고 단백질을 안정화시키며 분해를 정지시켜 형태를 보존한다. 화학적 고정화 없이는 내생적인 효소의 작용으로 세포가 용해되고 조직의 형태가 변형된다. 고정화가 적절하지 않다는 것을 나타내는 것으로 다음과 같은 것이 있다: 조직 구조의 분해, 조직 절편에서의 버블/구멍, 약하고 불규칙적인 염색, 수축된 세포, 세포질의 응집, 농축 및 불명확한 핵 크로마틴, 및 적혈구의 자가분해/용혈현상. 아세톤을 이용한 고정화는 통상적으로 수 시간이 아닌 수 분 내에 이루어지며, 장시간의 노출은 조직이 부서지기 쉽게 하고 조직의 수축을 야기하기 때문이다. 포르말린에 의한 고정화와 대조적으로, 케톤 및 알코올은 화학적인 반응 (예를 들어, 반응성 그룹의 알데하이드-매개 교차결합) 없이, 응집 또는 침전에 의한 물리적인 단백질 안정화를 통하여 조직을 고정하는 것으로 판단된다.

탈수는 조직 표면으로부터 물을 제거하여 경화를 촉진한다. 조직 표본에서 물을 탈수제로 치환하는 것은 탈수제를 주입 (impregnation)에 사용되는 물질로 순차적 치환하는 것을 수월하게 한다. 이 용매/용질 교환은 탈수를 위하여 휘발성 용매를 사용하는 것에 의하여 증대된다. 표본의 탈수가 실패하면, 부적절한 주입 및 절단 중 약한 리본형성 (ribbon formation), 물이 제거되지 않은 조직 절편에서 틈, 구조의 분열, 조직 절편에서 물 결정 및 약한 염색의 결과를 얻는다.

선택적으로, 지방을 용매를 사용하여 조직 표본으로부터 제거할 수 있으며, 지방은 정화 (clearing) 및 주입 (impregnation)을 방해하기 때문이다. 부적절한 지방 제거는 조직 절편의 펴진 아티팩트 (spreading artifact), 조직 절편의 주름및 약한 염색의 결과로 나타난다. 조직 표본의 정화 (clearing)는 선택사항이다. 정화제는 조직 표본으로부터의 탈수 및/또는 지방제거에 사용된 용매가 주입제와 섞이지 않는 다면, 그들을 추출해 낸다. 조직은 "정화 (clear)"되고 추출에 의하여 불투명도도 감소한다.

마지막으로, 조직 표본을 일단 적절히 고정하고 탈수하면, 니트로셀룰로오스, 플라스틱, 레진 또는 왁스와 같은 제제로 주입되어 경화 및/또는 상기 제제에 포매된다. 블록의 형태의 주입 (impregnation)된 표본을 놓고 미크로톰 나이프 (microtome knife)로 10 미크론 또는 더 얇은 절편으로 자르기 전에 형태의 적합한 보존 더불어 조직 표본의 적절한 경화가 요구된다. 바람직한 주입 물질은 상업적으로 시판되는 왁스 제제, 다른 녹는점의 왁스 혼합물 (예를 들어, 액상 미네랄 오일 및 고상 파라핀) 및 PARAPLAST 미디움이 있다. 파라핀은 본 명세서의 실시예에서 사용되었으며, 이는 저렴하고 다루기 쉬우며, 이 물질에 의하여 제공되는 구조의 부착성에 의하여 리본 (ribbon) 절단이 용이하기 때문이다.

주입 후에, 조직 표본을 블록을 제조하기 위하여 포매한다. 조직 표본을 포매하기 위하여 사용되는 제제는 바람직하게는 주입에 사용되는 물질과 동일하나, 다른 주입제제를 사용할 수 있다. 불럭화된 조직 표본을 미크로 톰에 올려놓고 0.5 ㎛ 내지 50 ㎛로 자르고, 바람직하게는 2 ㎛ 내지 10 ㎛로 자른다. 조직 절편은 histochemical 염색, 항체 결합, 인 시츄 핵산 혼성화, 증폭 또는 이들을 조합한 것을 위하여 추가적으로 처리된다. 조직 표본은 현미경으로 조사할 수 있으나, 세포특성을 실험할 수 있는 다른 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어, 자동화된유동 또는 스캐닝 세포분석 (cytometry), 생중합체 검출 및 서열 결정, 오토라디오그래피 (autoradiograpy), 단백질 또는 핵산의 전기영동).

본 발명에 의하여 제조된 유리 슬라이드 왁스-주입 절편에 대하여, 염색 또는 면역 조직화학적 분석 전에 왁스를 녹이고 제거한다. 조직 절편을 재수화하고 그 다음 염색 및 항체를 이용하여 하기된 것처럼 분석한다. 염색을 완료하거나 조직화학적 반응을 전개한 후, 슬라이드를 커버슬립으로 덮고 현미경에서 관찰하다. 또는 염색되거나 항체-표지된 표본을 세포분석 (cytometry)에 사용하는 기기로 조사한다. 조직 블록은 차후의 실험을 위하여 보관한다.

세포 및 분자적 분석

헤마토크실린-에오신 (Hematoxylin-eosin) 염색은 세포학 및 조직학에 일반적으로 사용되며, 비교를 위한 표준 (standard)으로 병리학자에 의하여 사용된다. 하지만, 다른 염료 및 염색제도 사용된다. 조직 내생적인 또는 항체 및 다른 친화성 결합에 대한 표지로 사용되는 효소는 적절한 기질을 선택하여 인 시츄에서 배치될수 있다. 효소 및 기질은 반응하여 검출할 수 있는 생성물을 형성한다.

항체-항원 및 리간드-수용체 결합은 단백질의 서열 특이적 검출에 대한 기초가 된다. 단백질은 크로마토그래피 또는 전기영동에 의하여 분류되고 분리되어 최소한 부분적으로 정제된다. 어레이, 웨스턴 블롯팅, 면역침전 (IP), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassy) 및 면역 조직화학 (IHC)에 대한 특이적 결합에 의하여 검출할 수 있다.

