JP2010168386A - 細胞および組織のrnaおよび形態の保存 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】約10%ポリエチレングリコールおよび90%メタノールを含有する保存溶液。この溶液中に保存されたおよび/または貯蔵された組織は、様々な方法により、化学染色および/または抗体結合を含む、細胞学または組織学のために処理を行うことができ;抗原、DNA、およびRNAは、処理された組織から、多収量でかつ最小限の分解もしくは分解を伴わずに得ることができる。この溶液の利点は以下を含む:経済性および安全性、永久保管用材料への容易なアクセス、ならびに細胞分析および遺伝的分析の両方との適合性。
【選択図】なし
Description
本出願は、その内容が本明細書に参照として組入れられる、2002年5月10日に出願された、仮出願第60/379,015号の恩典を請求するものである。
1.発明の技術分野
本発明は、特に周囲温度で細胞または組織の保存するための、ポリエチレングリコール(PEG)およびメタノールを含有する組成物に関する。これは、細胞または組織の貯蔵に使用することもできる。本発明の組成物により保存されたおよび/またはその中に貯蔵された細胞または組織は、冷蔵または凍結を必要とせずに、その形態学的特徴、同系の(cognate)抗体によるその抗原の認識、およびその核酸(例えば、DNAおよびRNA)の完全性を維持する。
細胞学的および組織学的処理によって、細胞および組織はそれぞれ生体からの摘出後に、それらの自己融解を妨害される。更に、個々の細胞の構造および組織内のそれらの構成は、このような処理により安定化される。しかし、臨床状況において細胞および組織を処理するためにはほとんどの場合において洗練された手法および専用の器具が必要である。従って、標本は通常、医師の診療所または手術の状況において採集され、中央の病理検査室に輸送される。細胞または組織の保存および/または貯蔵のための適当な組成物は、自己融解が防止されること、ならびに細胞の形態、抗原、および核酸が処理がおこなわれるまで維持されることを確実にすることが必要である。
本明細書に説明された組成物は、それらの化学的単純性、組織の形態学的および遺伝的特徴を保存する能力、ならびに周囲温度利用の簡便性および実践性のために開発された。細胞または組織は、そこで貯蔵することができ、ならびに細胞学、組織学、および/または遺伝的分析のための記録保存用給源として利用することができる。これは、前向き研究または後ろ向き研究のために保存および/または貯蔵されてもよい。好ましくはないが、本発明の組成物中の貯蔵は、他の保存剤および/または固定液と細胞または組織を接触した後であってもよい。
固定は、組織標本の硬化で開始し、ならびに蛋白質を安定化しおよび分解を停止することにより、形態を保存する。化学的固定を伴わないならば、内在性酵素は、細胞を異化代謝および融解し、ならびに組織の形態は変更されるであろう。固定が不十分であるという表れは以下を含む:組織構造の解離、組織切片中の泡/孔、不良で不規則な染色、縮んだ細胞、細胞質の凝塊、核クロマチンの凝縮および不明瞭さ、ならびに赤血球の自己融解/溶血。長期曝露は、組織を壊れやすく縮んだものにするため、アセトンによる固定は、通常数時間ではなく数分で実現される。ホルマリンによる固定とは対照的に、ケトンおよびアルコールは、それらとの化学的反応を伴わない凝固または沈殿により蛋白質を物理的に安定化することで組織を固定すると考えられる(例えば、アルデヒドが媒介した反応基を架橋)。
ヘマトキシリンエオシン染色は、一般に細胞学および組織学のために使用され、ならびにこれは、病理学者による比較の標準として使用することもできる。しかし他の色素および染色を使用してもよい。組織に内在する、または抗体および他の親和性結合剤のための標識として使用される酵素は、基質の適切な選択により原位置で局在化され得る。この酵素および基質は反応し、検出可能な生成物を形成する。
DNAは、様々な溶液(例えば、10%ポリエチレングリコール300および90%メタノール)中に保存した後、AquaPure Genomic DNA単離キット(Bio-Rad Laboratories社)を用い、下記のように組織切片から抽出した:
新鮮なミンチしたマウスの肝臓組織または10%PEG/90%メタノール中に保存された同じ組織20mgを、300μ溶解液が入った1.5mlの微量遠心管中に入れた。このライゼートへ、プロテイナーゼK溶液(20mg/ml)1.5μlを添加し、および倒置混合した後、一晩55℃でインキュベーションした。このライゼートに、RNAse A溶液(4mg/ml)1.5μlを添加し、穏やかに攪拌し、および37℃で60分間インキュベーションした。試料を、室温に冷却し、および蛋白質沈殿溶液100μlを添加した。試料を、20秒間激しく攪拌し、その後16000gで3分間遠心した。DNAを含有する上清を、新たなチューブに移し、100%イソプロパノール300μlで沈殿させた。試料を混合し、および16000gで1分間遠心した。DNAペレットを、70%エタノールで洗浄し、引き続き15分間風乾した。DNAを、DNA水和溶液100μlに溶解し、濃度をUV分光計により決定した。
