KR20090079251A

KR20090079251A - 조직 보존 및 고정 방법

Info

Publication number: KR20090079251A
Application number: KR1020097010845A
Authority: KR
Inventors: 랜스 에이. 리오타; 엠마누엘 에프. 페트리코인; 데이비드 게호; 버지니아 에이. 에스피나
Original assignee: 조지 매이슨 인털렉춸 프로퍼티즈, 인코퍼레이티드
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2009-07-21
Also published as: US20100068690A1; US8460859B2; CA2667790C; CA2667790A1; AU2007332924A1; EP2104420A2; WO2008073187A3; US9029076B2; WO2008073187A2; JP2010515012A; US20130345075A1

Abstract

본 발명은, 예를 들어, 실온에서 인단백질을 포함하는 샘플과 접촉시, 세포 인단백질을 고정 및 안정화시킬 수 있고, 세포 형태를 보존할 수 있고, 샘플이 동결되어 분자 분석에 적합한 크라이오스태트(cryostat) 동결 섹션을 생성시키는 것을 가능케 할 수 있는 조성물과 관련이 있다. 조성물은, (1) 인단백질을 고정시키는데 효과적이고, 안정화제 및/또는 투과성 증강제가 가용성이 되기에 충분한 수분 함량을 지니는 고정제; (2) (a) 키나아제 억제제 및 (b) 포스파타아제 억제제, 및 임의로 (c) 프로테아제(예를 들어, 단백분해효소) 억제제를 포함하는 안정화제; (3) 투과성 증강제(예를 들어, PEG)를 포함한다. 상기 조성물을 이용하여 인단백질을 보존하는 방법이 기재되어 있다. 번역 후, 예를 들어, 피검체로부터의 세포 또는 조직의 분리 후 변형(예를 들어, 인산화)의 손실을 포함하는 단백질 분해를 모니터하기 위한 내인성 대용 마커; 및 세포 또는 조직 집단 샘플의 가공 내역을 평가하는 것을 가능케 하는 외인성 분자 센티넬(sentinel)(예를 들어, 자성 나노입자에 부착된 인단백질)이 또한 기재되어 있다.

Description

조직 보존 및 고정 방법{TISSUE PRESERVATION AND FIXATION METHOD}

본 출원은 2006년 10월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 제60/855,120호, 및 2006년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 제60/861,086호를 우선권으로 주장하며, 상기 둘 모두의 가출원은 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

인단백질 분자 프로파일링(profiling)은 최근 생겨난 개별화된 암 치료 분야의 중요한 구성요소이다. 분자적으로 표적화된 항암 치료는 흔히 결함이 있는 키나아제 신호전달 네트워크의 완화 또는 조절을 포함한다. 종양 내의 혼란된 신호전달 세트워크의 설명은 분자 표적 암 치료를 개별화시키고 치료 개재(intervention)를 위한 완전히 신규한 표적을 확인하는 수단으로서 큰 가망성을 제공한다. 유전자 마이크로어레이(핵산 분석)을 이용한 분자 시그너처(signature)/전사 연구로부터의 결과는 각각의 환자의 종양이 독특한 유전적 초상(genetic portrait)을 지니는 것을 암시한다. 그러나, 유전자 마이크로어레이는 체세포 유전 분류에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있으나, 이들은 단백질 수준에서 발생하는 번역후 및 변동 신호전달 분자 네트워크 사건에서 구현되는 약물 표적 자체의 효과적인 발생 반복(recapitulation)을 제공할 수 없다. 키나아제에 의해 유도된 신호 네트워크의 인산화 또는 활성화 상태는 질병 발병기전 및 키나아제-관련 치료 표적의 진행 상태 둘 모두와 관련된 중요한 정보를 함유한다. 이러한 이유로 인해, 진행 세포 키나아제 활성의 조절은 신규한 약물 발견에서 가장 급속하게 성장하는 배경 중 하나이다. 특정 인단백질 신호전달 이상의 확인은, 예를 들어, 폐암, 유방암, 결장암 또는 기타 암에 걸린 환자에 대한 표적화된 치료의 개발에 사용될 수 있다. 인간 종양 생검 표본을 이용하여 종양 인단백체(phosphoproteome)를 프로파일링하는 것은 개별화된 암 치료의 다가오는 지각되는 변혁의 중요한 구성요소이다.

단백체 분자 프로파일링은 종양학의 실시를 변화시키는 큰 가망성을 제공하나, 조직에 적용되는 진단 분석으로부터 수득된 데이터의 정확도는 모니터되고 보장되어야 하며; 그렇지 않은 경우, 임상적 결정이 부정확한 분자 데이터에 기초할 수 있다. 현재까지, 임상 보존 실시는 통상적으로 조직학적 검사를 위한 표본을 보존하도록 디자인된 포르말린 고정과 같은 수십년된 오래된 프로토콜에 의존하고 있다. 조직은 일반적으로, a) 병원 기반의 수술실에서의 수술, b) 외래환자 병원에서 수행된 생검, 및 c) 방사선 슈트(radiologic suit)에서 수행된 영상 특이적 바늘 생검 또는 바늘 흡입물의 3개의 주요 환경에서의 병리학적 검사에 의해 획득된다. 현재, 조직은 일반적으로 단백체 연구를 수행하기 위해 급속-동결(snap-frozen)된다. 분주한 임상 환경의 현실 세계에서는, 액체 질소 중에 획득된 조직을 즉시 보존시키는 것이 불가능할 수 있다. 또한, 병리학적 검사 및 분자 분석을 위한 환자의 절제로부터의 시간 지연은 종종 기록되지 않으며, 날짜의 시간, 절차의 강도 및 동반하는 환자의 수에 따라 30분 내지 수시간으로 다양할 수 있다.

도 1은 조직 획득(예를 들어, 인간 조직으로부터 획득)을 위한 안정성 간격을 규정하는 다양한 시간 기간의 2개의 부류를 도시한다. 시점 A는 조직이 환자로부터 절제되고, 분석 및 가공을 위해 생체외에서 이용가능하게 되는 순간으로 정의된다. 절제후 지연 시간(또는 EDT(excision delay time))은 시점 A로부터 본원에서 시점 B로 언급되는, 표본이 안정화된 상태로 배치되는, 예를 들어, 표본이 고정제(fixative) 중에 침지되거나 액체 질소 중에서 급속-동결되는 시간이다. EDT 동안 환자 간호 환경이 복잡한 경우, 조직은 수술실 또는 병리학자의 도마(cutting board)에서 실온에서 존재할 수 있거나, 이는 표본 용기에 냉각될 수 있다. 두번째의 가변 시간 기간은 가공 지연 시간(또는 PDT(processing delay time))이다. 이러한 간격의 시작시, 조직은 보존성 조성물에 침지되거나, 동결기에 저장된다. 이러한 간격의 종료 시인 시점 C에서, 조직은 분자 분석을 위해 가공된다. 상기 두 시간 간격의 길이와 관련된 불확실성에 더하여, 공지된 변수 및 공지되지 않은 변수의 숙주가 상기 시점 기간 동안 조직 분자의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이는, 1) 고정 또는 동결 전의 온도 변동, 2) 보존제의 화학 물질 및 조직 투과 속도, 3) 조직 표본의 크기, 4) 조직의 처리, 절단 및 분쇄 정도, 5) 미세절제(microdissection) 전의 고정 및 염색, 6) 조직 수화 및 탈수, 및 7) 임의의 시점에서의 환경으로부터의 포스파타아제 또는 단백분해효소(proteinase)의 도입을 포함한다.

번역후 변형된 단백질, 예를 들어, 인단백질(신체 추출 약 4시간 이내)을 포함하는 단백질을 수집하고 보존(고정 및 안정화)하기 위한 방법, 및 EDT 및 PDT 기간 동안 단백질의 상태(예를 들어, 인산화 상태)를 모니터하기 위한 방법이 필요하다.

도 1은 인간 조직 획득에 대한 안정성 간격을 규정하는 다양한 시간 기간을 도시한다.

도 2는 보존 전의 획득 후 조직의 단백질 안정성 시간 경과를 도시한다. 숫자는 절제 시점에서 동결된 조직에서의 동일한 인단백질의 수준인 기준선에 비한 시간에 따른 인단백질에서의 변화 또는 변동을 나타낸다. 시간 0의 기준선을 획득하기 위한 동결을 동결 섹션을 절단하기 위한 통상적인 과정인 액체 질소에서의 급속 동결 또는 OCT 동결보호제 젤에서의 동결에 의해 수행하였다. 각각의 연속 시점에서의 조직 샘플의 동결은 실온에서 살아 있는 상태에서 유지되도록 허용된 조직에 비해, 조직에서 발생하는 임의의 변화를 억제하였다. 조직 샘플의 나머지를 추가의 보존 없이 다양한 총계의 시간 동안 실온에서 방치되도록 하였다. 본 도면은 보존되지 않은 시간 경과로부터의 값을 절제후 즉시 보존된 샘플의 값에 비교하는 시간 경과를 도시한다. 평가된 엔드포인트(end point)는 생존전, 아폽토시스, 및 전사 조절 단백질/인단백질이었다.

도 3은 절제후 지연 시간 연구를 도시한다. 1개의 자궁 절제물을 25개의 조각으로 나누었다. 조각을 4℃ 또는 실온에서 개방된 페트리 접시(Petri dish)에서 인큐베이션되도록 하였다. 90분의 과정 후, 조각을 약 15분의 간격으로 분리하고, 역상 단백질 마이크로어레이(RPMA)에 의해 10개의 상이한 엔드포인트에 대해 분석하였다. 도 3A는 4℃에서의 시간 경과를 도시한다. 도 3B는 실온에서의 시간 경과를 도시한다. 시간에 걸쳐 양성 및 음성 둘 모두의 가장 큰 변동을 나타낸 프로-생존(pro-survival) 및 아폽토시스 경로에서 선택된 인산화된 단백질이 예시적인 후보 대용 마커(surrogate marker)를 이룬다.

도 4는 인단백질 보존의 평가를 위한 세포 샘플에 적용된 화학적 안정화제를 도시한다. 미세침 흡입(Fine Needle Aspirate, FNA) 샘플을 화학 제품/화학 용액의 각각에 4℃에서 24시간 동안 저장하였다. 역상 단백질 마이크로어레이 분석을 위해 세포 샘플을 추가로 가공하였다. 도 4A는 샘플을 다양한 화학 용액에서 인큐베이션한 후 샘플당 인산화된 단백질 수준(AKT ser473) 및 전체 단백질 수율(Sypro Ruby)의 평가를 위해 AKT ser473(우측 상단) 및 Sypro Ruby(우측 하단)로 염색된 마이크로어레이의 영상을 도시한다. 2개의 수직 스폿(spot) 옆의 4개의 수평 스폿의 각각의 세트는 각각의 FNA 샘플에 대해 2배 희석으로 어레이에 프린팅된 본래의 샘플 및 이의 복제 샘플을 나타낸다. 희석 시리즈는 각각의 샘플의 비희석, 1:2, 1:4 및 1:8 희석이다. 획득 시점에서의 기준선 인산화 수준은 용해 완충용액에서 직접 용해된 세포이다(표 5, 실시예 Ⅴ 참조). 도 4B는 선택된 프로-생존 및 아폽토시스 엔드포인트에 대한 FNA 샘플로부터의 번역후 변형된 단백질의 상대량을 도시한다. 세포의 직접적인 용해는 획득 시점에서 인단백질을 보존한다. 이러한 기준선의 용해된 샘플에 대한 상이한 화학 용액에서 인큐베이션된 샘플을 비교함으로써, 본 발명자들은 에탄올과 같은 전통적인 고정제가 인단백질을 적절하게 보존하지 않는 것을 밝혀내었다. 0.9%의 염수는 24시간 후에 인단백질 엔드포인트 황폐의 수준을 나타낸다.

도 5는 동결된 조직 샘플과 고정된 조직 샘플 사이의 조직 형태의 비교를 도시한다. 뇌로 전이된 유방 조직을 동결된 섹션을 절단하기 전에 급속 동결시키거나, 메탄올:물에 고정시켰다. 조직 형태, 동결된 섹션을 절단하는 능력, 및 효과적인 레이저 포획 미세절제로 동결 샘플 및 메탄올:물 고정 샘플을 비교하였다.

도 6은 인단백질 안정성에 대한 메탄올:물 고정제 대 동결 조직을 도시한다. 도 6A. 역상 단백질 마이크로어레이는 고정된 조직 및 동결된 조직에 대해 동등한 스폿 강도를 나타낸다. 도 6B는 평균 신호 강도가 동결 조직에서 더 크나, 샘플 사이의 방향은 다양한 단백질 엔드포인트에 대해 유사한 것을 나타낸다.

도 7은 샘플당 세포 동등물이 역상 단백질 마이크로어레이에 프린팅되고, mTOR(S2448) 인산화의 수준이 측정되는 분석을 도시한다. 도 7A의 샘플은 급속 동결되었다. 도 7B의 샘플은 물중 20-50% 메탄올에 고정되었다. 분석은 샘플 보존 기술 사이의 동등성을 나타낸다.

도 8은 포스파타아제 억제제 또는 키나아제 억제제인 기본 고정제에 부가된 인단백질 안정화에 대한 효과를 도시한다. 샘플을 수거하고, 도에 나타낸 시점에서 선택된 인단백질 엔드포인트의 존재에 대해 분석하였다. 도 8A는 엔드포인트, SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)을 도시하고; 도 8B는 베타 카테닌(catenin)(S33/37/Thr41)을 도시하고; 도 8C는 엔드포인트, Her3(Tyr1289)을 도시하고; 도 8D는 CC3(Asp175)를 도시한다.

도 9는 나노입자 센티넬(sentinel)을 도시한다.

도 10은 시험관내 세포 배양 모델(살아 있는 세포)에서 포스파타아제 억제제(퍼바나데이트(pervanadate))의 존재하에서 시간에 따라 관찰된 인산화의 서지(surge)를 도시하는 선 그래프를 도시한다. 도 10A는 EGF 수용체(EGFR Y1173)의 인산화에 대한 포스파타아제 억제제의 효과를 도시한다. 인산화는 40분 미만에서 높은 수준으로 급속하게 증가하였고, 이후 세포가 사멸하였다. 도 10B는 포스파타아제 억제제에 대한 살아 있는 세포의 노출 후의 나열된 인-엔드포인트(phospho-endpoint) 시리즈에 대한 시간에 따른 과인산화를 도시한다.

