JP2001128662A

JP2001128662A - 診断検査用細胞に長期安定性をもたらす組成物

Info

Publication number: JP2001128662A
Application number: JP2000275711A
Authority: JP
Inventors: Dolores M Berger; エム．バーガードロレス; A Yuashisu Daretta; エー．ユアシスダレッタ; William A Nussbaumer; エー．ナスバウマーウイリアム; Anne B Brown; ビー．ブラウンアン
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2001-05-15
Also published as: DE60035156T2; US6916608B2; DE60035156D1; EP1085098A2; AU5350100A; EP1085098A3; CA2314663A1; US20020009722A1; CA2314663C; EP1085098B1

Abstract

(57)【要約】【課題】臨床標本（すなわち、生物学的試料中の細
胞）を輸送用およびその後の診断検査用に安定化する方
法および組成物を提供すること。【解決手段】この組成物は、具体的には細胞の核酸を
オリゴヌクレオチド捕獲および検出用プローブとハイブ
リダイズさせるために完全に維持することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、輸送用およびその
後の診断検査用の試料（たとえば、生物学的試料中の臨
床標本など）中の細胞を安定化させるための方法および
組成物に関する。細胞を安定化させる組成物は、具体的
にオリゴヌクレオチド捕獲および検出プローブとハイブ
リダイゼーションさせるために核酸を完全に維持するこ
とができる。

【０００２】

【従来の技術】感染症および性行為感染症の診断検査
は、次第により迅速かつより正確な結果を求めるように
なってきた。核酸プローブ技術によって、より特異性が
高く、より主観性の少ない、時間と結果の障壁を破る迅
速な診断検査が可能になった。核酸プローブアッセイ
は、生育に基づく生化学アッセイよりも迅速で、免疫学
に基づくアッセイよりも特異的である一方、標的試料を
無傷で輸送するという独特の問題を抱えている。さら
に、ある場所で採取され、別の場所で検査することが可
能な試料は、適切に扱わないと特に核酸が変性を受けや
すい。

【０００３】ハイブリダイゼーションおよび捕獲による
核酸検出は、病気の宿主に適用されてきた。特に、従来
の方法では時間がかかり過ぎ、迅速な治療が極めて重要
で、および／またはその疾患を保健機関に報告する義務
がある感染性疾患に有用である。Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａ
ｓｖａｇｉｎａｌｉｓ膣炎（トリコモナス症）は、報
告の義務のある性行為感染症で、米国において毎年約３
００万人の女性が罹っている。さらに、細菌性膣炎（Ｂ
Ｖ）およびカンジダ症による膣疾患は、女性が治療を求
める２つの最も一般的な理由である。これら３種の別々
の疾患の症状は共通性があり、したがって適切かつ特定
の薬物療法を処方する前に鑑別診断を下す必要が生じ
る。迅速かつ正確な診断は、ＢＶおよびトリコモナス症
の妊婦の場合早産および低出生時体重児と関係があるの
で、特に重要である。さらに、ＢＶ陽性の妊婦は絨毛羊
膜症、羊水感染症、および産褥感染合併症に罹りやす
い。ＢＶはまた、骨盤内炎症性疾患、分娩後子宮内膜
炎、菌血症、卵管炎などに関連がある。膣炎の適切な診
断および治療には、原因微生物を同定し、適切な抗菌治
療を明確にすることが必要である。

【０００４】米国特許第５，６５４，４１８号に記載さ
れたＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは、１本の膣スワブによって膣トリコモナ
ス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、膣ガードネレラ（Ｇ．
ｖａｇｉｎａｌｉｓ）またはカンジダアルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を検出する能力があるので、
膣炎の診断に著しい進歩をもたらした。このスワブを、
生物を溶解して核酸を遊離させる溶解溶液中において高
温でインキュベートする。その後緩衝溶液をこの試料に
添加する。次にこの試料溶液を特異的捕獲プローブでそ
れぞれ誘導体化された１組のナイロンビーズとインキュ
ベートする。ｒＲＮＡは捕獲ビーズにハイブリダイズ
し、これを次にビオチン化検出オリゴヌクレオチドプロ
ーブを含む溶液とインキュベートする。この検出プロー
ブはｒＲＮＡ中の別の領域とハイブリダイズする。この
ビーズを酵素を含むウェルに移す。ビオチン化検出プロ
ーブがｒＲＮＡとハイブリダイズしている場合、この酵
素はビオチンと結合する。ビーズにｒＲＮＡがハイブリ
ダイズしていない場合は、酵素が結合するビオチン化検
出プローブは存在しない。最後に、このビーズを酵素と
反応して青色を呈する基質とインキュベートする。ｒＲ
ＮＡが存在する場合、ビーズは青色を呈する。試料中に
ｒＲＮＡがない場合、ビーズは無色のままである。１種
だけの分析物に特異的なビーズ、３種を使用することに
よって単一の試料によって鑑別診断を得ることができ
る。

【０００５】本発明は、膣スワブ試料、特にＡｆｆｉｒ
ｍＶＰＩＩＩ微生物同定検査を使用して、カンジダ
（Ｃａｎｄｉｄａ）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅ
ｌｌａ）、またはトリコモナスの存在を検査するために
採取された試料に安定性をもたらすために開発された。
本発明の援助がなければ、スワブ試料は周囲温度では１
時間まで、冷蔵温度では４時間までしか安定に維持され
ないだろう。具体的に言うと、細胞内のｒＲＮＡは検出
するために完全に維持されなければならず、また少数の
非病理学的数のカンジダが存在する場合は複製を抑えて
偽陽性の発生を抑えなければならない。適切に保存する
ことによって、離れた場所での試料の収集および試料検
査の実施が可能になり、または多くの試料をまとめて全
て一度に処理し検査することが可能になる。

【０００６】ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試料の適切な輸
送または保存または固定溶液には次の特徴が必要であっ
た。

【０００７】１．この溶液は膣分泌液に認められるＲＮ
Ａ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を制御または阻害しなければ
ならない。２．この溶液は、カンジダ、ガードネレラまたはトリコ
モナスの生長を抑制しなければならない。その間に、３．内在性ヌクレアーゼまたは細胞死による細胞内のＲ
ＮＡ分解を制御する。４．この溶液は具体的にＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ検査
に適合しなければならない。５．この溶液は最終使用者に不必要な危険性をもたらさ
ず、かつ６．この溶液は７２時間まで保存する試験にシグナル安
定性をもたらす。