본 방법에 의하여 보존된 조직 절편은 면역조직화학에 사용된다. 항원은 본 발명 및 적절하게 선택된 조직 처리 조건에 의하여 보존된다. 비특이적인 결합 자리를 블록하고 항원은 특이적 항체 (즉, 예를 들어, 일차 항원)에 결합되며, 결합되지 않은 항체를 제거한다. 만약 프로브 또는 신호 생성 모이어티 (moiety)로 표지되었다면, 일차 항체를 직접적으로 검출할 수 있으나, 프로브는 일차 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 (예를 들어, 이차 항체)에 붙이는 것이 바람직하다. 이차 항체는 일차 항체의 중 사슬 또는 경 사슬 불변 부위에 작용한다. 이것은 항원-항체 접합에 의하여 생성되는 신호를 증폭하며, 이는 각각의 일차 항체가 많은 이차 항체에 결합하기 때문이다. 또는, 바이오틴-스트렙타비딘과 같은 특이적 상호작용을 통하여 증폭이 발생한다. 항체 결합은 소규모 부피로 실시하여 고가의 시료 사용을 줄이고 높은 결합률을 유지하도록 한다; 습윤 챔버에서 반응시켜 이와 같은 소규모 부피의 증발을 감소시킨다. 신호 생성 모이어티 (moiety)는 바람직하게는 조직에 존재하지 않는 효소이다: 예를 들어, 알칼린 포스파타제 및 호오스래디쉬 퍼옥시다아제를 2차 항체에 붙이거나 스트렙타비딘에 접합한다. 이들 효소의 기질로서 발색 (chromogenic), 형광 또는 발광 산물을 생성하여 시각적으로 검출할 수 있는 기질이 이용 가능하다.

항원에 대한 염색 패턴은 카운터스테이닝 (counterstaining)에 의하여 드러난 세포 구조의 배경 (context)에서 항원의 발현을 배치하는 데 사용된다. 항원 발현은 세포 또는 조직 형태, 발달 단계, 종양 징후 마커, 퇴행성 대사 과정 또는 병원체에 의한 감염의 동정에 사용된다.

항원-항체 결합은 오토라디오그패피, 에피형광 (epifluorescent) 현미경 또는 전자 현미경을 각각 방사선, 형광 또는 콜로이드 금속 프로브와 사용하여 시각화될 수 있다. 또는 항원은 조직 절편으로부터 추출되고 직접적으로 검출 또는 실험된다. 예를 들어, 면역조직화학 대신에 항원을 추출하고 네이티브 (native) 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 웨스턴 블롯으로 검출할 수 있다.

유사한 프로브를 사용하여 인 시츄 혼성화로 조직 절편에서 핵산을 검출하여 유전적 돌연변이 또는 전사물 (transcript)을 동정한다. 또는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)을 조직 절편으로부터 추출하고 직접적으로 검출 또는 실험하거나 추가적인 유전분석 전에 증폭할 수 있다.

본 발명은 처리 전 또는 처리 후의 조직으로부터의 핵산 (DNA 또는 RNA) 제조와 비교할 만하다. 분자생물학적 기술에 대하여 Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, New York, NY: Greene, 2002) 및 Sambrook & Russell(Molecular Cloning, 3rd Ed., Woodbury, NY: CSHL, 2001) 참조.

본 발명의 조성물 및 절차는 유전분석을 위한 물질을 보존하고 실온에서의 조직의 보존 및/또는 보관을 가능하게 한다. 따라서, 병리학 연구실에 정례적으로 수집되는 조직에 대한 유전적 연구가 가능하다. 세포학적 관찰은 염색 또는 항체 결합에 의하여 선별된 세포를 분석하는 것 및 이들로부터 유전적 분석을 위하여 핵산을 제조하는 것에 의하여 유전적 정보와 상호 연결된다. 유사하게, 조직학적 관찰은 염색 또는 항체 결합에 의하여 하나의 절편을 분석하는 것 및 유전적 분석을 위하여 인접한 절편으로부터 핵산을 제조하는 것에 의하여 유전적 정보와상호 연결된다. 연속적인 절편의 재구성에 의하여 해부적으로 세부적인 것까지 볼 수 있다. 예를 들어, 동일한 절편의 질병 부위 및 정상 부위를 유전적 차이 (예를 들어, 크로모좀 재배열, 돌연변이 또는 전사 수준) 검출하여 비교할 수 있고, 수 개의 시점에서 수집한 시료에서의 유전적 차이를 비교하여 병력 또는 병의 진행을 알 수 있으며, 초기 암으로부터 전이까지의 유전적 차이를 수집하여 종양 발생을 파악할 수 있다.

돌연변이는 생식선 (gemline)에서 발생할 수 있으며 질병의 유전적 경향을 추적하는데 사용되고, 돌연변이는 체세포에서 발생할 수 있으며, 질병 병인론에서 유전적 변경을 결정하는 데 사용된다. 질병은 대사적 또는 신경적 장애, 악성 종양, 발달 장애 또는 감염체에 의한 것이다.

유전적 분석을 위하여, 포름알데히드-유도된 DNA 비정상화를 제거하고 보관된 물질 (archival material)로부터 핵산의 추출을 증대한다.

보존 및/또는 보관된 조직으로부터 RNA의 연구는 진단 및 연구 응용 면에 있어서 전에는 가능하지 못한 것들을 가능하게 하다. 리보뉴클레아제를 억제하거나 비활성화하는 통상적인 RNA 보존제 (예를 들어, 암모늄 클로라이드 또는 셀페이트, β-메르캅토에탄올, 디에틸 피로카르보테이트, 구아니딘 티오시아테이트, 플라센탈 리보뉴클레아제 억제제, 요소)는 본 발명에 따른 신선한 조직의 보존에 요구되지 않으나, 보존된 조직으로부터 RNA를 추출하고 분리하는 동안 사용될 수 있다. N-라우릴 사르코신 및/또는 다른 용제 (detergent) (예를 들어, TRITON X-100)를 세포막 용해 및 리보뉴클레오단백질 복합체를 분해하는데 사용한다. RNA는 리튬 클로리드에 의하여 침전되나, 5.5S보다 작은 RNA의 손실은 이소프로파놀을 사용한 바람직한 고-염 침전에 의하여 최소화될 수 있다. RNA 추출 및 분리를 위하여 시판되는 키트를 사용하며 (예를 들어, Ambion, BD BiosciencesClontech, nitrogen, Promega 및 Stratagene), RNA 분리 기술은 Chirgwin et al. (Biochemistry, 18: 294-299,1979) ; Chomczynski & Sacchi (Anal. Biochem. , 162: 156-159,1987) ; 및 미합중국 특허 제 4,843,155호, 제 5,010,183호, 제 5,234,809호 및 제 5,346,994호에 기재되어 있다. 고상 조직은 동결되고 막자 사발로 갈아 분말화 하거나 DOUNCE 또는 POLYTRON 기기, 볼텍싱, 초음파분해, 비드 또는 동결 분쇄기 (freezer mill)의 사용 또는 이들의 조합으로 파쇄되다. 미정제 또는 부분 정제된 DNA 또는 RNA 제조물을 유전분석에 사용한다.