도 11은 실온에서 다양한 고정제 제형(formulation)에서 고정된 자궁 조직의 형태를 도시하는 영상(헤마톡실린 및 에오신으로 염색)을 도시한다. 도 11A: 10% 메탄올 2X 배율; 도 11B: 최적 절단 화합물에 포매(embedding)된 동결 조직 2X 배율; 도 11C: 포르말린 10X 배율; 도 11D: 10% 메탄올 10X 배율; 도 11E: 10% 메탄올 + 폴리에틸렌 글리콜 10X 배율; 도 11F: 10% 메탄올 + PEG + 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 10X 배율.

도 12는 10% 에탄올 + PEG + 프로테아제 억제제로 고정된 자궁 조직의 레이저 포획 미세절제를 도시한다. 도 12A: 절제 전; 도 12B: 미세절제 후; 도 12C: LCM 캡(cap)에서 획득된 세포.

도 13 A-D는 본 발명의 보존 조성물로 고정되고 안정화된 CD4에 대해 염색된 세포의 FACS 분석을 도시한다. 도 13A는 FITC 컨쥬게이션된 아이소형(isotype) 항체 대조군(IgG₁, kappa)으로 염색된 미처리 세포를 도시한다. 도 13B는 실시예 Ⅴ에 기재된 보존 조성물을 이용하여 20분 동안 처리되고, 2회 세척되고, 항-CD4-FITC로 염색된 세포를 도시한다. 도 13C는 먼저 항-CD4-FITC로 염색되고, 2회 세척된 후, 보존 조성물을 이용한 처리에 적용된 세포를 도시한다. 도 13D는 항-CD4-FITC로 염색되고, 2회 세척되고, 유세포분석으로 분석된 미처리 세포를 도시한다(고정제 없음).

본 발명은, 예를 들어, 피검체로부터 수득된 샘플 중의 단백질, 특히 번역후 변형된 단백질, 예를 들어, 인단백질을 보존하고 모니터하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 보존된 단백질은 임상 표본으로부터 수득된 인간 종양 조직의 인단백체 레퍼토리를 나타내는 인단백질이다. 본 발명의 양태는 실온에서의 샘플 보존(고정 및 안정화)을 위한 조성물(예를 들어, 용액); 샘플, 예를 들어, 피검체로부터 분리되었으나 아직 안정화 절차에 적용되지 않은 샘플의 품질 조절 모니터링에 사용될 수 있는 내인성 대용 마커의 확인; 및 품질 평가, 예를 들어, 샘플이 안정화 절차에 적용된 시간과 추가 절차(예를 들어, 분자 분석)이 수행되는 시간 사이의 샘플의 모니터링에 사용될 수 있는 외인성 마커를 포함하는 센티넬(예를 들어, 센티넬의 패널)을 포함한다.

특히 신체 추출후 처음 3-4시간 이내에 획득된 조직 샘플에 대한 특정 보존 필요조건이 존재한다. 본 발명자들은 본원에서 피검체로부터 절제(획득)된 조직이 지속적으로 살아 있고, 조직이 절제(획득)되는 시간과 조직이 보존제에 노출되는 시간 사이의 수시간 동안 혈관 관류의 부재, 허혈, 저산소증, 산증, 세포 폐기물의 축적, 전해질의 부재, 온도 변화 등에 반응할 수 있는 것을 예기치 않게 발견하였다. 본 발명자들은 인단백질이 이의 미세환경 및 에너지 공급원, 신호전달 리간드 및 산소 공급원으로부터 분리됨에도 불구하고, 절제된 샘플 내의 인단백질이 내인성 키나아제 및 포스파타아제 각각의 작용을 통해 인단백질의 활성화 및 불활성화 둘 모두인 대사 변화를 지속적으로 겪는 것을 발견하였다.

이러한 지속적인 대사 과정은 샘플 내의 인단백질의 보존에 문제가 된다. 예를 들어, 본 발명자들은 내인성 포스파타아제에 의한 단백질 포스페이트 기의 제거를 차단하는 것으로 디자인된 포스파타아제 억제제 단독의 첨가가 확인되지 않고 고도로 비정상적으로 인단백질의 축적 상승을 야기시켜 치사 수준에 도달할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 티로신 포스파타아제 억제제인 퍼바나데이트를 이용하여 배양된 세포주(A549)의 치료 후에 거대한 인산화 서지를 나타내는 도 10을 참조하라. 임의의 특정 메커니즘으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 포스파타아제 억제제가 키나아제의 탈인산화를 방지하나, 키나아제 자체가 활성이고, 단백질 인산화를 지속시키므로, 상기 서지가 발생하는 것으로 제안되어 있다.

따라서, 절제 시점에서 살아 있는 조직에서 분자(예를 들어, 인단백질)의 정확한 반영을 달성하기 위해, 획득 후 가능한 한 신속히 조직을 고정시키고, 분석시까지 세포 신호전달 및 대사 기능의 반응성 변동을 억제하는 것이 중요하다.

본 발명자들은 본원에서 실온에서 인단백질을 포함하는 샘플과 접촉되는 경우 세포 형태 및 조직의 조직 구조를 보존하는 조건하에서 단일 단계로 인단백질의 인산화 상태를 고정 및 안정화(예를 들어, 포스파타아제, 키나아제, 및 임의로 프로테아제를 억제)시킬 수 있고, 추가 가공(예를 들어, 동결된 섹션의 제조 또는 장기간의 냉동 저장) 동안 샘플의 동결을 방해하지 않는 조성물(보존성 조성물)을 확인하였다.

본 발명의 보존성 조성물의 첫번째 성분은 세포 내의 단백질을 침전시킴으로써 이를 고정시킬 수 있으나 여전히 충분한 수분 함량을 함유하여, 포스파타아제, 키나아제 및/또는 프로테아제의 억제제와 같은 안정화제가 가용성이고, 고정된 세포 내로 진입하여 기능할 수 있도록 하는, 고정제(예를 들어, 용액)이다.

인단백질의 활성화 및 비활성화 둘 모두가 인단백질이 획득된 후 세포 또는 조직에서 지속적으로 발생하는 본원의 관찰에 비추어, 본 발명의 보존성 조성물은 두번째 성분으로서 1개 이상의 키나아제 억제제 및 1개 이상의 포스파타아제 억제제, 및 임의로 1개 이상의 프로테아제 억제제를 포함하는 안정화제를 추가로 포함한다.

본 발명의 보존성 조성물에 일반적으로 존재하는 세번째 성분은 세포 또는 조직의 내부 집단(inner mass)으로 세포 또는 조직의 표면으로부터의 고정제 및/또는 안정화제의 신속한 투과를 향상시킬 수 있는 침투성(투과성) 증강제(시약)이다. 투과성 증강제는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다(본 발명의 일부 구체예에서, 세포 내부에 존재하는 성분을 고정시키고 안정화시킬 필요가 없는 경우, 투과성 향상 시약이 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, 세포의 표면 상의 항원성 표면 단백질만이 고정되고 안정화되는 것이 중요한, FACS 분류를 위해 세포를 보존하는 경우, 투과성 증강제를 포함할 필요가 없을 수 있다).

고정제, 안정화제 및 투과성 증강제를 포함하는 조성물은 종종 본원에서 "본 발명의 조성물" 또는 "본 발명의 보존성 조성물"로 언급된다.

세포 또는 조직과 접촉되는 경우, 본 발명의 조성물은 세포 분자를 동시에 고정시키고/시키거나, 억제시키고/시키거나, 침전시키고, 동결 섹션 또는 파라핀 섹셔닝(sectioning) 후의 조직학적 진단을 위해 세포 형태를 보존시키면서, 조직 부피를 통해 신속하게 투과하고, 절제 충격에 반응하는 살아 있는 세포 내에서의 신호전달 경로에서 변동(증가 및 감소 둘 모두)을 억제하는, 신속하게 이동하는 용매선(solvent front)을 발생시킬 것이다. 조성물의 안정화제 성분은, 예를 들어, 고정제 이동 선(moving front)에 의해 세포 분자의 완전한 고정 또는 억제 전에 살아 있는 조직 세포 내에서 발생하는 신호전달 경로 활성화를 억제할 수 있다. 이러한 기능 모두는 실온에서 달성된다.

본 발명자들은 본원에서 피검체로부터 분리된 샘플 내에서 특히 불안정한(labile)(인산화 상태의 변화를 나타냄) 인단백질을 예기치 않게 확인하였다. 이러한 인단백질(뿐만 아니라 상기 논의된 기타 단백질)은 샘플(예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물로부터의 샘플)에서 인단백질 보존 상태를 측정하는데 사용될 수 있는 내인성 대용 마커로 제공될 수 있다. 이러한 분석은 제공된 샘플 내의 기타 단백질이, 상기 샘플이 추가 분석, 예를 들어, 단백체(proteomic) 분석에 적합하도록 충분히 잘 보존되어 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 확인된 불안정한 인단백질 또는 기타 단백질은 또한 미립자 물질에 부착(예를 들어, 이에 결합, 이에 커플링, 또는 이에 고정)되어, 예를 들어, 세포 또는 조직 집단 샘플의 가공 내역을 평가하는데 사용될 수 있는 외인성 센티넬을 형성할 수 있다. 요망되는 경우, 다양한 상기 외인성 센티넬 분자의 패널이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 장점은 보존이 실온에서 수행되므로, 고비용의 냉동의 필요성이 배제된다는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 임상 환경, 및 냉동을 이용할 수 없는 조건(예를 들어, 제약된 상황 또는 전장)하에서 샘플의 분석을 촉진한다. 본 발명의 방법은 추가 분석, 예를 들어, 선택된 인단백질의 인산화 상태에 기초한 분자 진단 분석을 위해 샘플의 신속하고, 정확하고, 재현가능한 제조를 가능케 한다. 세포 및 조직 형태가 병리학적 진단에 대해 보존된다. 또한, 본 발명의 방법에서, 고정제 및 안정화제는 침지되거나 처리된 조직의 표면으로부터 조직의 내부 집단으로 신속하게 투과할 수 있다. 세포 또는 조직으로의 고정제의 신속한 도입으로 인해, 본 발명의 방법은 서서히(시간당 밀리미터) 투과하는 포르말린, 및 보존되는 조직이 여전히 진행되는 대사 반응하는 시간 동안 가교제가 수시간 뒤뒤쳐지는 알데히드와 같은 통상적인 고정제의 문제를 극복한다.

본 발명은, 예를 들어, 실온에서 인단백질을 포함하는 샘플과 접촉시, 인단백질을 고정 및 안정화시킬 수 있고, 세포 형태를 보존할 수 있고, 샘플이 동결되어 분자 분석에 적합한 크라이오스태트(cryostat) 동결 섹션이 생성되도록 하는 조성물(보존성 조성물)에 관한 것으로, 이러한 조성물은,

(1) 인단백질을 고정시키는데 효과적이고, 안정화제 및/또는 투과성 증강제에 대해 가용성이 되기에 충분한 수분 함량을 지니는 고정제;

(2) (a) 키나아제 억제제, (b) 포스파타아제 억제제, 및 임의로 (c) 프로테아제(예를 들어, 단백분해효소) 억제제를 포함하는 안정화제; 및

(3) 투과성 증강제를 포함한다.

본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에 달리 명백하게 지시되지 않는 경우 복수 형태를 포함한다. 예를 들어, 상기에 사용되는 키나아제 억제제는 1개 이상의 상기 억제제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 샘플 내의 인단백질의 보존에 효과적인 조건하에서 샘플을 실온에서 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 실온에서 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 1개 이상의 인단백질을 보존(고정 및 안정화)시키는 방법이다. 상기 방법은 보존된 샘플을 동결(예를 들어, 샘플이 조직을 포함하는 경우)시키고, 임의로 동결 보존된 샘플을 섹셔닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 보존 방법은 파라핀 포매의 필요 없이 조직을 동결시키고 섹셔닝하기 위한 매트릭스를 제공한다. 본 발명의 보존 방법에서, 샘플 내의 세포의 적어도 서브셋(subset)에서 1개 이상의 인단백질의 인산화 상태를 추가로 분석할 수 있다. 요망시, 보존 전에 외부 에너지원(예를 들어, 초음파, 적외선, 마이크로파, 전자기, RF(라디오파) 에너지, 또는 압력, 열 또는 화학 물질)을 이용한 처리에 의해 인단백질을 변성시킬 수 있다.

샘플 내의 인단백질을 보존하기 위한 "효과적인 조건"은 사용되는 보존성 조성물의 성분의 특성, 샘플의 특성 등을 포함하는 다양한 변수의 함수이다. 적절한 조건은 당업자에 의해 통상적으로 최적화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 샘플(예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플) 내의 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법이다. 상기 방법은 연구자가 샘플 내의 단백질이 샘플의 이후의 (정확하고 유의한) 분자 단백체 분석을 수행하기에 충분히 안정적인지의 여부를 결정하는 것을 가능케 할 수 있다. 상기 방법은 샘플 내의 특정한 불안정한 (비교적 불안정한) 단백질이 안정화되는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. "충분히 안정화된"은 시간에 따른 생체외에서(ex vivo) 변동이 조직이 안정화 처리제에 침지되기 바로 직전에 존재하는 기준 값의 20% 이하가 되도록, 단백질의 번역 후 변형(예를 들어, 인산화) 형태의 수준의 양성 또는 음성 변동이 안정화된 것을 의미한다.