【０００８】殺菌効果または阻害効果を有するものなど
従来の保存剤は、低濃度の生物の生育を阻害するが、核
酸分解の問題は解決できない。逆に、輸送培地は、その
後の培養で生物の生存率が維持されるように調合された
最小または飢餓培地になる傾向がある。しかし、カンジ
ダはこのような培地で増殖する傾向があり、一方ガード
ネレラおよびトリコモナスは生存できない。このような
培地での結果は、カンジダについてはＡｆｆｉｒｍの結
果は偽陽性となり、後者２種については偽陰性となる。
これら３種の生物が原核細胞種および真核細胞種両者の
代表であり、それぞれが異なった構造の細胞壁および／
または細胞膜を有するということによって、問題はさら
に複雑になる。

【０００９】物質の種類として、固定剤はアルコール、
ホルムアルデヒドまたはクロロホルム、および標本およ
び適用に応じて広範囲の添加物を含む傾向がある。多く
は安定な溶液ではなく、調製の数時間内での使用にのみ
適している。さらにこれらには、既に臨床医が直面して
いる危険（すなわち、塩化水銀（II）、ピクリン酸）を
上回る危険が存在する可能性がある。ホルムアルデヒド
はＡｆｆｉｒｍ試薬と適合しないことが発見された。ア
ルコールをベースとした固定剤は、蛋白質、特にヌクレ
アーゼを沈殿または変性させる能力によって大いに期待
されている。

【００１０】このような固定剤の１種が、ほ乳類細胞の
構造の保存に関する米国特許第５，２５６，５７１号に
記載されている。Ｈｕｒｌｅｙ等は、メタノール４５か
ら５５％、凝集阻害剤および緩衝剤の溶液（以後Ｐｒｅ
ｓｅｒｖＣｙｔと称する）を特許請求の範囲に記載して
いる。しかし、この溶液はほ乳類細胞にいかに有効であ
ろうと、問題としている３種の膣病原体の全てをはっき
りさせる基準に見合うことは不可能であった。これは哺
乳細胞に見られない構造である各生物の細胞壁構造に複
雑性が高いためである可能性が高かった。さらに、これ
らの研究では、メタノール濃度を９５％まで増加させて
も、２４時間後にｒＲＮＡが検出できるように膣試料を
保存または固定することはできなかった。

【００１１】細胞学および組織学に使用する多くの固定
剤は、自家製の溶液で、その処方は当業者によく知られ
ている。それらは、前記のように用時調製され、短期間
内に使用されることが多い。このような溶液には、たと
えば、１０％中性緩衝ホルマリン、カーノイズ溶液（エ
タノール、クロロホルム、酢酸）、Ｂ−５（塩化水銀
（II）、酢酸ナトリウム、ホルマリン、水）、ボーイン
ズ溶液（ピクリン酸、氷酢酸、ホルムアルデヒド）およ
びツェンカー溶液（水、重クロム酸カリウム、塩化水銀
（II）、氷酢酸）が含まれる。これらの調合物は通常、
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｓｔｏｌ′ｓＤ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ＆
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｈｔｔｐ：／／ｌａｎｇ−
ｄｌ−ｓｒｖ．ｌａｎｇ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／Ｃｐ
ｌ／ｈｉｓｔｆｉｘ．ｈｔｍ）、ＴｈｅＪａｃｋｓｏ
ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊ
ａｘ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ
ｓ／ｓｓｓ／ｉｍａｇｉｎｇ／ｈｉｓｔｆ．ｈｔｍ
ｌ）、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｗｃａ
ｓｔｌｅａｔＡｕｓｔｒａｌｉａ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｅｗｃａｓｔｌｅ．ｅｄｕ．ａｕ／ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ／ｂｉ／ｂｉｒｊｔ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／
ｂｉｏ＿ｆｉｘ．ｈｔｍｌ．）などの大学または研究施
設によるインターネットにより参考ページに公表されて
いる。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓ、Ａｕ
ｓｔｉｎによってインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｖｉ
ｚｅ２２２．ｚｏ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／Ｍａｒｋｅ
ｒ＿ｐａｇｅｓ／ｍｅｔｈｏｄｓ＿ｐａｇｅｓ／ｆｉｘ
ａｔｉｖｅｓ．ｈｔｍｌ）で公表されているあまり有名
ではない１種の固定剤は、Ｄｅｎｔｓ溶液として知られ
ている。この溶液にはメタノールが４およびジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）が１の割合で含まれる。Ｄｅｎ
ｔｓ溶液は、ツメガエル属標本の免疫学的染色に使用さ
れる固定剤として記載されている。特定の方法は、試料
を−２０℃で一晩固定することである。著者らは、この
方法で調製した試料が何カ月、おそらく何年も安定に凍
結されることが可能であることを特許請求の範囲に記載
している。

【００１２】本発明者等によって、前記のＤｅｎｔｓ溶
液が、膣分泌液を含み、多量の膣トリコモナス（Ｔｒｉ
ｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、膣ガードネ
レラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉ
ｓ）、およびカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）を有する膣スワブ試料を保存できる
ことが明らかになった。この溶液中に保存されたスワブ
は、ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ系で試験するまでの数日
間、周囲温度で安定である。このようなスワブで得られ
た結果は、準備直後に検査した同一スワブと同様のシグ
ナルである。本発明者等によって、エタノール、または
エタノールおよびメタノールの混合物はまた、ＤＭＳＯ
と混合したとき試料を保存することも発見された。好ま
しい実施形態では、メタノールおよびＤＭＳＯの１：１
混合物を使用している。

【００１３】ジメチルスルホキシドは、今までの文献で
は他の分子と混合した成分として使用されてきたが、非
常に低い濃度で使用されてきた。米国特許第５，６２
２，８６７号では、保存血小板溶液中にＤＭＳＯ０．５
から６％を使用しており、米国特許第３，８５２，１５
５号では、ウマ細胞培養の低温保存用溶液にＤＭＳＯ８
から１０％を使用しており、米国特許第５，３６４，７
５６号ではＤＭＳＯ０．５Ｍ（約３〜４％）を含む溶液
を記載している。米国特許第５，４２２，２７７号およ
び４，６６６，６９９号では、染色固定溶液にＤＭＳＯ
をそれぞれ５から１０％および３から８％使用してい
る。しかし、これらの例では全て、ＤＭＳＯはより多く
の複合溶液のほんの小部分の成分に過ぎない。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明では本発明者等
は、少なくとも１種のアルコールまたはケトンである第
１の物質およびＤＭＳＯなどの第２の促進物質の混合物
である新規の組成物と、この組成物を使用して、たとえ
ば細胞、特に臨床標本に長期間（数日）の安定性をもた
らす方法とを記載しており、好ましい実施形態はメタノ
ール５０％／ＤＭＳＯ５０％混合物である。