RNA는 분리되어 용액에서 또는 고상 기재 (예를 들어, 클레이, 실리카, 여과막, 상자성 비드, 현탁액 또는 시트로서의 셀룰로오스)에 의하여 최소한 부분적으로 정제된다. 예를 들어, RNA는 올리고 (dT)에 결합, 차별적 침전, 전기 영동, 쿠숀 (cushion)을 통한 침강, 농도 구배에서 부력 부양 (buoyant flotation) 등에 의하여 DNA, 단백질 및 다른 바이오분자로부터 분리될 수 있다. 용액 또는 다른 시료에서 리보뉴클레아제의 비활성화를 위하여 디에틸 피로카르보네이트 (DEPC)사용이 바람직하다.

조직으로부터 추출된 RNA의 함량은 UV 흡광도 (흡광계수 1 OD₂₈₀/㎝는 40 ㎍/㎖ RNA이다) 또는 화학량적 (stoichiometric) 염료 결합에 의하여 측정한다. UV흡광도로 오염정도를 측정할 수 있다: OD₂₆₀/OD₂₈₀비율은 조직의 소스에서는 비율이 2 보다 더 클지라도 실질적으로 순수한 RNA에서는 1.8 내지 2.0 사이 이다. RNA의 강한 이차 구조는 비변성 전기 영동 이후 에티듐 브로마이드 (EtBr)-염색된 아가로스 겔상에서의 이동을 시각화하는 것을 어렵게 한다: 다중 밴드 또는 스미어 (smear)는 네이티브 (native) 조건에서 분리된 단일 RNA 종에서 얻어진다. 따라서, RNA의 온전한 상태(integrity)의 측정을 위해서는 변성 조건 (예를 들어, 알데하이드, 포름아마이드 및 요소) 하에서 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이 바람직하다. 진핵세포로부터의 전체 RNA는 변성 조건에서 2:1의 비율의 28S 및 18S 리보조말 RNA (rRNA)의 선명한 밴드 및 약 6 Kb 내지 약 0.5 Kb의 메신져 RNA (mRNA)의 스미어 (smear)로서 이동한다. 28SrRNA 밴드는 18SrRNA 밴드 보다 약 2 배 짙어야한다; mRNA의 스미어는 2.0 Kb 내지 1.5 Kb 사이에서 더 짙어야 한다. 폴리아데닐레이트(poly A+) RNA에 대해서는 단지 mRNA 스미어가 보여져야한다. rRNA 밴드의 밀도 측정기는 분해정도를 정량화할 수 있다. 또는, mRNA는 역 전사-중합효소 사슬반응 (RT-PCR)에 프라이머와 사용되어 다른 크기의 산물의 증폭에 사용된다. 긴 RNA는 짧은 RNA보다 더 빨리 분해되는 것을 생각되므로 큰 산물 (larger procut)은 작은 산물 (small product)전에 감소되어져야 한다.

본 발명에 따라 보존된 조직으로부터 추출한 RNA는 유적 공학적으로 다루어지고 또는 분석된다. 예를 들어, RNA는 공지된 기술 (예를 들어, RNA-의존적 RNA 중합효소에 의한 직접 전사, DNA-의존적 RNA 중합효소에 의하여 인식되는 프로모터를 포함하는 이중-가닥 DNA의 전사, RNA-의존적 복제 효소 (replicase)에 의한 복제)에 의하여 증폭된다. RNA는 cDNA로 역전사된다: cDNA는 공지된 기술 (예를 들어, 중합효소 사슬 반응 즉 PCR, 리게이션 사슬 반응 즉 LCR, 전사 매개된 전사 즉 TMA, 전사 또는 복제)에 의하여 증폭된다. RNA에 상응하는 이중-가닥 DNA을 제조하면, 그 다음, RNA 또는 cRNA는 DNA 기재의 말단에서 프로모터 또는 프라이머를 사용하여 전사된다. RNA, cRNA 또는 상응하는 DNA을 배치 또는 농축하기 위한 혼성화 전, 동안 또는 후에 고형 기재 상에 표적 핵산의 캡쳐 (capture)가 가능하다.

긴축 (Stringent) 혼성화는 핵삭의 서열-특이적 동정의 기본이 된다. DNA는 서던 블롯으로 검출한다; RNA는 노던 블롯으로 검출한다. 용액에서, DNA 또는 RNA는 뉴클레아제 보호에 의하여 검출한다. 핵산은 크로마토그래피 또는 전기영동을 통하여 분류되고 분리되어 최소한 부분적으로나마 정제될 수 있다.

동일 시점에서 병행하여 다른 유전자들의 발현을 모니터하는 데 다중 분석이 사용된다. 이와 같은 다중 분석은 기재 (예를 들어, 비드, 섬유 (fiber), 막 또는 칩) 상에 배열된 표적 핵산 (예를 들어, RNA, cRNA 또는 상응하는 DNA, 단일 또는 이중 가닥 DNA)에 상보적인 프로브를 이용하여 실시된다. 어레이는 프로브로 스폿되거나 또는 평평한 기재 상에서 인 시츄에서 프로브를 합성한다; 프로브는 정렬된 라이브러리로서 개개의 비드 또는 섬유에 부착된다. 실-시간 상대적 RT-PCR, 다중 프로브 리보뉴클레아제 보호 분석 또는 다중 프라이머쌍 증폭과 같은 동시 용액 방법 (simultaneous solution method)은 각각의 전사물 (transcript)을 분자량에 기초하여 분리된 다른 길이의 검출 산물과 연결시킨다. 유전자 발현 프로파일 또는 서열 동정은 어레이 또는 일련의 유전자 발현 (SAGE) 기술을 사용하여 실시한다.

보존 및/또는 보관된 조직으로부터 아미노산 서열은 Edman 분해, 겔 전기영동 또는 크로마토그래피, 또는 질량 분석기 (예를 들어, 비행시간 (time-of-flight), 삼중-사중극자, 사중극자-TOF 또는 이온 트랩 검출과 연결된 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 또는 전자스프레이 이온화)에 의하여 결정한다. 보존 및/또는 보관된 조직으로부터 뉴클레오타이드 서열은 핵산 (또는 핵산의 증폭된 산물)에 실시되는 Maxam-Gilbert, Sanger 즉, 혼성화에 의한 서열 (SBH) 절차에 의하여 결정한다. 하지만, 전술한 기술은 서열의 결정 없이 항원 및 핵산을 검출 및/또는 동정할 수 있다.