이러한 내인성 마커는 종종 본원에서 "내인성 대용 마커" 또는 "내인성 대용 인단백질"로 언급된다. 내인성 대용 마커는, 예를 들어, 표 1에 나열된 인단백질 중 1개 이상일 수 있다. 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법에서, 샘플은 피검체로부터 분리될 수 있으나, 안정화 절차에는 아직 적용되지 않은 것이다(예를 들어, 샘플은 안정화 절차 전 4시간 이내에 분리될 수 있다). 보존 상태를 결정하는 방법은 인단백질의 결정된 보존 상태에 기초하여 분자 진단 분석 진행의 여부를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 내인성 대용 마커 중 1개 이상, 예를 들어, 표 1에 나열된 인단백질 중 1개 이상; 상기 인단백질 중 5개 이상; 상기 인단백질 중 10개 이상; 또는 상기 표에서의 특히 불안정한 인단백질인 STAT-3 또는 STAT-1(예를 들어, STAT-3), CC-3(cleaved caspase-3)) 및 ASK-1의 인산화된 동형 및/또는 비-인산화된 동형에 대해 특이적인 항체 세트이다. 항체 세트에 또한 존재할 수 있는 기타 항체는 표 2에 나열된 단백질 중 1개 이상; p-셀렉틴, e-셀렉틴, IL-2, IL-6, IL-8 및/또는 피브로넥틴; 및/또는 본원에 논의된 기타 내인성 대용 마커 중 임의의 마커에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 사실, 내인성 대용 단백질 중 1개에 특이적이고 샘플 내의 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법에 사용될 수 있는 임의의 리간드가 사용될 수 있고, 키트에 존재할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 첫번째 시점에서 (샘플 내의 세포로 센티넬을 도입시키기에 효과적인 조건하에서) 샘플과, (1개 이상의) 대용 인단백질 마커를 포함하는 세티넬을 접촉시키는 단계, 두번째 시점에서 센티넬을 분리하고, 두 시점에서 센티넬과 회합된 대용 인단백질 마커(들)의 인산화 상태를 측정하고 비교하는 단계를 포함하는, 두 상이한 시점에서 샘플(예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플) 내의 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법이다. 센티넬은 실질적으로 동시에 샘플 내로 도입될 수 있고, 샘플은 본 발명의 보존성 조성물에 배치된다. 센티넬(들)은 샘플이 도입되는 보존성 조성물을 지니는 용기에 존재할 수 있거나, 샘플이 실질적으로 배치된 직후에 샘플/보존성 조성물에 첨가될 수 있다.

본원에서 사용되는 "센티넬"은 1개 이상의 인단백질(예를 들어, 고도로 불안정한 인단백질)과 회합된 외인성 미립자 실체를 의미한다. 본 발명의 센티넬의 특성은 본원 다른 곳에 보다 상세하게 논의되어 있다. 상기 방법은 샘플 내의 단백질의 안정성을 모니터하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 피검체로부터의 샘플의 분리와 절차(예를 들어, 고정/보존 절차) 시작 사이의 시간의 총계를 결정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 샘플이 피검체로부터 수득되는 첫번째 시점에서, 샘플을 동시에 실온에서, 본 발명의 (1개 이상의) 센티넬 및 본 발명의 보존성 조성물과 접촉시킴으로써, 샘플 내의 관심 인단백질을 고정시키고 안정화시키는 단계; 두번째 시점에서, 센티넬을 추출하는 단계: 이후, 센티넬과 회합된 대용 인단백질 마커(들)의 보존 상태를 측정하고, 대용 인단백질 마커(들)의 보존 상태가 샘플 내의 관심 인단백질(들)의 보존 상태가 이의 분자 특성 규명에 적합한지를 나타내는 단계; 및 관심 인단백질(들)의 분자 특성규명을 수행하는 단계를 포함하는, 샘플이 피검체로부터 분리되는 경우 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 1개 이상의 관심 인단백질의 분자 특성규명(예를 들어, 분자 진단 분석) 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 임의로 1개 이상의 용기 중에 본 발명의 보존성 조성물의 성분을 포함하는, 실온에서 샘플(예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플) 내의 인단백질을 고정시키고 안정화시키는 키트이다. 본 발명의 또 다른 양태는 샘플 내의 단백질(예를 들어, 인단백질)의 보존 상태를 모니터하는 키트이다. 키트는 본 발명의 1개 이상의 센티넬 및 1개 이상의 용기를 포함하고, 임의로 키트에 사용하기 위한 단백질의 인산화 상태를 모니터(측정)하는 시약 및/또는 설명서를 함유한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 보존성 조성물을 함유하는 제 2 챔버에 연결된 샘플의 특정 부피를 제거하거나 획득하는 제 1 챔버를 포함하여, 1회의 수행으로 샘플이 상기 챔버 내의 보존제에 획득되고 침지되는, 세포 또는 조직 표본을 수집하고 보존하는 장치이다. 제 2 챔버는 분리될 수 있고, 추가 분석, 예를 들어, 조직 섹셔닝 또는 분자 가공에 직접 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 본 발명의 방법에 의해 고정되고 보존(및, 임의로, 예를 들어, 샘플 내의 인단백질 중 1개 이상의 인산화 상태를 결정하기 위해 분석)될 수 있는 임의의 적절한 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물(예를 들어, 단백질)을 포함할 수 있다. 적절한 샘플은, 예를 들어, 외과 절제 또는 조직 생검, 예를 들어, 바늘생검; 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 기계적 수단, 또는 미세침 또는 기타 적절한 장치를 이용한 샘플, 예를 들어, 종양 샘플의 흡입에 의해 세포 집단으로부터 분리된 세포; 체액, 예를 들어, 혈액, 유리 체액, 또는 상기 체액 중 하나 또는 둘의 분획; 또는 세포의 생성물, 예를 들어, 세포로부터 쉐딩되거나, 분비되거나, 배설되거나, 달리 수득된 단백질을 포함한다. 샘플은 임의의 피검체(환자), 예를 들어, 임의의 동물, 예를 들어, 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 래빗 또는 기니아 피그), 농장 동물, 가축 또는 애완 동물(예를 들어, 고양이 또는 개), 비-인간 영장류, 또는 바람직하게는 인간으로부터 수집될 수 있다.

단백질의 "인산화 상태"는 단백질의 인산화 정도(인산화의 전체량)를 의미한다. 이는 인산화되는 단백질의 부위(예를 들어, 적절한 Ser, Thr 또는 Tyr 아미노산 잔기)의 수, 및/또는 아미노산 사슬 상의 임의의 제공된 수용체 부위에서의 인산화 수준 둘 모두를 포함한다. 샘플의 "보존 상태"는 인단백질의 인산화 상태를 포함하여, 샘플 및 단백질 등의 샘플에서의 상태를 반영한다.

본 발명자들은 샘플 내의 단백질을 침전시킴으로써 이를 고정시킬 뿐만 아니라, 안정화제(단백질을 포함하는 안정화 작용제)가 고정제 내에서 가용성을 유지하도록 하기에 충분한 양의 물을 함유하는 고정제(고정 작용제)를 확인하였다. 일반적으로, 고정제는 수성 베이스, 예를 들어, 에탄올(예를 들어, 약 10-40%, 약 10-20%, 또는 약 12%), 메탄올(예를 들어, 약 10-40%, 약 10-20%, 또는 약 12%), 벤질 알코올(예를 들어, 약 10-40%) 또는 아세톤(예를 들어, 약 5-15%)(모두 V/V) 중에 비-가교 침전 작용제를 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 ±10%를 의미한다. 예를 들어, 약 1%는 0.9% 내지 1.1%를 포함한다. 본원에서 사용되는 범위의 엔드포인트는 상기 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 5-15%의 범위(예를 들어, 5% 내지 15%의 값)은 5% 및 15% 둘 모두를 포함한다. 본 발명자들은 전술한 적은 양의 상기 침전 고정제가 여러 이유로 인해 통상적인 양의 알코올(예를 들어, 50-60%)보다 우수한 것을 예기치 않게 결정하였다. 통상적인 수준과는 달리, 상기 낮은 수준은 키나아제 및 포스파타아제 억제제와 같은 작용제가 용액 내에 유지되도록 하고, 상기 낮은 수준은 세포 형태의 보존 및 동결 섹션의 제조에 특히 유효하다.

다른 유형의 적절한 고정제는 본 발명의 안정화제 및/또는 투과성 작용제가 용해되기에 충분한 희석제에 존재하는 하기의 성분의 용액 또는 현탁액을 포함한다: 물을 제거하거나, 단백질 침전 또는 집합체, 예를 들어, 미립자 물질, 바이오세라믹, 폴리 디올 시트레이트, 키토산 및 히드록시아파타이트를 유도할 수 있는 작용제(0.1-10% w/w); 킬레이트화 작용제(예를 들어, EDTA)(0.05%); 트리클로로아세트산(TCA)(1-5%); 클로로포름/메탄올(10-40%); 또는 황산암모늄(5-15%).

본 발명의 조성물의 두번째 성분은 키나아제 억제제(신호전달 경로 활성화의 억제제) 및 포스파타아제 억제제(번역후 인산화의 제거를 억제함)를 포함하는 안정화제(안정화 작용제)이다. 임의로, 본 발명의 안정화제는 또한 프로테아제 억제제를 포함할 수 있다.

사용될 수 있는 적절한 키나아제 억제제는, 예를 들어, 아다포스틴(Adaphostin); AG 490; AG 825; AG 957; AG 1024; 알로이신(Aloisine)(예를 들어, 알로이신 A); 알스테르파울론(Alsterpaullone); 아미노게니스테인(Aminogenistein); API-2; 아피게닌(Apigenin); 아르크티게닌(Arctigenin); AY-22989; 비스인돌릴말레이미드 IX; BMS-354825(다사티니브(Dasatinib)); 켈러리트린(Chelerythrine); DMPq; DRB; 에델포손(Edelfosone); 에르브스타틴(Erbstatin) 유사체; ET180CH3; ERK 억제제 파수딜(fasudil); 제피티니브(Gefitinib); H-7; H-8; H-89; HA-100; HA-1004; HA-1077; HA-1100; 히드록시파우스딜(Hydroxyfausdil); 인디루빈-3'-옥심(Indirubin-3'-oxime); 5-이오도투베르시딘(5-Iodotubercidin); 켄파울론(Kenpaullone); KN-62; KY12420; LFM-A13; 루테올린(Luteolin); LY-294002; 말로톡신(Mallotoxin); ML-9; NSC-154020; NSC-226080; NSC-231634; NSC-664704; NSC-680410; NU6102; 올로모우신(Olomoucine); 옥신돌 Ⅰ(oxindole Ⅰ); PD 153035; PD 98059; 플로리드진(Phloridzin); 피세아타놀(Piceatannol); 피코로포도필린(Picoropodophyllin); PKI; PP1; PP2; 부르발라놀A(Purvalanol A); 퀘르세틴(Quercetin); RAPA; 라파뮨(Rapamune); 라파마이신(Rapamycin); Ro 31-8220; 로스코비틴(Roscovitine); 로틀러린(Rottlerin); SB202190; SB203580; 시롤리무스(Sirolimus); SL327; SP600125; 스타우로스포린(Staurosporine); STI-571; SU1498; SU4312; Su6656; Syk 억제제; TBB; TCN; 트리시리빈(Triciribine); 티로포스틴(Tyrophostin) AG 490; 티로포스틴 AG 825; 티로포스틴 AG 957; 티로포스틴 AG 1024; U0126; W-7; 보르트마닌(Wortmannin); Y-27632; ZD 1839; 및 ZM 252868이다. 이러한 시약 및 본원에 논의된 다른 작용제 모두는 시그마(Sigma)사 또는 칼바이오켐(Calbiochem)사와 같은 시판업체에서 용이하게 구입할 수 있다.

사용될 수 있는 적절한 포스파타아제 억제제는, 예를 들어, A-나프틸산 포스파타아제(A-Napthyl acid phosphatase); 칼리쿨린 A(Calyculin A), 노둘라린(Nodularin), NIPP-1(PP1을 억제함); 마이크로시스틴(Microcystins), 오카다산(Okadaic Acid), 엔도탈(Endothall)(PP2A를 억제함); 시클로스포린 A(Cyclosporine A) 및 FK 506/이뮤노필린(Immunophilin) 복합체, 사이퍼메트린(Cypermethrin); 칸타라딘(Cantharadin); 칸타리드산(Cantharidic acid); 델타메트린(Deltamethrin)(PP2B 억제); bpV(phen), 데포스타틴(Dephostatin), mpV(pic), DMHV(PTP 억제); β-글리세로포스페이트; (-)-p-브로모터트라미솔 옥살레이트; 펜발러레이트(Fenvalerate); L-690,330; L-호모아르기닌(L-Homoarginine); 페닐아르신 옥시드(Phenylarsine Oxide); 퍼메트린(Permethrin); 소듐 몰리브데이트(Sodium molybdate)(및 퍼몰리브데이트(permolybdate)); 이미다졸; 소듐 플루오라이드(Sodium fluoride); 소듐 타르트레이트 데히드레이트; 소듐 스티보글루오코네이트(Sodium Stibogluoconate); 소듐 피로포스페이트; 수라민(Suramin); 바나데이트(오르쏘바나데이트(orthovanadate) 및 퍼바나데이트(pervanadate)); 1,4-디메틸렌도탈(Dimethylendothall); 1-노르-오카다온(1-nor-Okadaone); 알레트린(Allethrin); 아스코마이신(Ascomycin); 벤질포폰산(Benzylphophonic acid); 타우토마이신(Tautomycin); 테트라미솔(Tetramisole); 및 티르포스틴 8(Tyrphostin 8)이다.

본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 키나아제 및 포스파타아제 억제제의 적절한 균형을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 적절한 안정화제는 포스파타아제 억제제로서 약 100mM 내지 약 400mM 농도의 소듐 오르쏘바나데이트, 또는 약 375mM 내지 1.5M 농도의 베타 글리세로포스페이트, 키나아제 억제제로서 약 5.0μM 내지 20.0μM 농도의 스타우로스포린, 또는 약 0.5μM 내지 2.0μM 농도의 제니스테인을 함유할 수 있다. 당업자는 전술한 비율에 비추어, 포스파타아제 및 키나아제 억제제의 다른 배합물의 적절한 비를 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 배합물 및 방법에 사용되는 키나아제 및 포스파타아제 억제제는 임의의 적절한 메커니즘에 의해 작용할 수 있다. 예를 들어, 키나아제 억제제 및/또는 포스파타아제 억제제는 키나아제 또는 포스파타아제 효소의 활성을 직접 억제할 수 있고; 키나아제 억제제는 키나아제 기질인 ATP를 방해할 수 있고/있거나; 포스파타아제 억제제는 인산화된 단백질 상의 포스페이트 기와 상호작용하거나, 포스파타아제에 대한 의사-기질(pseudo-substrate)로 작용할 수 있다.

