DE60035156T2 - Eine Zusammensetzung zur Bereitstellung von dauerhaft haltbaren Zellen für diagnostische Tests - Google Patents

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DE60035156T2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Stabilisieren von Zellen in einer Probe (wie zum Beispiel einer klinischen Probe in einer biologischen Probe) zum Transport und anschließenden Testen für eine Diagnose. Die Zusammensetzung zum Stabilisieren der Zellen ist insbesondere in der Lage, Nucleinsäuren für die Hybridisierung mit Oligonucleotid-Abfang- und -Detektorsonden intakt zu halten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das diagnostische Testen von Infektions- und Geschlechtskrankheiten hat sich immer mehr auf schnellere, genauere Ergebnisse konzentriert. Die Nucleinsäuresondentechnologie ermöglichte ein schnelles diagnostisches Testen und durchbrach dabei Zeitbarrieren mit hoher Spezifität und weniger Subjektivität. Während die schneller als biochemische Assays auf Wachstumsbasis und spezifischer als immunologische Assays sind, stellen Nucleinsäuresondenassays eine einzigartige Herausforderung für die intakte Lieferung der Zielprobe dar. Weiterhin sind Proben, die an einer Stelle genommen und an einer anderen Stelle getestet werden, besonders anfällig für Nucleinsäureabbau, wenn sie nicht richtig gehandhabt werden.
  • Der Nucleinsäurenachweis durch Hybridisierung und Abfang wird auf eine Vielzahl von Krankheiten angewendet. Er ist besonders nützlich bei Infektionskrankheiten, bei denen herkömmliche Verfahren zeitraubend sind, eine rasche Behandlung entscheidend ist und/oder die Krankheit meldepflichtig ist. Trichomonas-vaginalis-Vaginitis (Trichomoniase) ist eine meldepflichtige Geschlechts krankheit, die in den USA ungefähr 3 Millionen Frauen pro Jahr befällt. Weiterhin sind vaginale Störungen aufgrund einer bakteriellen Vaginose (BV) und Candidiase zwei der häufigsten Gründe, warum Frauen sich einer medizinischen Behandlung unterziehen. Die Symptome dieser drei unterschiedlichen Krankheiten überlappen, so dass eine Differentialdiagnose notwendig ist, bevor eine geeignete und spezifische Medikation verschrieben werden kann. Eine schnelle und genaue Diagnose ist bei Schwangeren besonders entscheidend; bei ihnen sind BV und Trichomoniase mit Frühgeburten und Babys mit geringem Geburtsgewicht verbunden. Außerdem sind BV-positive Schwangere für Chorioamniotitis, Fruchtwasserinfektion und puerperale infektiöse Morbidität prädisponiert. BV wurde auch mit entzündlichen Beckenerkrankungen, Kindbettfieber, Bakteriämie, Salpingitis und dergleichen in Verbindung gebracht. Eine richtige Diagnose und Behandlung von Vaginitis erfordert die Identifizierung des verursachenden Mikroorganismus, so dass die geeignete antimikrobielle Behandlung definiert werden kann.
  • Der Affirm-VPIII-Nucleinsäure-Hybridisierungsassay, der im US-Patent Nr. 5,654,418 beschrieben ist, ist ein erheblicher Fortschritt bei der Diagnose der Vaginitis, weil er T. vaginalis, G. vaginalis oder C. albicans aus einem einzigen Scheidenabstrich nachweisen kann. Der Abstrich wird bei hoher Temperatur in einer Lyselösung inkubiert, was bewirkt, dass der Organismus lysiert wird und Nucleinsäure freisetzt. Dann wird eine Pufferlösung zu der Probe gegeben. Dann wird die Probelösung mit einem Satz von Nylonperlen inkubiert, die jeweils mit spezifischen Abfangsonden derivatisiert sind. Die rRNA hybridisiert mit den Abfangperlen, die anschließend mit einer Lösung inkubiert werden, die biotinylierte Detektor-Oligonucleotidsonden enthält. Die Detektorsonden hybridisieren mit einem anderen Bereich in der rRNA. Die Perle wird in einen Napf übergeführt, der ein Enzym enthält. Wenn biotinylierte Detektorsonden mit der rRNA hybridisiert werden, bindet das Enzym an das Biotin. Wenn keine rRNA an die Perle hybridisiert ist, ist auch keine biotinylierte Detektorsonde vorhanden, an die das Enzym binden kann. Schließlich werden die Perlen mit einem Substrat inkubiert, das unter Bildung einer blauen Farbe mit dem Enzym reagiert. Wenn rRNA vorhanden ist, erscheinen die Perlen blau. Wenn keine rRNA in der Probe ist, bleiben die Perlen farblos. Eine Differentialdiagnose kann aus einer einzigen Probe erhalten werden, indem man drei Perlen verwendet, wobei jede Perle spezifisch für nur einen der Analyten ist.
  • Die vorliegende Erfindung wurde entwickelt, um für Stabilität von Scheidenabstrichproben zu sorgen, insbesondere Proben, die zum Testen auf die Anwesenheit von Candida, Gardnerella oder Trichomonas unter Verwendung des Affirm-VPIII-Mikrobenidentifizierungstests gesammelt wurden. Ohne die Hilfe der vorliegenden Erfindung bleiben die Abstrichproben nur bis zu einer Stunde bei Umgebungstemperatur oder vier Stunden bei Kühlschranktemperatur stabil. Insbesondere die rRNA innerhalb der Zellen muss intakt bleiben, um nachgewiesen zu werden, und bei Anwesenheit einer geringen, nichtpathologischen Zahl von Candida muss verhindert werden, dass diese sich vermehren und zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Der geeignete Konservierungsstoff würde es erlauben, die Probenahme und das Testen der Probe an entfernten Stellen durchzuführen oder viele Proben zu einer Charge zusammenzufassen, um sie alle auf einmal zu verarbeiten und zu testen.
  • Die richtige Transport- oder Konservierungs- oder Fixierungslösung für die Affirm-VPIII-Probe müsste die folgenden Attribute haben:
    • 1. Die Lösung müsste RNA-abbauende Enzyme (RNasen), die sich in der Scheidenflüssigkeit befinden, reduzieren oder hemmen.
    • 2. Sie müsste das Wachstum von Candida, Gardnerella oder Trichomonas verhindern, während sie ...
    • 3. den RNA-Abbau innerhalb der Zellen aufgrund von endogenen Nucleasen oder Zelltod reduziert.
    • 4. Die Lösung müsste mit dem Affirm-VPIII-Test, wie er ausgeführt ist, verträglich sein.
    • 5. Sie dürfte keine unnötige Gefahr für die Endverbraucher einführen, und
    • 6. Sie würde für eine Signalstabilität bei Proben sorgen, die bis zu 72 Stunden lang gelagert werden.
  • Herkömmliche Konservierungsstoffe, wie solche mit bakteriziden oder inhibitorischen Wirkungen, verhindern zwar das Wachstum von geringen Mengen von Organismen, lösen jedoch nicht das Problem des Nucleinsäureabbaus. Umgekehrt sind Transportmedien häufig Minimal- oder Hungermedien, die so zubereitet sind, dass sie die Lebensfähigkeit des Organismus für die spätere Kultur aufrechterhalten. Candida neigt jedoch dazu, in solchen Medien gut zu gedeihen, während Gardnerella und Trichomonas nicht überleben. Das Ergebnis bei solchen Medien ist ein falsch positives Affirm-Ergebnis für Candida und ein falsch negatives für die beiden anderen. Die Komplexität des Problems wird dadurch erhöht, dass diese drei Organismen sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zelltypen repräsentieren und jeder eine unterschiedlich aufgebaute Zellwand und/oder -membran hat.
  • Fixierungsmittel als Substanzklasse enthalten häufig Alkohol, Formaldehyd oder Chloroform sowie je nach Probe und Anwendung einen weiten Bereich von Additiven. Viele sind keine stabilen Lösungen, die nur für die Verwendung innerhalb von Stunden nach der Herstellung geeignet sind. Weiterhin können sie Gefahren darstellen über diejenigen hinaus, denen der Kliniker ohnehin ausgesetzt ist (d.h. Quecksilber(II)chlorid, Pikrinsäure). Formaldehyde erwiesen sich als unverträglich mit Affirm-Reagentien. Fixierungsmittel auf Alkoholbasis waren aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine und insbesondere Nucleasen auszufällen oder zu denaturieren, am vielversprechendsten.