다음의 실시예는 유용성을 예시하고 본 발명의 효과를 구체화한다. 비교예에 의하여, 종래기술에 대한 본 발명의 이점을 비교하여 나타낸다. 본 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 실시범위를 제한하거나 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1: DNA 추출

다른 용액들 (예를 들어, 10% 폴리에틸렌 글리콜 300 및 90% 메탄올)에서 보존한 후에 조직 절편으로부터 DNA를 추출하였으며, 추출은 AquaPure Genomic DNA 분리 키트 (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 다음과 같이 실시되었다 :

바로 다진 마우스 간 조직 20 ㎎ 또는 10%PEG/90% 메탄올에 보존한 동일한 조직을 300 ㎕의 용해 (lysis) 용액을 포함하는 1.5 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 담았다. 1.5 ㎕의 프로테인아제 K (Proteinase K) 용액 (20 ㎎/㎖)을 상기 용해물에 첨가하고 위, 아래로 뒤집어 혼합하고 55℃에서 오버나잇 (overnight)동안 반응 시켰다. 상기 용해물에 1.5 ㎕의 RNAse A 용액 (4 ㎎/㎖)을 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후 37℃에 60분 동안 반응시켰다. 시료를 실온으로 냉각시킨 후 100 ㎕의 단백질 침전 용액을 첨가하였다. 시료를 20초 동안 볼텍스하고 16000 g에서 3분동안 원심분리하였다.

DNA를 포함하는 상등액을 새 튜브에 옮기고 300 ㎕의 100% 이소프로판올로 침전시켰다. 시료를 혼합하고 16000 g에서 1분 동안 원심분리하였다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 15분 동안 공기건조 (air drying)하였다. DNA를 100 ㎕의 DNA 혼성화 용액에 용해하고 농도를 UV 분광광도계로 측정하였다.

10 ㎎의 DNA을 Taql, EcoRl orBamHl 제한효소를 사용하여 가수분해하였다. DNA 미리그램 당 5 unit의 효소를 사용하여 오버나잇으로 가수분해하였으며, 적절할 제한 효소 완충액을 사용하였고 총 부피는 200 ㎕이었다. 20 ㎕를 0.8% 아가로스 겔에서 전개하여 DNA가 가수분해되었는지 조사하였다.

DNA 결과:

1. 보존된 조직은 신선한 조직과 유사한 함량의 DNA를 제공하였다.

2. 조직을 포르말린에서 보존하는 경우, 신선한 조직 또는 10%PEG/90% 메탄올에 보존된 조직과 비교하여 약 30% 적은 DNA가 추출되었다.

3. 10%PEG/90% 메탄올에 보존한 조직으로부터 추출한 게놈 DNA는 일반적인 제한 효소로 가수분해할 수 있었으며, 신선한 조직 또는 포르말린-고정된 조직과 질적으로도 필적할 만 하였다.

실시예 2: RNA 추출

다른 용액들 (예를 들어, 10% 폴리에틸렌 글리콜 300 및 90% 메탄올)에서 보존한 후에 조직 절편으로부터 RNA를 추출하였으며, 추출은 Trizol RNA 분리 키트(Gibco BRL)를 사용하여 다음과 같이 실시되었다:

50 ㎎의 신선한 조직 또는 10% PEG/90% 메탄올에 보존된 조직을 1 ㎖의 Trizol 시약에 넣고 Poltron 파쇄기 (homogenizer)로 파쇄하였다. 시료를 실온에서 5분 동안 반응시키고 0.2 ㎖의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 손으로 혼합하였다. 시료를 12000 g에서 15분 동안 5℃에서 원심분리하였다. 수용성 층을 제거하고 이소프로필 알코올을 사용하여 침전시켰다. 10분 동안 실온에서 반응시키고 시료를 5℃로 냉각한 후 12000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 15분 동안 공기 건조하였으며, 100 ㎕의 리보뉴클레아제가 없는 H₂0에 용해하였다. 추출된 RNA 함량은 UV 분광광도계로 측정하였다. RNA의 질 (quality)은 변성 아가로스 겔상에서 RNA를 분리하고 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드를 비교하여 측정하였다.

실시예 3: 조직 절편에서 항원의 검출

미합중국 특허 제 6,207,408호에서 교시된 것처럼, 신선한 조직에서 얻은 조직 절편으로 면역조직화학분석을 실시할 수 있다. 이와 비교하여, 다른 용액들 (예컨대, 10% 폴리에틸렌 글리콜 300 및 90% 메탄올)에 보존한 후에 면역조직화학분석을 실시하였으며, 미합중국 특허 제 6,207,408 호에 따라 처리되었다. 통상의 방법으로 처리되어 보존된 조직과 결과를 비교하였다.

자궁근종 (Uterine leiomyoma), 악성 흑색종 (melanoma), 신장 신우신염 (pyelonephritis of kidney) 및 정상 간세포를 사용하였다. 다음의 항체를 사용하였다: 표피 마커 (예를 들어, 광범위 사이토케라틴 (wide-spectrum cytokeratin), 사이토케라틴 7, 표피막 항원); 멜라토사이트 마커 (예를 들어, S100 단백질, Melan A, 티로시나아제, HMB-45); 핵 항원 (예를 들어, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체, Ki-67) ; 백혈구 (leukocyte) 항원 (예를 들어, CD45, CD68, CD31); 근육 마커 (예를 들어, 데스민, 클래데스몬, 머슬 액틴 ); 내피 마커 (예를 들어, FactorVlil 관련 항원, CD31); 그리고 간세포 및 신세포 (renal cell) 항원. 모든 조직에 대하여 면역조직화학적 결과들은 간세포 항원에 대한 항체의 반응이 약한 것을 제외하고는 포르말린에 고정된 것과 유사하였다.

면역조직화학적 절차 (단계 12 내지 18을 Dako Autostainer 장치에서 실시하였다):

1. 파라핀 절편을 3 미크론으로 절단하였다.

2. 58℃ 오븐 (또는 바람직하게는 37℃)에 슬라이드들을 넣고 파라민을 녹였다.

3. 크실렌에서 10분 동안 처리하여 슬라이드들에서 왁스를 제거하였다.

4. 일련의 농도를 낮춘 에탄올 용액 (즉, 순수 에탄올 2 배스 (bath), 95% 에탄오 2 배스 및 90% 알코올 1 배스)을 각각 1분 동안 처리하여 슬라이드들을 재수화하였다.

5. 내생 퍼옥시다아제를 6% 과산화 수소 (H₂0₂) 용액으로 10분 동안 블록 (block)하였다.

6. 슬라이드들을 1분 동안 수돗물에 담가 씻어주었다.

7. 슬라이드들의 랙 (Rack)을 PBS 배스 (bath)에 넣고 1분 동안 담가두었다.

8. 표적 리트리발 (target retrieval, TR)을 20 ㎖의 표적 리트리발(DAKOS1699)과 180 ㎖의 dH₂0을 첨가하여 녹색 염색 디쉬 (dish)에서 제조하다. dH₂O를 스팀기에 넣고 스팀기를 작동시킨다. 표적 리트리발 용액을 포함하는 염색 디쉬를 스팀기 안에 놓고 30분 동안 가열하다. TR 용액은 90℃까지 가열하여야 한다.