임의로, 본 발명의 안정화제는 프로테아제 억제제를 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "프로테아제 억제제"는 분자의 말단 또는 내부 위치로부터의 단백질의 분해를 차단하는 작용제를 의미한다. 프로테아제 억제제는 다양한 단백분해효소 억제제, 예를 들어, 세린 단백분해효소(예를 들어, PNSF 또는 아프로티닌(aprotinin)), 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 단백분해효소, 금속단백분해효소(예를 들어, EDTA); 산 단백분해효소, 중성 단백분해효소 또는 알카리성 단백분해효소의 억제제를 포함한다.

사용될 수 있는 적절한 프로테아제 억제제는, 예를 들어, 아세틸-펩스타틴(acetyl-Pepstatin); AEBSF, 하이드로클로라이드; ALLN; ALLM; 아마스타틴(Amastatin), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp .); E-아미노-n-카프로산(E-amino-n-caproic acid)(EACA); α1-항키모트립신; α2-항플라스민; 안티파인(Antipain), 디히드로클로라이드 또는 히드로클로라이드; 항트롬빈 III; α1-항트립신; p-APMSF, 히드로클로라이드; 아프로티닌; ATBI; 벤즈아미딘, 히드로클로라이드; 베스타틴(Bestatin); 베스타틴, 메틸 에스테르; 칼파스타틴(Calpastatin); CA-074; 칼펩틴(Calpeptin); 카르복시펩티다아제; 카텝신(cathepsin) 억제제 I, II, III; 카텝신 B 억제제 I, II; 카텝신 K 억제제 I, II, III; 카텝신 L 억제제 I, II, III, IV, V, VI; 카텝신 S 억제제; 키모스타틴(Chymostatin); 키모트립신 억제제 I; 시스타틴(Cystatin); 3,4-디클로로이소쿠라민(3,4-dichloroisocouramin); 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP); 디펩티딜 펩티다아제 IV 억제제; 1,5-DNS-GGACK, 2HCl; 디펩티딜펩티다아제 II 억제제; E-64 프로테아제 억제제; 에코틴(Ecotin); EDTA; EGTA; 엘라스타아제 억제제 I, II, III; EST; FUT-175; GGACK; HDSF; α-이오도아세트아미드; 키노겐(Kinnogen); 류히스틴(Leuhistin); 류펩틴(Leupeptin); α2-마크로글로불린(α2-Macroglobulin); DL-2-머캅토메틸-3-구아니디노에틸티오 프로판산; NCO-700; 펩스타틴 A; 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF); PPACK; 프롤릴 엔도펩티다아제 억제제; 2,3,5,7-테트라니트로-9-플루오레논; TLCK 히드로클로라이드; 트롬빈 억제제; 트리펩티딜펩티다아제 II 억제제; 트립신 억제제; 티로마이신 A(Tyromycin A); 및 D-Val-Phe-Lys 클로로메틸 케톤, 디히드로클로라이드이다. 다른 프로테아제 억제제는, 예를 들어, 문헌[Neel et al. (1997) Curr Opin Cell Biol 9, 193-204; and B. Goldstein (2002) J Clin Endocrinol Metab 87, 2474-2480)]에 기재되어 있다.

본 발명의 보존성 조성물의 세번째 성분은 고정제 및/또는 안정화제의 세포 또는 조직으로의 수송을 향상시키는 투과성 증강제(때때로, 본원에서 투과성 작용제 또는 투과 작용제로 언급됨)이다. 투과성 증강제는, 예를 들어, 조직 부피를 통한 본 발명의 조성물의 성분의 투과 속도를 증가시켜, 살아 있는 조직의 내부 집단 내의 세포에 신속하게 도달되고, 이의 분자가 이후의 진단을 위해 억류되도록 할 수 있다. 세포 또는 조직으로의 안정화제의 투과 속도는 세포 대 세포외 공간의 비율, 및 조직의 표면 대 부피의 비의 함수이다. 세포외 공간에서의 물, 용질 및 용질의 확산계수에 대한 조직 세포막의 투과성은 안정화 작용제의 투과성에 모두 영향을 줄 것이다. 세포내 공간과 세포외 공간 사이의 물질 수송 및 교환 후, 보존제가 세포로 진입한다.

다양한 투과성 증강제가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 적절한 투과성 증강제는 중합체(예를 들어, PEG, 폴리스티렌 등), 단백질(예를 들어, 친지질 단백질), 지질, 및 나노입자(예를 들어, 금속 또는 시클로덱스트린 나노입자)이다. 예를 들어, 적절한 투과성 증강제는 물; 약 1.5M의 디메틸술폭시드(DMSO); 디메틸아세트아미드(DMAC); 데메틸포름아미드(demethylformamide)(DMF); 디메틸술폭시드(DCMS); 알킬 사슬로 포화된 C_1O-C₁₈을 지니는 지방산; 소듐 라우릴 술페이트(SDS); 소르비탄 모노라우레이트 20; 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드; 노녹시놀(nonoxynol) 계면활성제; 쯔비터이온(zwitterionic) 계면활성제(예를 들어, 도데실 베타인); 라우로카프람(laurocapram): 아존(Azone)(1-도데실아자시클로헵탄-2-온); SR-38(4-데시클로아졸리딘-2-온); 에탄올성 용액; 정유(essential oil), 테르펜 및 테르페노이드(유칼립투스, d-리모닌, 네롤리돌, 1-8-시네올, 멘톨); 지방 알코올(alknols); 올레산; 글리콜; PEG 200 모노라우레이트; PEG 400 모노올레이트(Alkamuls 400-MO); PEG 400 모노라우레이트(Lipopeg 4-L); PEG 600 모노올레이트(Alkamuls 600-MO); PEG 6000 모노올레이트(Kesso Polyetheylene Glycol esters); 폴리옥시아릴 에테르(Syn Fac 8210); POE 올레일 알코올(Ethosperse OA-9); POE 소르비탄 모노올레이트(Atlas G8966T); POE 미리스틸 에테르(Lipco-4); POE 라우릴 알코올(Ethosperse LA-4); POE 라우릴 에테르(Brij 30); POE 소르비탄 모노올레이트(Glycosperse 0-5); POG 라우릴 술페이트(Emthox 5967); 옥티페녹시폴리(에틸렌옥시) 에탄올(Igepal CA 420); 선형 알코올 에톡실레이트(Rexonic N4); 폴리소르베이트 80(Tandem 8)을 지닌 모노글리세라이드 및 디글리세라이드; 노닐 페놀 에톡실레이트(Alkasurf NP-4); 노닐페녹시폴리(페닐렌옥시) 에탄올(Igepal CO-720); 노닐페놀 에톡실레이트(alkasurf NP-15); 피마자유 에톡실레이트(Sandoxylate C-32); 에톡실화된 코크모노글리세라이드(cocmonoglyceride)(Varonic LI-63); 에틸렌 옥시드와 축합된 올레일알코올(Volpo-20); 변형된 옥시에틸화된 직쇄 알코올(Plurafac C-17); 에톡실화된 라놀린 알코올(Polychol 40); 에티옥실레이트 폴리옥시프로필렌 글리콜(Alkatronic PGP 23-7); 에티옥실레이트 폴리옥시프로필렌 글리콜(Alkatronic PGP 23-8); 논페닐 에톡실레이트(Alkasurf NP-30); 폴리에틸렌 100 스테아릴 에테르(Brij 700); 모노글리세라이드 및 에틸 팔미테이트; 알킬아릴 폴리에테르 에탄올(Triton X-363 M); N,N-디메틸 아미드(Mallcomid M 8-10); 알킬 또는 아릴 우레아 유사체; 글리세롤 모노라우레이트 및 라우릴 아세테이트; 세프솔-318(Sefsol-318) 중간 사슬 글리세라이드; 세포-투과 펩티드; 페길화된 펩티드; 세포 투과 펩티드; 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트; 인지질; 피롤리돈; N-메틸-2-피롤리돈 및 2-피롤리돈; 덴드리머(dendrimer); 렉틴; 또는 페길화된 금 및/또는 콜로이드 금이다.

본 발명의 한 구체예에서, 투과성 작용제는 약 0.5-15%, 예를 들어, 약 0.5-5%의 농도의 PEG이다. 보다 높은 농도의 PEG는 세포 조직을 간섭할 수 있고, 조직의 섹셔닝을 방해할 수 있다.

투과성 증강제는 본 발명의 고정제 및 안정화제의 혼합물에 대한 독립적인 요소로서 첨가되어, 보존성 조성물을 형성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 안정화제(이의 성분 중 1개 이상)이 투과성 증강제에 부착(예를 들어, 이에 결합, 이에 커플링, 이에 고정)되고, 이는 세포 또는 조직으로의 투과성 증강제의 투과를 촉진할 수 있다. 적절한 투과성 증강제에 안정화 작용제를 부착시키는 방법은 통상적인 일이다. 한 구체예에서, 안정화제(예를 들어, 포스파타아제 억제제 및 키나아제 억제제) 및 투과성 작용제의 성분은 둘 모두 나노입자에 부착되고, 이는 세포 또는 조직으로의 본 발명의 조성물의 둘 모두의 유형의 성분의 진입을 촉진한다. 결합된 성분을 지니는 나노입자는 본 발명의 고정제에 현탁될 수 있다.

당업자는 본 발명의 보존성 조성물의 개별적 성분, 예를 들어, 투과성 증강제의 상대량 또는 심지어 이의 존재가 개별적 세포 유형 또는 표본 유형에 따라 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 조직(예를 들어, 근 조직)은 특히 밀집하여 있고, 이에 따라 덜 밀집한 조직에 비해 많은 양의 투과 향상을 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 높은 수준의 지방 또는 소수성 층(예를 들어, 유방 또는 피부)은 지방 특성이 결여된 조직 보다 낮은 양의 투과성 증강제를 필요로 할 수 있다. 이러한 조정은 본원에 논의된 보존성 조성물의 일반적인 범위 내에서 통상적으로 결정될 수 있다.

세포 또는 조직으로의 본 발명의 보존성 조성물의 투과를 돕기 위해 물리적 방법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 바늘의 격자를 이용한 압력파(pressure wave) 및 투과를 포함한다. 다른 물리적 방법은, 예를 들어, 초음파, 적외선, 마이크로파, 전기(고전압), 전자기, RF(라디오파) 또는 화학적 방법에 의한 일시적 열 도입을 포함한다. 이러한 물리적 방법은 조직으로 보존성 조성물을 유도하고, 키나아제, 포스파타아제 및 프로테아제 활성을 억제하기 위해 단백질을 활동적으로 변성시킨다.

본 발명의 보존성 조성물에 존재할 수 있는 기타 작용제는 막 수용체 억제제, 예를 들어, OSI-774(Tarceva, Erlotinib); 트라스투주맙(TraztuzμMab)(Herceptin); 라파타니브(Lapatanib); 및 제피티니브(Gefitinib)(Iressa)를 포함한다. 사용될 수 있는 항히스타민(H-1 수용체 길항제)은, 예를 들어, 아자타딘(Azatadine); 안타졸린(Antazoline); 브롬페니라민(Brompheniramine); 시클리진(Cyclizine); 클로르사이클리진(Chlorcyclizine); 세티리진(Cetirizine); 클로르페니라민(Chlorpheniramine); 클레마스틴(Clemastine); 시프로헵타딘(Cyproheptadine); 데슬로라타딘(Desloratadine); 덱스클로르페니라민(Dexchlorpheniramine); 디멘히드리네이트(Dimenhydrinate); 디펜히드라민(Diphenhydramine); 독실아민(Doxylamine); 펙소페나딘(Fexofenadine); 디드록시진(Hydroxyzine); 케토티펜(Ketotifen); 로라타딘(Loratadine); 메피라민(Mepyramine); 메클리진(Meclizine); 페니라민(Pheniramine); 페닌다민(Phenindamine); 프로메타진(Promethazine); 및 트리프롤리딘(Triprolidine)을 포함한다.

본 발명의 보존성 조성물에 존재할 수 있는 기타 작용제는 막을 안정화시킬 뿐만 아니라, 세포 분자 및 이의 번역후 변형물이 침전되거나 고정될 때까지 손상으로부터 세포를 보호하는 막 안정화 작용제를 포함한다. 적절한 세포막 안정화제는, 예를 들어, 트레할로오스; 탄수화물; 프로필렌 글리콜(예를 들어, 약 1.5M); 에틸렌 글리콜(예를 들어, 약 1.5M); 글리세롤(예를 들어, 약 1.5M); 수크로오스; 글리신; 키토산 또는 메틸셀룰로오스이다.

본 발명의 보존성 조성물에 존재할 수 있는 신호전달 경로 활성화의 다른 억제제는 조직학적 검사, 미세절제, 및 동결 섹션 또는 중합체 또는 파라핀 섹셔닝 후의 병리학적 진단을 위한 소기관 형태를 포함하는 세포 형태를 보존하는 작용제를 포함한다. 적절한 상기 작용제는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 약 200-8000kD의 크기 범위), 키토산 또는 메틸셀룰로오스를 포함한다.

존재할 수 있는 기타 작용제는 가교제(예를 들어, 디알데히드, 글루테르알데히드, 디티오비스-숙신이미딜프로피오네이트, 아라비아 검, 디에틸렌 글리콜, 또는 아라비아 검) 및 분자적으로 억제된 중합체 또는 하이드로겔, 예를 들어, 침전 중합에 의해 형성된 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAm) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(BIS)를 포함한다.

