JP5468586B2 - 肝臓におけるハイポキシアの検出法 - Google Patents
肝臓におけるハイポキシアの検出法 Download PDFInfo
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(1)肝臓がハイポキシア状態におかれると、肝細胞中のミトコンドリア由来蛋白質が細胞外に逸脱するため、血中のミトコンドリア由来蛋白質の濃度を測定することにより、ハイポキシアや、それに伴う疾患の存在及びその程度を検出することができること、また、
(2)ハイポキシア条件下ではミトコンドリア電子伝達系が働かないために解糖系が亢進し、乳酸が産生されてアシドーシスの状態となり、このとき、OCTの逸脱が細胞質由来蛋白質に対して相対的に顕著となるため、OCTの濃度を細胞質由来蛋白質の濃度と相対的に比較することにより、きわめて鋭敏なハイポキシアの検出が可能となること、したがって、血中の肝臓ミトコンドリア由来蛋白質濃度またはミトコンドリア由来蛋白質と細胞質由来蛋白質の濃度比を測定することによって、肝臓におけるハイポキシアを簡便かつ感度よく検出できることを明らかにし、本発明を完成させた。
A)ミトコンドリア由来蛋白質単独で測定する場合
a)健常人試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度と患者試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度を比較する。
b)同一患者由来の試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度を、一定期間を置いて複数回測定し、ミトコンドリア由来蛋白質濃度の推移を調べる。そして、患者試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度が、健常人試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度に比べて高ければ、患者の肝臓がハイポキシア状態にあると判断することができる。
B)ミトコンドリア由来蛋白質濃度と細胞質由来蛋白質濃度を測定し、その比を求める場合
c)同一患者由来の試料中のミトコンドリア由来蛋白質濃度と細胞質由来蛋白質濃度を、一定期間を置いて複数回測定し、「ミトコンドリア由来蛋白質濃度/細胞質由来蛋白質濃度」の比の推移を調べる。
d)算出した比を、健常者または各種疾患患者における既知の「ミトコンドリア由来蛋白質濃度/細胞質由来蛋白質濃度」の値(例えば、Clilnical Biochemistry, Vol.40 (2007) 1077-1080 Table1 等)等と比較し、測定値から算出した比が既知の値よりも高くなっていれば、患者の肝臓はより厳しいハイポキシア状態にあると判断する(ハイポキシア関連疾患に罹患している可能性が高いものと推定できる)。
例えば後述する実施例では、ハイポキシアに伴うアシドーシスが進行するに伴って、ミトコンドリア由来蛋白質濃度/細胞質由来蛋白質濃度の値が上昇していくことが実証されている。そして、上記方法によって、ハイポキシアまたはアシドーシスを伴う疾患が生じていると診断したり、または疾患の重症度が進んでいると判定することもできる。また、逆に値が減少していれば、予後が良好である、治療の効果が現れているなどと判定することが可能である。
雄のウィスターラットを麻酔下で放血させ、門脈と下大静脈にカテーテルを挿入した。門脈より緩衝液(40mM Hepes−NaOH(pH7.4), 0.12M NaCl, 5mM KCl, 5mM NaHCO3, 10mM ピルビン酸ナトリウム)を肝臓が黄土色になるまで環流した後、0.025%コラゲナーゼ、5mM CaCl2を含有する緩衝液に変えて10分環流した。その後、肝臓を取り出して細断し、メッシュを通過した肝細胞をHanks液に懸濁した。その後、当該懸濁液を500rpmで5分間遠心し、非実質細胞を含む上清を除いた。懸濁と遠心操作を4回繰り返し、実質細胞を得た。このようにして得られたラット肝細胞を、コラーゲンコートした24穴プレートに10万細胞/ウェルとなるように加え、4時間培養した。接着しなかった細胞を除いた後、各種pHの培養液を加え、窒素置換して無酸素状態としたチャンバー内で細胞を培養した。17時間後に培養液をサンプリングし、培養液中のOCT及びARGの濃度をELISA法によって測定した。また、培養終了時にTriton−X100を0.5%(終濃度)添加して細胞を破壊し、その懸濁液のOCTまたはARG濃度(OCTまたはARGの発現量に相当)を100%としたときの、培養液中へのOCT及びARGの逸脱割合(%)を算出した。
るところである。
Claims (9)
- OCTに対する抗体を含む、肝臓のハイポキシア状態を検出するための検出試薬。
- さらに細胞質由来蛋白質に対する抗体を含む、請求項1に記載の検出試薬。
- 患者由来の血液由来サンプル中のOCT濃度を測定する工程を含む、肝臓がハイポキシア状態にあることを検出する方法。
- 患者由来の血液由来サンプル中の細胞質由来蛋白質の濃度を測定する工程と、
前記OCT濃度と前記細胞質由来蛋白質濃度の比を求める工程と、
をさらに含む、請求項3に記載の方法。 - 患者由来の血液由来サンプル中のOCT濃度が、健常人由来の血液由来サンプル中のOCT濃度よりも大きいことを検出する工程と、
患者由来の血液由来サンプル中のOCT濃度/細胞質由来蛋白質濃度が、健常人由来の血液由来サンプル中のOCT濃度/細胞質由来蛋白質濃度よりも大きいことを検出する工程と、
を含む、請求項4に記載の方法。 - 前記細胞質由来蛋白質がアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びアルギナーゼ(ARG)から成る群より選ばれる1種以上である、請求項4または5に記載の方法。
- 前記OCT濃度、または前記OCT濃度と前記細胞質由来蛋白質濃度を、請求項1または2に記載の試薬を用いて免疫学的測定法によって測定する、請求項4、5または6に記載の方法。
- 患者由来の血液由来サンプル中のOCT濃度及び細胞質由来蛋白質濃度の値を2回以上測定し、
後に測定したときのOCT濃度/細胞質由来蛋白質濃度の値が、先に測定したときのOCT濃度/細胞質由来蛋白質濃度の値よりも大きいことを検出する工程、
を含む、請求項4に記載の方法。 - 患者由来の血液由来サンプル中のOCT濃度が、健常人由来の血液由来サンプル中のOCT濃度よりも大きいことを検出する工程、
をさらに含む、請求項8に記載の方法。
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