9. 스팀기에서 염색 디쉬를 꺼내고 슬라이드들을 디쉬안에 놓았다 (장갑 사용) 20분 동안 스팀처리하다.

10. 스팀처리 후, 슬라이드를 동일한 컨테이너에서 30분 동안 냉각한다.

11. 슬라이드를 PBS 완충액에 실온에서 놓았다 (또는 슬라이드를 완충액에서 2분 내지 18시간 보관하고 계속 염색할 수 있다).

12. 조직 절편을 (a) 아비딘 용액 (DAKO X0590)과 10분 동안 반응시켰다. 아비딘 용액을 씻어내고 조직 절편을 (b) 바이오틴 용액 (DAKO X0590)과 10분 동안 반응시켰다. 바이오틴 용액은 염색 절차의 첫 단계 실시 전에 세척하여야 한다.

13. 특이적 일차 항체를 각각의 슬라이드에 첨가하고 30분 동안 습윤 챔버에서 반응시켰다.

14. 슬라이드를 랙에 다시 놓고 랙을 PBS 배스에 2분 동안 담갔다. 과량의 PBS를 각각의 슬라이드로부터 건조시켰다. 연결용액 (DAKO LSAB + 키트, 바이오티닐 항-마우스, 항-토끼 및 항-염소)을 첨가하고 25분 동안 습윤 챔버에서 반응시켰다.

15. 슬라이드를 랙에 다시 놓고 핵을 PBS 배스에 2분 동안 담갔다.

16. 과량의 PBS를 각각의 슬라이드에서 건조시켰다. 스트렙타비딘-퍼옥시다아제-접합체를 첨가하고 25분 동안 습윤 챔버에서 반응시켰다.

17. 랙을 PBS 배스에서 2분 동안 담가두고 그 다음 슬라이드를 DAB 크로모젠 (chromogen) (DAKO K3468)과 반응시켰다. 슬라이드를 신선한 PBS에서 4분 동안 씻어 주었다.

18. 슬라이드를 건조시키고 헤마토크실린 (hematoxylin)으로 카운터염색되었다. 노트: 핵 항원의 경우 과량의 PBS를 슬라이드로부터 건조시키고 1% 큐프릭 설페이트를 5분 동안 처리한다. 슬라이드를 수돗물로 2분 동안 씻어주고 그 다음 0.2% 패스트 그린 (fast green)에 1초 또는 2초 동안 놓아 둔다.

19. 슬라이드를 일련의 알코올 용액으로 재수화하고 그 다음 크실렌 (xylene)으로 깨끗이 하고 커버슬립을 덮는다.

실시예 4: 다른 화학 조성물들의 비교

바람직한 조성물은 10% 폴리에틸렌 글리콜 300 (PEG) 및 90% 메탄올을 갖는 비수성 용액이다. 동일한 조직 표본에서 형태 및 RNA이 보존되기 때문에 형태학적 및 유전분석을 가능하게 하는 보존용 조성물의 필요성을 감안하여, 다양한 용액에 대하여 대기 온도에서 신선한 조직 및 고상 조직의 특성 모두를 보존할 수 있는 능력 및 미합중국 특허 제 6,207,408 호 및 통상적인 방법에 따른 조직처리와의 호환성을 평가하였다.

신선한 조직을 15분 동안 포르말린 (즉, 10% 포름알데하이드의 수성 완충액), 글루테르알데하이드, 또는 메타캄 (즉, 60% 메탄올, 30% 클로로포름 및 10% 아세트산)에 접촉시킨 후, RNA을 완전하게 분해하였다. 신선한 조직을 이소프로판올 (45%, 55% 또는 100%)에서 한 시간 동안 고정한 후, RNA을 부분적으로 분해였다. 아세톤 또는 에탄올에서 24시간 동안 고정된 신선한 조직은 RNA을 포함하였으나, 일치되는 결과를 생성하지는 않았다. 반면, 신선한 조직을 PEG 또는 메탄올과 접촉시키면, 대기 온도에 3 주까지 RNA가 분해되지 않았다.

10% PEG 및 90% 메탄올에 보존된 신선한 조직의 형태는 포르말린-고정된 조직과 동일한 질 (quality)이었다. 유사하게, 10% PEG 및 90% 메탄올에 보존된 신선한 조직으로 실시한 면역조직화학분석은 포르말린-고정된 조직과 동일한 질 (quality)이었다. 형태는 실온에서 최소 7일 동안 유지되었다. RNA는 대기 온도에서 3 주까지 보호되었다; RNA는 4℃에서 최소 3 주 동안 보호되었다; RNA는 37℃에서 최소 3 일 동안 보호되었다.

실온 (약 25℃)에서 RNA의 보존

보존 시간	15 분	1 시간	4 시간	8 시간	24시간	48시간	1 주	2 주	3 주
1	PEG	++	++	++	++	++	++	++	++	++
2	메탄올	++	++	++	++	++	++	++	++	++
3	에탄올*	++	++	++	++	++	++	++	++	++
4	아세톤*	++	++	++	++	++	++	++	++	++
5	크실렌	++	+	0	0	0	0	0	0	0
6	이소프로파놀	++	+	+	+	+	+	+	+	+
7	55% 이소프로파놀	++	0	0	0	0	0	0	0	0
8	40% 이소프로파놀	++	0	0	0	0	0	0	0	0
9	10% 포르말린	0	0	0	0	0	0	0	0	0
10	클로로포름	+	0	0	0	0	0	0	0	0
11	글루타르알데하이드	0	0	0	0	0	0	0	0	0
12	메타카른	0	0	0	0	0	0	0	0	0

++ 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드의 미분해

+ 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드 분해 및/또는 낮은 밴드 세기 (intensity)

0 밴드 없음

* 비일치된 결과, 조직의 수분함량에 기인하는 것으로 판단됨

세포 또는 조직의 보존을 위하여, 폴리에틸렌 글리콜 300 (PEG) 농도는 약 10% 내지 약 20%이며, 메탄올 (MeOH) 농도는 약 80% 내지 약 90%이다. 여기서, 조직 (예를 들어, 신장, 간, 피부 및 자궁)을 25℃에서 1시간 내지 7일 동안 상기 용액과 접촉시켰다. 통상의 조직 처리법 (미합중국 특허 제 6,207,408호에서처럼 프로그램된 TissueTek) 또는 미합중국 특허 제 6,207,408호에 따라 조직을 처리한 후 형태의 유지 (HISTO)를 측정하였으며; RNA (RNA)의 보호는 미합중국 특허 제 6,207,408호에 따라 조직을 처리한 후 측정하였다. 조직을 수동으로 처리하여 리보뉴클레아제 또는 다른 분해 효소로 오염되는 것을 방지하였다. 만족스러운 조직형태 (histomorphology)는 (+)로 부최적 (suboptimal)의 형태 (즉, 절편의 단편화, 비규칙적인 염료 염색, 면역조직화학의 다양성)는 (+/-)로 나타낸다. RNA 질은 ++, + 및 0으로 나타낸다 (표 1의 범례 참조).