【００１５】特に、好ましい実施形態では、臨床標本は
膣炎および細菌性膣炎の原因菌を含む膣スワブであると
考えられるが、この溶液はＲＮＡの回収が必要なその他
の生物学的試料にも使用することができる。この溶液
は、膣分泌液などの生物学的液体の基質に懸濁した細胞
内に存在する核酸（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の分解
を抑制するのに有用である。さらにこの溶液は、たとえ
ばＲＮＡなど容易に分解する核酸の分解を、周囲温度以
上で数日間抑制することができよう。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規の細胞固
定組成物および細胞（さらには、臨床標本）の保存方法
を提供する。

【００１７】好ましい実施形態では、本発明の組成物
は、蛋白質を沈殿または変性することのできる第１の物
質および細胞への第１の物質の注入を促進する第２の促
進物質からなる。

【００１８】本発明の一実施形態では、組成物はＤＭＳ
Ｏ１に対しメタノール４の割合から成る。

【００１９】本発明の他の実施形態では、組成物はメタ
ノール２．５、エタノール２．５、およびＤＭＳＯ５の
割合から成る。

【００２０】本発明のさらに他の実施形態では、組成物
はエタノールが４およびＤＭＳＯが１の割合から成る。

【００２１】本発明の好ましい実施形態では、組成物は
メタノールが１およびＤＭＳＯが１の割合から成る。

【００２２】本発明の他の実施形態では、組成物は蛋白
質を沈殿または変性させる機能とこの物質の細胞への注
入を促進する機能との両方を実現する単一の物質から成
る。

【００２３】本発明の好ましい実施形態では、組成物は
メタノールのみから成る。

【００２４】本発明の別の実施形態では、組成物はジメ
チルスルホキシドのみから成る。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明は、新規な固定組成物と、
試料、好ましくは生物学的試料中の細胞を保存する方法
とを提供する。

【００２６】本発明の組成物は、Ｉ．少なくとも１種のアルコールまたはケトンから成
る、蛋白質を沈殿または変性させることができる第１の
物質と、ＩＩ．この第１の物質の細胞への注入を促進する第２の
促進物質とから成る。

【００２７】このアルコールまたはケトンは、以下の、
メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノ
ール、ブタノールまたはアセトンの１種または複数であ
ることが可能である。促進物質は、ジメチルスルホキシ
ド、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ま
たは当業者によく知られているその他の物質であること
ができる。

【００２８】本発明の組成物の好ましい実施形態がいく
つかある。この組成物は、メタノール：ＤＭＳＯの比が
４：１、メタノール：エタノール：ＤＭＳＯの比が２．
５：２．５：５．０、エタノール：ＤＭＳＯの比が４：
１、または最も好ましくは、メタノール：ＤＭＳＯの比
が１：１であることができる。他の好ましい実施形態に
は、組成物がメタノールのみまたはジメチルスルホキシ
ドのみから成る場合が含まれる。

【００２９】好ましい一実施形態では、本発明の方法は
試料中の少なくとも１個の細胞の構造および核酸を安定
にするためのもので、前記方法は、（ａ）試料を含む容
器に、蛋白質を沈殿または変性させることができ、前記
化合物の前記少なくとも１個の細胞への注入を促進する
ことができる物質を有効濃度含んでいる組成物を添加す
る工程、（ｂ）前記試料中の前記少なくとも１個の細胞
を前記組成物と接触させる工程、（ｃ）前記試料を前記
組成物と有効期間、有効温度でインキュベートする工
程、および（ｄ）前記試料中の構造および核酸を安定化
させた前記少なくとも１個の細胞を得る工程を含む。

【００３０】この物質は、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセト
ン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよび
ポリエチレングリコールであることができる。

【００３１】他の好ましい実施形態では、本発明は試料
中の少なくとも１個の細胞の構造および核酸を安定化す
る方法に関しており、前記方法は、（ａ）試料を含む容
器に、有効濃度の（ｉ）少なくとも１種のアルコールま
たはケトンを含む、蛋白質を沈殿または変性させること
ができる第１の物質、および（ｉｉ）この第１の物質の
少なくとも１個の細胞への注入を促進する第２の促進物
質を含む組成物を添加する工程、（ｂ）前記試料中の前
記少なくとも１個の細胞を前記組成物と接触させる工
程、（ｃ）前記試料を前記組成物と有効期間、有効温度
でインキュベートする工程、および（ｄ）前記試料中の
構造および核酸を安定化させた前記少なくとも１個の細
胞を得る工程を含む。

【００３２】このアルコールまたはケトンは以下の、メ
タノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノー
ル、ブタノールまたはアセトンの１種または複数である
ことが可能である。促進物質は、ジメチルスルホキシ
ド、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ま
たは当業者によく知られているその他の物質であること
ができる。

【００３３】具体的には、本発明で固定した膣スワブ試
料は、トリコモナス、ガードネレラまたはカンジダのリ
ボソームＲＮＡ検出により安定性を評価すると、周囲温
度以上で４日目まで安定であることができる。

【００３４】好ましい実施形態では、本発明は米国特許
第５６５４４１８号に記載されたＡｆｆｉｒｍＶＰＩ
ＩＩ核酸ハイブリダイゼーションアッセイと共に使用す
ることができる。しかし、本発明はまた、診断上核酸の
完全性に依拠するその他の検査方法で使用するためのも
のでもある。

【００３５】本発明は、限定はしないが膣ガードネレラ
（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ）（グ
ラム陰性細菌）を含む原核細胞種および、限定はしない
がカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（酵母）および膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏ
ｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）（原生動物）を含む
真核細胞種の核酸、特に好ましい実施形態ではＲＮＡを
保存するので、本発明溶液の保存効果が他のどんな原核
細胞および真核細胞にも適用でき、他のどんな原核細胞
および真核細胞にも適用できるように意図されたもので
あることは当業者には明らかである。