1. 保存された組織は、新鮮な組織と類似量のDNAを提供した。
2. 組織がホルマリン中に保存された場合、新鮮な組織または10%PEG/90%メタノール中に保存された組織と比べ、約30%未満のDNAが抽出された。
3. 10%PEG/90%メタノール中に保存された組織から抽出されたゲノムDNAを、通常の制限酵素で消化し、およびこれは新鮮な組織またはホルマリン固定した組織由来のDNAと同等の量であった。
RNAは、様々な溶液(例えば、10%ポリエチレングリコール300および90%メタノール)中に保存した後、Trizol RNA単離キット(Gibco BRL社)を用い、下記のように組織切片から抽出した:
新鮮な組織または10%PEG/90%メタノール中に保存された同じ組織50mgを、約1mlのTrizol試薬中に配置し、およびポリトロンホモジナイザーを用いて粉砕した。試料を、室温で5分間インキュベーションし、およびクロロホルム0.2mlを添加し、その後15秒間手で混ぜ合わせた。試料を、12000gで15分間5℃で遠心した。水相を除去し、およびイソプロピルアルコール0.5mlを用いて沈殿した。室温で10分間インキュベーションした後、試料を5℃に冷却し、12000gで10分間遠心した。RNAペレットを、70%エタノールで洗浄し、15分間風乾し、およびリボヌクレアーゼ非含有H2Oの100μl中に溶解した。抽出したRNA量を、UV分光光度計により決定した。その量は、変性アガロースゲル上でのRNAの分離により評価し、28Sおよび18SリボソームRNAバンドの強度を比較した。
米国特許第6,207,408号に開示されているように、新鮮な組織を処理した後、組織切片に対し免疫組織化学法を行うことができる。比較のために、様々な溶液(例えば、10%ポリエチレングリコール300および90%メタノール)中で保存し、その後米国特許第6,207,408号に従い処理した後、免疫組織化学法を行った。結果を、通常の方法で処理された保存された組織と比較した。
1.パラフィン切片を3ミクロンに切削した。
2.スライドを58℃の炉(または好ましくは37℃の炉)中に30分間放置することにより、パラフィンを溶融した。
3.スライドをキシレンで10分間脱ワックスした。
4.スライドを、漸減するエタノール溶液(すなわち、無水のふたつのバス、95%のふたつのバス、および90%ひとつのバス)により、各々1分間再水和した。
5.内因性ペルオキシダーゼを、6%過酸化水素水(H2O2)溶液で10分間ブロックした。
6.スライドを、1分間水道水中に沈め洗浄した。
7.スライドラックを、1分間PBSバス中に沈め放置した。
8.緑色染色皿中の標的検索(DAKO S1699)20mlと、180ml dH2Oの添加により、標的検索(TR)を調製した。スチーマーにdH2Oを添加し、スチームのスイッチを入れた。標的検索液を含有する染色皿をスチーマーの内側に配置し、およびこれを30分間加熱した。TR溶液は、90℃に加熱しなければならない。
9.スチーマーから染色皿を取り出し、スライドを皿の内側に配置し(手袋使用)、および20分間スチームを通した。
10.スチームを通した後、スライドを同じコンテナ内で30分間冷ました。
11.スライドを、PBS緩衝液中に、室温で配置した(あるいは、スライドを、この緩衝液中に、2分間〜18時間貯蔵し、その後染色を継続した。)。
12.組織切片を、(a)アビジン溶液(DAKO X0590)と10分間インキュベーションした。その後アビジン溶液を、洗浄除去し、および組織切片を、(b)ビオチン溶液(DAKO X0590)と10分間インキュベーションした。ビオチン溶液を洗浄除去し、その後染色法の第一工程を適用した。
13.特異的一次抗体を、各スライドに添加し、次に高湿チャンバーにおいて30分間インキュベーションした。
14.スライドを、ラックに戻し、ラックをPBSバスに2分間沈めた。過剰なPBSを、各スライドから乾燥除去した。架橋溶液(DAKO LSAB+Kit、ビオチン化した抗マウス、抗ウサギおよび抗ヤギ)を添加し、および高湿チャンバーにおいて25分間インキュベーションした。
15.スライドを、ラックに戻し、ラックをPBSバスに2分間沈めた。
16.過剰なPBSを、各スライドから乾燥除去した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体を添加し、および高湿チャンバーにおいて25分間インキュベーションした。
17.ラックをPBSバスに2分間沈め、その後スライドを、DAB色素原(DAKO K3468)と反応させた。これらのスライドを、新たなPBSで4分間洗浄した。
18.スライドを乾燥し、ヘマトキシリンで対比染色した。注意:核抗原については、過剰なPBSをスライドから乾燥除去し、および1%硫酸第二銅を5分間塗布した。スライドを、水道水で2分間洗浄し、その後0.2%ファストグリーン中に1、2秒間置いた。