  • Ein solches Fixierungsmittel ist im US-Patent Nr. 5,256,571 beschrieben, um die Struktur von Säugerzellen zu konservieren. Hurley et al. beanspruchen eine Lösung (im Folgenden als PreservCyt bezeichnet) von 45 bis 55% Methanol, einem Antiverklumpungsmittel und einem Puffermittel. So effektiv diese Lösung auch für Säugerzellen sein mag, war sie nicht in der Lage, die oben skizzierten Kriterien für alle drei interessierenden vaginalen Pathogene zu erfüllen. Dies war höchstwahrscheinlich auf die erhöhte Komplexität der Zellwandstruktur jedes Organismus zurückzuführen, eine Struktur, die man bei Säugerzellen nicht antrifft. Weiterhin wurden in diesen Studien durch Erhöhung der Methanolkonzentration auf 95% die Vaginalproben nicht so konserviert oder fixiert, dass die rRNA nach 24 Stunden nachweisbar war.
  • Viele Fixierungsmittel, die für die Cytologie und Histologie verwendet werden, sind selbst herzustellende Lösungen, deren Zubereitungen dem Fachmann wohlbekannt sind. Sie werden häufig frisch hergestellt und innerhalb einer kurzen Zeitspanne verwendet, wie es oben erwähnt ist. Zu diesen Lösungen gehören zum Beispiel: 10% neutrales gepuffertes Formalin, Carnoy-Lösung (Ethanol, Chloroform, Essigsäure), B-5 (Quecksilber(II)chlorid, Natriumacetat, Formalin, Wasser), Bouin-Lösung (Pikrinsäure, Eisessig, Formaldehyd) und Zenker-Lösung (Wasser, Kaliumdichromat, Quecksilber(II)chlorid, Eisessig). Diese Zubereitungen werden routinemäßig auf Nachschlageseiten über das Internet von akademischen oder Forschungsinstitutionen veröffentlicht, wie etwa: das Department of Pathology & Microbiology der University of Bristol (http://lang-dl-srv.lang.bris.ac.uk/Cpl/histfix.htm), das Jackson Laborstory (http://ww.jax.org/resources/documents/sss/imaging/histf.html) und die University of Newcastle at Australia (http://www.newcastle.edu.au/department/i/birjt/techinfo/bio_fix.html). Ein weniger bekanntes Fixierungsmittel, das von der University of Texas, Austin, über das Internet veröffentlicht wird (http://vize222.zo.utexas.edu/Marker_pages/methods_pages/fixatives.html), ist als Dent-Lösung bekannt. Diese Lösung enthält vier Teile Methanol und ein Teil Dimethylsulfoxid (DMSO). Dent-Lösung wird beschrieben als Fixierungsmittel, das für die immunologische Anfärbung von Xenopus-Proben beschrieben ist. Die angegebene Vorschrift besteht darin, Proben über Nacht bei -20 °C zu fixieren. Die Autoren behaupten, dass auf diese Weise hergestellte Proben viele Monate, vielleicht sogar Jahre lang stabil eingefroren werden können.
  • Die Erfinder haben herausgefunden, dass die oben beschriebene Dent-Lösung Scheidenabstrichproben konserviert, die Scheidenflüssigkeit und eingesäte Mengen von Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und Candida albicans enthalten. In dieser Lösung aufbewahrte Abstriche sind bei Umgebungstempera tur mehrere Tage lang stabil, bevor sie mit dem Affirm-VPIII-System getestet werden. Mit solchen Abstrichen erhaltene Ergebnisse ergeben ähnliche Signale wie identische Anstriche, die unmittelbar nach der Herstellung getestet wurden. Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass Ethanol oder Gemische von Ethanol und Methanol die Proben ebenfalls konservieren, wenn sie mit DMSO gemischt werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird ein 1:1-Gemisch von Methanol und DMSO verwendet.
  • Dimethylsulfoxid wird in früheren Literaturstellen als Bestandteil verwendet, der mit anderen Molekülen gemischt wird, aber in erheblich geringeren Konzentrationen. Im US-Patent Nr. 5,622,867 werden 0,5 bis 6% DMSO in einer Lösung zur Lagerung von Blutplättchen verwendet; im US-Patent Nr. 3,852,155 werden 8 bis 10% DMSO in einer Lösung zur Kryokonservierung von Pferdezellkulturen verwendet; im US-Patent Nr. 5,364,756 ist eine Lösung beschrieben, die 0,5 M (entspricht 3-4%) DMSO enthält. In den US-Patenten Nr. 5,422,277 und 4,666,699 wird DMSO in Färbe-Fixierungs-Lösungen in einer Menge von 5 bis 10% bzw. 3 bis 8% verwendet. In jedem dieser Fälle ist DMSO jedoch nur eine in geringem Anteil vorhandene Komponente einer viel komplexeren Lösung.
  • In der vorliegenden Erfindung beschreiben die Erfinder eine neue Zusammensetzung, die ein Gemisch aus einer ersten Substanz, bei der es sich um wenigstens einen Alkohol oder ein Keton handelt, und einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, wie DMSO, ist, wobei eine bevorzugte Ausführungsform aus einem Gemisch von 50% Methanol/50% DMSO besteht, und das Verfahren zum langfristigen (mehrere Tage) Stabilisieren zum Beispiel von Zellen und insbesondere klinischen Proben unter Verwendung dieser Zusammensetzung.
  • Insbesondere wird in einer bevorzugten Ausführungsform davon ausgegangen, dass die klinischen Proben Scheidenabstriche sind, die die Erreger von Vaginitis und bakterieller Vaginose enthalten, doch könnte die Lösung auch für andere biologische Proben verwendet werden, bei denen die Gewinnung von RNA notwendig ist. Diese Lösung wird nützlich sein bei der Verhinderung des Abbaus von Nucleinsäuren (d.h. DNA, RNA), die sich innerhalb von Zellen befinden, welche in einer Matrix einer biologischen Flüssigkeit, wie Scheidenflüssigkeit, suspendiert sind. Weiterhin wird diese Lösung in der Lage sein, den Abbau von zum Beispiel RNA, einer leicht abbaubaren Nucleinsäure, bei Umgebungstemperatur und darüber über mehrere Tage zu verhindern.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Zellfixierungszusammensetzung bereit und gibt ein Verfahren zur Konservierung von Zellen (und weiterhin von klinischen Proben) an.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung aus einer ersten Substanz, die Proteine ausfällen oder denaturieren kann, und einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, die die Infusion der ersten Substanz in Zellen unterstützen soll.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung aus 4 Teilen Methanol auf 1 Teil DMSO.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung aus 2,5 Teilen Methanol, 2,5 Teilen Ethanol und 5 Teilen DMSO.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung aus 4 Teilen Ethanol und 1 Teil DMSO.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung aus 1 Teil Methanol und 1 Teil DMSO.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnung
  • 1(A-E) ist eine schematische Beschreibung des Affirm-VPIII-Nucieinsäure-Hybridisierungsassays.
  • 2A ist eine Mikrophotographie, die unbehandelte T.-vaginalis-Zellen zeigt, im Vergleich zu 2B, die eine Mikrophotographie von T.-vaginalis-Zellen zeigt, die mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt sind.
  • 3A ist eine Mikrophotographie, die unbehandelte C.-albicans-Zellen zeigt, im Vergleich zu 3B, die eine Mikrophotographie von C.-albicans-Zellen zeigt, die mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt sind.
  • 4A ist eine Mikrophotographie, die unbehandelte humane Epidermis-Keratinocyten zeigt, im Vergleich zu 4B, die eine Mikrophotographie von humanen Epidermis-Keratinocyten zeigt, die mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt sind.
  • 5A ist eine Mikrophotographie, die unbehandelte Spodoptera-frugiperda-Eierstockzellen zeigt, im Vergleich zu 5B, die eine Mikrophotographie von Spodoptera-frugiperda-Eierstockzellen zeigt, die mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt sind.
  • 6A ist eine Mikrophotographie, die unbehandelte humane Mundschleimhautzellen zeigt, im Vergleich zu 6B, die eine Mikrophotographie von humanen Mundschleimhautzellen zeigt, die mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt sind.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Fixierungszusammensetzung bereit und gibt ein Verfahren zur Konservierung von Zellen in einer Probe, vorzugsweise einer biologischen Probe, an.
  • Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht aus:
    • I. einer ersten Substanz, die Proteine ausfällen oder denaturieren kann und die aus wenigstens einem Alkohol oder Keton besteht; und
    • II. einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, die die Infusion der ersten Substanz in Zellen unterstützen soll.