본 발명의 보존성 조성물에 존재할 수 있는 다른 작용제는 ATPase 억제제를 포함한다. 사용될 수 있는 적절한 ATPase 억제제는, 예를 들어, 아데노신; 아밀로라이드 히드로클로라이드; 바필로마이콘 A1(Bafilomycon A1), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus); BHQ; (-)-블레비스타틴(Blebbistatin); (±)-블레비스타틴; BTS; 부팔린(Bufalin); 2,3-부탄디온 2-모녹심; 칼미다졸륨 클로라이드; 시클로피아존산(cyclopiazonic Acid), 펜실륨 시클로피움(PencilliμM cyclopium); DPC(디페닐아민 2-카르복실산); Eq5 억제제 III, 데메틸렌아스트론(Demethylenastron); N-에틸말레이미드; 폴리마이신(Folimycin), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.); 4-히드록시노네날; 히포크렐린(Hypocrellin) B, 히포그렐라 밤부사에(Hypocrella bambusae); 마스토파란(Mastoparan); 미칼롤리드(Mycalolide) B, 미칼레 종(Mycale sp.); NC-1300-B; 올리고마이신; 오메프라졸(Omeprazole); 쿠아바인(Quabain), 옥타히드레이트; 포르볼-12,13-디부티레이트; 수라민, 나트륨염; 및 탑시가르긴(Thapsigargin)이다.

물론, 특정 기능을 제공하는 상기 나열된 성분 중 임의의 성분이 기재된 다른 기능 중 하나가 아니라 하나 이상을 이행할 수 있다.

본원에 기재된 보존성 조성물(고정/안정화/투과성 작용제)은 다양한 세포내 성분을 보존시킬 수 있다. 이중 다수의 적용이 인단백질의 보존에 관한 것이나, 다른 세포 성분(예를 들어, 번역 후 변형되지 않는 단백질; 포스파타아제 기가 아닌 부분, 예를 들어, 글리코실, 지질 또는 지질-메틸 기를 이용하여 번역 후 변형되는 단백질; 세포 소기관 등)이 또한 본 발명의 방법에 의해 보존될 수 있다. 한 구체예에서, 불안정한 세포 표면 항원 단백질을 보존하기 위해 조성물이 전혈에 첨가된다. 표면 단백질은 이들의 항원성을 보유하므로, 보존된 세포는 항원성 표면 항원에 의존하는 방법, 예를 들어, FACS 분석 또는 자성 포획에 의한 세포 분류에 의해 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 실시예 V를 참조하라.

세포 신호전달 및/또는 대사 기능이 본 발명의 조성물에 의해 보존되는지 여부를 결정하기 위해 다양한 통상적인 방법 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 절제된 조직의 물리화학적 특성이, 예를 들어, 면역조직화학, 효소학, 현미경 사용법, 또는 생화학에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 간행물[Hernandez-Cueto et al. (2000) in Am Journal Forensic Med Path. 21., 21-31] 참조). 평가될 수 있는 효소 조직화학 마커는 미토콘드리아 산화 효소 활성, 에스테라아제, 피브로넥틴, 테나신(tenascin), e-셀렉틴, p-셀렉틴, TGF-α, TGF-β, 인터루킨 10, ICAM-1, VCAM-1, 산 포스파타아제, 알칼리성 포스파타아제, 루신아미노펩티다아제 및/또는 글리코사미노글리칸과 관련된 효소이다. 수행될 수 있는 생화학적 분석은 ATP 및 이의 분해 생성물(ADP, AMP, IMP, 이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 및 요산), 브로모데옥시유리딘 DNA 합성, DNA 및/또는 RNA 중합, C3, 면역글로불린 E, A, G, M, 히스타민, 세로토닌, 카텝신 D,D-이합체 및/또는 락테이트 데히드로게나아제의 평가이다. 단백질의 인산화 상태의 분석은 통상적인 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명자들은 다양한 인단백질의 시간 경과 분석을 수행하고, 신체 절제 후의 광범위한 불안정성(예를 들어, 번역 후 변형, 예를 들어, 인산화의 상실 또는 획득)을 나타내는 마커를 확인하였다. 표 1에 나타낸 인단백질은 "특히 불안정한"("비교적 불안정한") 단백질이다. 즉, 상기 단백질은 조직 절제 후 보존제 처리시 저장 시간에 걸쳐 이들의 인산화 상태를 20% 이상 변경하였다. 엔드포인트를 세포 신호전달 경로에 의해 표에 기재하였다. 표에 기재된 특정 인산화된 아미노산 잔기가 표의 단백질의 인산화 상태를 모니터하기 위해 사용되었으나, 단백질의 다른 인산화된 잔기가 또한 모니터될 수 있다.

표 1

본 발명의 한 구체예는, 예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 단백질(예를 들어, 인단백질)의 보존 상태를 결정하는 방법이다. 상기 방법은 샘플 내의 1개 이상의 내인성 대용 마커(예를 들어, 표 1의 고도로 불안정한 내인성 대용 마커)의 인산화 상태를 측정하는 것을 포함한다. 상기 방법은 샘플 내의 다른 단백질(예를 들어, 인단백질)이 이후의 분석, 예를 들어, 진단 분자 단백체 분석, 단백질의 인산화 상태 연구 등에 사용되기에 충분히 잘 보존되어 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

단일한 내인성 대용 마커가 사용될 수 있거나, 다수의 상기 마커(예를 들어, 약 2-10개, 또는 이 이상)가 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 사용되는 표 1로부터의 대용 마커는 특히 불안정한 인단백질 STAT-1 및/또는 STAT-3(예를 들어, STAT-3), CC-3(cleaved caspae-3) 및 ASK-1이다. 표 1에 나열된 고도로 불안정한 내인성 대용 마커는 절충(compromised) 보존 상태의 초기 징후를 구성한다.

상기 인단백질에 더하여, 또는 상기 인단백질 대신에, 다른 유형의 인단백질이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 내인성 대용 마커는 특정 경로로부터의 부류; 잔기(예를 들어, 티로신, 세린 또는 트레오닌)의 부류; 및 핵, 세포질 및 세포막 구획을 포함하는 인단백질의 다양한 부류로부터 선택될 수 있다. 내인성 대용 마커는 다양한 정도의 불안정성을 나타내는 선택된 인단백질의 패널의 형태일 수 있다.

상기 논의된 인단백질에 더하여 또는 이를 대신하여, 다양한 다른 유형의 내인성 대용 마커가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 대용 마커는 안정성이 세포 집단 내의 인단백질의 보존 상태와 상관관계가 있는 비-인단백질 분자일 수 있다(예를 들어, 락테이트 데히드로게나아제, LDH, 글루코오스-6 데히드로게나아제, 글루코오스 옥시다아제 등).

한 구체예에서, 내인성 대용 마커는 표 2에 나열된 인단백질 중 1개 이상, 및/또는 p-셀렉틴, e-셀렉틴, IL-2, IL-6, IL-8 또는 피브로넥틴 중 1개 이상을 포함한다.

표 2: 유효한 인단백질 엔드포인트 및 참조 인펩티드(phosphopeptide).

보존의 부재하에서 피검체로부터의 샘플의 제거 후 초기, 중기 또는 후기에 불안정한 마커가 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 다른 내인성 대용 마커는 염증의 마커이다. 절제된 조직은 세포 신호전달 경로의 활성화와 관련하여 본질적으로 상처가 있거나 외상이 있는 조직이다. 상처 생명력(Wound vitality)은 법의병리학에서 널리 특성규명되어 있다. 상처 치유의 단계는 통상적으로 염증, 혈관형성, 상피화 및 조직 리모델링의 4개의 경로를 따른다. 따라서, 절제된 조직은 외상, 환경 스트레스, 저산소증, 프로생존 신호 및 아폽토시스 신호에 기초하여 세포 신호전달 활성화의 유사한 단계를 지니는 것으로 예상된다. 염증의 적절한 내인성 대용 마커는, 예를 들어, 하기를 포함한다:

세포-세포 부착 - PAX, Src, FAK, p130cas, 코필린(Cofilin), 피브로넥틴, 액틴, ICAM-1 , VCAM-1, e-셀렉틴, p-셀렉틴;

사이토카인 - TNFα, 인터루킨-1(IL-1), IL1β, IL-6, IL-8, p38MAPK, ERK, SAPK/JNK, IKK, IkB, NFKβ;

스트레스의 대용 마커: IL-6, iNOS, eNOS, Jak1/2, Stat3, Stat5, Stat1, Shp2, Grb2, MEK, ERK;

저산소증의 대용 마커: HIF-1α, AMPKα, AMPKβ, AMPKγ, PKA, LKB1, 아세틸CoA 카르복실라아제, 시토크롬 c, C0X2;

프로생존의 대용 마커: AKT, mTOR, 4EBP1, p70S6, eIF4G, eIF4E, GSK3β;

아폽토시스의 대용 마커: 아넥신, TNFα, AKS-1, IKK, IkB, NFKB, 카스파아제 3, 6, 7, 9, JNK, Bcl-2, BCL-XL, Bax, Bak, Bad, Smac/Diablo, Apaf-1, 시토크롬 c, 라민 A(Lamin A).

내인성 대용 마커의 측정은 하기 기재되는 바와 같이 센티넬이 이용이 불가능한 경우 샘플의 보존 상태를 결정하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 센티넬이 이용가능할 수 없거나, 분석되는 조직이 보관용 조직인 경우, 신체로부터의 조직의 분리 후 센티넬이 첨가되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태는 2개의 상이한 시점에서 샘플 내의 단백질의 보존 상태를 모니터하는데 사용될 수 있는 센티넬(외인성 센티넬)이다. 본 발명의 센티넬은 본원에 논의된 (내인성) 대용 마커 중 1개 이상에 부착(회합, 결합, 고정)되는 미립자 실체를 포함한다. 센티넬에 부착되는 경우, 마커는 더 이상 "내인성"이 아니므로, 이들은 종종 본원에서 "대용 마커" 또는 "대용 인단백질"로 언급된다. 당업자에게 명백할 본원에 논의된 대용 마커 중 임의의 마커 또는 기타 적절한 마커가 본 발명의 센티넬에 부착될 수 있다.

미립자 실체(entity)는 첫번째로 샘플과 접촉된 후, 센티넬에 부착된 단백질 마커(들)의 보존 상태(예를 들어, 인산화 상태)의 결정을 위해 두번째로 샘플로부터 분리될 수 있는 임의의 존재물일 수 있다. 예를 들어, 미립자 물질은 하이드로겔, 실리콘, 다공성 비활성 점토, 폴리스티렌 또는 기타 중합체, 또는 콜로이드 금으로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 미립자 물질은 나노입자, 예를 들어, 시클로덱스트린 또는 금속 나노입자(예를 들어, 자성 나노입자)이다. 센티넬은 임의의 다양한 방법에 의해 샘플로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 이는 원심분리(샘플의 회전)되거나, 크기에 의하거나 적절한 태그의 사용에 의해 분리될 수 있다. 자성 나노입자는 자성 감소를 통해 표본의 세포 용해물로부터 분리될 수 있다.

센티넬은 샘플이 피검체로부터 분리되는 시간과 샘플이 분자 특성규명과 같은 절차에 적용되는 시간 사이에서 샘플 내의 단백질의 안정성을 모니터하는데 사용될 수 있다. 이후, 센티넬에 부착되는 대용 마커 상의 인(phospho) 기의 존재 또는 부재, 또는 수준이 측정될 수 있고, 가공 내역을 평가하기 위해 센티넬이 먼저 표본으로 도입되는 경우의 수준과 비교될 수 있다. 이러한 객관적 표준을 통해, 조직 인단백체에 대한 가공 변수의 영향이 실험실 표본 품질 조절 평가의 일부로서 측정될 수 있다. 한 구체예에서, 피검체로부터의 샘플의 분리와 절차의 시작(예를 들어, 고정화/보존 상태) 사이의 시간의 총계를 결정하는데 센티넬이 사용된다.

샘플은, 예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물일 수 있다.

본 발명의 한 양태는 2개의 상이한 시점에서 샘플(예를 들어, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플) 내의 단백질의 보존 상태를 결정하는 방법이다. 상기 방법은 첫번째 시점에서 샘플을 1개 이상의 대용 마커, 예를 들어, 본원에 논의된 고도로 불안정한 인단백질에 부착(이와 회합)된 센티넬과 접촉시키고; 두번째 시점에서(예를 들어, 샘플 내의 단백질의 이후의 분석을 방해하지 않는 조건하에서) 샘플로부터 센티넬을 분리시키고; 샘플로부터 센티넬을 분리시키고; 두 시점에서 센티넬에 부착(이와 회합)된 단백질의 인산화 상태를 측정하고 비교하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "센티넬"은 1개 이상의 센티넬을 포함한다. 예를 들어, 단일한 센티넬이 사용될 수 있거나, 동일하거나 상이할 수 있는 다수(예를 들어, 패널)의 센티넬이 사용될 수 있다. 각각의 센티넬은 동일하거나 상이할 수 있는 1개 이상의 대용 마커를 함유할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 샘플은 세포 또는 조직을 포함하고, 상기 방법은 첫번째 시점(예를 들어, 센티넬이 세포로 진입하기에 효과적인 조건하에서)에서 샘플 내의 세포와 센티넬을 접촉시키고; 두번째 시점(예를 들어, 샘플 내의 단백질의 이후의 분석을 방해하지 않는 조건하에서)에서 샘플 내의 세포로부터 센티넬을 분리하고; 두 시점에서 센티넬에 대한 대용 마커(들)의 인산화 수준을 분석하고 비교하는 것을 포함한다. 센티넬은 투과 작용제의 존재하에서 세포로 도입될 수 있다.

한 구체예에서, 1개 이상의 센티넬 분자가 가공 전의 시점, 예를 들어, 수집시에 샘플에 첨가되고; 가공 후, 센티넬(들)은 샘플로부터 분리되고 특성규명된다(예를 들어, 분자의 인산화 상태가 분석된다). 본 발명의 센티넬의 추가의 논의를 위해서는 실시예 Ⅳ 및 도 9를 참조하라.