【００３６】好ましい実施形態では、膣スワブをＡｆｆ
ｉｒｍＶＰＩＩＩ試験管に入れ、新規の固定剤（５０
から５００μｌ、好ましくは１００μｌ）の量をこの試
験管に添加する。試料試験管に蓋をして、次いで試料を
周囲温度で検査場に輸送する。検査は４日後まで実施す
ることができる。検査を準備するとき、溶解溶液を試験
管に添加し、この試験管に蓋をして８５℃でインキュベ
ートし、生物を溶解し核酸を遊離させる（図１Ａ）。溶
解後冷却して、次いで膣ガードネレラ（Ｇ．ｖａｇｉｎ
ａｌｉｓ）およびカンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）の１６ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブポリマーを含む緩
衝溶液を添加すると、複合体（図１Ｂ）が形成する。膣
トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）はｒＲＮＡ転
写のコピー数が多いので、このポリマーは必要ではな
い。次いでこの複合体を、ｒＲＮＡの別の箇所にハイブ
リダイズする捕獲オリゴヌクレオチドによって試料から
取り出す。それぞれ膣トリコモナス、膣ガードネレラま
たはカンジダアルビカンスに独特の特異性を有する３種
の異なる捕獲オリゴヌクレオチドがある。ナイロンビー
ズは、捕獲オリゴヌクレオチドの１種だけで誘導体化さ
れている。各種のビーズ１個を試料とインキュベートし
て、３種の異なる生物のｒＲＮＡを同時に捕獲すること
を可能にする（図１Ｃ）。このビーズを次にビオチン化
検出オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液中でインキ
ュベートする。この検出プローブはｒＲＮＡの別の領域
にハイブリダイズする（図１Ｄ）。洗浄後、このビーズ
を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトア
ビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）を含むウェルに移す。ビオチン
化検出プローブがｒＲＮＡにハイブリダイズする場合、
ＳＡ−ＨＲＰはビオチンに結合する（図１Ｅ）。ビーズ
にハイブリダイズするｒＲＮＡがない場合は、ＳＡ−Ｈ
ＲＰが結合するビオチン化検出プローブはない。最後
に、このビーズを、ＨＲＰと反応して青色を形成する基
質とインキュベートする。ｒＲＮＡが存在する場合はビ
ーズは青色を呈し、ｒＲＮＡが存在しない場合はビーズ
は無色のままである。

【００３７】ビーズにハイブリダイズしたｒＲＮＡの相
対量の定量測定を行う研究目的で、別の検出試薬を使用
することができる。ＳＡ−ＨＲＰを結合させた後、マイ
クロタイターウェル内で化学ルミネッセンスＨＲＰ基質
とインキュベートし、照度計で読み取ることができる。

【００３８】効果的にするためには、固定溶液は膣分泌
液基質に存在するヌクレアーゼを阻害または阻止する必
要がある。第２に、生物に浸透して、内在性ヌクレアー
ゼによる核酸分解を防がなければならない。第３に、生
物細胞壁をそのまま残さなければならない。Ａｆｆｉｒ
ｍＶＰＩＩＩアッセイにおいて溶解溶液で試料を加熱
するとき、生物の溶解が不完全であると、ある種のＲＮ
Ａの損失をもたらす。第４に、固定溶液はＡｆｆｉｒｍ
ＶＰＩＩＩに適合して、アーティファクトを生じない
ものでなければならない。

【００３９】組織固定、染色および低温保存に使用する
多くの固定剤は、しばしば不快な試薬を含む、極めて安
定性の限られた複合溶液である。これは細胞構造または
蛋白質の保存が重要なときに欠かせないことが多い。こ
こでは核酸および細胞壁だけを保存することを目的とし
ているので、この溶液の複雑さはより少なくすることが
できる。複雑さを減じることで、より安定な溶液になる
と言う利点が生まれる。

【００４０】アルコール（類）、およびＤＭＳＯの混合
物またはこれらの化合物が単独で、標本、特に膣炎およ
び細菌性膣炎の原因菌を接種された膣スワブを安定化す
ることができることを本明細書で記載する。この新規の
溶液は、臨床標本の輸送培地として役立つことができ、
離れた場所で採取し、中央に位置する分析研究所で検査
することを可能とする。注意深い取扱および限界温度を
避けること以外に、輸送に特別な配慮は必要ない。

【００４１】以下は本発明の特定の実施例であるが、い
ずれもそれらの限定を意味するものではない。

【００４２】

【実施例】実施例１ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ微生物同定検査の説明ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ微生物同定検査およびこの検
査の方法の説明は以下の通りである。

【００４３】採取した膣スワブ試料をＡｆｆｉｒｍＶ
ＰＩＩＩ試料試験管に入れ、スワブの軸を切り込み線
（ちょうど試験管の上端）で折る。溶解溶液１２滴を
（試験管に残ったスワブを有する）各試験管に添加し、
試験管に蓋をしてＡｆｆｉｒｍ溶解台（８５℃）に１０
分間入れる。この試験管の蓋は、後にスワブを取り除き
やすいようにスワブの柄を「捕捉」する。１０分後、台
から試験管を取り出し、緩衝溶液１２滴を各試験管に添
加する。この緩衝溶液は、カンジダアルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）および膣ガードネレラ（Ｇ．ｖａｇ
ｉｎａｌｉｓ）のシグナル増幅ポリマーを含む。試験管
を勢い良く１０回弾いて混合する。次いで液体を取り出
すために試験管の端からスワブを取り出して捨てる。試
験管の蓋をフィルターチップと交換する。このように処
理した試料は２４時間以内にアッセイしなければならな
い。

【００４４】ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試薬ケースには
７個のウェルがあり、６個には試薬が入っている。試料
毎に１個の試薬ケースを使用する。ウェル１は空で、準
備した試料をこのウェルに添加する。ウェル２には、緩
衝カオトロピック溶液に溶かしたビオチン化検出プロー
ブおよびホルムアルデヒドから成るハイブリダイゼーシ
ョン溶液が含まれる。ウェル３には、洗浄溶液が含まれ
る。ウェル４には、ストレプトアビジン−セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）複合体が含まれ
る。ウェル５および６の両方には洗浄液が含まれる。ウ
ェル７には、緩衝ペルオキシダーゼ溶液が含まれる。検
査を実施する前に、基質溶液４滴をウェル７に添加す
る。この基質溶液には、ＨＲＰと反応して視覚的に確認
される青色を形成する指示薬が含まれる。（研究目的の
みに）化学ルミネッセンス指示薬を使用する場合、プロ
ーブ分析カード（ＰＡＣ）をウェル７に入れる前に、Ａ
ｆｆｉｒｍプロセッサを停止する。

【００４５】このＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩプローブ分
析カードには、既に記載した３種の分析物特異的捕獲ビ
ーズが含まれる。さらに、１個の陰性対照ビーズおよび
１個の陽性対照ビーズがある。試料毎に１枚のＰＡＣを
使用する。

【００４６】試料毎に１個のＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ
試薬ケースを開封し、Ａｆｆｉｒｍ自動プロセッサに配
置する。試料試験管を試薬ケースのウェル１に入れる。
比色または視覚的検出法を使用する場合は、基質溶液４
滴をウェル７に添加する。（研究目的で）化学ルミネッ
センス検出法を使用する場合は、基質溶液はウェル７に
添加しない。ＰＡＣを試薬ケースのウェル１に入れ、プ
ロセッサを始動する。