19.スライドを、一連のアルコール溶液により脱水し、その後キシレンで透明とし、カバースライドを置いた。
好ましい組成物は、10%ポリエチレングリコール300(PEG)および90%メタノールの非水溶液である。形態およびRNAは同じ組織標本において保存されるので、形態学的分析および遺伝的分析の両方に順応可能である保存用組成物が必要と仮定し、様々な溶液を、新鮮な、固形組織の特徴、および米国特許第6,207,408号および通常の方法に従う組織処理とのそれらの適合性の両方について、周囲温度で保存するそれらの能力について評価した。
++ 28Sおよび18SリボソームRNAバンドの分解なし
+ 28Sおよび18SリボソームRNAバンドの分解および/またはより低いバンド強度
0 バンド無し
* 恐らく組織内の水含有のための、一致しない結果
RNAlater(Ambion社)は、Florellらにより「病理学診断のための組織の完全性、および分子分析のためのRNAの両方」を保存するものとして説明されている(Mod. Pathol.、14:116-128(2001))。RNAlaterの化学組成は、本発明とは異なるが、通常の組織処理または米国特許第6,207,408号に従う組織処理を用い、形態が保存されたかどうかを決定した。
マウスおよびヒトの両試料を、本試験に使用した。初期相において、マウス肝臓組織を用い、UMFIX(すなわち、10%ポリエチレングリコール300および90%メタノール)の巨大分子に対する作用を決定した。マウス肝臓は、3ヶ月齢のC57BL/6雌のマウスから摘出した。質量約50mgの組織キューブを、直ちにUMFIXまたは10%リン酸緩衝したホルマリンに浸した。同様のサイズのキューブを、液体窒素で瞬間凍結し、-75℃で対照標本として使用するために保存した。
PCRは、マウスG3PDHプライマー(Clontech社、パロアルト、CA)を用い、0.5μgのRNase処理した単離されたDNAおよびQiagen Taq PCR Mastermix(Qiagen社、バレンシア、CA)を使用し行った。あるいは、同じプライマーを、Qiagen社Quantitect Cybergreen MastermixおよびBio-Rad社(ヘラキュレス、CA)のiCyclerと共に使用した。DNAのPCR条件は、以下であった:95℃で15分間;94℃で45秒、60℃で45秒、72℃で2分間を35サイクル;および、72℃で7分間維持。更に、マウスG3PDHプライマー(Biosource社、カマリロ、CA)を、0.5μgのDNase処理したRNAと共に、実時間RT-PCRで、Qiagen社Quantitect Cybergreen MastermixまたはQiagen社Quantitect Probe Mastermixを、Bio-Rad社iCycler上で使用した。PCR条件は、50℃で30分間の最初の逆転写、それに続く95℃で20分間のTaq活性化、それに続く95℃ 15秒、60℃ 1分間の40サイクルであった。
総RNAは、UMFIX処理した組織から処理およびパラフィン包埋の前後に抽出し、その後アポトーシス関連遺伝子のナイロンベースのcDNAマイクロアレイ(HS-002-12、Superarray社、ベセスダ、MD)について製造業者の指示に従い使用した。X線濃度計測の結果は、Chemimager 5500 Gel Documentation System(Alpha Innotech社、サンレンドロ、CA)により得た。データは、Genesisソフトウェア(Genesis社、グラツ、オーストリア)を用い解析した。統計解析は、Statisticaソフトウェア(StatSoft社、タルサ、OK)を使って行った。
総タンパク質を、標準プロトコールを用い抽出した。簡単に述べると、マウス肝臓の試料を、組織1mgにつき20μlのT-PER試薬(Pierce Biotechnology社、ロックフォード、IL)中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用するクマーシータンパク質アッセイ(Bio-Rad社)を用い測定した。2Dゲルのために、タンパク質抽出物を、ReadyPrep(商標)2-Dスターターキット(Blo-Rad社)の指示に従い使用した。簡単に述べると、11.0cm IPG(pH3〜10)ストリップを、一晩室温で、8M尿素、2%CHAPS、50mMジチオスレイトール(0.2%w/v)、BioLyte(登録商標)3/10アンホライト、およびブロモフェノールブルーの10mlを含有する再水和緩衝液185μl中の、タンパク質250μgと共にインキュベーションした。その後再水和したストリップを、Immunoelectrophoresis Focusing Chamber(Bio-Rad社)に移し、製造業者の推奨するプロトコール(30,000V/時間で5.3時間)に従い流した。次にストリップを6M尿素、2%SDS、0.375M Tris-HCl(pH8.8)、20%グリセロール、および2%(w/v)DTTの混合液中で10分間平衡化し、その後DTTを含まないが、ヨウ化アセトアミドを添加した同じ緩衝液において10分間平衡化した。