한 구체예에서, 센티넬에 존재하는 인단백체 엔드포인트는 특히 불안정하고, 짧은 반감기를 지닌다(예를 들어, 표 1의 인단백질로부터 선택된 인단백질). 본원에 논의된 바와 같이, 용어 "인단백질"은 인펩티드를 포함하는 임의의 적절한 크기의 폴리펩티드를 포함한다. 1개 이상(예를 들어, 2, 5, 10개 또는 이 이상)의 상기 엔드포인트가 센티넬(예를 들어, 나노입자 센티넬)로 통합되어, 대규모로 생성될 수 있는 화학적으로 규명된 센티넬(나노입자 센티넬)이 생성될 수 있다.

나노입자는 살아 있는 조직으로 주입될 수 있고, 이에 침투할 수 있다(예를 들어, 문헌[Muldoon et al. (1995) Am J Pathol 147, 1840-1851] 참조). 예를 들어, 단결정 산화철 나노입자(덱스트란의 외부 코어를 지니는 5 nm의 직경, 대략 20 nm의 전체 입자 크기를 발생시킴)가 래트의 뇌로 주사될 수 있고, 상기 입자가 입자의 크기보다 수배의 거리인 대략 7.93 mm의 길이에 걸친 뇌의 피질을 투과하는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 센티넬(예를 들어, 나노입자 센티넬)을 제조하고, 적절한 마커 단백질을 이에 부착시키기 위해 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 대용 단백질 마커는 통상적인 방법, 예를 들어, 링커를 통해 센티넬(예를 들어, 나노입자)에 부착(이와 회합, 이에 결합, 이에 고정)될 수 있다. 예를 들어, 실란 코팅을 지니는 자성 철 나노입자가 NHS 작용기의 첨가를 통해 유도체화될 수 있다. 이는 합성된 펩티드의 아미노 말단에 대한 결합 부위를 제공한다. 센티넬로 작용하는 인펩티드의 수집물(예를 들어, 1, 2, 5, 10개 또는 이 이상의 인펩티드)이 합성된다(예를 들어, 약 95%의 순도). 펩티드는 스페이서 성분으로 제공되는 글리신의 아미노 말단 스트레치(stretch)를 함유할 수 있다. 상기 펩티드의 인산화된 형태를 특이적으로 인지하는 항체가 이용가능하다. 다수의 상기 항체가 인단백질의 인산화 상태의 모니터링에 유효하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 단일한 표본 용기(예를 들어, 통상적으로 생검 샘플을 저장하기 위해 사용되는 통상적인 메시 백(mesh bag) 또는 파우치(pouch))는 본 발명의 보존성 조성물과 1개 이상의 센티넬의 배합물로 미리 충전된다. 수술실(O.R.) 또는 외래환자 병원에서의 절제 직후, 조직 표본은 특화된 용기에 보관된다. 용기 및 표본은 수송 또는 선적 동안 실온에서 안정적이다. 임상 실험실에서, 센티넬 첨가물이 가공 및 분석 단계 동안 품질 보장 데이터를 수집하고, 조절(College of American Pathologists[CAP]/Clinical Laboratory Improvement Act [CLIA]) 표준을 뒷받침하기 위해 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 보존제 및 센티넬은 육안 검사, 조직학 또는 형태학을 변경시키지 않으며, 양적인 단백질 엔드포인트의 수율을 최대화시킨다. 용기로부터 조직의 분리 후, 내인성 대용 엔드포인트의 측정이, 예를 들어, 분자 분석 또는 뱅킹(banking)을 위한 표본의 허용을 적합화시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 메시 파우치에 키나아제 또는 포스파타아제의 단백질성 억제제를 포함하는 단백질성 성분과 같은 본 발명의 보존성 조성물의 불안정한 성분이 채워지고; 이러한 불안정한 성분은 이후 건조되어 이들이 액체 형태로 보관되는 경우보다 긴 저장 수명을 지니도록 한다. 샘플이 메시 파우치에 배치된 후, 보존성 용액의 나머지 액체 성분이 파우치에 첨가됨으로써, 보존성 용액이 재구성되고, 이는 샘플이 고정되고 안정화되도록 한다.

또 다른 구체예에서, 메시 파우치에는 본 발명의 샘플 및/또는 보존성 용액과 접촉되는 경우 1-15분 이내에 65℃를 초과하는 온도로 상승시키는 단기간의 강렬한 열 폭발을 방출함으로써, 조직을 변성시키고 보존성을 돕는 화합물이 채워진다. 열 발생 화합물은 발열 반응을 발생시키는 당 분야에 공지된 임의의 건조된 작용제, 예를 들어, 핸드 워머(hand warmer) 및 난로를 포함하지 않는 요리에서 사용되는 화학 물질(예를 들어, 과망간산칼륨, 산화망간, 염소산칼륨, 과산화바륨, 질산칼륨, 금속, 반금속, 금속 합금 또는 금속-반금속 합금)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에 유용한 키트이다. 이러한 키트는 본 발명의 조성물(예를 들어, 샘플 내의 단백질을 고정시키고 안정화시키는 조성물; 본 발명의 내인성 대용 마커 또는 센티넬 상의 대용 마커의 인산화의 양을 측정하기 위한 시약, 예를 들어, 특이적 항체; 및/또는 본 발명의 센티넬을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 (1개 이상의) 용기 또는 패키징 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는, 예를 들어, 추가 분석, 뱅킹 또는 실험 적용을 위해 피검체로부터 샘플을 제조하는데 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법 중 임의의 방법을 수행하는데 적합한 키트의 성분 등을 인지할 것이다.

임의로, 키트는 상기 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 본 발명의 키트의 임의의 성분은 적절한 완충용액, 약학적으로 허용되는 담체 등, 용기, 또는 패키징 물질을 포함한다. 키트의 시약은, 예를 들어, 동결건조 형태 또는 건조된 형태 또는 안정화된 액체에서와 같이 시약이 안정적인 용기 내에 존재할 수 있다. 시약은 또한, 예를 들어, 단일 환자 샘플의 보존을 위한 단일한 사용 형태, 또는 단일한 환자로부터의 다수의 샘플의 단일 사용 형태로 존재할 수 있다.

키트에 존재하는 본 발명의 보존성 조성물의 성분은 액체 형태, 건조 형태 또는 둘 모두의 형태일 수 있다. 분해로부터 보호하기 위해, 불안정한 성분(예를 들어, 단백질성 성분)이 건조 형태로 존재할 수 있고, 나머지 성분은 액체 형태로 존재할 수 있다. 건조된 성분은 표면 상에 코팅을 형성할 수 있고, 이들은 조성물의 나머지 성분을 포함하는 액체와 접촉함으로써 재구성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 보존성 조성물을 함유하는 제 2 챔버에 연결된 샘플의 특정 부피를 제거하거나 획득하는 제 1 챔버(예를 들어, 바늘)를 포함하여, 1회 수행으로 보존성 조성물을 함유하는 챔버 내의 보존제에 샘플이 획득되고 침지되는, 피검체로부터의 세포 또는 조직 표본을 수거하고 보존하는 장치이다. 한 구체예에서, 제 2 챔버는 이동가능하고, 조직 섹셔닝, 분자 가공 등에 직접 사용될 수 있다. 예를 들어, 제 2 챔버는 보존 조직의 저장 및 우송을 위한 다목적 용기일 수 있고/있거나; 이는 조직 섹셔닝을 위한 자동화 또는 반자동화 시스템이 직접적으로 조화될 수 있는 출구 영역을 함유할 수 있다.

전술한 기재사항 및 하기 실시예에서, 모든 온도는 보정되지 않은 섭씨이며; 달리 지시되지 않는 경우 모든 부(part) 및 백분율은 중량을 기준으로 한다.

실시예 1. 재료 및 방법

A. 역상 단백질 어레이( RPA ) - 조직 및 세포 내의 인단백질의 정량. 본 발명자 및 협력자에 의해 개발된 RPA 포맷(예를 들어, 문헌[Paweletz et al. (2001) Oncogene 20, 1981-1989)] 참조)으로 소형 희석 곡선에 개별적 시험 샘플을 고정시켜, 어레이가 수백개의 상이한 환자의 샘플, 치료제 또는 시점을 포함하도록 하였다. RPA 포맷에서, 각각의 어레이를 1개의 검출 단백질(예를 들어, 항-펩티드 항체)과 인큐베이션시키고, 단일 분석물 엔드포인트를 측정하고, 다수의 샘플에 걸쳐 비교하였다. 간단하게, 용해물을 로봇식 어레이 프린팅 장치(GMS 417 arrayer (Affymetrix, Santa Clara, CA or Aushon 2470, Aushon Biosystems, Burlington, MA equipped with 125 - 500 μm pins)를 이용하여 유리로 등을 댄 니트로셀룰로오스 어레이 슬라이드(FAST Slides Whatman, Florham Park, NJ or ONCYTE slides Grace BioLabs, Bend, OR)에 프린팅하였다. 각각의 용해물을 비희석(neat), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 및 음성 대조군 희석을 나타내는 희석 곡선에 프린팅하였다. 슬라이드를 면역염색 전에 -20℃에서 건조제(Drierite, W. A. Hammond, Xenia, OH)와 함께 저장하였다.

현재까지, 본 발명자들은 광범위한 분석물을 인지하는 150개의 유효한 항체를 확인하였다(예를 들어, 문헌[Gulmann et al. (2005) Clin Cancer Res 11, 5847-5855; Sheehan et al. (2005) Mol Cell Proteomics 4, 346-355; Davidson et al. (2006) Clin Cancer Res 12, 791-799; Nishizuka et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 14229-14234; Petricoin et al. (2005) J Clin Oncol 23, 3614-3621; Wulfkuhle et al. (2003) Proteomics 3, 2085-2090)] 및 표 2 참조).

B. 단백질 마이크로어레이 면역염색. 면역염색을 제조업체의 설명서에 따라 자동화 슬라이드 염색기에서 수행하였다(Autostainer CSA kit, Dako, Carpinteria, CA). 각각의 슬라이드를 30분 동안 실온에서 단일 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 폴리클로날 일차 항체는, 예를 들어, GSK3α/β Tyr279/216(Invitrogen-Biosource, Carlsbad, CA), BCL-2, HIF-1α(BD, Franklin Lakes, NJ), 4EBP1, FKHR ser256, eIF4E, eIF4E ser209, eIF4G, eIF4G ser1108, IGFR-β, IRS-1, IRS-2, IRS-1 ser612, SGK, Bak, Bax, BAD, BAD ser112, BAD ser136, BAD ser155, B-Raf, mTOR, mTOR ser2448, p70S6 Thr389, p70S6 키나아제, p70S6 ser371, S6 키나아제 ser240/244, Akt, Akt ser473, Akt Thr308, 4EBP1 ser65, 4EBP1 ser70, 및 4EBP1 Thr37/46(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)일 수 있다. 음성 대조군 슬라이드를 항체 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 이차 항체는 염소 항-래빗IgG H+L(1:5000)일 수 있다(Vector Labs, Burlingame, CA).

C. 마이크로어레이 분석을 위한 생물정보학( Bioinformatics ) 방법. 각각의 어레이는 스캐닝되고, 스폿 강도가 분석되고, 데이터가 표준화되고, 규격화되고, 단일 데이터 값이 어레이(Image Quant v5.2, GE Healthcare, Piscataway, NJ) 또는 MicroVigene v2.8(Vigene Tech, Billerica, MA)에서 각각의 샘플에 대해 발생될 수 있다. 스폿 강도는 고정된 영역에 걸쳐 통합된다. 국소 영역 백그라운드 강도가 프린팅되지 않은 인접한 슬라이드 백그라운드를 이용하여 각각의 스폿에 대해 계산된다. 이는 어레이 상의 모든 다른 스폿에 대한 비교를 위한 각각의 샘플에 대한 단일 데이터 포인트를 발생시킨다. 이차원 계층적 군집(two-way hierarchical clustering)을 위한 워드(Ward) 방법이 JMP v5.0을 이용하여 수행될 수 있다(SAS Institute, Cary NC). 두 그룹 사이의 값을 비교하기 위해 윌콕슨 2-샘플 순위합 검정(Wilcoxon two-sample rank sum test)이 사용될 수 있다. 0.05 미만의 P 값이 유의한 것으로 간주된다. 변수의 정규 분포를 추정할 수 없는 경우, 비-모수 방법이 사용된다. 다변량(univariate) 생존 분석을 위한 카플란-마이어 (로그-순위) 생존 추정분석(Kaplan-Meier (log-rank) survival estimate)이 사용될 수 있다.

실시예 Ⅱ. 인간 조직 인단백질 안정성 시간 경과 분석("실-사회" 병원 환경에서의 분석)

다음과 같은 큰 조직 표본으로부터 획득된 조직 상의 인단백질 잔기 엔드포인트의 시간 경과 분석을 수행하기 위해 RPA 마이크로어레이 기술을 사용하였다: a) 질병에 걸리지 않은 자궁 내막 및 자궁근육층, b) 자궁 근종, c) 영향을 받지 않은 결장 점막 및 점막밑층, d) 영향을 받지 않은 폐, 및 e) 폐 샘암종. '0 시간' 창('time zero" window)을 일괄하기 위한 수단으로서 환자로부터의 획득 직후에 발생하는 기간, 예를 들어 5분, 10분 및 20분에 특별히 중점을 두었다. 이를 수행하여, 37℃로부터 실온으로의 조직의 냉각으로 인한 가장 초기의 변화를 관찰할 수 있었다. 자궁에 대해, 본 발명자들은 또한 90분까지 시점을 확장하여 샘플을 조사하였다. 성장 인자 수용체, 프로-생존, 및 스트레스 경로 관련 단백질에 걸치도록 엔드포인트를 선택하였다(도 2). 각각의 시점의 샘플의 세포 내용물은 16 게이지의 코어 바늘 생검의 부피를 나타내었다. 8 마이크론으로 절단된 20개의 연속 동결 섹션을 가공하고 용해시켰다. 각각의 신호전달 단백질 엔드포인트를 전체 세포 단백질 내용물에 대해 표준화시켰다. 모든 엔드포인트가 수율, 직선성 및 정밀도에 대해 이전에 유효함이 확인되었다(Sheehan et al. (2005), 상기). 인단백질 엔드포인트 수준의 변화를 조직 획득의 중간점에서 측정된 정량적 값의 백분율로 나타내었다.