  • Bei dem Alkohol oder Keton kann es sich um eines oder mehrere der folgenden handeln: Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol oder Aceton. Die Hilfssubstanz ist aus Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und Polyethylenglycol ausgewählt.
  • Es gibt mehrere bevorzugte Ausführungsformen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzung kann aus Methanol:DMSO in einem Verhältnis von 4:1, Methanol:Ethanol:DMSO in einem Verhältnis von 2,5:2,5:5,0, Ethanol:DMSO in einem Verhältnis von 4:1 oder am meisten bevorzugt Methanol:DMSO in einem Verhältnis von 1:1 bestehen. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen solche, bei denen die Zusammensetzung nur aus Methanol oder nur aus Dimethylsulfoxid besteht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Stabilisieren der Struktur und der Nucleinsäuren wenigstens einer Zelle in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) Hinzufügen einer Zusammensetzung, die eine effektive Konzentration von Folgendem enthält, zu einem Gefäß, das die Probe enthält:
    • (i) einer ersten Substanz, die Proteine ausfällen oder denaturieren kann und wenigstens einen Alkohol oder ein Keton umfasst; und
    • (ii) einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, die die Infusion der ersten Substanz in die wenigstens eine Zelle unterstützen soll;
    • (b) In-Kontakt-Bringen der wenigstens einen Zelle in der Probe mit der Zusammensetzung;
    • (c) Inkubieren der Probe mit der Zusammensetzung während eines effektiven Zeitraums und bei einer effektiven Temperatur; und
    • (d) Gewinnen der wenigstens einen Zelle mit einer stabilisierten Struktur und stabilisierten Nucleinsäuren in der Probe.
  • Bei dem Alkohol oder Keton kann es sich um eines oder mehrere der folgenden handeln: Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol oder Aceton. Die Hilfssubstanz ist aus Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und Polyethylenglycol ausgewählt.
  • Insbesondere sind Scheidenabstrichproben, die mit der Erfindung fixiert sind, bei Umgebungstemperatur und darüber bis zu vier Tage lang stabil, wenn die Stabilität anhand der nachweisbaren ribosomalen RNA von Trichomonas, Gardnerella oder Candida bewertet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Erfindung zusammen mit dem Affirm-VPIII-Nucleinsäure-Hybridisierungsassay verwendet werden, der im US-Patent Nr. 5,654,418 beschrieben ist. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch für die Verwendung mit anderen Testverfahren vorgesehen, die für die Diagnose von der Unversehrtheit der Nucleinsäure abhängen.
  • Da die vorliegende Erfindung Nucleinsäure und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform RNA in einem prokaryontischen Zelltyp einschließlich unter anderem Gardnerella vaginalis (eines Gram-negativen Bakterium) und einem eukaryontischen Zelltyp einschließlich unter anderem Candida albicans (einer Hefe) und Trichomonas vaginalis (eines Protozoons) konserviert, wäre es für den Fachmann offensichtlich, dass die konservierenden Wirkungen der vorliegenden Lösung auch auf irgendwelche anderen prokaryontischen und eukaryontischen Zellen angewendet werden können, und sie soll auch auf irgendwelche anderen prokaryontischen und eukaryontischen Zellen anwendbar sein.
  • In der bevorzugten Ausführungsform werden Scheidenabstriche in das Affirm-VPIII-Röhrchen gegeben, und ein Volumen des neuen Fixierungsmittels (50 bis 500 μl, vorzugsweise 100 μl) wird in das Röhrchen gegeben. Die Probenröhrchen werden verschlossen, und dann können die Proben bei Umgebungstemperatur zu der Stelle transportiert werden, wo sie getestet werden. Das Testen kann bis zu vier Tage später stattfinden. Wenn man zum Testen bereit ist, wird eine Lyselösung zu dem Röhrchen gegeben, und das Röhrchen wird verschlossen und bei 85 °C inkubiert, was bewirkt, dass der Organismus lysiert wird und Nucleinsäure freisetzt (1A). Nach der Lyse und nach dem Abkühlen wird eine Pufferlösung, die Oligonucleotidsondenpolymere enthält, welche spezifisch für 16s-ribosomale Ribonucleinsäure (rRNA) von G. vaginalis und C. albicans ist, hinzugefügt und bildet einen Komplex (1B). Das Polymer ist bei T. vaginalis wegen der höheren Kopienzahl von rRNA-Transcripten nicht erforderlich. Dann wird der Komplex durch ein Abfangoligonucleotid, das an eine andere Stelle auf der rRNA hybridisiert, aus der Probe entfernt. Es gibt drei verschiedene Abfangoligonucleotide, die jeweils eine einzigartige Spezifität für T. vaginalis, G. vaginalis oder C. albicans haben. Nylonperlen sind mit nur einem einzigen Typ von Abfangoligonucleotid derivatisiert. Eine Perle jeden Typs wird mit der Probe inkubiert, was das gleichzeitige Abfangen von rRNA von drei unterschiedlichen Organismen ermöglicht (1C). Dann werden die Perlen in einer Lösung inkubiert, die biotinylierte Detektor-Oligonucleotidsonden enthält. Die Detektorsonden hybridisieren mit einem anderen Bereich in der rRNA (1D). Nach dem Waschen wird die Perle in einen Napf übergeführt, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Streptavidin (SA-HRP) enthält. Wenn biotinylierte Detektorsonden mit der rRNA hybridisiert sind, bindet das SA-HRP an das Biotin (1E). Wenn keine rRNA an die Perle hybridisiert ist, ist auch keine biotinylierte Detektorsonde vorhanden, an die das SA-HRP binden kann. Schließlich werden die Perlen mit einem Substrat inkubiert, das unter Bildung einer blauen Farbe mit dem HRP reagiert. Wenn rRNA vorhanden ist, erscheinen die Perlen blau; wenn keine vorhanden ist, bleiben die Perlen farblos.
  • Für Forschungszwecke können auch alternative Nachweisreagentien verwendet werden, um ein quantitatives Maß für die relative Menge der an die Perle hybridisierte rRNA zu erhalten. Nach der Bindung von SA-HRP können die Perlen in Mikrotiternäpfen mit einem chemilumineszenten HRP-Substrat inkubiert und mit einem Luminometer abgelesen werden.
  • Um effektiv zu sein, muss die Fixierungslösung die Nucleasen, die in Scheidenflüssigkeitsmatrix vorhanden sind, hemmen oder ausschalten. Zweitens muss sie den Organismus durchdringen und einen Abbau von Nucleinsäure aufgrund von endogenen Nucleasen verhindern. Drittens muss sie die Zellwand des Organismus intakt wieder verlassen. Die vorzeitige Lyse der Organismen kann zum Verlust von einiger RNA führen, wenn die Probe mit der Lyselösung im Affirm-VPIII-Assay erhitzt wird. Viertens muss die Fixierungslösung mit den Affirm-VPIII-Reagentien verträglich sein und darf kein Artefakt produzieren.
  • Viele Fixierungsmittel, die für die Gewebefixierung, -anfärbung und -kryokonservierung verwendet werden, sind komplexe Lösungen, die häufig aggressive Reagentien mit sehr begrenzter Stabilität enthalten. Dies ist häufig notwendig, wenn die Konservierung von zellulären Strukturen oder Proteinen entscheidend ist. Da es hier die Absicht ist, nur die Nucleinsäure und die Zellwand zu konservieren, wird davon ausgegangen, dass die Lösung viel weniger komplex sein muss. Ein zusätzlicher Nutzen der reduzierten Komplexität ist eine stabilere Lösung.
  • Hier wird beschrieben, dass Gemische von Alkohol(en) und DMSO Proben, insbesondere Scheidenabstriche, die mit Erregern von Vaginitis und bakterieller Vaginose beimpft sind, stabilisieren können. Die neuen Lösungen können als Transportmedien für klinische Proben dienen, die an entfernten Stellen gesammelt und später an einem zentral lokalisierten Verarbeitungslabor getestet werden können. Außer der vorsichtigen Handhabung und Vermeidung von extremen Temperaturen sind keine speziellen Transporterwägungen notwendig.
  • Folgendes sind spezielle Beispiele der vorliegenden Erfindung, die jedoch in keiner Weise als Einschränkung derselben anzusehen sind.