PEG 및 메탄올의 다양한 농도 처리

보존 시간	1 시간	24 시간	72 시간	1 주
	PEG	MeOH	RNA	HISTO	RNA	HISTO	RNA	HISTO	RNA	HISTO
A	0	100	++	(+/-)	++	(+)	++	(+)	++	(+)
B	10	90	++	(+)	++	(+)	++	(+)	++	(+)
C	20	80	++	(+)	++	(+)	+	(+)	++	(+)
D	30	70	++	(+)	+	(+)	0	(+)	0	(+)
E	40	60	+	(+)	+	(+)	0	(+)	0	(+)
F	50	50	+	(+/-)	+	(+)	0	(+)	0	(+)

표 2 및 도 1은 10% PEG 및 90% 메탄올이 형태 및 RNA를 보존하는 조성물을 제공하는 것을 보여준다. 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드 사이의 비율 및 고분자량 mRNA의 스미어 (smear)는 추출된 RNA의 질을 확증하였다. 메탄올 단독 조성물은 RNA를 보존하였으나 장시간 동안의 100% 메탄올 접촉에 의한 조직 경화는 조직학적 분석의 장애가 되었다. 한편, 고농도의 PEG는 RNA을 보존하였으나 형태를 보존하지 못하였다. 그러나, 본 발명이 조성물은 조직의 형태 및 RNA 함량을 모두 보존하였다.

본 발명의 조성물에 의한 조직의 보존은 낮은 온도를 요구하지 않는다. 보존 및 보관이 대기 온도에서 가능하였다 (예를 들어, 약 25℃). 따라서, 조직 표본의 이송 및 보관 시에 냉장고 또는 냉동고를 필요로 하지 않는다.

실시예 5: RNAlater와의 비교

RNAlater (Ambion)은 Florell et al에 의하여 "병리학적 진단을 위한 조직의 온전한 상태 및 분자수준의 분석을 위한 RNA 모두를 보존하는 것"으로 알려져 있다(Mod. Pathol., 14: 116-128,2001). RNAlater의 화학적 조성은 본 발명과는 다르지만, 통상적인 조직 처리법 및 미합중국 특허 제 6,207,408호에 따른 조직 처리법을 사용하여 형태가 보존되는 지를 측정하였다,

마우스 간을 10% PEG 및 90% 메탄올 또는 RNAlater에서 48시간, 72 시간 또는 일주일 동안 보존하였다. 도 2는 10% PEG 및 90% 메탄올에서 반응시킨 조직은형태가 보존되나 RNAlater는 대기 온도에서 형태를 보존시키기 않는다는 것을 보여준다. 약 25℃에서 RNAlater에서 조직을 반응시키고 48시간 만에 핵막의 붕괴 및 핵 크로마틴의 농축이 일어났다. RNAlater에서의 장기간의 반응은 형태는 특성을 점진적으로 회손하였다. 그러나, 실온에서 10% PEG 및 90% 메탄올에서 조직의 보존은 최소 3 주간 형태적 특성을 일관되게 보존하였다.

실시예 6: 마우스 및 인간 조직 연구

마우스 및 인간 시료를 사용하였다. 초기 단계에서 마우스 간 조직을 사용하여 거대분자에 대한 UMFIX (즉, 10% 폴리에틸렌 글리콜 300 및 90% 메탄올)의 효과를 실험하였다. 마우스 간을 3 개월된 C57BL/6 암컷 마우스로부터 적출하였다. 약 50 ㎎ 정도 되는 큐브형태의 조직을 즉시 UMFIX 또는 10% 포스페이트 완충된 포르말린에 담갔다. 유사한 크기의 큐브를 액체질소로 동결하고 -75℃에서 보관하여 대조군 표본으로 사용하였다.

실험 말기에, 분자 분석 그리고 UMFIX의 조직형태학적, 조직화학적 및 면역조직화학적 특성에 대한 효과의 측정을 위하여 인간 조직을 사용하였다. 인간 조직 (예를 들어, 부신 피질, 유방, 결장, 눈, 식도, 신당, 간, 허파, 림프절, 골격근육, 췌장, 부갑상선, 이하 (parotid), 전립선, 피부, 소장, 비장, 갑상선, 편도선 및 자궁)을 마이애미 대학, Jackson 기념 의학 센터에서 외과수술 후 1 내지 30분 내에 수집하였다. 일차적으로 외과적으로 적출된 커다란 표본으로부터 대표적인 시료를 가져왔다. 주요 수술 검체를 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정하고 통상적인 기술을 사용하여 오버나잇으로 처리하였다. 대응하는 조직 (Parallel tissue) 블록을 UMFIX 및 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정하고, 조절된 RNase-프리 조건하에서 급속 처리 기술 (rapid processing technique)에 따라 처리하였다 (Morales et al. Arch. Pathol. Lab. Med. 126: 583-590,2002). 인접한 절편을 액체 질소로 동결하였다. 마우스 및 인간 조직을 UMFIX에서 4℃ 또는 대기 온도 (22℃)에서 1시간 내지 8 주 동안 보관하였다.

PCR, RT-PCR 및 실시간 PCR

PCR을 마우스 G3PDH 프라이머 ((Clontech, Palo Alto, CA), 0.5 ㎍의 RNase-처리 분리된 DNA 및 Qiagen Taq PCR Mastermix (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 실시하였다. 또는, 동일한 프라이머를 Qiagen Quantitect Cybergreen Mastermix 및 Bio-Rad (Hercules, CA)iCycler와 사용하였다. DNA의 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 15분; 35 사이클 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 2분; 그리고 72℃에서 7분 동안 홀드. 또한, 마우스 G3PDH 프라이머 (Biosource, Camarillo, CA)를 0.5 ㎍의 DNase-처리된 RNA와 실시간 RT-PCR을 위하여 사용하였으며, Bio-RadiCycler 상에서 Qiagen Quantitect Cybergreen Mastermix 또는 Qiagen Quantitect probe Mastermix을 사용하였다. PCR 조건은 30분 동안 50℃에서 초기 역전사, 95℃에서 20분 동안 Taq 활성, 95℃에서 15 초 및 60℃에서 1분의 40사이클이었다.

발현 프로파일

전체 RNA를 UMFIX-처리된 조직으로부터 처리 및 파라핀 포매 (embed) 전 그리고 후에 추출하고, 그 다음, 세포사멸 (apoptosis) 관련 유전자의 포르닐론에 기초한 cDNA 마이크로어레이 (HS-002-12, Superarray, Bethesda, MD)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.