결과. 1) 수율: 수득된 조직 세포 부피는 매우 적절하였고, 각각의 인단백질 엔드포인트를 백그라운드의 10배를 훨씬 초과하는 범위에서 측정(일차 항체를 지니지 않는 값)하고, 분석의 직선 범위 내에서 측정하였다. 150㎕ 부피의 각각의 조직 샘플 시점의 용해물에 대해 5% 미만을 도 2에 나타낸 12개의 엔드포인트를 분석하기 위해 사용하였다. 2) 안정성 시간 경과: 도 2A-2E에 나타난 바와 같이, 획득 직후, 선택된 인단백질 표적에서 변동이 발생하였다. 몇몇 엔드포인트는 시간 경과에 따라 일시적으로 증가한 반면, 나머지는 느린 감소를 나타내었다. 도 2A-2E에 나타낸 인단백질은 조직의 안정화 상태를 판단하기 위해 사용될 수 있는 내인성 대용 패널의 통상적인 일원을 나타낸다. 본 발명의 한 구체예에서, 연구자들은 관심 샘플(예를 들어, 세포 또는 조직을 포함함)이 분자 진단 분석에 적용되기에 적절한 상태의 보존으로 존재하는지의 여부를 결정한다. 또 다른 구체예에서, 연구자들은 관심 샘플이 피검체로부터 분리된 기간이 얼마나 되는 지의 여부를 결정할 수 있다. 이러한 구체예에서, 연구자들은 내인성 인단백질 중 1개 이상의 인산화 상태를 시간에 따른 단백질의 인산화 상태를 나타내는 교정 곡선과 비교한다. 본원에 나타낸 데이터는 제안된 대용의 실행가능성 및 선택된 방법의 적합성을 뒷받침한다.

추가로, 자궁 조직만을 시험하고, 선택된 엔드포인트가 프로생존, 스트레스 및 아폽토시스 경로 내에 존재하는 것을 제외하고는, 상기와 같이 시간 경과를 수행하였다. 실온 및 4℃에서의 시간 경과의 디자인은 도 3에 나타내었다. 인산화 상태의 변화는 4℃에서 느려졌으나, 없어지지는 않았다. 실시예에 제시된 시간 경과로부터, 내인성 마커가 다양한 용도를 위한 대용 마커로 제공될 수 있음이 명백해졌다.

실시예 Ⅲ. 조직 인단백질 안정화제의 확인

다음과 같은 고정제 및/또는 안정화제 중 1개 이상의 배합물을 함유하는 후보 보존제 용액을 평가하였다: a) 시판되는 포스파타아제 억제제, b) 시판되는 키나아제 및 단백분해효소 억제제, c) 30% 수크로오스, 15% 트레할로오스 안정화제, d) 시판되는 PreservCyt, e) 시판되는 CytoLyt, f) 약한 세제, 및 g) 침전 고정제(예를 들어, 표 3 및 4 및 도 4 및 5). 상기 분석에 기초하여 적절한 배합물을 선택하여, 24시간 동안 실온 또는 4℃ 저장에 효과적인 보존제 후보가 생성될 수 있었다.

표 3

표 4

고정 연구

첫번째 연구

미세침 흡입(FNA) 샘플을 인단백체 보존 및 고정을 위한 10개의 상이한 화학적 안정화제에서 연구하였다(화학적 제형에 대해서는 표 3 참조). 액체 실험의 결과를 도 4에 나타내고, 인단백질의 상대 보존에 대해, 물에서의 다양한 농도를 비교하는 에탄올/메탄올 침전 고정제를 24시간에서 서로 비교하였다.

이후, 본 발명자들은 동결 섹션 또는 미세절제물의 절단을 가능케 하고, 인단백질 안정성을 달성하는 능력에 대해 다양한 용액을 시험하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 에탄올 단독, 아세톤 단독, PEG 단독 또는 이들의 배합물이 상기 용량에서 잘 작용하지 않음을 발견하였다. 그러나, 물과 낮은 백분율의 메탄올 또는 에탄올의 배합물이 사용되는 경우(예를 들어, 수중 10% 메탄올), 동결이 방해되지 않고, 동결된 섹션이 절단될 수 있고, LCM(레이저 포획 미세절제)에 대해 조직학이 허용된다(표 2). 예를 들어, 동결 섹션의 제조에 적합한 조건에 대해서는 또한 도 11 및 12를 참조하라.

본 발명자들은 급속 동결된 샘플에 대해 실시간의 메탄올:물 또는 에탄올:물 고정제 중에서의 실온 적하 조건으로부터 인단백질을 비교하였다. 도 6A, 6B 및 7에 나타난 바와 같이, 연구된 선택 엔드포인트는 두 방법의 동등성을 나타내었다.

인단백질 고정제를 추가로 평가하기 위한 두번째 연구

후보 조직 인단백질 안정화제를 확인하기 위한 추가 연구에서, 다양한 억제제의 조합물을 이용하여 다양한 고정제 베이스를 시험하였다. 연구를 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

표 2 및 3에 나열된 일련의 화학물질을 인단백질 엔드포인트의 안정화에 대해 시험하였다. 4개의 상이한 안정화 화학물질을 선택된 인단백질 엔드포인트의 보존에 대해 비교하였다. 26개의 엔드포인트를 다양한 경로에 걸쳐 평가하였다(표 1). CC3 D175, STAT1 Y701 , ASKl Ser83, EGFR Y1148의 연구를 위해 선택된 4개의 불안정한 인단백질 엔드포인트가 처음 30-90분 이내에 변동하는 것을 발견하였다. 데이터는 후보 보존제에 침지된 24시간에 대한 절제 15분 후의 값을 비교시, 고정제 및 첨가제의 유형이 개별적 조직 분석물의 보존에 영향을 주는 것을 입증한다. 프로테아제, 키나아제 및 포스파타아제 억제제의 첨가는 특정 엔드포인트의 안정에 필요한 것으로 보인다.

인단백질 고정제를 추가로 평가하기 위한 세번째 연구

결장 조직을 85% 에탄올에 고정시키고, 동결시키고, 섹셔닝하였다. 이러한 절차는 적어도 조직이 OCT에 결합하지 않음으로써 동결 섹션 내에 구멍을 남기므로, 조직이 동결 섹션에 적합하지 않게 한다. OCT는 조직이 아교에 배치되어 동결 섹션이 절단되는 것을 중지시키는 당 분야에 인지된 표준 젤이다. OCT 젤은 조직으로 분출되고, 전체 블록은 동결된 후, 슬라이싱(slicing)된다. 약 85% 메탄올과 같이 항-동결제로 작용하는 높은 백분율의 다른 고정제에서의 보존이 또한 동결에 대해 적절하지 않은 것이 밝혀졌다. 대조적으로, 현저히 낮은 백분율의 고정제(예를 들어, 40% 메탄올)를 함유하는 보존제에 고정되고, 30일 동안 4℃에서 저장된 후, 동결되고, 섹셔닝된 조직(예를 들어, 유방 조직)은 평탄한 동결 섹션을 발생시켰고, 구멍은 없었다. 상기 고정 및 슬라이싱 절차 동안 포르말린 또는 파라핀이 사용되지 않았다.

형태를 보존하기 위한 조건을 평가하기 위한 네번째 연구

형태의 보존은 진단 및 미세절제 둘 모두에 중요하다. 세포하 세포 소기관의 형태 보존은 조직의 내부 집단으로의 침전 고정제의 투과의 조직학적 척도이다. 본 실시예(도 11 및 12에 예시되어 있음)는 본 발명의 조성물에서의 24시간의 조직 인큐베이션 후 조직 형태에 대한 투과성 증강제 PEG의 첨가의 극적인 효과를 입증한다. 예를 들어, 핵 형태는 PEG의 부재하에서의 상피 세포 핵의 보존의 완전한 결핍(도 114D)과 대조적으로, 투과성 증강제 PEG의 존재하에서의 내부 조직 집단에서의 상피샘에 대해 잘 보존되어 있다(도 11F). 도 12에 나타난 바와 같이, 이러한 조성물(화학물질)은 95%를 초과하는 효율을 지닌 레이저 포획 미세절제에 적합하다.

인단백질을 안정화시키기 위한 통상적인 고정제의 실패를 나타내는 다섯번째 연구

보존제가 선택된 인단백질을 안정화시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 다양한 유형의 종양 조직을 일련의 통상적인 보존제에서 인큐베이션하였다. 표 5에 나타난 바와 같이, 종합적으로, 시험된 보존제는 시험된 인단백질 대부분을 안정화시킬 수 없었다.

간단하게, 가스트린종/간, 중피종 및 부갑상선 종양으로부터의 종양 조직을 5회의 바늘 통과에 의해 샘플 채취하고, 표 5에 나열된 보존제에 두었다. "용해 완충용액"으로 표지된 샘플을 용해 후 즉시 동결시켰고, 따라서 이는 인단백질이 임의의 분해를 겪지 않은 양성 대조군이었다. 세포 단백질의 즉시 용해 및 변성을 표준 피어스(Pierce) 조직 단백질 추출 키트(T-PER)와 함께 추가적인 SDS, 변성 시약 및 세제에 의해 달성하였다. 세포 샘플을 4℃에서 나열된 보존제에서 24시간 동안 저장한 후, 나열된 인단백질 엔드포인트를 측정하였다. RPMI 배지에서, 조직은 살아 있는 채로 유지되었고, 인단백질 값에서의 폭넓은 변동이 인식되었다. 일부 값은 0으로 감소한 반면, 나머지는 새로이 용해된 세포 기준에 비해 현저하게 상승하였다. 특히, 세포 병상에 대한 표준 침전 고정제인 PreservCyt 및 70% 에탄올이 엔드포인트의 유의한 재현가능한 분해를 발생시켰다. 이들은 세포 또는 조직 적하에 대한 통상적인 시간 지연인 24시간의 저장 기간에 걸쳐 중요한 신호 단백질의 인산화 상태를 안정화시킬 수 없었다. 표의 수는 본원에 기재된 RPA 기술을 이용한 상대 표준화 강도 값이다.

표 5

포스파타아제 억제제 또는 키나아제 억제제의 효과를 나타내는 여섯번째 연구

유방 종양 및 유방 지방 조직으로부터의 샘플을 실온에서 210분 동안 하기의 안정화 첨가물을 함유하는 3개의 고정 조성물 중 1개에 배치하였다: HBSS(Hank's buffered saline solution) 단독; HBSS + 포스파타아제 억제제, 오르쏘바나데이트(100-400mM) 및 베타 글리세로포스페이트(375mM - 1.5M); 또는 HBSS + 키나아제 억제제, 스타우로스포린(5.0μM - 20.0μM) 및 제니스테인(genistein)(0.5μM - 2.0μM). 샘플을 도 8에 나타낸 시점에서 분리시키고, AcCoA(S79), AKT(S473), E-카드헤린, HSP90, IKBa(S32), CC3(Asp175), CC9(Asp330), VEGFR2(Y1175), STAT3(S727), ASK1(S83), MARCKS(S152), ERK(T202/Y204), 베타 카테닌(S33/S37/T41), IRS-1(S612), SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) 및 Her3(Tyr1289)을 포함하는 다양한 인-엔드포인트의 인산화 수준에 대해 본원 다른 곳에 기재되어 있는 RPMA 절차에 의해 분석하였다.

인산화 정도는 시험된 인-엔드포인트에서 매우 다양하였고, 이는 복잡한 대사 사건(단백질로부터의 포스페이트 기의 추가와 제거 사이의 균형)을 반영한다. 모든 예에서, HBSS 단독에서의 조직의 인큐베이션은 시간에 따른 번역후 변형된 단백질의 수준을 감소시켰다(도 8A-D). 포스파타아제 억제제의 존재하에서의 과-인산화의 예로서, 포스파타아제 억제제 단독(HBSS+Phos Inhib)의 존재는 HBSS 단독 또는 HBSS+키나아제 억제제에 비해 시간에 따른 SAPK/JNK Thr183/Tyr185 및 Her3 Tyr1289의 증가된 수준을 발생시켰다(SAPK/JNK 및 Her3에 대해서는 각각 도 8A 및 8C 참조). 키나아제 억제제 단독의 존재하에서, 이러한 동일한 인단백질 수준은 시간에 따라 비교적 안정적인 채로 유지되었다. 다른 엔드포인트(예를 들어, 베타 카테닌(S33/S37/T41))인 HBSS+키나아제 억제제는 다른 2개의 고정제 조성물 중 어느 하나에 비해 시간에 따라 인산화의 수준을 안정화시켰다(도 8B). 다른 것(예를 들어, CC3(Asp175))에 비해, 포스파타아제 또는 키나아제 억제제의 첨가는 HBSS 단독에 비해 단백질의 분리된 형태를 안정화시켰다(도 8D). 이러한 발견은 세포 또는 조직을 고정시키는 경우 적절히 균형을 이룬 양의 포스파타아제 및 키나아제 억제제 둘 모두를 포함시키는 것이 바람직함으로 역설한다.

실시예 Ⅳ. 나노입자-기재 인단백체 센티넬

인산화된 단백질을 포함하는 나노입자는 샘플 내의 인단백질의 보존 상태에 대한 마커로 제공될 수 있다.

본 실시예에서, 나노입자는 다양한 두께의 조직과 인큐베이션된다. 형광 표지된 입자에 의한 조직의 투과는 현미경에 의해 입증된다. 요망시, 조직은 동결된 섹션으로 절단될 수 있고, 선택된 세포는 레이저 포획 미세절제를 이용하여 분리될 수 있다. 세포(동결되거나 실온)는 용해되고, 이의 내용물은 가용화된다. 방출된 입자는 이후 자석을 이용하여 세포 용해물로부터 정제된다. 세척 후, 정제된 입자는 마이크로어레이(예를 들어, 단백질 용해물이 RPMA를 이용하여 측정됨에 따라 동일한 기판 상)에 배열된다. 나노입자로부터의 인특이적 에피토프의 손실은 세포 단백질 용해물 내의 인단백체 엔드포인트에서의 변화와 비교된다.