  • Beispiel 1
  • Beschreibung des Affirm-VPIII-Mikrobenidentifizierungstests
  • Es folgt eine Beschreibung des Affirm-VPIII-Mikrobenidentifizierungstests und der Testvorschrift:
    Gesammelte Scheidenabstrichproben werden in das Affirm-VPIII-Probenröhrchen gegeben, und der Stiel des Abstrichstäbchens wird an der Kerbe (genau oberhalb des Röhrchens) abgebrochen. In jedes Röhrchen werden zwölf Tropfen Lyselösung gegeben (wobei die Abstriche in den Röhrchen bleiben), und die Röhrchen werden verschlossen und zehn Minuten lang in den Affirm-Lyseblock (bei 85 °C) gegeben. Die Röhrchenverschlüsse "halten den Stiel des Abstrichstäbchens "gefangen" und erleichtern so die spätere Entfernung des Abstrichs. Nach zehn Minuten werden die Röhrchen aus dem Block entnommen, und in jedes Röhrchen werden zwölf Tropfen Pufferlösung gegeben. Die Pufferlösung enthält die Signalamplifikationspolymere für C. albicans und G. vaginalis. Die Röhrchen werden durch 10-maliges kurzes Schütteln gemischt. Die Abstriche werden dann auf den Seiten des Röhrchens exprimiert, um Flüssigkeit zu entfernen, und verworfen. Der Röhrchenverschluss wird durch einen Filteraufsatz ersetzt. Auf diese Weise verarbeitete Proben müssen innerhalb von vierundzwanzig Stunden bestimmt werden.
  • Die Affirm-VPIII-Reagentiencassette weist sieben Näpfe auf, von denen sechs Reagentien enthalten. Eine Reagentiencassette pro Probe wird verwendet. Napf 1 ist leer, und die vorbereitete Probe wird in diesen Napf gegeben. Napf 2 enthält eine Hybridisierungslösung, die aus den biotinylierten Detektorsonden und Formamid in einer gepufferten chaotropen Lösung besteht. Napf 3 enthält eine Waschlösung. Napf 4 enthält das Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase(SA-HRP)-Konjugat. Die Näpfe 5 und 6 enthalten beide Waschlösung. Napf 7 enthält eine gepufferte Peroxidlösung. Vor der Durchführung des Tests werden vier Tropfen Substratlösung zu Napf 7 gegeben. Die Substratlösung enthält den Indikator, der unter Bildung der blauen Farbe, welche visuell abgelesen wird, mit dem HRP reagiert. Wenn ein chemilumineszenter Indikator verwendet wird (nur für Forschungszwecke), wird der Affirm-Prozessor gestoppt, bevor die Sondenanalysekarte (PAC) in Napf 7 eintritt.
  • Die Affirm-VPIII-Sondenanalysekarte enthält die zuvor beschriebenen drei analytenspezifischen Abfangperlen. Außerdem gibt es eine negative Kontrollperle und eine positive Kontrollperle. Eine PAC pro Probe wird verwendet.
  • Affirm-VPIII-Reagentiencassetten werden geöffnet und auf dem automatischen Affirm-Prozessor angeordnet, eine Cassette pro Probe. Die Probenröhrchen werden in Napf 1 der Reagentiencassette entleert. Wenn das kolorimetrische oder visuelle Nachweisverfahren verwendet wird, werden vier Tropfen Substratlösung in Napf 7 gegeben. Wenn ein chemilumineszentes Nachweisverfahren verwendet werden soll (für Forschungszwecke), wird keine Substratlösung zu Napf 7 gegeben. PACs werden in Napf 1 der Reagentiencassetten gegeben, und der Prozessor wird gestartet.
  • Der Prozessorarm nimmt die PAC auf und schüttelt die Karte sachte in den Näpfen mit Hilfe einer vertikalen Hoch-und-Runter-Bewegung. Nach mehreren Minuten in Napf 1 bewegt der Prozessor die PAC in Napf 2. Wenn rRNA in den Abfangperlen vorhanden ist, hybridisieren die biotinylierten Detektorsonden in Napf 2 mit dem Perle-RNA-Komplex. Die positive Kontrollperle ist mit einem Abfangoligonucleotid derivatisiert, das zu einem der Detektoroligonucleotide in Napf 7 komplementär ist. Dadurch wird gewährleistet, dass die positive Kontrollperle stets positiv reagiert, außer wenn der Assay im Nachweisschritt versagt. Wenn die positive Kontrolle versagt, ist dies ein guter Hinweis darauf, dass entweder 1) der Anwender die Substratlösung nicht in Napf 7 gegeben hat oder 2) es ein Reagentienversagen in der Cassette gab. Umgekehrt ist die negative Kontrollperle mit einem Oligonucleotid derivatisiert, das in keinem der Näpfe ein komplementären Detektoroligonucleotid hat. Daher sollte diese Perle stets farblos bleiben. Nach Napf 2 bewegt der Prozessor die PAC zu Napf 3, wo Waschlösung alle unspezifisch gebundenen Nucleinsäure- oder Oligonucleotidsonden entfernt. In Napf 4 binden die biotinylierten Detektorsonden an das SA- HRP-Konjugat. Dann wird das PAC in zwei aufeinanderfolgenden Näpfen, 5 und 6, gewaschen. Dadurch wird gewährleistet, dass es keine unspezifische Farbentwicklung aufgrund von Übertragung von Meerrettich-Peroxidase gibt. An diesem Punkt kann der Perle/Nucleinsäure/Detektor/SA-HRP-Komplex für den Chemilumineszenznachweis entnommen oder für die Reaktion mit dem Indikatorsubstrat zu Napf 7 fortschreiten gelassen werden. Dann wird die PAC kurz in Napf 6 gewaschen, und der Assay wird beendet. Jede blaue Farbentwicklung auf den spezifischen Analytenperlen zeigt an, dass die Probe diesen Organismus enthält. Eine farblose spezifische Analytenperle zeigt an, dass die Probe in Bezug auf diesen Organismus negativ ist.
  • Proben wurden gemäß der Vorschrift des Affirm-VPIII-Mikrobenidentifizierungstests verarbeitet und getestet, wenn nichts anderes vermerkt ist.
  • Beispiel 2
  • Beschreibung des experimentellen Verfahrens zur Bewertung von Konservierungslösungen
  • Pools von Scheidenflüssigkeit wurden aus frischen, selbst genommenen Scheidenabstrichen und/oder gefrorenen Scheidenabstrichen hergestellt. Spenderinnen frischer Abstriche wurden angewiesen, ihre Abstriche (5 pro Spenderin) innerhalb von 2 Stunden nach der Gewinnung auf Eis zu legen. Die Abstriche wurden auf Eis gehalten, bis innerhalb von zwei Stunden Pools hergestellt wurden, oder sie wurden sofort für die spätere Verwendung eingefroren. Zur Herstellung der vaginalen Pools wurden zehn frische oder aufgetaute gefrorene Abstriche pro Milliliter normaler Kochsalzlösung (Kat.-Nr. 4397753, Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks Maryland) exprimiert. Abstriche wurden in dieser Weise hergestellt, bis genügend Volumen für die Zahl der getesteten experimentellen Proben erhalten wurde. Ein Teil des Pools wurde verwendet, um Sedimente der Organismen zu resuspendieren, wie es unten beschrieben ist, und ein Teil wurde ungeimpft gelassen und diente als Kontrolle.
  • Candida albicans (ATCC 60193) wurde 24-48 Stunden lang bei 35 °C auf Sabouraud-Dextrose-Agar (Kat.-Nr. 4321278, Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks Maryland) gezüchtet. Eine einzelne Kolonie wurde herausgesucht und auf einer zweiten Platte ausgestrichen, die dann 18-20 Stunden lang bei 35 °C inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurden 3 ml BSA/Kochsalzlösung zu der Platte gegeben, und die Kolonien wurden mit einer 10-μl-Impföse sachte resuspendiert. Eine sterile Pipette wurde verwendet, um die Suspension in ein Röhrchen zu übertragen, das wenigstens 10 ml BSA/Kochsalzlösung enthielt. Die Suspension wurde im Wirbelmischer gemischt, und die Extinktion bei 625 nm wurde spektrophotometrisch gemessen. Die Suspension wurde auf eine OD625 von ungefähr 0,4 (ungefähr 6,0 × 106 CFU/ml) eingestellt. Dann wurde ein Volumen der Suspension 10 Minuten lang bei 3000 U/min in einer TJ-6-Tischzentrifuge (Beckman Instruments) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Sediment wurde mit der Scheidenflüssigkeit resuspendiert, so dass man eine Endkonzentration von ungefähr 7,5 × 106 CFU/ml erreichte.