【００４７】プロセッサアームがＰＡＣを持ち上げ、垂
直の上下運動によってウェルの中でカードをそっと攪拌
する。ウェル１に数分入れた後、プロセッサはＰＡＣを
ウェル２に移動する。ｒＲＮＡが捕獲ビーズに存在する
場合、ウェル２のビオチン化検出プローブがビーズ−Ｒ
ＮＡ複合体とハイブリダイズするであろう。陽性対照ビ
ーズは、ウェル７の検出用オリゴヌクレオチドの１つと
相補的な捕獲オリゴヌクレオチドで誘導体化されてい
る。検出段階でアッセイが失敗しなければ、陽性対照ビ
ーズは常に陽性になることは確かである。陽性対照がう
まくいかない場合は、１）使用者がウェル７に基質溶液
を添加していない、または２）ケース内に試薬不足があ
る、のいずれかであることが明らかに示唆される。逆
に、陰性対照ビーズは、どのウェルの検出オリゴヌクレ
オチドとも相補的ではないオリゴヌクレオチドで誘導体
化されている。したがって、このビーズは常に無色のま
まである。ウェル２の後、プロセッサはＰＡＣをウェル
３に移動させ、洗浄溶液によって非特異的結合核酸また
はオリゴヌクレオチドプローブが除去される。ウェル４
では、ビオチン化検出プローブはＳＡ−ＨＲＰ複合体に
結合する。次いで、このＰＡＣを連続した２個のウェ
ル、５および６で洗浄する。持ち越されたセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼによる非特異的発色を確実になくす
る。この時点で、ビーズ／核酸／検出体／ＳＡ−ＨＲＰ
複合体は化学ルミネッセンス検出のために取り出すこと
ができ、または指示基質による反応のためにウェル７に
進めることが可能である。その後、ＰＡＣをウェル６で
手早く洗浄して、アッセイは完了する。特定の分析物の
ビーズに青色の発色があれば、その試料に生物が含まれ
ていることが示唆される。特定の分析物の無色のビーズ
は、その試料はその生物について陰性であることを示唆
する。

【００４８】試料は、特記しない限り、Ａｆｆｉｒｍ
ＶＰＩＩＩ微生物同定検査方法に従って処理されかつ検
査された。

【００４９】実施例２保存溶液を評価するための実験手順の説明新鮮な、自己採取膣スワブおよび／または凍結膣スワブ
から、膣分泌物収集物を調製した。新鮮なスワブの提供
者には、スワブ（提供者１人当たり５本）は２時間以内
に採取して氷上に置くよう指示した。収集物を調製する
まで、スワブは２時間以内氷上に維持するか、または後
に使用するため直ちに凍結した。膣収集物を調製するた
め、１０本の新鮮なスワブまたは解凍スワブを生理食塩
液（カタログ番号４３９７７５３、ＢｅｃｔｏｎＤｉ
ｃｋｉｎｓｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓメリーランド）１ｍｌで絞り出
した。検査用実験試料数に十分な量を得るまで、このよ
うにしてスワブを準備した。収集物の一部を使用して以
下に記述するように生物ペレットを再懸濁し、一部を接
種せずに残して対照として使用した。

【００５０】カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ６０１９３）は、サブ
ローデキストロース寒天（カタログ番号４３２１２７
８、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙＳｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓメリー
ランド）上で、３５℃で２４〜４８時間生育させた。１
個のコロニーを採取し、第２のプレートに画線し、３５
℃で１８〜２０時間インキュベートした。インキュベー
ト後、ＢＳＡ／食塩水３ｍＬをプレートに添加して、こ
のコロニーを１０μＬ白金耳でそっと再懸濁した。懸濁
液をＢＳＡ／食塩水を少なくとも１０ｍＬ含む試験管に
移すために滅菌ピペットを使用した。この懸濁液を振盪
して、分光光度計で６２５ｎｍの吸光度を測定した。こ
の懸濁液を、ＯＤ₆₂₅が約０．４（約６．０×１０⁶ＣＦ
Ｕ／ｍＬ）になるように調整した。その後懸濁液のある
量を、ＴＪ−６卓上遠心機（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ）で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。上清液を傾瀉し、ペレットを膣分泌液で再懸濁し
て、約７．５×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度を実現し
た。

【００５１】膣ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ
ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ４９１４５）は、チ
ョコレートＩＩ寒天（カタログ番号４３２１２６７、Ｂ
ｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で３５℃で２４〜
４８時間生育させた。１個のコロニーを採取して、第２
のプレートに画線し、３５℃で１８〜４８時間インキュ
ベートした。インキュベーション後、ＢＳＡ／食塩水３
ｍＬを各第２のプレートに添加し、コロニーを１０μＬ
白金耳でそっと再懸濁した。懸濁液を、ＢＳＡ／食塩水
を少なくとも１０ｍＬ含む試験管に移すために滅菌ピペ
ットを使用した。この懸濁液を振盪して、分光光度計で
６２５ｎｍの吸光度を測定した。この懸濁液を、ＯＤ
₆₂₅が約０．３（約２．５×１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）になる
ように調整した。その後懸濁液のある量を、ＴＪ−６卓
上遠心機（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清液を傾
瀉し、ペレットを膣分泌液で再懸濁して、約２．５×１
０⁹ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度を実現した。

【００５２】膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ
ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ３０００１）を変更
Ｄｉａｍｏｎｄ′ｓ培地（カタログ番号０７−０９７、
Ｒｅｍｅｌ）の入った１０ｍＬの試験管で、３７℃でＣ
Ｏ₂５〜１０％下で５日間、または密度が約２×１０⁵細
胞／ｍＬに達するまで生育させた。１×１０⁵から１．
５×１０⁶トリコモナス／ｍＬを含み、汚染のない培養
から第２の培養物を調製した。新鮮な、予備加温した培
地の試験管に、この培養物０．５から１．０ｍｌを接種
した。試験管に緩く蓋をして、３７℃でＣＯ₂５〜１０
％下で２、３日インキュベートした。少なくとも２×１
０⁵トリコモナス／ｍＬある第２の培養物を収集し、混
合して血球計算盤で計数した。この懸濁物をＴＪ−６卓
上遠心機で２０００ｒｐｍで７分間回転させた。上清を
傾瀉し、ペレットを膣分泌液で再懸濁して、約６×１０
⁶トリコモナス／ｍＬの最終濃度を実現した。