次にこれらのストリップを、11.0cmのCriterion Gels上に載せ、1X Tris/グリシン/SDS泳動緩衝液を用い、Criterion System(Bio-Rad社)において200V1定圧で65分間電気泳動を行った。その後ゲルを、10%メタノールおよび7%酢酸で30分間洗浄し、Sypro-Rubyタンパク質染色(Bio-Rad社)で一晩染色した。10%メタノールおよび7%酢酸で10分間洗浄した後、ゲルを、ddH2Oですすぎ、CCDカメラを装着した、Chemimager 5500 Gel Documentation System(Alpha Innotech社)を用い分析した。Tiff画像を、PDQuestソフトウェア(Bio-Rad社)を用い、自動化されたスポット合わせについて解析した。あるいは、組織をホモジナイズし、および沸騰している溶解緩衝液(10mM Tris、pH7.4、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%SDS)4.1mlの15〜20秒間の添加により、タンパク質を単離した。次に6X電気泳動試料用緩衝液(360mM Tris、pH6.8、600mM DTT、12%SDS、60%グリセロール、0.018%ブロモフェノールブルー)0.9mlを添加し、よく混合した。試料を、再度95℃で30秒間ヒートブロックにおいて加熱した。
凍結したおよびUMFIX保存した組織から抽出したマウス肝臓RNAの性質および量は同等である一方で、ホルマリン固定した組織は、先に示した、28Sおよび18SリボソームRNAバンドの非存在により示されるような、著しく分解されたRNAを生じた。ホルマリン固定した組織から抽出したRNAは著しく分解されたが、これを、RT-PCRにより少量の生成物を増幅するために使用した。しかし新鮮なマウス肝臓またはUMFIXに1または24時間曝された肝臓組織からのRNAと比較し、ホルマリン中に1または24時間固定された肝臓組織由来の有意に多いRNAが、定量的RT-PCRに必要であった。組織から抽出したDNAで示されたように、RNAの質は、UMFIXに対するより長期曝露により実質的に異ならなかったが、ホルマリンによる長期固定については顕著に異なった。UMFIX中で1日後、高分子量RNAを、25/35試料から抽出した。同様の成功が、2〜7日(19/22試料)および8〜30日(16/18試料)で達成された。
Claims (15)
- 5〜20%ポリエチレングリコール(PEG)および80〜95%メタノールを含む非水溶液である、細胞または組織の保存および/または貯蔵のための組成物。
- 非水溶液が、10〜15%ポリエチレングリコール(PEG)および85〜90%メタノールを含む、請求項1記載の組成物。
- 非水溶液が、約10%ポリエチレングリコール(PEG)および約90%メタノールを含む、請求項1記載の組成物。
- 非水溶液が、約10%ポリエチレングリコール(PEG)および約90%メタノールから実質的になる、請求項1記載の組成物。
- 非水溶液が、約10%ポリエチレングリコール(PEG)および約90%メタノールからなる、請求項1記載の組成物。
- PEGが、分子量600ダルトン未満である、請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
- PEGが、分子量400ダルトンまたはそれよりも小さい、請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
- 少なくとも細胞または組織を保存および/または貯蔵するための、請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物の使用。
- PEGおよびメタノールを混合することを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物の製造法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物を含有し、および少なくとも細胞または組織を保持するように適合された、細胞または組織のホルダー。
- 少なくとも細胞または組織が、請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物と接触することを含む、細胞または組織を保存する方法。
- 少なくとも部分的に保存された細胞または組織が、請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物と接触することを含む、細胞または組織を貯蔵する方法。
- 細胞または組織の少なくとも一部から核酸を抽出することをさらに含む、請求項11または12記載の方法。
- 核酸がRNAである、請求項13記載の方法。
- 請求項13または14記載の方法により単離された核酸。
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