  • Gardnerella vaginalis (ATCC 49145) wurde 24-48 Stunden lang bei 35 °C auf Chocolate-II-Agar (Kat.-Nr. 4321267, Becton Dickinson) gezüchtet. Einzelne Kolonien wurden herausgesucht und auf sekundären Platten ausgestrichen, die dann 18-48 Stunden lang bei 35 °C inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden 3 ml BSA/Kochsalzlösung zu jeder sekundären Platte gegeben, und die Kolonien wurden mit einer 10-μl-Impföse sachte resuspendiert. Eine sterile Pipette wurde verwendet, um die Suspension in ein Röhrchen zu übertragen, das wenigstens 10 ml BSA/Kochsalzlösung enthielt. Die Suspension wurde im Wirbelmischer gemischt, und die Extinktion bei 625 nm wurde spektrophotometrisch gemessen. Die Suspension wurde auf eine OD525 von ungefähr 0,3 (ungefähr 2,5 × 108 CFU/ml) eingestellt. Dann wurde ein Volumen der Suspension 10 Minuten lang bei 3000 U/min in einer TJ-6-Tischzentrifuge (Beckman Instruments) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Sediment wurde mit der Scheidenflüssigkeit resuspendiert, so dass man eine Endkonzentration von ungefähr 2,5 × 109 CFU/ml erreichte.
  • Trichomonas vaginalis (ATCC 30001) wurde fünf Tage lang oder solange, bis es eine Dichte von ungefähr 2 × 105 Zellen/ml erreichte, in 10-ml-Röhrchen mit modifiziertem Diamond-Medium (Kat.-Nr. 07-097, Remel) bei 37 °C in 5-10% CO2 gezüchtet. Aus Kulturen, die 1 × 105 bis 1,5 × 106 Trichomonaden/ml enthielten und frei von Kontamination waren, wurden Sekundärkulturen hergestellt. Frische, vorgewärmte Röhrchen mit Medium wurden mit 0,5 bis 1,0 ml der Kultur geimpft. Die Röhrchen wurden locker verschlossen und 2 bis 3 Tage lang bei 37 °C in 5-10% CO2 inkubiert. Sekundärkulturen, die einen Gehalt von wenigstens 2 × 105 Trichomonaden/ml hatten, wurden vereinigt, gemischt und mit Hilfe eines Hämacytometers ausgezählt. Die Suspension wurde sieben Minuten lang bei 2000 U/min in einer TJ-6-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Sediment wurde mit der Scheidenflüssigkeit resuspendiert, so dass man eine Endkonzentration von ungefähr 6 × 106 Trichomonaden/ml erreichte.
  • Typischerweise wurden alle drei Organismen in einem Experiment getestet. In diesem Fall wurden die Sedimente von jedem Organismus, C. albicans, G. vaginalis und T. vaginalis, anschließend mit derselben Scheidenflüssigkeit resuspendiert. Serielle zehnfache Verdünnungen der geimpften Scheidenflüssigkeit wurden doppelt auf Chocolate-II-Agarplatten plattiert, um die tatsächlichen Konzentrationen an lebensfähigen cfu/ml von Gardnerella vaginalis und Candida albicans zu bestimmen.
  • Glas-Schraubdeckelröhrchen oder Affirm-VPIII-Probenröhrchen wurden hergestellt, indem man 100 μl der getesteten Konservierungsmittel/Fixierungsmittel-Lösung in die Röhrchen pipettierte. In Röhrchen mit negativer Kontrolle (kein Konservierungsmittel) wurde nichts pipettiert. Für jede Testbedingung und jeden Zeitpunkt wurden drei Replikate hergestellt. Affirm-Probenahmestäbchen (Kat.-Nr. 4406251) wurden mit 100 μl Scheidenflüssigkeit oder geimpfter Scheidenflüssigkeit angesetzt. Dann wurden die Abstriche in das Glas oder die Affirm-VPIII-Röhrchen gegeben, und diese wurden verschlossen. Proben vom Anfangszeitpunkt, t0, wurden sofort verarbeitet. Die übrigen Proben wurden ungefähr 24, 48, 72 oder 96 Stunden später verarbeitet. Das Testen erfolgte gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift.
  • Für den quantitativen Nachweis wurde ein chemilumineszentes Substrat verwendet. Das Nachweissubstrat war Luminol/4-Iodphenol (Boehringer-Mannheim-Chemilumineszenz-ELISA-Substrat, Katalog-Nr. 1582950). Kurz gesagt, PACs wurden von dem Affirm-Prozessor entfernt, kurz bevor sie in Napf 7 eintraten. Von den Abfangperlen wurden die PACs entfernt, und die Perlen wurden in weiße flachbödige Mikrotiternäpfe gegeben, eine Perle pro Napf. Die aufnehmenden Näpfe enthielten 100 μl Waschlösung, um zu verhindern, dass die Perlen austrocknen. Sobald die Platte voll war, wurde die Waschlösung mit Hilfe einer Mehrkanalpipette aus den Näpfen abgesaugt, und 100 μl der chemilumineszenten Substratlösung wurden pro Napf hinzugefügt. Die Platte wurde sofort auf ein Platten-Lesegerät (Dynatek ML3000, Innentemperatur 30 °C, 7 Zyklen, 61 Sekunden Pause zwischen den Zyklen) gegeben, und es wurden 7 Zyklen abgelesen. Daten aus dem 5. Zyklus (ungefähr zehn Minuten nach der Zugabe von Substrat) wurden für alle Analysen verwendet.
  • Beispiel 3
  • Übliche Fixierungsmittel und Konservierungsmittel, die auf Eignung mit Affirm-Proben getestet werden
  • In der folgenden Tabelle sind mehrere kommerziell erhältliche Konservierungsmittel und Fixierungsmittel oder -lösungen, die im Haus unter Verwendung von Standardzubereitungen hergestellt werden, aufgeführt. Diese Lösungen wurden im Affirm-VPIII-Mikrobenidentifizierungstest mit Proben, die gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Vorschrift hergestellt wurden, mit Hilfe von Glasprobenröhrchen und Chemilumineszenznachweis getestet. Lösungen, die nicht wenigstens 24 Stunden Probenstabilität ergaben, werden als "durchgefallen" bezeichnet, während Lösungen, die den Affirm-Assay störten, als "gestört" bezeichnet werden.
    Reagens Hersteller Status
    PreservCyt (50% Methanol, Essigsäure, EDTA) Cytyc durchgefallen
    95% Methanol, Essigsäure, EDTA im Haus hergestellt durchgefallen
    95% Methanol, Essigsäure, EDTA, Lithiumchlorid im Haus hergestellt durchgefallen
    95% Methanol, Essigsäure im Haus hergestellt durchgefallen
    95% Methanol, EDTA im Haus hergestellt durchgefallen
    95% Methanol im Haus hergestellt durchgefallen
    gepuffertes Formalin SDL Inc. durchgefallen
    Parasafe SDL Inc. durchgefallen
    PVA (Polyvinylalkohol geringer Dichte) SDL Inc. gestört
    Affirm-VPIII-Puffer im Haus hergestellt durchgefallen
    modifizierter Affirm-Puffer (0,5×, mit Lithiumchlorid) im Haus hergestellt durchgefallen
    Carnoy-Lösung (60% Ethanol, 30% Chloroform, 10% Essigsäure) im Haus hergestellt gestört
    Säure/Ethanol (80% Ethanol, 20% Essigsäure) im Haus hergestellt durchgefallen
    PACE-Transportpuffer Gen-Probe durchgefallen
    RNA Later Ambion durchgefallen
    Molecular Biology Fixative Streck Labs. durchgefallen
    CytoRich Blue Preservative Fluid AutoCyte, Inc. durchgefallen
  • Beispiel 4
  • Konservierende Wirkungen von drei Zubereitungen über 24 Stunden
  • Drei Zubereitungen von Methanol- und Dimethylsulfoxid-Lösung wurden hergestellt und über 24 Stunden mit C. albicans, G. vaginalis und T. vaginalis auf ihre Konservierungsfähigkeit getestet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, wobei Glasprobenröhrchen verwendet wurden. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 6 × 106/ml; Gardnerella 1,5 × 109/ml; Candida 1 × 107/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Lösung Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    keine 0 0,0 6,8 5,3 154,4 11,3
    24 0,5 9,7 0,1 77,5 2286,9
    80% Methanol, 20% DMSO 0 0,0 9,8 5,9 103,8 15,8
    24 0,0 9,3 6,4 102,0 15,3
    50% Methanol, 50% DMSO 0 0,1 10,3 5,8 171,5 22,4
    24 0,0 9,7 5,9 196,1 15,1
    100% Methanol 0 0,0 10,6 7,0 172,7 16,7
    24 0,0 9,8 7,1 106,9 16,4
  • Die Daten bewiesen, dass ohne Konservierungsmittellösung das T.-vaginalis-Signal negativ war, das G.-vaginalis-Signal stark abnahm und das C.-albicans-Signal nach 24 Stunden stark zugenommen hatte (aufgrund von Wachstum). Mit den Konservierungsmittellösungen blieben die Signale über 24 Stunden Lagerung der Proben bei Umgebungstemperatur relativ konstant.