X-레이 덴시토미터 결과를 Chemimager 5500 Gel Documentation System (AlphaInnotech, San Leandro, CA)로 얻었다. 데이터를 Genesis 소프트웨어(Genesis, Graz, Austria)로 분석하였다. 통계적 분석에 Statistica 소프트웨어 (StatSoft, Tulsa, OK)을 사용였다.

단백질 분리 및 검출 (웨스턴 블롯팅)

전체 단백질을 표준 프로토콜에 따라 추출하였다. 요컨대, 마우스 간 시료를 조직 ㎎당 20 ㎕의 T-PER 시약에 파쇄하였다 (Pierce Biotechnology, Rockford,IL). 단백질 농도를 우혈청 알부민 (BSA)를 사용하여 쿠마쉬 단백질 분석으로 측정하였다. 2D 겔을 위하여, 단백질 추출물을 ReadyPrep2-D Starter 키트의 지시 (Bio-Rad)에 따라 처리하였다. 요컨대, 11.0 ㎝ IPG (pH 3-10) 스트립 (strip)을 오버나잇으로 실온에서 250 ㎍의 단백질과 185 ㎕의 10 ㎖의 8M 요소, 2% CHAPS, 50 mM 디티오트레이톨 (0.2%w/v), Bio-LyteS)3/10 암포라이트 및 브로모페놀 블루를 포함하는 재수화 완충액에서 반응시켰다. 재수화된 스트립트를 Immunoelectrophoresis Focusing Chamber (Bio-Rad)에 이동시키고 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다 (5.3시간, 30,000 볼트/시간). 그 다음 스트립트를 10 분 동안 6 M 요소, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCI (pH 8.8), 20% 글리세롤 및 2%(w/v) DTT에서 평형화시킨 후, DTT 대신 아이도아세타미드를 넣은 동일한 완충액에서 10분 평형화시켰다. 스트립트를 11.0 ㎝ Criterion 겔에 올린 후 Criterion System (Bio-Rad)에서 65분 동안 일정한 200 V₁로 1X Tris/글리신/SDS 전개 완충액을 사용하여 전기영동하였다. 겔을 10% 메탄올 및 7% 아세트산으로 30분 동안 세척하고 오버나잇으로 Sypro-Ruby 단백질 염색으로 염색하였다 (Bio-Rad). 10% 메탄올 및 7% 아세트산에서 10분 동안 세척하고, 겔을 ddH₂O로 씻은 후 CCD 카메라를 갖춘 Chemimager 5500 Gel Documentation System (Alpha Innotech)으로 분석하였다. PDQuest software (Bio-Rad)를 사용하여 자동화된 스폿 매칭을 위하여 Tiff 이미지를 분석하였다. 또는, 단백질을 조직을 파쇄하여 단백질을 분리하고, 4.1 ㎖의 끊는 용해 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM 소디움 오르쏘바나에이트, 1 % SDS)을 15-20 초 동안 첨가하였다. 그 다음, 0.9 ㎖의 6X 전기영동 시료 완충액 (360 mM Tris pH 6.8, 600 mM DTT, 12% SDS, 60% 글리콜, 0.018% 브로모페놀 블루)을 첨가하고 혼합하였다. 시료를 가열 블록 (heat block)에서 95℃에서 30초 동안 다시 가열하였다.

웨스턴 블롯 트랜스퍼는 Becton Dickinson Powerblot Service로 실시하였다. 다양한 세포내 위치 및 다른 분자량을 갖는 단백질에 결합하는 항체의 활성에 기초하여 항체를 선택하였다. 카베올린 1, 카세인 키나아제 II 알파, 베타-카테닌, Bcl-2, 아답틴 베타, GDNFR-알파, PKC 알파, PAF53, NF-카파 B (p65), 포스포리파낭제 C 감마 (BD, Lexington, KY)에 대한 항체들이었다. 인산화에서 인산화된 단백질의 보존을 연구하기 위하여, 다섯가지 단백질을 선택하였다 (카베올린, ERKI, GSK-3 베타, p38 알파/ SAPK2a 및 Stat1).

상기 다섯가지 단백질의 본래의 상태 및 인산화된 상태에 대한 항체를 사용하였다. 또한, 다른 13 가지 항체를 대조군으로 처리하였다. 요컨대, 66 ㎍의 단백질을 4-15% 농도 구배 SDS-PAGE (Bio-Rad Criterion IPG Well Comb)의 각각의 웰 (well)에 로드하였다. 150 V에서 1.5 시간 겔을 전개시킨 후, Hoefer TE wet electrophoretic transfer apparatus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 사용하여 200 mA에서 2시간 동안 Immobilon-P 막으로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼 후에 막을 젤라틴 블록화 완충액에 1 시간 동안 담가두었다. 그 다음, 막을 따라 40 채널을 분리 (isolate) 하는 웨스턴 블롯 매니폴드 (manifold)로 막을 고정하였다. 각각의 채널에서, 일차 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.블롯을 매니폴드에서 제거하고 세척한 후, Alexa 680 fluorescent dye (Molecular Probes, Eugene, OR)에 접합된 2차 염소 항-마우스 임뮤노클로불린와 37℃에서 45 분간 반응시켰다. 막을 세척하고, 건조한 후, Odyssey Infrared Imaging System (LICOR,Lincoln, NE)을 사용하여 스캔하였다.

결과

동결된 조직 및 UMFIX-보관 조직으로부터 추출한 마우스 간 RNA의 양과 질은 비교될 만하였으나, 포르말린-고정 조직은 앞서 보았듯이, 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드가 부재가 나타내는 것처럼 상당한 RNA의 분해가 있었다. 포르말린-고정 조직으로부터 추출된 RNA가 상당히 분해되었으나, RT-PCR에 의한 소량을 증폭하는 데 사용될 수 있었다. 하지만, 신선한 마우스 간 또는 UMFIX에 1 또는 24 시간 노출된 간 조직으로부터의 RNA에 비교하여 포르말린에서 1 또는 24 시간 고정된 간 조직으로부터의 RNA는 보다 더 정량적 RT-PCR이 필요하였다. 조직으로부터의 DNA에서 본 바와 같이, RNA의 질 (quality)은 UMFIX에 장기간 노출되어도 크게 변하지 않았으나, 프로말린에 의한 장기간의 고정에 의하여 달라졌다. UMFIX에서 하루 후에, 고분자량 RNA를 25/35 시료로부터 추출하였다. 2 내지 7일 (19/22 시료) 및 8 내지 30 일 (16/18 시료) 후에도 유사한 결과를 얻었다.