실시예 Ⅴ. 유세포 분석 동안의 세포 크기 및 형태에 대한 본 발명의 보존성 조성물의 효과 분석

세포 표면 수용체 당단백질인 CD4를 항체-항원 상호작용 및 세포 크기 및 형태에 대한 보존성 조성물의 효과의 평가를 위한 대표적인 단백질로서 선택하였다. CD4는 T-세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면에서 발현되고, 따라서 이는 백혈구(WBC)를 함유하는 말초 혈액 샘플에 존재할 것이다.

말초 혈액을 풍부한(enriched) WBC 공급원을 제공하기 위해 피콜(Ficoll) 밀도 구배 매질로 처리하였다(버피(buffy) 코트). 이러한 버피 코트 세포 현탁액을 유세포 분석을 위해 4개의 분취량으로 나누었다: 1. 동형 항체 염색을 위한 처리되지 않은 세포; 2. 보존제로 처리된 후 염색된 세포(10-20% 에탄올, 0.5-5% PEG, 오르쏘바나데이트(100-400mM), 베타 글리세로포스페이트(375mM - 1.5M), 스타우로스포린(5.0μM - 20.0μM) 및 제니스테인(0.5μM - 2.0μM)를 지닌 HBSS); 3. 먼저 염색된 후 보존제로 처리된 세포; 또는 4. 처리되지 않은, 보존제 미처리 세포(대조군).

이러한 분석의 결과를 도 13에 나타냈다. 처리되지 않은 세포에 비한 고정제 조성물로 처리된 세포에 대해서, 정방향 분산 분석(Forward scatter analysis)은 세포 크기의 일관성을 나타내고, 측면 분산 분석은 세포 형태의 일관성을 나타낸다. (A) FITC 컨쥬게이션된 동형 항체 대조군(IgG₁, kappa)으로 염색된 미처리된 세포. (B) 본원에 기재된 고정제 조성물로 20분 동안 고정된 세포. 이후, 세포를 2회 세척하고, 항-CD4-FITC로 염색하였다. (C) 먼저 항-CD4-FITC로 염색되고, 2회 세척되고, 이후 본원에 기재된 고정 조성물로 고정된 세포. (D) 항-CD4-FITC로 염색되고, 2회 세척되고, 유세포 분석으로 분석된 미처리 세포(고정제 없음). 보존성 조성물의 첨가는 세포의 크기 또는 형태에 현저히 영향을 주지 않았고, 유세포 분석을 위한 항체 염색을 방해하지 않았다.

상술된 기재로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 이해할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이, 다양한 용도 및 조건에 적합시키고, 최대한 범위로 본 발명을 이용하기 위해 본 발명의 변경 및 변화가 이루어질 수 있다. 상기 바람직한 특정 구체예는 단지 예시로 간주되어야 하며, 이는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 2006년 10월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 제60/855,120호 및 2006년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 제60/861,086호를 포함하는 상기 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 기재내용 및 수는 이의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.

Claims

실온에서, 인단백질(phosphoprotein)을 포함하는 샘플과 접촉시, 상기 인단백질을 고정 및 안정화시킬 수 있고, 세포 형태를 보존시킬 수 있고, 상기 샘플이 동결되게 하여 분자 분석에 적합한 크라이오스태트(cryostat) 동결 섹션을 생성시킬 수 있는 조성물로서,

a. 상기 인단백질을 고정시키는데 효과적이고, 안정화제(stabilizer) 및/또는 투과성 증강제(permeability enhancing agent)가 가용성이 되도록 하는데 충분한 물 함량을 지니는 고정제(fixative);

b. (ⅰ) 키나아제 억제제, (ⅱ) 포스파타아제 억제제, 및 임의로 (ⅲ) 프로테아제 억제제를 포함하는 안정화제; 및

c. 투과성 증강제를 포함하는, 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 고정제가 약 10 내지 40%의 에탄올, 약 10 내지 40%의 메탄올, 약 10 내지 40%의 벤질 알코올, 또는 약 5 내지 15%의 아세톤을 포함하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 고정제가 약 20% 미만의 농도로 에탄올, 또는 약 20% 미만의 농도로 메탄올을 포함하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 고정제 중의 에탄올의 농도가 약 12%이거나, 메탄올의 농도가 약 12%인 용액.
제 1 항에 있어서, 상기 고정제가 바이오세라믹(bioceramic), 폴리 디올 시트레이트, 키토산 또는 히드록시아파타이트; 킬레이트화 작용제; 트리클로로아세트산(TCA); 클로로포름/메탄올; 또는 암모늄 술페이트로 제조된 미립자 물질(particulate material)을 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키나아제 억제제 및/또는 포스파타아제 억제제가 상기 효소의 활성을 직접적으로 억제하고/하거나; 상기 키나아제 억제제가 상기 키나아제 기질인 ATP를 방해하고/하거나; 상기 포스파타아제 억제제가 인산화된 단백질 상의 포스페이트 기와 상호작용하거나, 상기 포스파타아제에 대한 의사-기질(pseudo-substrate)로 작용하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키나아제 억제제가 스타우로스포린 또는 제니스테인이고; 상기 포스파타아제 억제제가 소듐 오르쏘바나데이트(orthovanadate) 또는 베타 글리세로포스페이트이고; 상기 임의의 프로테아제 억제제가 알칼리성-프로테아제, 산성-프로테아제, 중성-프로테아제, 세린-프로테아제, 시스테인-트로테아제, 아스파르트산-프로테아제 또는 금속-프로테아제의 억제제인 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파타아제 억제제가 약 100mM 내지 약 400mM 농도의 소듐 오르쏘바나데이트, 또는 약 375mM 내지 1.5M 농도의 베타 글리세로포스페이트이고, 상기 키나아제 억제제가 약 5.0μM 내지 20.0μM 농도의 스타우로스포린, 또는 약 0.5μM 내지 2.0μM 농도의 제니스테인인 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투과성 증강제가 중합체, 단백질, 나노입자 또는 지질인 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투과성 증강제가 약 0.5% 내지 약 15%의 PEG인 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 막 수용체 억제제, 막 안정화제, 세포 형태 보존제, 가교제 및/또는 ATPase 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제가 상기 투과성 증강제에 부착된 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제 및 상기 투과성 증강제가 나노입자에 부착된 조성물.
하나 이상의 용기 내에 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 조성물의 성분들을 포함하는, 실온에서 세포 인단백질을 고정 및 안정화시키기 위한 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 성분들이 액체 형태, 건조(dried) 형태, 또는 둘 모두의 형태인 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 조성물의 불안정한(labile) 성분들이 건조 형태로 존재하고, 나머지 성분들이 액체 형태로 존재하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 건조 성분들이 표면 상에 코팅을 형성하고, 상기 조성물의 나머지 성분들을 포함하는 액체와 접촉시 재구성될 수 있는 키트.
샘플 내의 인단백질의 보존에 효과적인 조건 하에서 세포, 조직, 체액 또는 세포 생성물을 포함하는 샘플을 실온에서 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 실온에서 상기 샘플 내의 인단백질을 보존시키기 위한 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 세포가 분해된(disaggregated) 세포 집단으로부터 유래되고/되거나, 상기 체액이 전혈(whole blood), 유리 체액(vitreous humour), 또는 전혈 또는 유리 체액의 분획이고/이거나, 상기 세포로부터의 생성물이 혈액 또는 유리 체액으로부터 쉐딩(shedding)되거나, 추출되거나, 분비되거나, 달리 분리되는 단백질인 방법.
제 18 항 또는 제 19 항에서, 상기 샘플이 조직을 포함하고, 상기 보존된 샘플을 동결시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 동결 보존된 샘플을 섹셔닝(sectioning)하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 샘플의 파라핀 포매(embedding)가 수행되지 않는 방법.
제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내의 1개 이상의 인단백질의 인산화 상태를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 샘플이 전혈, 유리 체액, 또는 전혈 또는 유리 체액의 분획이고, 상기 샘플 내의 보존된 인단백질이 FACS 분석 또는 자성 포획(magnetic capture)에 의해 추가로 분석되는 방법.
제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 인단백질의 보존 전에 외부 에너지원을 이용한 처리에 의해 상기 인단백질을 변성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 외부 에너지원이 초음파, 적외선, 마이크로파, 전기, 전자기, RF(라디오파), 압력, 열 또는 화학적 에너지인 방법.
표 1에 나열된 내인성 대용 마커(surrogate marker) 중 하나 이상의 인산화 상태를 측정하는 것을 포함하는, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법.
제 27항에 있어서, 인산화가 측정되는 상기 내인성 대용 마커가 STAT-3, CC-3(cleaved caspase-3)) 및 ASK-1인 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 내인성 대용 마커 중 5개 이상의 인산화 상태가 측정되는 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 내인성 대용 마커 중 10개 이상의 인산화 상태가 측정되는 방법.
제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표 2에 나열된 내인성 단백질 또는 염증 마커 중 1개 이상의 인산화 상태가 또한 측정되는 방법.
제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정되는 내인성 대용 마커(들)이 보존 상태가 세포 집단에서의 인단백질의 보존 상태와 상관관계가 있는 비-인산화된 단백질 분자를 추가로 포함하는 방법.
제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 피검체로부터 분리되었으나, 안정화 절차에 적용되지 않은 것인 방법.
제 33 항에 있어서, 상기 샘플이 안정화 과정 4시간 미만 전에 피검체로부터 분리된 것인 방법.
제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내의 내인성 대용 마커(들)의 보존 상태에 기초하여 분자 진단 분석의 진행 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
고도로 불안정한 내인성 대용 마커인 STAT-3, CC-3(cleaved caspase-3) 및 ASK-1에 특이적인 항체 세트.
표 1의 고도로 불안정한 내인성 대용 마커 중 5개 이상에 특이적인 항체 세트.
표 1의 고도로 불안정한 내인성 대용 마커 중 10개 이상에 특이적인 항체 세트.
첫번째 시점에서 1개 이상의 대용 인단백질 마커를 포함하는 센티넬(sentinel)과 샘플을 접촉시키는 단계; 두번째 시점에서 상기 센티넬을 분리시키는 단계; 및 상기 두 시점에서 상기 센티넬의 대용 인단백질의 인산화 상태를 측정하고 비교하는 단계를 포함하는, 2개의 상이한 시점에서 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 인단백질의 보존 상태를 결정하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 첫번째 시점이 피검체로부터 샘플을 분리하는 시간이고, 상기 두번째 시점이 상기 샘플의 단백체(proteomic) 분석을 시작하는 시간인 방법.
제 38 항에 있어서, 피검체로부터의 샘플의 분리와 분석 절차의 시작 사이의 시간의 총계를 결정하는 방법.
제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 대용 인단백질 마커가 표 1에 나열된 고도로 불안정한 인단백질 마커로부터 선택되는 방법.
제 42 항에 있어서, 상기 1개 이상의 대용 인단백질 마커가 STAT-3, CC-3(cleaved caspase-3) 및 ASK-1인 방법.
제 42 항에 있어서, 5개 이상의 대용 인단백질 마커가 표 1에 나열된 고도로 불안정한 인단백질 마커로부터 선택되는 방법.
제 42 항에 있어서, 10개 이상의 대용 인단백질 마커가 표 1에 나열된 고도로 불안정한 인단백질 마커로부터 선택되는 방법.
제 39 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 대용 인단백질 마커가 표 2에 나열된 내인성 단백질 또는 염증의 마커로부터 선택되는 방법.
제 39 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 대용 마커(들)이 이의 보존 상태가 세포 집단 내의 인단백질의 보존 상태와 상관관계가 있는 비-인산화된 단백질 분자를 포함하는 방법.
제 39 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미립자 실체(entity)가 자성 나노입자인 방법.
제 39 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 대용 인단백질 마커가 링커를 통해 상기 미립자 실체와 회합되는 방법.
제 39 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센티넬을 샘플 내의 세포 및/또는 조직에 도입시키는 것을 포함하는 방법.
제 50 항에 있어서, 상기 센티넬이 투과 작용제(permeation agent)의 존재하에서 세포 및/또는 조직에 도입되는 방법.
1개 이상의 대용 인단백질 마커와 회합되는 미립자 실체인 센티넬.
제 52 항에 있어서, 상기 미립자 실체가 표 1에 나열된 대용 인단백질 마커 중 1개 이상과 회합되는 센티넬.
1개 이상의 용기 중의 제 52 항 또는 제 53 항의 1개 이상의 센티넬, 및 임의로 센티넬(들)과 회합된 대용 인단백질 마커의 인산화 상태를 측정하기 위한 시약을 포함하는, 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하는 샘플 내의 1개 이상의 관심 인단백질의 보존 상태를 결정하기 위한 키트.
샘플이 피검체로부터 분리되는 시점인 첫번째 시점에서, 실온에서 상기 샘플을 대용 인단백질 마커 및 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 보존성 조성물을 포함하는 제 52 항 또는 제 53 항의 센티넬과 동시에 접촉시킴으로써 상기 샘플 내의 관심 인단백질을 고정시키고, 안정화시키는 단계; 상기 샘플 내의 인단백질의 분자 특성규명이 수행되는 시점인 두번째 시점에서, 상기 샘플로부터 상기 센티넬을 추출하는 단계; 및, 이후, 상기 센티넬과 회합된 대용 인단백질 마커(들)의 보존 상태를 측정함으로써, 상기 대용 인단백질 마커(들)의 보존 상태가 상기 샘플 내의 관심 인단백질(들)의 보존 상태가 이의 분자 특성규명에 적합한 것을 나타내는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 관심 인단백질의 인산화 상태가 관심 인단백질의 분자 특성규명을 수행하기에 적합한지 여부를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 샘플이 세포, 조직, 체액 또는 세포의 생성물을 포함하고, 피검체로부터 분리된 것인 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 보존성 조성물을 함유하는 제 2 챔버에 연결된, 샘플의 특정 부피를 제거하거나 획득하는 제 1 챔버를 포함하는, 세포 또는 조직 표본을 수거하고 보존하는 장치로서, 단일 수행으로 챔버 내의 보존제에 상기 샘플이 획득되고, 침지되는 장치.
제 56 항에 있어서, 상기 제 2 챔버가 분리가능하고, 조직 섹셔닝 또는 분자 가공에 직접 사용될 수 있는 장치.