  • Beispiel 5
  • Konservierende Wirkung von zusätzlichen Zubereitungen über 24 Stunden
  • Zusätzliche Zubereitungen von Konservierungsmittellösungen wurden über 24 Stunden mit C. albicans und G. vaginalis auf ihre Konservierungsfähigkeit getestet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, wobei Glasprobenröhrchen verwendet wurden. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Gardnerella 9,7 × 108/ml; Candida 3,4 × 106/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Lösung Stunden negativ positiv Gv Ca
    keine 0 0,0 8,2 140,4 15,7
    24 0,0 10,3 71,0 1721,1
    40% Methanol, 40% Ethanol, 20% DMSO 0 0,0 8,9 52,3 10,4
    24 0,0 9,8 95,2 12,1
    25% Methanol, 25% Ethanol, 50% DMSO 0 0,0 10,0 124,0 16,8
    24 0,0 9,7 165,7 15,8
    80% Ethanol, 20% DMSO 0 0,1 9,9 127,2 16,1
    24 0,0 10,2 102,2 13,1
  • Die Daten zeigten an, dass ohne Konservierungsmittellösung das G.-vaginalis-Signal stark abnahm und das C.-albicans-Signal nach 24 Stunden stark zugenommen hatte (aufgrund von Wachstum). Mit den Konservierungsmittellösungen blieben die Signale über 24 Stunden Lagerung der Proben bei Umgebungstemperatur relativ konstant.
  • Beispiel 6
  • Probenstabilität nach 48 Stunden mit mehreren Zubereitungen
  • Fünf Konservierungsmittelzubereitungen wurden über 48 Stunden mit T. vaginalis, C. albicans und G. vaginalis auf ihre Konservierungsfähigkeit getestet.
  • Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, wobei Glasprobenröhrchen verwendet wurden. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 4,7 × 107/ml; Gardnerella 1,4 × 108/ml; Candida 5,6 × 106/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Lösung Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    keine 0 0,0 9,5 87,0 190,0 16,8
    24 0,0 8,1 9,1 16,7 1528,9
    48 0,0 9,6 0,6 1,7 1394,9
    80% Methanol, 20% DMSO 0 0,0 10,2 68,4 70,1 8,1
    24 0,0 9,4 66,3 171,6 4,8
    48 0,0 8,8 75,3 127,4 6,8
    50% Methanol, 50% DMSO 0 0,1 8,8 68,7 79,6 7,5
    24 0,0 11,0 67,7 162,1 5,9
    48 0,0 8,4 79,5 174,9 5,7
    40% Methanol, 40% Ethanol, 20% DMSO 0 0,0 8,1 87,6 179,4 7,8
    24 0,0 10,0 75,3 136,2 4,8
    48 0,0 8,4 70,7 75,5 5,4
    25% Methanol, 25% Ethanol, 50% DMSO 0 0,0 9,0 96,2 228,8 7,9
    24 0,0 8,1 67,4 132,7 2,7
    48 0,0 8,4 70,8 124,6 5,0
    80% Ethanol, 20% DMSO 0 0,0 9,1 97,4 128,0 8,2
    24 0,0 9,4 66,1 117,2 2,7
    48 0,0 8,9 70,2 84,8 5,4
  • Die Daten zeigten an, dass ohne Konservierungsmittellösung das T.-vaginalis- und das G.-vaginalis-Signal nach 48 Stunden negativ waren und das C.-albicans-Signal nach 24 und 48 Stunden stark zugenommen hatte (aufgrund von Wachstum). Mit den Konservierungsmittellösungen blieben die Signale über 48 Stunden Lagerung der Proben bei Umgebungstemperatur relativ konstant.
  • Beispiel 7
  • Probenstabilität mit Konservierungsmittel im Affirm-VPIII-Probenröhrchen
  • Eine Konservierungsmittelzubereitung wurde über 48 Stunden mit T. vaginalis, C. albicans und G. vaginalis getestet, wobei entweder Glas-Schraubdeckel röhrchen oder das Affirm-VPIII-Verarbeitungsröhrchen aus Polyethylen geringer Dichte verwendet wurde. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 3,9 × 107/ml; Gardnerella 3,1 × 108/ml; Candida 5,3 × 106/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Lösung Röhrchen Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    keine Glas 0 0,0 8,5 47,5 164,5 7,9
    24 0,0 9,7 1,2 20,1 1093,0
    48 0,0 10,9 0,1 0,8 1583,0
    Affirm 0 0,0 7,8 85,4 204,1 13,1
    24 0,0 9,5 8,3 98,6 857,3
    48 0,0 10,2 3,0 1,5 1152,5
    50% Methanol, 50% DMSO Glas 0 0,0 8,7 43,9 202,7 6,2
    24 0,0 9,9 41,9 292,7 4,1
    48 0,0 9,3 39,5 296,4 5,8
    Affirm 0 0,0 8,5 119,3 476,7 4,4
    24 0,2 10,1 109,4 725,7 5,4
    48 0,0 11,7 116,5 890,5 5,0
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass das Affirm-VPIII-Probenröhrchen eine Stabilität bot, die mit derjenigen der Glas-Schraubdeckelröhrchen vergleichbar war, wenn eine Konservierungsmittellösung verwendet wurde. Tatsächlich ging weniger Probe verloren, wenn das Affirm-VPIII-Röhrchen verwendet wurde, da der Abstrich in demselben Röhrchen transportiert und verarbeitet wurde. In Glasröhrchen transportierte Abstriche wurden zur Verarbeitung in Affirm-VPIII-Röhrchen übergeführt. Keines der beiden Röhrchen bewahrte die Probenstabilität, wenn keine Konservierungsmittellösung verwendet wurde.
  • Beispiel 8
  • Leistungsfähigkeit der Lösung über Probenmatrixpools
  • Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit der Konservierungsmittellösung über verschiedene Scheidenflüssigkeitsmatrices nachzuweisen. Vier Pools von Scheidenflüssigkeit wurden hergestellt: zwei aus frisch gesammelten Abstrichen und zwei aus gefrorenen Abstrichen. Affirm-VPIII-Röhrchen wurden für die Probentransportbedingungen verwendet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die mittleren cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 5 × 107/ml; Gardnerella 2,1 × 108/ml; Candida 5,6 × 107/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Vaginaler Pool Lösung Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    Pool 1 (gefroren) keine 0 0,0 7,5 83,3 141,5 27,5
    24 0,1 12,9 14,2 78,7 1255,8
    48 0,0 8,9 1,9 4,4 751,2
    72 0,1 18,8 0,8 7,7 2619,2
    50% MeOH, 50% DMSO 0 0,0 8,8 68,1 245,7 12,1
    24 0,0 10,5 58,9 249,4 24,3
    48 0,0 9,4 56,1 299,9 13,5
    72 0,0 8,1 31,1 222,3 20,2
    Pool 2 (gefroren) keine 0 0,0 7,6 93,8 89,0 20,8
    24 0,0 9,7 7,8 32,7 1316,3
    48 0,0 7,3 1,5 1,8 955,4
    72 0,0 9,6 0,2 2,4 1773,7
    50% MeOH, 50% DMSO 0 0,0 6,7 99,3 168,7 9,2
    24 0,1 11,0 94,2 168,2 13,5
    48 0,0 9,1 76,5 143,3 9,9
    72 0,0 9,3 60,2 221,3 11,1
    Pool 3 (frisch) keine 0 0,0 8,6 86,9 76,3 17,1
    24 0,0 9,2 0,0 8,4 1244,7
    48 0,0 9,6 0,0 2,6 1135,8
    72 0,0 8,9 0,0 0,9 1205,1
    50% MeOH, 50% DMSO 0 0,0 5,6 79,2 118,6 6,1
    24 0,2 9,2 95,7 155,8 11,6
    48 0,0 9,2 62,8 107,8 6,4
    72 0,0 7,5 54,4 159,4 9,2
    Pool 4 (frisch) keine 0 0,0 8,2 68,9 119,6 18,5
    24 0,0 7,9 0,7 54,4 1226,7
    48 0,0 8,8 0,0 11,8 1086,9
    72 0,0 6,0 0,0 2,6 1223,4
    50% MeOH, 50% DMSO 0 0,0 9,5 94,0 172,6 11,2
    24 0,0 8,3 44,9 144,0 9,6
    48 0,0 6,3 45,9 135,9 5,1
    72 0,0 7,1 29,8 147,1 6,7
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die Lösung in der Lage war, das Signal der Organismen in den vier Scheidenflüssigkeitspools über eine Lagerzeit von 72 Stunden aufrechtzuerhalten.