조절되는 RNase-프리 조건에서 급속 처리 기술에 의하여 경화되고 주입되고 파라핀에 포매 (embed)된 UMFIX-보존 간 조직은 신선한 채로 동결된 조직에 비교할 만하게 온전한 RNA를 제공하였다. 아가로스 겔 전기영동에서 28S 및 18S 리보조말 RNA 밴드 사이의 비율 관찰 및 정량을 위한 Agilent RNA 6000 나노칩을 사용은 이를 확증하였다. 또한, 인간 조직 (예를 들어, 뇌 전이성 암종)을 UMFIX에 노출시키고, 급속 처리 기술로 처리하고 파라핀에 포매시키는 것은 실온에서 하루, 4주 및 8주 보관 후에 분해되지 않은 RNA를 제공하였다. 신선한 시료 및 실온에서 하루, 4주 및 8주 보관한 UMFIX-보존되고 파라민-포매된 조직으로부터 추출한 RNA의 발현 프로파일 (profiling)은 비교할 만한 94 세포사멸 관련 유전자들에 대한 패턴 및 세기를 나타내었다.

cDAN 마이크로어레이를 사용하여 측정한 발현 수준은 8주까지의 처리과정의 다양한 시점에서 유사하였다 (Pearson 계수 r > 0. 85, p < 0.05). 결과간의 소차는 조직의 이종성 (heterogeneity)에서 기인한다.

한 시간 동안 UMFIX에 보존된 마우스 간은 신선한 시료에서 얻은 결과와 동일한 단백질 스폿의 2차원 겔 패턴을 보여주었다. UMFIX-보존된 시료에서 관찰된 뚜렷한 스폿과는 대조적으로 포르말린-고정 조직으로부터 추출한 단백질은 어떠한 뚜렷한 스폿 없이 스미어(smear)을 만들었다.

또한, 매칭 기준을 낮게 함에도 불구하고 신선한 시료 및 포르말린-노출된 시료 사이에서는 PDQuest 소프트웨어에 의하여 유사성이 관찰되지 않았다. PDQuest 소프트웨어에 의한 겔 상의 스폿의 수 및 위치 측정은 UMFIX 시료 및 신선한 조직의 단백질 추출물 사이에 상당한 상동성을 보여주었다. 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)에서도 동일한 결과가 관찰되었다; 신선한 시료 및 UMFIX 보존된 시료에서는 뚜렷한 밴드가 관찰되었고, 포르말린-고정 시료는 불명확한 얼룩을 만들었다.

유사하게, PAGE로부터의 웨스턴 블롯은 UMFIX 보존된 시료는 포르말린-고정시료에 비하여 매우 뚜렷한 밴드를 보여주었다. 항체는 분자량 및 세포위치에 기초하여 선택하였다. 10 종의 테스트 항체 및 12 종의 대조 항체 모두를 UMFIX에서 1 시간 고정된 시료와 반응시켰다: 이 항체 중 20 종은 24 시간까지 고정된 시료에서 뚜렷이 검출할 수 있는 밴드를 제공하였다. 이와 대조적으로, 포르말린 고정된 시료에서 단지 6종의 항체만이 반응하였으며, 세기도 상당히 낮았다.

인산화 연구에서 선택된 5 단백질 중에서, 웨스턴 블롯의 결과는 신선한 시료 및 한 시간 동안 UMFIX-보존된 시료 사이에는 유사하였다. 단백질 중 둘은 24시간 고정 후에 소실되었다. 포르말린-고정된 시료에서, 하나의 본래의 시료 및 하나의 인산화된 시료만이 한 시간 내에서 검출되었고, 24시간 처리된 시료에서는 결과를 얻지 못하였다.

청구항의 의미 및 이의 법적 등가물의 범위 내에 해당하는 모든 변형 및 치환은 본 발명의 범위에 포함된다. 용어 "포함하는 (comprising)"을 사용하는 청구항은 다른 요소의 포함도 청구항의 범위 내이도록 한다; 본 발명은 용어 "포함하는" 대신에 용어 "필수적으로 구성되는 (consisting essentially)" (즉, 다른 요소가 본 발명의 작용에 물질적으로 영향을 미치지 않는 다면, 다른 요소의 포함이 청구항의 범위 내이도록 한다) 및 용어 "구성되는 (consisting)" (즉, 본 발명과 일반적으로 연관된 불순물 또는 중요하지 않은 활성은 아니고 청구항에 나열된 요소만을 의미한다. 상기 3가지 용어 모두는 본 발명을 청구하기 위하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서 기재된 구성요소는 청구항에서 명시되어 있지 않으면, 청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 청구항은 허여되는 법적 보호범위를 결정하는 기초이며, 청구항을 설명하는 명세서로부터 제한되지 않는다.

더욱이, 특정한 관계가 청구항에서 명시되어 있지 않으면, 청구항 사이에는 특정한 관계가 없는 것을 의미한다 (예를 들어, 생성물에서 구성요소의 배열 또는 방법 청구항에서 단계의 순서는 그렇게 명시되어 있지 않으면 그 청구항을 제한하는 것이 아니다). 본 명세서에서 개시된 개개 요소의 모든 가능한 조합 및 교환은 본 발명에 해당하는 것으로 해석된다: 유사하게, 본 발명의 기재의 일반화는 본 발명의 일부인 것으로 해석된다.

상술한 것으로부터, 본 발명의 사상 또는 필수적인 특징으로부터 벗어남이 없이 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있다는 것은 당업자에게 명확하다. 기재된 구현예는 제한이 아닌 예시를 위한 것으로 해석되어야 하며, 이는 본 발명의 법적 보호 범위는 본 명세서가 아닌 첨부된 청구항에 의하여 나타내어지기 때문이다.

Claims (15)

1. 5-20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 80-95% 메탄올을 포함하는 비수성 용액인 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 비수성 용액은 10-15% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 85-90% 메탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 비수성 용액은 약 10% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 약 90% 메탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 비수성 용액은 약 10% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 약 90% 메탄올로 필수적으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 비수성 용액은 약 10% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 약 90% 메탄올로 구성된 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 600 달톤 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 400 달톤 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관용 조성물.
8. 최소한 세포 또는 조직의 보존 및/또는 보관을 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
9. PEG 및 메탄올을 혼합하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하고 최소한 세포 또는 조직을 홀드 (hold)하도록 하는 세포 또는 조직의 홀더 (holder).
11. 최소한 세포 또는 조직을 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 보존 방법.
12. 최소한 부분적으로 보존된 세포 또는 조직을 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 보관 방법.
13. 제 11 항 또는 제 12 항의 방법에 최소한 일부의 세포 또는 조직으로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 13 항 또는 제 14 항의 방법에 의하여 분리된 핵산.