【００５３】一般に、３種の生物全てを１回の実験で検
査した。この場合、各生物、カンジダアルビカンス、膣
ガードネレラおよび膣トリコモナスのペレットを連続し
て同一の膣分泌液で再懸濁した。この添加された膣分泌
液の１０倍希釈系列をチョコレートＩＩ寒天プレートに
２連で培養し、膣ガードネレラおよびカンジダアルビカ
ンスの実生菌ｃｆｕ／ｍＬ濃度を測定した。

【００５４】ガラス製のスクリューキャップ付き試験
管、またはＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試料試験管に、試
験する保存／固定溶液１００μＬをピペットで試験管に
添加して準備した。陰性対照（保存剤なし）試験管には
何も添加しなかった。各試験条件および各時点につい
て、３連ずつ準備した。ＡｆｆｉｒｍＳａｍｐｌｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎスワブ（カタログ番号４４０６２
５１）に、膣分泌液または添加膣分泌液１００μｌを接
種した。次いで、スワブをガラス試験管またはＡｆｆｉ
ｒｍＶＰＩＩＩ試験管に入れて蓋をした。開始時の試
料、ｔ₀はすぐに処理した。残りの試料は、約２４、４
８、７２、または９６時間後に処理した。検査は、実施
例１で記載した方法にしたがって実施した。

【００５５】定量的な検出には、化学ルミネッセンス基
質を使用した。この検出基質は、ｌｕｍｉｎｏ／４−ｉ
ｏｄｏｐｈｅｎｏｌ（ベーリンガーマンハイム化学ル
ミネッセンスＥＬＩＳＡ基質、カタログ番号１５８２９
５０）であった。簡単に言うと、ウェル７に入れる直前
にＰＡＣをＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩプロセッサから取
り出した。捕獲ビーズをＰＡＣから取り出して、白色の
平らな底のマイクロタイターのウェルに、ウェル１個当
たり１個のビーズを入れた。受け入れるウェルには、ビ
ーズが乾燥しないように洗浄溶液１００μｌを入れた。
プレートが一杯になると、洗浄溶液をマルチチャンネル
ピペットを使用してウェルから吸引し、化学ルミネッセ
ンス基質溶液１００μｌをウェル毎に添加した。このプ
レートをすぐにプレート読み取り機（Ｄｙｎａｔｅｋ
ＭＬ３０００、内部温度３０℃、７サイクル、サイクル
間６１秒）に置き、７サイクル読み取った。５サイクル
目のデータ（基質添加後約１０分）を全化学分析に使用
した。

【００５６】実施例３Ａｆｆｉｒｍ試料に有用な一般的な試験固定剤および保
存剤以下の表は、数多くの市販されている保存剤および固定
剤または標準的調合法を使用した自家製の溶液を挙げた
ものである。これらの溶液を、ガラス試料試験管および
化学ルミネッセンス検出を使用して、実施例２で記載し
た方法に従って調製した試料とＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩ
Ｉ微生物同定検査で検査した。少なくとも２４時間試料
の安定性が実現されない溶液は、「不成功」とし、一方
Ａｆｆｉｒｍアッセイによって干渉された溶液は、「干
渉」とした。

【００５７】

【表１】

【００５８】実施例４２４時間の３種調合物の保存効果メタノールおよびジメチルスルホキシド溶液の３種の調
合物を調製し、カンジダアルビカンス、膣ガードネレラ
および膣トリコモナスの２４時間保存能力について試験
した。この手順は、ガラス試料試験管を使用した実施例
２で記載した。膣分泌液１ｍｌ当たりの生物ｃｆｕは次
の通りである。トリコモナス、６×１０ ⁶／ｍＬ、ガー
ドネレラ、１．５×１０⁹／ｍＬ、カンジダ、１×１０⁷
／ｍＬ。実施例２で記載したように、シグナルは化学ル
ミネッセンス検出法を使用して測定した。報告した値
（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＵｎ
ｉｔｓ、ＲＬＵｓ）は、３回の平均である。

【００５９】

【表２】

【００６０】このデータによって、保存溶液がない場
合、膣トリコモナスのシグナルは陰性で、膣ガードネレ
ラのシグナルは急激に減少し、カンジダアルビカンスの
シグナルは２４時間経つと（生育によって）急激に増加
したことが示された。保存溶液がある場合、シグナルは
試料を周囲温度で２４時間保存しても比較的一定に維持
された。

【００６１】実施例５２４時間の追加調合物の保存効果保存溶液の追加調合物のカンジダアルビカンスおよび膣
ガードネレラの２４時間保存能力について試験した。こ
の手順は、ガラス試料試験管を使用した実施例２で記載
した。膣分泌液１ｍｌ当たりの生物ｃｆｕは次の通りで
ある。ガードネレラ、９．７×１０⁸／ｍＬ、カンジ
ダ、３．４×１０⁶／ｍＬ。実施例２で記載したよう
に、シグナルは化学ルミネッセンス検出法を使用して測
定した。報告した値（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅＵｎｉｔｓ、ＲＬＵｓ）は、３回の平均
である。

【００６２】

【表３】

【００６３】このデータによって、保存溶液がない場
合、膣ガードネレラのシグナルは急激に減少し、カンジ
ダアルビカンスのシグナルは２４時間経つと（生育によ
って）急激に増加したことが示された。保存溶液がある
場合、シグナルは試料を周囲温度で２４時間保存しても
比較的一定に維持された。

【００６４】実施例６数種の調合物の４８時間での試料安定性５種の保存調合物について、カンジダアルビカンス、膣
ガードネレラおよび膣トリコモナスの４８時間保存能力
について試験した。この手順は、ガラス試料試験管を使
用した実施例２で記載した。膣分泌液１ｍｌ当たりの生
物ｃｆｕは次の通りである。トリコモナス、４．７×１
０⁷／ｍＬ、ガードネレラ、１．４×１０⁸／ｍＬ、カン
ジダ、５．６×１０⁶／ｍＬ。実施例２で記載したよう
に、シグナルは化学ルミネッセンス検出法を使用して測
定した。報告した値（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅＵｎｉｔｓ、ＲＬＵｓ）は、３回の平均
である。

【００６５】

【表４】

【００６６】このデータによって、保存溶液がない場
合、膣トリコモナスおよび膣ガードネレラのシグナルは
４８時間経っても陰性で、カンジダアルビカンスのシグ
ナルは２４時間および４８時間経つと（生育によって）
急激に増加することが示された。保存溶液がある場合、
シグナルは試料を周囲温度で４８時間保存しても比較的
一定に維持された。