  • Beispiel 9
  • Leistungsfähigkeit der Lösung über eine Probenmatrix von fünfzehn Individuen
  • Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit der Konservierungsmittellösung (50% Methanol, 50% Dimethylsulfoxid) über Scheidenflüssig keit, die von fünfzehn Frauen gesammelt wurde, nachzuweisen. Von jeder Spenderin wurden zwei Tage lang zehn Abstriche pro Tag gesammelt. Affirm-VPIII-Röhrchen wurden für die Probentransportbedingungen verwendet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die mittleren cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 3,5 × 107/ml; Gardnerella 6,0 × 108/ml; Candida 7,7 × 106/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von chemilumineszenten Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die angegebenen Werte (relative Lumineszenzeinheiten, RLU) sind der Mittelwert von drei Replikaten.
    Spenderin Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    1 0 0,0 7,8 47,1 165,0 15,3
    24 0,0 7,6 67,5 277,3 12,7
    48 0,0 12,8 47,3 249,0 16,0
    72 0,0 7,8 43,7 214,6 9,4
    2 0 0,0 5,4 67,6 254,4 15,0
    24 0,0 6,4 91,8 464,6 27,8
    48 0,0 11,1 99,7 665,2 27,7
    72 0,0 9,5 61,6 485,7 16,2
    3 0 0,0 8,6 72,4 268,7 16,5
    24 0,0 9,1 65,7 308,0 19,7
    48 0,0 14,8 81,8 449,7 28,6
    72 0,0 8,2 49,4 301,1 16,7
    4 0 0,0 8,9 65,3 206,1 15,6
    24 0,0 8,7 39,0 203,4 18,8
    48 0,0 15,2 40,0 261,5 29,4
    72 0,0 6,4 23,6 216,7 13,3
    5 0 0,0 9,3 57,6 165,3 11,8
    24 0,0 8,6 50,8 266,5 12,8
    48 0,1 12,1 64,6 299,9 24,0
    72 0,0 8,5 44,6 259,4 11,8
    6 0 0,0 8,5 63,3 464,7 16,3
    24 0,0 7,1 40,9 259,0 10,4
    48 0,0 8,6 49,7 349,5 12,4
    72 0,0 8,1 44,9 486,6 15,9
    7 0 0,0 8,9 62,6 318,1 20,0
    24 0,0 8,2 44,7 244,9 9,5
    48 0,0 8,4 34,7 226,1 9,5
    72 0,0 8,9 33,5 284,1 12,9
    8 0 0,0 8,1 60,2 291,6 11,2
    24 0,0 7,9 42,3 168,2 7,5
    48 0,0 9,8 44,4 190,9 7,1
    72 0,0 8,9 53,1 292,6 8,9
    9 0 0,0 8,6 62,2 273,6 17,6
    24 0,0 8,1 27,2 191,7 12,6
    48 0,0 8,6 21,3 222,8 16,7
    72 0,0 12,0 29,1 379,5 16,7
    10 0 0,0 8,3 39,8 145,7 12,2
    24 0,1 7,5 26,5 103,7 8,9
    48 0,2 9,9 22,9 128,0 11,0
    72 0,0 9,2 31,1 208,9 14,1
    11 0 0,0 8,5 113,2 218,7 8,2
    24 0,0 8,1 95,6 156,6 5,1
    48 0,0 11,9 158,2 332,6 8,2
    72 0,0 8,6 90,8 178,2 3,0
    12 0 0,0 9,5 112,4 189,7 11,7
    24 0,0 8,6 66,0 172,4 11,9
    48 0,0 13,2 114,6 346,8 22,0
    72 0,0 9,8 60,4 170,4 7,5
    13 0 0,0 9,8 130,2 159,9 7,3
    24 0,0 10,0 118,5 191,4 10,2
    48 0,0 13,2 222,4 322,2 14,7
    72 0,0 9,0 125,0 225,3 7,8
    14 0 0,0 8,6 118,7 138,7 9,7
    24 0,0 8,7 91,2 126,1 6,0
    48 0,0 15,2 160,6 213,9 12,3
    72 0,0 9,3 89,5 105,5 4,3
    15 0 0,0 10,1 103,2 97,8 7,5
    24 0,0 8,7 88,0 123,5 11,9
    48 0,0 14,6 122,6 168,6 18,1
    72 0,0 9,3 97,8 117,7 10,8
  • Die Lösung zeigte konservierende Wirkungen über die Scheidenflüssigkeit von 15 verschiedenen individuellen Spenderinnen. Alle Organismensignale wurden aufrechterhalten.
  • Beispiel 10
  • Leistungsfähigkeit der Lösung mit Proben, die bei einer Reihe von Temperaturen gelagert wurden
  • Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit der Konservierungsmittellösung (50% Methanol, 50% Dimethylsulfoxid) über eine Reihe von Lagertemperaturen nachzuweisen. Von jeder Spenderin wurden zwei Tage lang zehn Abstriche pro Tag gesammelt. Affirm-VPIII-Röhrchen wurden für die Probentransportbedingungen verwendet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 8,2 × 106/ml; Gardnerella 1,4 × 107/ml; Candida 7,9 × 106/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von kolorimetrischen Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, außer dass der Farbe der Perlen ein Wert relativ zur Farbe der positiven Kontrollperle zugeschrieben wurde. Positiven Kontrollperlen wurde eine "2" zugeschrieben. Analytenperlen, die dunkler als die Kontrollperle waren, wurde eine "3" zugeschrieben, Analytenperlen mit derselben Farbe wie die Kontrollperle wurde eine "2" zugeschrieben, und Analytenperlen, die heller als die Kontrollperle, aber dunkler als die negative Kontrollperle waren, wurde eine "1" zugeschrieben. Die angegebenen Werte sind der Modalwert von drei Replikaten, die jeweils von drei verschiedenen Ablesern eingestuft wurden. Die Proben wurden bis zu 96 Stunden lang gelagert.
    Lösung Temperatur Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    keine Umgebungst. 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 0 0 3
    48 0 2 0 0 3
    96 0 2 0 0 3
    50% Methanol, 50% DMSO Umgebungst. 0 0 2 3 3 3
    24 0 2 3 3 3
    48 0 2 2 2 3
    96 0 2 2 3 3
    2 °C 0 0 2 3 3 3
    24 0 2 3 3 3
    48 0 2 3 3 2
    96 0 2 3 3 2
    30 °C 0 0 2 3 3 3
    24 0 2 2 2 2
    48 0 2 2 2 3
    96 0 2 1 1 1
    35 °C 0 0 2 3 3 3
    24 0 2 2 3 2
    48 0 2 1 3 2
    96 0 2 2 3 3
  • Die Daten zeigten, dass die Lösung in der Lage war, für Probenstabilität bei einer Reihe von Lagertemperaturen über 96 Stunden zu sorgen. Sie zeigten auch an, dass die konservierende Lösung keine Auswirkung auf das Nachweisverfahren hatte.
  • Beispiel 11
  • Beweis dafür, dass die Lösung Schutz vor Nucleasen bietet
  • Die bevorzugte Ausführungsform (50% Methanol, 50% DMSO) wurde auf ihre Fähigkeit getestet, RNA vor Nuclease-Abbau zu schützen. Ein kommerziell erhältlicher RNase-Nachweiskit (RNaseAlertTM RNase Detection Dipsticks, Katalog-Nr. 1960, Ambion) wurde mit Proben von Scheidenflüssigkeit allein und mit Scheidenflüssigkeit und zugesetzter Konservierungsmittellösung verwendet. Der Kit ergibt eine RNA-Lösung, die gemäß der Kit-Vorschrift an zwei Stellen auf einen Teststreifen getüpfelt wird. Ein Tüpfel wird mit der Testlösung inkubiert. Beide Tüpfel auf dem Teststreifen werden dann einem kolorimetrischen Nachweis unterzogen. Wenn der RNA-Tüpfel, der mit der Testlösung inkubiert wurde, weiß ist oder einen helleren Blauton als der Kontrolltüpfel aufweist, enthält die Testlösung RNase. Die Streifen wurden verwendet, um Scheidenflüssigkeit zu testen, die mit der Konservierungsmittellösung gemischt wurde. Die Ergebnisse zeigten an, dass die mit Konservierungsmittellösung gemischte Scheidenflüssigkeit häufiger nachweisbare RNA auf dem Testtüpfel hinterließ als unbehandelte Scheidenflüssigkeit. Dies zeigte an, dass die Konservierungsmittellösung Schutz vor in der Scheidenflüssigkeit vorhandenen Nucleasen bot.
  • In einem getrennten Experiment wurden die RNaseAlertTM RNase Detection Dipsticks verwendet, um die Konservierungsmittellösung mit humanem Vollblut, Serum und Plasma zu bewerten. Proben davon wurden jeweils 1:1 mit der bevorzugten Ausführungsform (50% Methanol, 50% DMSO) gemischt und mit den Teststreifen getestet. Proben, die kein Konservierungsmittel enthielten, wurden ebenfalls getestet. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Vollblut-, Serum- und Plasmaproben aktive RNasen enthielten, da auf dem Teststreifen kein sichtbarer Tüpfel zurückblieb, nachdem die Vorschrift zu Ende befolgt wurde. Wenn jedoch Vollblut, Serum und Plasma mit der Konservierungsmittellösung gemischt wurden, war der Test-RNA-Tüpfel auf dem Streifen eindeutig sichtbar. Dies bewies, dass die Konservierungsmittellösung Schutz vor in humanem Vollblut, Serum und Plasma vorhandenen Nucleasen bot.
  • Beispiel 12
  • Leistungsfähigkeit über einen breiten Bereich von Lösungszusammensetzungen
  • Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit der Konservierungsmittellösung nachzuweisen, wenn eine der beiden Komponenten bis zu extremen Konzentrationen variiert wird. Die Proben wurden bis zu 72 Stunden lang in dem Konservierungsmittel aufbewahrt. Affirm-VPIII-Röhrchen wurden für die Probentransportbedingungen verwendet. Das Verfahren war so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die cfu-Werte der Organismen pro ml Scheidenflüssigkeit waren wie folgt: Trichomonas 1 × 107/ml; Gardnerella 1,9 × 107/ml; Candida 1,4 × 107/ml. Das Signal wurde mit Hilfe von kolorimetrischen Nachweisverfahren gemessen, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist. Die angegebenen Werte sind der Mittelwert von drei Replikaten, die jeweils von drei verschiedenen Ablesern eingestuft wurden. Bei allen getesteten Zubereitungen wurden konservierende Wirkungen beobachtet.
    Zubereitung Stunden negativ positiv Tv Gv Ca
    keine 0 0 2 3 1 3
    24 0 2 1 0 4
    72 0 2 0 0 4
    20% Methanol 80% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 2,9 1,7 3
    40% Methanol 60% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 3 2,2 3
    50% Methanol 50% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 3 2 3
    60% Methanol 40% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 3 2 3
    80% Methanol 20% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 3 1,2 3
    100% Methanol 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 2,9 2 3
    72 0 2 3 1,8 3
    100% DMSO 0 0 2 3 2 3
    24 0 2 3 2 3
    72 0 2 3 2 3
  • Beispiel 13
  • Mikroskopische Bewertung von mit Konservierungsmittellösung behandelten Zellen
  • Zellen von verschiedenen Organismen wurden durch Zentrifugation sedimentiert und dann in BSA/Kochsalzlösung resuspendiert. Ein Aliquot von jeder Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen von Konservierungsmittellösung behandelt, die aus einem 1:1-Gemisch von Methanol und DMSO bestand. Die behandelten Zellen wurden 24 Stunden lang bei Umgebungstemperaturen gelagert. Als Kontrolle wurde ein zweites Aliquot von Zellen unmittelbar vor der mikroskopischen Untersuchung mit einem gleichen Volumen BSA/Kochsalzlösung behandelt. Beide Aliquote wurden mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (Eclipse E400, Nikon Japan) mit 40-facher Vergrößerung untersucht.
    Zelle Herkunft Ergebnisse
    Trichomonas vaginalis ATCC 30001 Figuren 2a und 2b
    Candida albicans ATCC 60193 Figuren 3a und 3b
    humane epidermale Keratinocyten Zelllinie NHEK-3007 (BioWhittaker Kat.-Nr. CC-2503) Figuren 4a und 4b
    Spodoptera-frugiperda-Eierstockzellen Sf9-Insektenzelllinie (PharMingen Kat.-Nr. 213001) Figuren 5a und 5b
    humane Mundschleimhautzellen von der Wange abgeschabte Probe Figuren 6a und 6b
  • Die mikroskopische Untersuchung ergab Zellen, die nach 24 Stunden Lagerung unter Umgebungsbedingungen in der konservierenden Lösung visuell intakt waren. Die Zellen hatten ein ähnliches Erscheinungsbild und eine ähnliche Anzahl wie bei den unbehandelten Kontrollen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Lösung die Zellen nicht lysiert, sondern ihre Struktur stabilisiert und die Zellen intakt hält.

Claims (14)

  1. Zusammensetzung zum Stabilisieren der Struktur und der Nucleinsäuren wenigstens einer Zelle, wobei die Zusammensetzung aus Folgendem besteht: (a) einer ersten Substanz, die Proteine ausfällen oder denaturieren kann und die aus wenigstens einem Alkohol oder Keton besteht; und (b) einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, die die Infusion der ersten Substanz in wenigstens eine Zelle unterstützen soll und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und Polyethylenglycol besteht; wobei die Konzentrationen der ersten und der zweiten Substanz in der Zusammensetzung entweder in einem Verhältnis von 2,5:2,5:5 (erster Alkohol oder erstes Keton : zweitem Alkohol oder zweitem Keton : zweiter Substanz) oder in einem Verhältnis von 1:1 (erste Substanz : zweiter Substanz) vorliegen.
  2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der wenigstens eine Alkohol oder das wenigstens eine Keton aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol und Aceton besteht.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die erste Substanz Methanol ist und die zweite Substanz Dimethylsulfoxid ist.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten Alkohol oder Keton um Methanol, bei dem zweiten Alkohol oder Keton um Ethanol und bei der zweiten Substanz um Dimethylsulfoxid handelt.
  5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die erste Substanz Ethanol ist und die zweite Substanz Dimethylsulfoxid ist.
  6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure DNA oder RNA ist.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der wenigstens einen Zelle um einen Prokaryonten oder Eukaryonten handelt.
  8. Verfahren zum Stabilisieren der Struktur und der Nucleinsäuren wenigstens einer Zelle, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht: (a) In-Kontakt-Bringen der wenigstens einen Zelle mit einer ersten Substanz, die Proteine ausfällen oder denaturieren kann und die aus wenigstens einem Alkohol oder Keton besteht; und (b) In-Kontakt-Bringen der wenigstens einen Zelle mit einer zweiten Substanz, einer Hilfssubstanz, die die Infusion der ersten Substanz in wenigstens eine Zelle unterstützen soll und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und Polyethylenglycol besteht; wobei die Konzentrationen der ersten und der zweiten Substanz so groß sind, dass sie die Struktur und die Nucleinsäuren der wenigstens einen Zelle stabilisieren.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der wenigstens eine Alkohol oder das wenigstens eine Keton aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol und Aceton besteht.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die erste Substanz aus einem Alkohol oder Keton besteht und wobei die Konzentrationen der ersten und der zweiten Substanz in der Zusammensetzung in einem Verhältnis von 4:1 (erste Substanz : zweiter Substanz) liegen.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung wie in Anspruch 1 bis 5 definiert ist.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Konzentrationen der ersten und der zweiten Substanz so groß sind, dass sie die Struktur und die Nucleinsäuren der wenigstens einen Zelle bei Umgebungstemperatur stabilisieren.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Nucleinsäure DNA oder RNA ist.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei es sich bei der wenigstens einen Zelle um einen Prokaryonten oder Eukaryonten handelt.
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