【００６７】実施例７ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試料試験管における保存剤に
よる試料安定性１種の保存調合物を、ガラススクリューキャップ付き試
験管または低密度ポリエチレンＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩ
Ｉ処理試験管を使用して、膣トリコモナス、カンジダア
ルビカンスおよび膣ガードネレラについて４８時間かけ
て試験した。手順は実施例２で記載した通りである。膣
分泌液１ｍｌ当たりの生物ｃｆｕは次の通りである。ト
リコモナス、３．９×１０⁷／ｍＬ、ガードネレラ、
３．１×１０⁸／ｍＬ、カンジダ、５．３×１０⁶／ｍ
Ｌ。実施例２で記載したように、シグナルは化学ルミネ
ッセンス検出法を使用して測定した。報告した値（Ｒｅ
ｌａｔｉｖｅＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＵｎｉｔ
ｓ、ＲＬＵｓ）は、３回の平均である。

【００６８】

【表５】

【００６９】この結果によって、ＡｆｆｉｒｍＶＰＩ
ＩＩ試料試験管は、保存溶液を使用したとき、ガラスス
クリューキャップ試験管に匹敵する安定性を示すことが
示唆された。実際に、スワブは同一試験管で輸送し処理
されるので、ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試験管を使用する
と試料の損失が少なかった。ガラス試験管で輸送したス
ワブは、処理のためにＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試験管
に移された。保存溶液を使用しないときに、試料の安定
性を維持できる試験管はなかった。

【００７０】実施例８試料基質収集物に対する溶液の性能異なる膣分泌物基質に対する保存溶液の性能を示すため
に実験を実施した。４種の膣分泌物収集物、すなわち２
種は新鮮な収集スワブから、もう２種は凍結スワブから
調製した。試料輸送条件としてＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩ
Ｉ試験管を使用した。手順は実施例２で記載した通りで
ある。膣分泌液１ｍｌ当たりの平均の生物ｃｆｕは次の
通りである。トリコモナス、５×１０⁷／ｍＬ、ガード
ネレラ、２．１×１０⁸／ｍＬ、カンジダ、５．６×１
０⁷／ｍＬ。実施例２で記載したように、シグナルは化
学ルミネッセンス検出法を使用して測定した。報告した
値（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＵ
ｎｉｔｓ、ＲＬＵｓ）は、３回の平均である。

【００７１】

【表６】

【００７２】

【表７】

【００７３】この結果によって、この溶液は４種の膣分
泌液収集物中の生物のシグナルを７２時間保存しても維
持できることが示された。

【００７４】実施例９１５人の患者から得た試料基質に対する溶液の性能１５人の女性から収集された膣分泌液に対する保存溶液
（メタノール５０％、ジメチルスルホキシド５０％）の
性能を示すために実験を実施した。１０本のスワブを各
提供者から２日間毎日採取した。試料輸送条件としてＡ
ｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ試験管を使用した。手順は実施
例２で記載した通りである。膣分泌液１ｍｌ当たりの平
均の生物ｃｆｕは次の通りである。トリコモナス、３．
５×１０ ⁷／ｍＬ、ガードネレラ、６．０×１０⁸／ｍ
Ｌ、カンジダ、７．７×１０⁶／ｍＬ。実施例２で記載
したように、シグナルは化学ルミネッセンス検出法を使
用して測定した。報告した値（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＵｎｉｔｓ、ＲＬＵｓ）は、３
回の平均である。

【００７５】

【表８】

【００７６】

【表９】

【００７７】

【表１０】

【００７８】この溶液は、１５名の異なる個人提供者か
ら得た膣分泌液に対して保存効果を示した。生物シグナ
ルは全て維持された。

【００７９】実施例１０温度範囲での保存試料への溶液の性能保存温度の範囲に対する保存溶液（メタノール５０％、
ジメチルスルホキシド５０％）の性能を示すために実験
を実施した。１０本のスワブを各提供者から２日間毎日
採取した。試料輸送条件としてＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩ
Ｉ試験管を使用した。手順は実施例２で記載した通りで
ある。膣分泌液１ｍｌ当たりの生物ｃｆｕは次の通りで
ある。トリコモナス、８．２×１０⁶／ｍＬ、ガードネ
レラ、１．４×１０⁷／ｍＬ、カンジダ、７．９×１０⁶
／ｍＬ。ビーズの色を陽性対照のビーズの色と比較して
数値に割り当てることを除いて、実施例２で記載したよ
うに、シグナルは比色検出法を使用して測定した。陽性
対照ビーズは「２」とした。対照ビーズより濃い分析物
ビーズは「３」とし、対照ビーズと同じ色の分析物ビー
ズは「２」とし、対照ビーズより薄いが、陰性対照ビー
ズより濃い分析物ビーズは「１」とした。記録数値は３
回形式で、異なる読み取り基３台でそれぞれ計数した。
試料は９６時間まで保存した。

【００８０】

【表１１】

【００８１】このデータによって、溶液は保存温度で９
６時間にわたって試料安定性をもたらすことができるこ
とが示された。保存溶液は検出方法に影響を及ぼさない
ことも示唆された。

【００８２】実施例１１この溶液がヌクレアーゼに対する防御をもたらすことの
示唆好ましい実施形態（メタノール５０％、ＤＭＳＯ５０
％）について、ヌクレアーゼ分解に対してＲＮＡを保護
する能力を試験した。市販のＲＮａｓｅ検出キット（Ｒ
ＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）ＲＮａｓｅＤｅｔｅｃｔ
ｉｏｎＤｉｐｓｔｉｃｋｓ、カタログ番号１９６０、
Ａｍｂｉｏｎ）を膣分泌液単独および保存溶液添加膣膣
分泌液の試料に使用した。このキットは、キットのプロ
トコールに従って、計量棒（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）の２箇
所にＲＮＡ溶液がスポットされている。１個のスポット
を試験溶液と共にインキュベートする。次いで計量棒の
両スポットの比色検出を行う。試験溶液と共にインキュ
ベートしたＲＮＡスポットが白色または対照スポットよ
りも淡い青色である場合、この試験溶液はＲＮａｓｅを
含む。この小片を保存溶液と混合した試験膣分泌液に使
用した。この結果によって、保存溶液と混合した膣分泌
液は、非処理の膣分泌液よりも頻繁に試験スポット上に
検出可能なＲＮＡが残存した。このことによって、保存
溶液は膣分泌液に存在するヌクレアーゼに対して防御を
もたらすことが示唆された。

【００８３】別の実験で、ヒト全血、血清および血漿で
の保存溶液を評価するためにＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商
標）ＲＮａｓｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＤｉｐｓｔｉｃ
ｋｓを使用した。それぞれの試料を好ましい実施形態
（メタノール５０％、ＤＭＳＯ５０％）と１：１で混合
して、計量棒で試験した。保存液を含まない試料も同様
に試験した。この結果によって、全行程完了後試験小片
に視覚的に認められるスポットは残存していなかったの
で、全血、血清および血漿試料は活性のあるＲＮａｓｅ
を含んでいることが示唆された。しかし、全血、血清お
よび血漿を保存溶液と共に混合したとき、試験ＲＮＡス
ポットは明らかに小片上に認められた。このことによっ
て、保存溶液はヒト全血、血清および血漿中に存在する
ヌクレアーゼに対して防御をもたらすことが示唆され
た。

【００８４】実施例１２広範囲の溶液組成物の性能どちらかの成分を極端な濃度まで変化させたときの保存
溶液の性能を示すために実験を実施した。試料は７２時
間まで保存剤中で保存した。試料輸送条件としてＡｆｆ
ｉｒｍＶＰＩＩＩ試験管を使用した。手順は実施例２
で記載した通りである。膣分泌液１ｍｌ当たりの生物ｃ
ｆｕは次の通りである。トリコモナス、１×１０⁷／ｍ
Ｌ、ガードネレラ、１．９×１０⁷／ｍＬ、カンジダ、
１．４×１０⁷／ｍＬ。シグナルは実施例１０で記載し
た通りに比色検出法を使用して測定した。記録数値は３
回の平均で、それぞれ異なる読み取り機３台で計数し
た。試験した調合物全てについて保存効果が観察され
た。

【００８５】

【表１２】

【００８６】実施例１３保存溶液で処理した細胞の顕微鏡評価種々の生物から得た細胞を遠心分離によってペレットと
し、ＢＳＡ／食塩水に再懸濁した。各細胞懸濁液の一部
をメタノールおよびＤＭＳＯの１：１混合物を含む同量
の保存溶液で処理した。この処理細胞を周囲温度で２４
時間保存した。対照として、細胞の第２部分を顕微鏡検
査直前に同量のＢＳＡ／食塩水で処理した。両部分を、
位相差顕微鏡（ＥｃｌｉｐｓｅＥ４００、ニコン、日
本）を使用して４０倍で調べた。

【００８７】

【表１３】

【００８８】顕微鏡検査によって、保存溶液中で２４時
間周囲温度で保存して視覚的に完全な細胞が確認され
た。細胞は、様相および数が未処理対照と同様であっ
た。これらの結果によって、この溶液は細胞を溶解しな
いが、構造を安定化し細胞を完全に維持することが示唆
された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡからＥは、ＡｆｆｉｒｍＶＰＩＩＩ核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイの概略説明図である。

【図２】図（Ａ）は、未処理膣トリコモナス（Ｔ．ｖａ
ｇｉｎａｌｉｓ）細胞を示す顕微鏡写真図であり、これ
に対し図（Ｂ）は、本発明の組成物で処理した膣トリコ
モナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の顕微鏡写真図であ
る。

【図３】図（Ａ）は、未処理カンジダアルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞を示す顕微鏡写真図であ
り、これに対し図（Ｂ）は、本発明の組成物で処理した
カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞の
顕微鏡写真図である。

【図４】図（Ａ）は、未処理のヒト表皮ケラチノサイト
を示す顕微鏡写真図であり、これに対し図（Ｂ）は、本
発明の組成物で処理したヒト表皮ケラチノサイトを示す
顕微鏡写真図である。

【図５】図（Ａ）は、未処理のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞を示す顕微鏡写真図で
あり、これに対し図（Ｂ）は、本発明の組成物で処理し
たＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣
細胞を示す顕微鏡写真図である。

【図６】図（Ａ）は、未処理のヒト口腔細胞を示す顕微
鏡写真図であり、これに対し図（Ｂ）は、本発明の組成
物で処理したヒト口腔細胞を示す顕微鏡写真図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者ドロレスエム．バーガーアメリカ合衆国 21239 メリーランド州バルチモアラックヒルコート 6505 (72)発明者ダレッタエー．ユアシスアメリカ合衆国 21120 メリーランド州パークトンマウントカーメルロード 1104 (72)発明者ウイリアムエー．ナスバウマーアメリカ合衆国 21093 メリーランド州ティモニウムコーマーコート７ナンバー201 (72)発明者アンビー．ブラウンアメリカ合衆国 11783 ニューヨーク州シーフォードヒルクレストドライブ 255

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１個の細胞の構造および核酸
を安定化する組成物であって、前記組成物が、（ａ）少なくとも１種のアルコールまたはケトンを含
む、蛋白質を沈殿または変性させることができる第１の
物質と、（ｂ）第１の物質の少なくとも１個の細胞への注入を促
進する第２の促進物質とを含む組成物であって、ここで、前記第１の物質と第２の物質の濃度が、前記少
なくとも１個の細胞の構造および核酸を安定化するため
に有効な濃度であることを特徴とする組成物。
【請求項２】前記少なくとも１種のアルコールまたは
ケトンがメタノール、エタノール、プロパノール、イソ
プロパノール、ブタノールおよびアセトンから成る群か
ら選択され、ならびに、前記第２の物質がジメチルスル
ホキシド、エチレングリコールおよびポリエチレングリ
コールから成る群から選択されることを特徴とする請求
項１に記載の組成物。
【請求項３】前記第１の物質が１種のアルコールまた
はケトンから成り、前記組成物における前記第１の物質
および第２の物質の前記濃度が４：１（第１物質：第２
物質）の比であることを特徴とする請求項１に記載の組
成物。
【請求項４】前記第１の物質が第１のアルコールまた
はケトンと、第２のアルコールまたはケトンとから成
り、前記組成物における前記第１の物質および第２の物
質の前記濃度が２．５：２．５：５（第１のアルコール
またはケトン：第２のアルコールまたはケトン：第２物
質）の比、若しくは１：１（第１物質：第２物質）の比
であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】前記第１の物質がメタノールであり、前
記第２の物質がジメチルスルホキシドであることを特徴
とする請求項３に記載の組成物。
【請求項６】前記第１のアルコールまたはケトンがメ
タノールであり、前記第２のアルコールまたはケトンが
エタノールであり、前記第２の物質がジメチルスルホキ
シドであることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項７】前記第１の物質がエタノールであり、前
記第２の物質がジメチルスルホキシドであることを特徴
とする請求項３に記載の組成物。
【請求項８】前記第１の物質がメタノールであり、前
記第２の物質がジメチルスルホキシドであることを特徴
とする請求項４に記載の組成物。
【請求項９】前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであるこ
とを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】前記少なくとも１個の細胞が原核生物
または真核生物であることを特徴とする請求項１に記載
の組成物。